KR102131569B1 - 쑥 발효물의 추출물을 유효성분으로 하는 탈모 방지 및 육모용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쑥의 추출물을 유효성분으로 사용하는 육모용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 쑥의 발효물을 추출한 것을 유효성분으로 하는 탈모방지 및 육모용 조성물에 관한 것이다.

Description

쑥 발효물의 추출물을 유효성분으로 하는 탈모 방지 및 육모용 조성물 {Composition for hair growth containing fermented Artemisia Vulgaris extract}

본 발명은 쑥의 추출물을 유효성분으로 사용하는 탈모 방지 및 육모용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 쑥의 발효물을 추출한 것을 유효성분으로 하는 탈모방지 및 육모용 조성물에 관한 것이다.

탈모란 모낭의 성장주기 중 성장기의 모낭에서 자라는 모발보다 퇴행기 또는 휴지기의 모낭에서 자라는 모발의 비율이 높아져 비정상적으로 빠지는 모발이 증가하는 것을 말한다.

탈모증은 크게 두 종류가 있는데 그중 첫째는 남성형 탈모증(male pattern baldness), 장년형 탈모증(alopecia seniles) 또는 남성 호르몬성 탈모증 (androgenic alopecia)이라고 불리는 것으로 중년 남성에게서 흔히 볼 수 있으며 전두부와 두정부에서 시작된다. 둘째로는 원형 탈모증(alopecia areata)이라고 불리는 것으로 원형 내지는 타원형의 비교적 경계가 명확한 탈모를 보이며 청소년기에 발생할 수 있는 탈모증이 있다.

탈모증은 남성에만 있는 질병이 아니고 여성에서도 발생하며, 탈모증의 대부분은 남성형 탈모증이나 남녀에 상관없이 발생한다. 원형 탈모증 역시 남녀 모두에게 발생하나 여성이 남성에 비하여 발생 빈도가 낮다.

이러한 탈모의 원인으로는 모발 주기 조절과 관련된 모유두세포(dermal papilla cell)와 모모세포(geminal matrixcell)의 기능저하 또는 증식억제, 남성호르몬의 과잉작용, 모포에의 혈류량의 저하, 피지분비 과잉, 과산화물과 세균 등에 의한 두피기능 저하, 유전적 요인, 노화, 스트레스에 따른 신경증 등이 있으며, 다양한 원인이 단독 혹은 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.

최근 현대인들에게 대기오염과 같은 환경적 요인과 정신적인 스트레스 등으로 인하여 탈모증의 발생이 증가하고 있으며 발생 연령도 점차 낮아지고 있다. 이와 같은 탈모증은 당사자들에게 심각한 스트레스를 유발하고 대인관계에 지장을 초래할 수 있어 그 치료 및 예방에 대한 관심은 증대되고 있다.

탈모증의 치료 및 예방에 있어 현재까지 다양한 시도가 이루어져 왔는데 외관적인 방법으로는 두피피판술, 탈모부위축소술 및 조직확장술에 의한 두피성형술과 최근에 발전된 자가모발 이식술 등이 있다. 이러한 외과적 방법은 비록 그 효과 면에서는 우수하더라도 수술에 대한 환자의 경제적, 정신적 부담이 매우 크므로 널리 사용되기 어렵다는 단점이 있다.

이에 다양한 외용제가 사용되고 있는데 현재 가장 널리 사용되는 것은 미국 FDA의 승인을 받은 업존사의 미녹시딜 함유제제이며 최근에는 머크사에서 Type 2의 5 알파-환원효소 억제효과가 있는 피나스테라이드(finasteride)가 주성분인 프로페시아(Propecia)가 발매되어 사용되고 있다. 그러나 미녹시딜의 경우 가려움증, 자극 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있고, 피나스테라이드의 경우에도 사용을 중단하면 2개월 안에 원상태로 돌아가는 문제점과 성욕감퇴, 발기부전 등의 부작용이 발생하며 여성은 기형아 출산 위험이 있기 때문에 복용할 수 없다는 단점이 존재한다.

또한, 부작용이 적은 천연물질로 천궁, 상황버섯, 금은화, 케모마일 등의 추출물, 하수오, 창포, 석류, 은행잎 추출물 등 천연추출물에 기초한 연구들이 진행되고 있으나 이러한 육모제를 실제 임상에서 사용하는 경우 두피에 작용하는 효과가 그다지 탁월하지 못하다.

이와 관련한 쑥에 대한 연구로는 등록 제10-2005777호(양모 및 발모 촉진과 탈모방지를 위한 조성물, 및 이를 포함하는 화장료), 등록 제10-1744103호(탈모방지 및 발모촉진용 조성물 및 그의 제조방법) 등이 있으나, 이들은 쑥의 양모 효과를 직접 실험하고 입증한 것은 아니다.

본 발명은 탈모방지 및 육모 촉진에 우수한 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 쑥 추출물, 더 나아가 쑥 발효물의 추출물로서 효과적이면서 부작용이 적은 탈모 방지 및 육모용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 탈모 방지 및 육모용 조성물은 쑥 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 쑥 추출물은 바실러스 균으로 발효된 것임을 특징으로 한다.

또한 상기 쑥 추출물은 Bacillus methylotrophicus(Apep microrganism S001)와 Bacillus subtilis(Apep microrganism K007) 2종의 균주를 이용하여 발효된 것임을 특징으로 한다.

또한 상기에서 추출 용매는 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 중의 하나인 것을 특징으로 한다.

또한 상기에서 쑥 추출물의 발효물은 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 한다.

더 나아가 상기에서 쑥 추출물의 발효물은 에틸아세테이트 분획물으로서 유효성분으로 카페익산을 함유한 것을 특징으로 한다.

또한 이때 카페익산의 함량은 50ppm을 넘고, 바람직하게는 500ppm를 넘는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 조성물은 천연물질을 유효성분으로 하여 부작용이 적을 뿐만 아니라 모유두 세포의 생존능력을 현저히 증가시켜 탈모 방지 및 육모 촉진에 우수한 효과를 갖는다.

이하 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다.

실험 대략적 요지(프로세스)는 다음과 같다.

쑥 원물 --> 쑥 추출물 --> 쑥 발효물 --> 쑥 분획물(그중 에틸아세테이트층) --> 지표성분 확인 결과 카페익산이 다량 함유되어 있음.

[쑥 추출물의 발효물 제조]

쑥 추출물은 쑥과 물을 1 : 10의 중량비로 혼합하여 120℃에서 8시간 열수추출한 것을 사용하였다.

쑥 추출물의 발효는 발효 식품에서 분리한 미생물 2종을 이용하여 진행하였다. 본 발명자들에 의해 스크리닝되어 최적의 발효 균주로 선별된 Bacillus methylotrophicus(Apep microrganism S001)와 Bacillus subtilis(Apep microrganism K007) 2종의 미생물을 사용하였다. 전 배양은 Nutrient broth(Difco, Detroit, MI, USA)를 이용하여 2종의 발효균주에 대해 각각 37℃ 진탕 배양기에서 24시간 배양하였다.

쑥 추출물의 발효 시 사용된 조성은 쑥 추출물, Glucose 0.6%, Yeast Extract 0.3%, Soytone 0.1%로 하였다. 쑥 추출물은 고형분 함량 기준으로 정량하여 발효시 사용하였으며, 발효를 위한 배지는 발효기에 쑥 추출물을 제외한 배지 성분을 넣어 121℃에서 20분간 멸균하여 사용하였고 쑥 추출물은 추출방법에 따라 배지 멸균 후 후첨하여 추출물의 성분이 열에 의해 파괴되지 않도록 하였다. 여기에 발효 미생물 2종을 접종하였다. 발효 미생물 농도는 spectrophotometer로 약 1.0 X 109 cfu/ml의 농도로 측정한 뒤 사용하였으며 접종이 완료되면 37℃에서 3일간 진탕 배양하여 발효를 진행하였다.

발효 완료 후 발효물은 원심분리를 진행하여 미생물을 걸러낸 뒤 0.2 μm 필터로 한번 더 여과하여 미생물을 완벽히 제거하였다.

[쑥 추출물의 발효물 분리정제]

쑥 추출물의 발효물을 이용한 분리, 정제 실험을 진행하였다.

쑥 발효물의 분리, 정제는 발효 - 용매분리(Hexane, CH₂Cl₂, EtOAc, N-BuOH, water)의 순서로 진행하였으며 각 단계별 분획물에 대한 단백질 정량을 기본으로 하여 단백질(펩타이드) 함량 확인 후 실험을 진행하였다.

<Fig. 1-1. 쑥 발효물 분리 모식도>

<Fig. 1-2. 천연물 분획>

[MTT assay를 통한 소재의 세포 독성 검증]

MTT assay는 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소작용에 의하여 노란색 수용성 기질인 MTT tetrazolium이 청자색의 비수용성 기질인 formazan crystal로 환원되는 것을 이용한 검사법이다.

세포배양용 12 well plate에 인간 모유두세포(Human Dermal papilla cells)를 1x10⁴개/ml로 분주하고 24시간 동안 배양하여 세포단층을 얻은 후, PBS로 1회 세척하고, 샘플을 각 well에 접종하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 72시간 배양하였다.

MTT 용액 40 μl씩을 각 well에 가하여 5% CO2, 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 정치하였다.

MTT 용액을 완전히 제거하여 배양 plate를 건조한 후 150 μl DMSO로 세포 내에 형성된 formazan 결정체를 용해하여 ELISA plate reader로 595 nm에서 흡광도를 측정한 후, 세포 독성을 계산하였다.

유효 소재의 안전성 검사를 위해 인간피부 섬유모세포(Human Dermal Firoblast)에 소재를 처리하고 세포독성 검사를 실시하였다.

그 결과 쑥 발효 분획물 중 Hexane을 제외한 분획물에서 세포 독성 없음이 확인되었다.

<Fig. 2>

[Wound healing assay를 이용한 모유두 재생 효과 확인]

6 well plate 원형 바닥면을 완전히 덮을 수 있도록 자란 인간 모유두 세포주의 중간부위를 tip을 이용하여 균일하게 상처를 낸 후 PBS를 이용하여 2회 세척하여 무혈청배지로 바꿔주었다.

샘플 처리 후 실험 시간을 72시간을 기준으로 하며, 각각의 시간 동안 상처의 회복 정도를 이미지 장비를 통해 확인하였다.

그 결과 쑥 발효군, 그중에서도 Ethyl Acetate군에서 가장 좋은 효과를 보임을 확인하였다. 또한 caffeic acid 함량군 및 농도에 의존적으로 효과가 증가하는 것으로 나타나 Caffeic acid가 모유두세포를 활성화하는 효과가 있음을 확인하였다.

이는 위 샘플이 모유두 세포 활성화를 통해 모발 성장과 관련한 효과를 보이는 부분이기도 하다.

<Fig. 3>

<Fig. 4>

<Fig. 5>

<Fig. 6>

[5α-Reductase 활성 억제 효과 검증]

5α-Reductase 활성 억제 효과 측정은 5α-Reductase Activity assay kit (ELISA)를 이용하여 측정하였다. DMEM으로 계대 배양된 인간 유래 모유두세포를 사용하여 24-Well에 2x10⁵개로 분주하여, 24시간 후에 시료용액을 넣은 후 무혈청 배양액으로 교환하여 72시간 처리하고, RIPA buffer와 Inhibitor cocktail를 이용해 세포 내 5α-Reductase를 비롯한 protein만을 이용해 5α-Reductase Activity를 측정하였다.

먼저 1차 5α-Reductase 항체가 균일하게 도포된 96-well plate에 채취한 protein을 100 μL을 넣고, 항원-항체 반응을 37℃ 항온조에서 광차단하여 2 시간 반응 시킨 후 인산완충액으로 4회 washing 한 다음 발색단이 결합된 2차 5α-Reductase 항체를 kit에 넣고 다시 1시간 반응시켰다.

반응 후 발색유발 물질을 넣어 실온에서 15-30분간 발색을 유발시키고, 다시 1 M의 황산을 넣어 발색을 중지시킨 후 이를 ELISA reader로 450 nm에 서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 쑥 발효군, 그중에서도 Ethyl Acetate군에서 좋은 효과를 보임을 확인하였다. 또한 caffeic acid의 함량이 높을수록 5α-Reductase를 억제하는 효과가 좋아 Caffeic acid가 탈모방지에 좋은 효과를 보임을 확인하였다.

<Fig. 7>

<Fig. 8>

<Fig. 9>

<Fig. 10>

이상의 결과를 통해 본 발명에 따른 조성물이 가지는 탈모 방지 및 육모 효과를 확인할 수 있다.

Claims (7)

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5. Bacillus methylotrophicus(Apep microrganism S001)와 Bacillus subtilis(Apep microrganism K007) 2종의 균주를 이용하여 발효된 쑥 추출물을 함유하며,
   이때 추출 용매는 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 중의 하나이고,
   쑥 추출물의 발효물은 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 육모용 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   쑥 추출물의 발효물은 에틸아세테이트 분획물으로서 유효성분으로 카페익산을 함유한 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 육모용 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   카페익산의 함량은 500ppm를 넘는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 육모용 조성물.