KR102106466B1

KR102106466B1 - 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102106466B1
Application number: KR1020190118055A
Authority: KR
Inventors: 이광훈; 신정우; 노지연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-05-28
Also published as: KR20190111870A; KR20170114921A; KR102028245B1

Abstract

ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 를 유효 성분으로 함유하는 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 FLG 유전자의 발현을 활성시키는 효능을 나타내며 이에 의해 FLG의 생성을 촉진함으로써, FLG의 감소로 인해 비롯되는 알러지성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 나아가, ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 약학 조성물들은 히스타민과 다양한 염증성 사이토카인의 수준을 낮추는 효능이 있어, 알러지성 질환, 특히 아토피피부염을 예방하거나 치료하는데 효과적일 수 있다.

Description

항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR ANTI ALLERGY AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ALLERGIC DISEASES}

본 발명은 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

피부 중에서 표피 (epidermis) 는 각질형성세포 (keratinocyte) 를 포함하고 있다. 피부의 최외각에 위치하고 있는 표피는 외부의 다양한 물리적, 화학적 및 기계적 자극에 대한 방어 및 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능을 수행한다. 이러한 보호 기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되고 유지됨으로써 가능하다.

이러한 각화 과정에서 각질형성세포는 천연 보습 인자 (Natural Moisturizing Factor; NMF) 와 세라마이드, 콜레스테롤 및 지방산과 같은 세포 간 지질을 생성하여 각질층이 외부와의 차단층 역할을 하게 됨으로써 피부 장벽 (skin barrier) 으로서의 기능을 보유하게 된다.

현대 사회의 주요 질환의 하나로 여겨지는 피부 건조증은 피부 장벽 기능 이상에 의해 야기되는 증상의 하나로, 최근, 환경 오염, 아파트, 고층 건물과 같은 건조한 환경의 증가, 사회적 스트레스의 증가, 우리 나라 특유의 과도한 목욕 문화, 피부 노화 등과 같은 여러 가지 요인에 의해 점점 더 증가하고 있으며, 증세가 심하여 치료를 필요로 하는 경우 또한 지속적으로 증가하고 있다.

특히, 아토피피부염은 알러지성 질환의 대표적인 질환으로서 만성, 재발성의 피부 질환으로 다양한 임상양상을 가지며 아이들에서는 20 %, 어른들에서는 1 내지 3 %의 유병률을 보인다. 이러한 아토피피부염 환자들은 알러지 천식, 알러지 비염과 같은 또 다른 알러지성 질환으로 발전하는 아토피 행진 양상을 보일 수 있다. 나아가, 아토피피부염은 수면을 방해하는 심한 가려움증을 동반하고 만성적으로 재발하는 경과를 가지기 때문에 환자들의 삶의 질이 떨어져 있으며 최근 유병률이 증가하고 있어 사회, 경제적인 문제를 초래하고 있다.

알러지성 질환은 유전적인 소인과 환경적인 원인, 전신적 및 국소적 면역학적 이상 반응 및 피부 장벽의 이상 등이 주요 발병원인일 수 있다. 즉, 면역학적 결함, 피부장벽의 이상과 같은 아토피피부염의 유전적 소인을 가진 사람에서 여러 가지 환경적 요인에 노출되었을 때 증상이 나타나게 된다. 알러지성 질환이 일어나는 과정을 구체적으로 살펴보면, 먼지, 꽃가루, 곰팡이, 각종 음식물, 약물 등과 같은 알러젠 (알러지 항원) 이 호흡기, 소화기, 피부를 통해 체내로 들어오게 되고, 그 결과 알러젠이 조직 속의 비만세포 (mast cell) 혹은 랑게르한스 세포와 같은 항원전달 세포 표면에 부착되어 있는 IgE 항체에 결합하게 된다. 이에 따라 비만세포는 히스타민 (histamine) 이라는 물질을 분비한다. 히스타민은 비점막에서 알러지성 반응을 일으키는 가장 중요한 화학매체로서, 혈관의 투과성을 증가시켜 비점막의 부종을 일으키고, 감각신경 말단을 자극하여 눈물, 콧물, 가려움증과 같은 다양한 알러지 초기반응을 유발한다. 이어서 히스타민 이외에 호산구 화학주성 인자 (eosinophilic chemotactic factor), 류코트리엔 (leukotriene) 등과 같은 화학 주성능을 가진 화학매체가 조직 속의 비만세포로부터 분비된다. 이러한 화학주성 물질에 의해 호산구 (eosinophile) 가 알러지 발생부위로 이동하게 되어, 조직손상, 염증반응, 과민반응과 같은 알러지 후기반응을 유발한다.

예를 들어, 알러지성 질환 중 하나인, 아토피피부염의 대부분은 IgE와 연관된 면역기전에 의해 발병할 수 있다. 이때, 아토피피부염은 특정 알레르겐에 대한 즉시형 면역반응보다는 T세포 이상에 의한 지연형 면역반응에 의해 유발된다. 또한, Th2 세포는 IgE의 생성을 유도하는 IL-4와 B세포로부터 IgE생성을 촉진하는 IL-5 및 IgE생성을 증폭시키는 IL-6등을 분비함에 따라, 아토피피부염과 연관된 세포일 수 있다. 구체적으로, 다른 피부질환과 달리 아토피피부염의 피부병변에 침윤되는 염증세포는 주로 Th2세포이고, Th2세포는 IL-4, IL-5 등의 염증성 사이토카인을 생성하여, 혈중 IgE의 상승을 촉진하고, 호산구의 증가를 유도한다. 사이토카인의 증가는 혈관 내피세포를 활성화하여 여러 세포유착분자의 발현을 유도하거나 증가시킬 수 있다. 이의 결과로 기억 T림프구의 복귀가 촉진됨으로써, 습진성 병변이 유발되게 된다.

아토피피부염 발병 원인은 피부 장벽 기능의 이상이 있을 수 있다. 아토피 피부염 환자에 있어서, 가장 중요한 임상증상은 가려움증과 피부 건조증이다. 이러한 피부 장벽의 손상은 외부에 존재하는 항원이 피부에 통과하고 흡수되는 것을 증가시킬 수 있고, 이는 면역반응이 나타날 수 있는 중요한 요소로 작용하고 있다. 특히 아토피피부염 환자의 피부는 표피의 수분증발이 촉진되어, 피부건조증 또한, 유발될 수 있다.

이러한 알러지성 질환의 치료를 위해, 항히스타민, 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증용 의약품 및 류코트리엔 길항제가 사용되고 있다. 구체적으로, 알러지성 질환 중 아토피피부염의 치료제로는 면역반응의 조절을 위한 국소 제제로 스테로이드제, 칼시뉴린억제제 등이 사용되고 있으며, 전신 경구 제제로 스테로이드제, 면역 조절제, 항히스타민제 등이 사용되고 있다. 하지만 국소제제 단독만으로는 조절되지 않는 환자가 많으며 특히 국소스테로이드제는 장기간 도포 시 피부 위축, 혈관 확장 등의 부작용을 일으킬 수 있어 만성 경과를 보이는 아토피피부염에는 적합하지 않다. 국소 칼시뉴린억제제의 경우 장기간 도포할 수 있으나 자극 증상이 있고 사용감이 불편한 한계가 있다. 경구 스테로이드제의 경우에는 당뇨, 골다공증, 쿠싱증후군 등의 부작용이 있으며 면역 조절제는 고혈압, 손발저림, 신장 기능 장애 등의 부작용이 있어 장기간 사용이 어렵고 경구 항히스타민제는 그 효과가 미미하다. 아토피피부염의 피부 장벽의 회복을 돕기 위한 치료 방법으로는 보습제의 사용이 중요하며 세라마이드 또는 항염 물질들을 포함한 보습제들이 제약, 화장품 영역에서 개발되어 사용 중에 있다. 하지만 이러한 여러 치료 방법에도 불구하고 아토피피부염은 아직까지 해결되지 않고 점차 늘어가는 추세에 있다.

이에 따라, 알러지성 질환에 대하여, 이를 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있는 물질들의 개발이 요구되고 있다. 나아가 보습효과와 동시에 염증반응을 억제효과를 갖는, 기존의 스테로이드 치료제들을 대체할 수 있는 새로운 치료제들의 개발이 요구되고 있다.

발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

아토피피부염의 원인은 면역학적, 환경적, 유전적인 복합적 요인으로 인해 발생하나 그 중 유전적 및 환경적 요인에 의한 피부 장벽의 손상이 중요한 역할을 한다. 피부 장벽의 주요 구성 성분인 FLG (Filaggrin) 은 피부 장벽에서 각질층의 형성 및 자연 함습인자의 생성에 중요한 역할을 하며 아토피피부염 환자들에서 loss of mutation이 많은 것으로 보고되어 있다. FLG의 유전적 변이가 있는 경우 아토피피부염이 일찍 발생하고 임상 증상이 심하며 알러지 행진으로 진행할 가능성이 높은 것으로 알려져 있다. 최근 피부 장벽의 적절한 회복이 염증반응을 줄이고 알러지 감작을 줄여 아토피피부염의 발생 및 알러지 행진으로의 진행을 억제할 수 있다는 보고가 나오고 있다. 하지만 아직까지 FLG의 발현을 직접적으로 조절하여 아토피피부염의 치료에 쓰일 수 있는 약제 또는 화장료 조성물은 개발되어 있지 않다. 나아가, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환에 효과적인 항알러지 약학 조성물의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 특히, 현재 이용되고 있는 스테로이드성의 아토피피부염 치료제들은 이용에 따른, 다양한 부작용들이 알려져 있다. 이에 따라, 이를 대체할 수 있는 새로운 치료물질에 대한 개발이 매우 중요할 수 있다.

이에, 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는 항알러지 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 피부 건조증, 피부 장벽 기능 이상의 개선과 동시에 항알러지, 항염증 효과를 나타낼 수 있는, ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, ZAG를 포함하는, 약학 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 약학 조성물을 개체에 투여하여, 알러지 반응을 억제하거나, 알러지 질환의 증상을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 약학 조성물을 개체에 투여하여, 알러지 반응 또는, 알러지 질환에 따른 이상 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 발명자들은 FLG의 활성을 연구하던 중, ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질과 FLG 단백질의 발현 위치가 유사하며 이들의 발현량에 상호관계가 있음을 처음으로 밝혀 내었다.

나아가, 본 발명의 발명자들은 ZAG 단백질을 표피에 처리함으로써 FLG 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 처음 발견하고, 이를 이용하여 ZAG 단백질을 표피에 처리함으로써 증가된 FLG 유전자의 발현 및 FLG 단백질이 피부 장벽의 손상을 예방하거나 손상을 회복시킬 수 있음을 처음으로 밝혀내어 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

현재까지 ZAG 단백질의 FLG 유전자 활성화 기능 및 피부 장벽 회복 능력에 관해서는 알려진 바가 없다. 본원 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물들은 FLG 유전자의 발현을 증가시킨다.

한편, 알러지성 질환은 과민증 (anaphylaxis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 천식 (asthma), 아토피피부염, 곤충알러지, 식품알러지, 약품알러지 및 두드러기 (urticaria) 중 적어도 하나일 수 있다.

바람직하게, 알러지성 질환은 아토피피부염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서의 약학 조성물들은 특히 아토피피부염에 있어서, 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상을 개선에 대한 효과가 있고, 이에 따라 보습효과 또한 우수한 것으로 확인되었다.

나아가, 본 발명의 발명자들은 ZAG 단백질을 표피에 처리함으로써 다양한 면역 반응 및 이에 따른 염증 반응과 연관된 Th2 세포뿐만 아니라 다양한 염증성 사이토카인의 수준, 히스타민의 수준을 낮출 수 있다는 것을 발견하였다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 ZAG 단백질이 면역 조절세포인 Treg 세포 (regulatory T cell) 의 수준을 증가시키는 것을 발견하였다.

여기서, 염증성 사이토카인과 Treg 세포는 알러지성 질환 특히, 아토피피부염의 진행과 연관될 수 있다. 특히, 본 발명의 발명자들은 아토피피부염 환자의 혈액내에서는 Th2 세포가 분비하는 IL-4, IL-5 및 IL-13의 수준과 Th17 세포가 분비하는 IL-17의 수준이 크게 증가하는 것을 발견하였다. 이때, IL-17의 수준의 증가는 면역학적 이상의 특징 중 하나일 수 있다. 따라서, 염증성 사이토카인의 발현 수준을 낮추는 기작, 특히 Th2 세포, Th17 세포성 사이토카인의 수준을 낮추는 것은 염증 반응을 억제하고, 아토피피부염 나아가, 알러지성 질환의 예방과 치료에 있어서, 핵심일 수 있다.

나아가, Treg 세포는 아토피피부염의 병변 부위에서 정상인에 비하여 감소될 수 있다. 이때, Treg 세포는 면역 조절세포로서 Th1, Th2, Th17 세포에 작용하는 수지상세포의 프라이밍 (priming) 역할 뿐 아니라 염증반응을 억제 시키고, 직접적으로 알러지 항원 특이 Th2 세포의 활성을 억제 시킴으로써 알러지 반응의 작동기 단계 동안 필수 사이토카인인 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성을 최소화 시킬 수 있다. 또한, Treg 세포는 비만 세포와 호염기구, 호산구에 직접 작용하여 알러지 염증을 억제 시키고 조직 세포와 상호작용 함으로써 조직 재구성에 중요한 역할을 할 수 있으며, B 세포에 직접 영향을 가하여 알러지 항원-특이 IgE의 생성을 억제하고 IgG4의 생성을 유도할 수 있다. 따라서, Treg 세포의 기능을 항진시키거나 이의 수준을 증가시키는 기작은 면역반응, 또는 이에 의한 염증 반응을 억제하는 데 있어 중요할 수 있다. 나아가, 이러한 기작은 알러지성 질환, 구체적으로 아토피피부염의 예방과 치료에 있어서, 중요할 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 발명자들은 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 조절할 수 있는 ZAG 단백질이 알러지성 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 항알러지 약학 조성물로 제공될 수 있음을 인지하였다.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따르면, ZAG를 포함하는 항알러지 약학 조성물, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 다양한 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항알러지 약학 조성물은 과민증 (anaphylaxis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 천식 (asthma), 아토피피부염, 곤충알러지, 식품알러지, 약품알러지 및 두드러기 (urticaria) 를 포함하는 알러지성 질환을 예방하거나 치료하는데 이용할 수 있다. 보다 바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물은 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물로서 이용되는 것에 효과적일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 ZAG를 포함하는 약학 조성물들은 염증성 사이토카인의 수준을 낮춤으로써 염증 반응을 억제할 수 있고, 이에, 염증성 피부질환, 특히 아토피피부염에 효과적일 수 있다.

나아가, 본 발명의 발명자들은 ZAG 단백질은 피부 장벽의 주요 구성 성분인 FLG 유전자의 발현 및 단백질의 수준을 증가시키는 것을 확인 하였다. 여기서, FLG는 피부 장벽에서 각질층의 형성 및 자연함습인자의 생성에 중요한 역할을 할 수 있다. 이에, 본 발명의 발명자들은 ZAG 단백질의 처리에 따라, 증가된 FLG 유전자의 발현 및 FLG 단백질이 피부 장벽의 손상을 예방하거나 손상을 회복시킬 수 있음을 처음으로 밝혀내어 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

이상의 ZAG 단백질을 포함하는 본 명세서에서의 다양한 약학 조성물들은 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상을 개선의 효과뿐만 아니라 항알러지, 항염증 효과를 나타낸 것에 의의가 있다. 특히, 다양한 염증성 피부질환에 대한 치료제로서 이용될 수 있는 스테로이드성 연고는 이의 이용에 따라 피부 건조증이 나타날 수 있다. 이에, ZAG 단백질을 포함하는 본 명세서에서의 다양한 약학 조성물들은 보습효과를 갖는 약학 조성물을 제공하여, 기존의 스테로이드성의 연고보다 우수한, 새로운 항염증제, 나아가 아토피피부염 치료제의 개발에 기여할 수 있다. 예를 들어, ZAG 단백질을 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물은 아토피피부염의 임상적 증상 중 하나인, 피부 건조증을 개선과 동시에 염증반응을 억제할 수 있는, 다 기능성 아토피피부염 치료제, 나아가 항염증제로서 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 사용되는 ZAG 단백질은 효모, 식물 또는 동물 유래의 모든 ZAG 단백질을 포함하고, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 ZAG 단백질을 포함한다. 야생형 (wild type) 의 ZAG 단백질을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물에서의 ZAG 단백질은 FLG 유전자의 발현을 촉진하는 기능을 하는 한 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 ZAG 단백질의 변이체를 포함한다. 하나의 구체적 예시로서, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물들에서의 ZAG 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 ZAG 단백질일 수 있으며, 이러한 서열의 치환, 삽입, 결실 변이체도 본 발명의 다양한 실시예에서의 약학 조성물에 사용할 수 있다.

ZAG 단백질의 변이체란 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 삽입은 통상적으로 약 1개 내지 20개 아미노산의 연속 서열로 이루어지나, 보다 큰 삽입도 가능할 수 있다. 결실은 통상적으로 약 1개 내지 30개의 잔기로 이루어지나, 일부의 경우에는 도메인중 하나가 결실될 수 있는 것과 같이 보다 큰 결실 또한 가능할 수 있다. 이런 변이체는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2d Ed., 1989). 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

또한, ZAG 단백질은 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 수식 (modification) 될 수도 있다.

상기 변이체 또는 수식체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이나, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질이다.

ZAG 단백질은 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 달리는, ZAG 단백질의 서열이 밝혀져 있으므로 화학적 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, ZAG를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 ZAG가 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 ZAG를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.

ZAG 단백질을 발현시키기 위한 발현벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 다 사용할 수 있다. 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 사용될 수 있는 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 이중 이. 콜라이가 가장 일반적으로 사용된다. 또한, 진균 (예를 들어, 아스페르길러스 (Aspergillus), 효모 (예를 들어, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은, ZAG 단백질을 함유하는 것에 더하여, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 멸균 주사 용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 바람직하게는 외용 연고, 로션 등과 같은 반고형 제제로 제조될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 개별 치료제로 도포하거나 다른 치료제와 병용하여 도포될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제로 제조되는 경우, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 1 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물이 비경구 투여를 위한 제제로 제조되는 경우, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등이 포함될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물들은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물에서 ZAG은 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 중량% 내지 10 중량%일 수 있다.

바람직하게, ZAG의 농도는 상기 약학 조성물의 부피를 기준으로, 0.1 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml일 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.

그러나 이에 제한되지 않고, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 대한 ZAG 단백질의 유효 함량, 나아가 전체 조성물의 약학 유효량, 유효 투여량은 상기 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있다. 나아가, 전체 조성물에 대한 ZAG 단백질의 유효 함량, 전체 조성물의 약학 유효랑, 유효 투여량은 상기 약학 조성물들의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물의 투여는 하루에 1 회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학 조성물들이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학 조성물들은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.

비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물들을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되지 아니한다.

본 발명의 상기 약학 조성물들은 보다 바람직하게는 비경구 투여 중 경피 투여, 더욱 바람직하게는 상기 약학 조성물들을 개체의 피부에 도포하는 방식으로 이루어지는 국부 투여 방식으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 "개체"는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유 동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다.

본 명세서에서 "도포"는 임의의 적절한 방법으로 개체의 피부에 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물을 접촉시키는 것을 의미하며, 이를 통해 해당 조성물을 피부 내부로 흡수시키는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 알러지성 질환을 개선시키는 방법에서 개체의 피부에 도포하는 도포량 또는 투여량은 본 발명의 상기 약학적 조성물과 관련하여 상기에서 설명한 투여량과 실질적으로 동일하므로, 중복되는 설명은 생략된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 약학 조성물을 인간을 제외한 포유 동 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 약학 조성물들은 알러지 증상 및 알러지성 질환에 따른 이상 증상을 예방, 개선 또는 치료할 수 있으며, 특히 알러지성 질환 중 아토피피부염을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 나타낸다.

보다 구체적으로, 본 발명의 상기 약학 조성물들은 피부 세포의 분화를 촉진함으로써 표피 분화의 불완전에서 비롯되는 여러 피부 질환들을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명은 ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는 다양한 조성물을 제공하고, 이를 이용하여 알러지성 질환, 특히 아토피피부염의 예방 또는 치료하는 효과를 나타낸다.

보다 구체적으로, ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는 항알러지 약학 조성물, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 알러지성 질환과 연관된 히스타민뿐만 아니라, 다양한 염증성 사이토카인의 수준, Treg 세포의 수준을 조절하는 효과를 나타낸다.

이에, ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환의 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있는 효과가 있다

구체적으로, ZAG 단백질을 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물은 FLG 유전자의 발현을 활성시키는 효능을 나타내며 이에 의해 FLG의 생성을 촉진함으로써, FLG의 감소로 인해 비롯되는 알러지성 질환을 예방하고 치료하는데 사용될 수 있다.

또한 본 발명은, 피부 건조증, 피부 장벽 이상에 대한 개선 효과를 나타내는 동시에, 항염증 효과를 나타내어, 향후 스테로이제 성분의 아토피피부염 치료제의 대체물로서 이용될 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1a는 IF (immunofluorescence) 방식으로 ZAG와 FLG의 위치와 발현량을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 1b는 정상의 인간 피부와 아토피피부염의 인간 피부에서 ZAG와 FLG의 위치와 발현량을 비교하기 위한 실험 결과들이다.
도 1c는 아토피피부염 마우스 모델에서의 ZAG와 FLG의 위치와 발현량을 나타내기 위한 실험 결과이다.
도 1d는 아토피피부염 마우스 모델에서 정상의 피부와 아토피피부염의 피부에서 ZAG와 FLG의 위치와 발현량을 비교하기 위한 실험 결과들이다.
도 2a 및 2b는 정상 마우스와 FLG가 결실된 Flanky Tail 마우스에서 ZAG의 발현량을 확인하기 위한 실험 결과들이다.
도 3a 내지 3b는 ZAG를 녹다운 (knockdown) 시킨 각질형성세포 (Keratinocyte) 에서 ZAG, FLG의 발현량을 RT-Q-PCR 및 면역형광염색 방식으로 확인하기 위한 실험 결과들이다.
도 4는 아토피피부염 유발 사이토카인인 TSLP와 보습제의 한 성분인 caffeic acid, hydroxydecine 에 의한 ZAG의 발현량 변화를 확인하기 위한 실험 결과들이다.
도 5a 및 5b는 H&E 염색 방식으로 정상군과 ZAG를 녹다운 시킨 3D-SKIN에서 rhZAG를 처리한 후의 효과를 나타내는 실험 결과들이다.
도 5c는 면역형광염색 방식으로 ZAG를 녹다운 시킨 3D-SKIN에서 rhZAG를 처리한 후의 ZAG의 발현량을 확인하기 위한 실험 결과들이다.
도 5d는 RT-Q-PCR 방식으로 3D-SKIN에서 rhZAG를 처리한 후 FLG과 ZAG 유전자의 발현량을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 6a는 정상의 피부 모델, 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델에서의 조직학적 분석결과를 나타내는 실험결과이다.
도 6b는 정상의 피부 모델, 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델에서의 피부염 발생점수 및 TEWL의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다.
도 6c는 정상의 피부 모델, 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델내의 혈청에서의 IgE의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다.
도 6d는 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델내의 림프절에서의 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다.
도 6e는 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델내의 비장에서의 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다.
도 7a는 ZAG 처리에 따른, B 림프구 세포주에서의 IgE의 수준을 나타내는 실험결과이다.
도 7b는 ZAG 처리에 따른, 호염구/비만 세포주에서의 히스타민 및 염증성 사이토카인의 수준을 나타내는 실험결과이다.
도 7c는 ZAG 처리에 따른, 대식세포주에서의 염증성 사이토카인의 수준을 나타내는 실험결과이다.
도 7d는 ZAG 처리에 따른, 각질형성세포주에서의 염증성 사이토카인의 수준을 나타내는 실험결과이다.
도 7e는 ZAG 처리에 따른, B 림프구 세포주, 호염구/비만 세포주, 대식세포주 및 각질형성세포주의 세포증식 효과를 나타내는 실험결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

이하에서는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 ZAG에 대한 알러지성 질환의 개선 효과를, 아토피피부염의 피부, FLG 결실, ZAG 녹다운된 각질형성세포 등을 예시로 들어 설명하나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 알러지상 질환의 증상 개선은 ZAG 단백질에 의해 FLG이 증가하는 한 넓은 범위로 적용될 수 있다.

또한, 이하에서는 NHEK (normal human epidermal keratinocyte), HaCaT, RPMI 1788, RBL-2H3 및 Raw 264.7세포를 예시적으로, 다양한 실시예에 따른 조성물에 대한 항알러지 효과를 설명하지만, 이에 제한되지 않고 본 발명의 조성물은 알러지와 연관된 다양한 세포, 더 나아가 알러지와 연관된 다양한 반응을 나타내는 개체에 대하여 알러지 반응의 억제 효과가 있을 수 있다.

실시예 1: 아토피피부염 피부에서의 ZAG 단백질 및 FLG의 발현량 분석

아토피피부염에서의 ZAG 단백질의 기능을 분석하기 위해 정상의 인간 피부와 아토피피부염의 피부에서 면역형광염색 (immunofluorescence) 방식으로 ZAG 단백질과 FLG 단백질을 각각 염색하였다. 도 1a의 (a) - (e) 를 참조하면, 정상의 인간 피부에서의 DAPI (청색), ZAG (녹색: FITC) 및 FLG (적색: alexa633) 이 도시된다. 정상의 인간 피부에서는 ZAG와 FLG이 위쪽 과립층 (granular layer) 에 발현된다. 도 1b의 (a) 에서는 정상의 인간 피부 (HC) 와 아토피피부염의 피부 (HAD) 를 비교하여 도시한다. 정상의 인간 피부 (HC) 와 비교하여 아토피피부염의 피부 (HAD) 에서 FLG와 ZAG의 발현량이 현저하게 감소된다. 도 1b의 (b) 에서는 피부 장벽과 각질형성세포 분화와 연관된 단백질인 IVL (Involurine) 과 TGase1을 IF 방식으로 염색하였다. IVL과 TGase 1도 모두 감소하였다. 도 1b의 (c) 에서는 도 1b의 (a) 에서의 형광 강도를 측정하였으며, 아토피피부염의 피부 (HAD) 에서 FLG와 ZAG의 발현량이 정상의 피부 (HC) 와 비교하여 약 절반으로 나타난다.

도 1c와 1d에서는 아토피피부염에서의 ZAG 단백질의 기능을 분석하기 위해 정상의 NC/Nga 마우스 피부와 아토피피부염 유발 NC/Nga 마우스 피부에서 IF 방식으로 ZAG 단백질과 FLG 단백질을 각각 염색하였다. 아토피피부염 유발 NC/Nga 마우스 피부 (AD) 모델의 설정을 위해, 먼저 NC/ Nga 마우스의 등쪽의 털을 완전히 제거한 후, 200 μl의 4% SDS (sodium dodecyl sulfate) 용액을 도포하여 마우스의 피부장벽을 무력화한다. SDS 도포 2시간 후, 100 mg의 DfE (D. farinae body extract) 를 마우스의 피부에 도포한다. 이상의 과정을 일주일에 2번씩, 6주동안 반복하여 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 모델을 설정한다.

도 1c의 (a) - (d) 를 참조하면, 정상의 마우스 피부에서의 ZAG (녹색) 및 FLG (적색) 이 도시된다. 도 1d의 (a) 에서는 정상의 마우스 피부 (NL) 와 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 를 비교하여 도시한다. 정상의 마우스 피부 (NL) 와 비교하여 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 에서 FLG와 ZAG의 발현량이 현저하게 감소된다. 도 1d의 (b) 에서는 도 1d의 (a) 에서의 형광 강도를 측정하였으며, 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 에서 FLG와 ZAG의 발현량이 정상의 마우스 피부 (NL) 와 비교하여 약 절반으로 나타난다.

실시예 2: FLG이 결실된 Flanky Tail 마우스에서의 ZAG 발현량 분석

ZAG와 FLG의 기능적 상호 작용을 확인하기 위해 정상의 B6 마우스의 피부와 FLG이 결실된 Flanky Tail 마우스에서 면역형광염색 방식으로 DAPI (청색), ZAG (녹색) 및 FLG (적색) 을 각각 염색하였다. 도 2a 및 도 2b를 참조하면, 정상의 B6 마우스의 피부 (정상 B6 Mouse, 도 2b의 a-1, a-2) 보다 FLG이 결실된 Flanky Tail 마우스의 피부 (Flanky Tail mouse, 도 2b의 b-1, b-2) 에서 ZAG 및 FLG의 발현량이 감소하였다.

실시예 3: ZAG를 낙다운시킨 각질형성세포 (keratinocytes) 및 TSLP를 처리한 각질형성세포에서 FLG의 발현량 분석

ZAG와 FLG의 기능적 상호 작용을 확인하기 위해 대조군으로 각질형성세포에 Scramble siRNA (25 nM, 48hr) 를 처리하고, 실험군으로 각질형성세포에 ZAG siRNA (25 nM, 48hr) 를 처리하였다. 도 3a의 (a) 를 참조하면, RT-q-PCR을 통해 48시간 이후에 Scramble siRNA를 처리한 Control에 비해 ZAG siRNA를 처리한 대조 군에서 ZAG 유전자의 발현량이 현저하게 감소하여 녹다운된다. 도 3a의 (b) 를 참조하면, 면역형광염색 방식을 통해 ZAG와 FLG이 대조군 (SC siRNA 처리 각질형성세포) 에 비해 실험군 (ZAG siRNA 처리 각질형성세포) 에서 감소된다. 도 3b에서는 RT-q-PCR 방법을 통하여 대조군에비해 실험군에서 ZAG 와 FLG 유전자 발현이 감소된다.

실시예 4: 아토피피부염과 연관된 피부 장벽 붕괴에 대한 ZAG의 기능 분석

정상 각질형성세포에 TSLP를 처리하여 아토피피부염과 연관된 피부 장벽 붕괴를 재현하였다. 도 4의 (a) 와 (b) 를 참조하면, TSLP 처리 후 ZAG 유전자 및 단백질의 발현량이 다소 감소하였고 각질형성세포의 분화를 촉진하는 것으로 알려진 카페산 (caffeic acid) 와 hydroxydesin 각각을 추가로 처리하였을 때, ZAG의 발현량이 증가한다.

HaCaT에 집먼지 진드기 항원 (DfE) 를 처리하여 아토피피부염과 연관된 피부 장벽 붕괴를 재현하였다. 도 4의 (c) 를 참조하면, 집먼지 진드기 항원을 처리했을 때 ZAG 단백질의 발현량이 다소 감소하였다.

실시예 1 내지 4를 참조하면, ZAG의 발현량과 FLG의 발현량에는 비례적 관계가 있음을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 발명자들은 이에 착안하여 알러지성 질환이 발병된의 경우 ZAG 및/또는 FLG의 발현량이 감소될 수 있으므로, ZAG 단백질을 처리함으로써 FLG의 발현량을 증가시키고 활성화시킬 수 있다는 점을 발견하였다. 이에 본 발명의 발명자들은 아토피피부염 사이토카인인 TSLP와 아토피피부염 원인 항원인 집먼지 진드기에 의해 ZAG의 발현이 감소하며 ZAG 단백질의 처리는 FLG의 발현량 증가시킬 수 있음을 발견하고, 알러지성 질환의 증상을 개선시킬 수 있으며, 보다 구체적으로는 알러지성 질환의 아토피피부염의 증상 중 하나인 피부 건조증을 완화시킬 수 있는, ZAG를 포함하는 약학 조성물을 발명하였다.

실시예 5: 3D-SKIN에서 scrambled siRNA를 처리한 그룹과 ZAG siRNA를 처리하고 rhZAG를 처리한 후의 피부 건조증의 완화, 피부 장벽 기능 개선 및 아토피피부염 증상 완화 평가

1번 그룹 (NL) 은 3D-SKIN (Tego science사의 Neoderm ED) 을 1주일간 배양시켰다. 2번 그룹 (Scrambled siRNA) 은 3D-SKIN에 Scrambled siRNA를 포함하는 배지를 2일마다 갈아주며 1주일간 배양시켰다. 3번 그룹 (ZAG siRNA) 은 3D-SKIN에 ZAG siRNA를 포함하는 배지를 2일 마다 갈아주며 1주일간 배양시켰다. 4번 그룹 (ZAG siRNA + rhZAG) 은 3번 그룹과 동일하게 ZAG siRNA를 포함하는 배지를 2일 마다 갈아주며 1주일간 배양한 후, rhZAG (human recombinant ZAG 40㎍) 을 처리하고 7일 후 파라핀 블록을 제작하였다. 각각의 그룹은 3개의 샘플로 제작되었으며, H&E 염색하여 촬영하였다.

도 5a를 참조하면, 1번 그룹 (NL) 의 모든 샘플에서 상부의 표피와 하부의 진피가 굵고 선명하게 나타나며, 2번 그룹 (Scarmbled siRNA) 에서도 마찬가지로 표피와 진피가 견고하며 선명하게 나타난다. 도 5b를 참조하면, 3번 그룹 (ZAG siRNA) 에서는 진피와 표피에 간극이 발생하고 진피와 표피의 양이 1번 및 2번 그룹과 비교하여 상대적으로 감소한다. 한편, rhZAG를 처리한 4번 그룹에서는 ZAG가 낙다운되었음에도 불구하고 3번 그룹과는 다르고 1번 그룹과 2번 그룹과 같이 진피와 표피 사이의 간극이 없어지고 진피와 표피의 양이 증가한다. RhZAG를 처리했을 때 피부 장벽이 ZAG가 감소되었을 때보다 개선된다.

도 5c는 상기 3D-SKIN 군들을 면역형광염색 방식으로 DAPI (청색), ZAG (녹색) 및 FLG (적색) 을 염색한 후 촬영한 결과이다. 도 5c를 참조하면, Scrambled siRNA를 처리한 군에서는 ZAG와 FLG 모두 관찰되며, ZAG siRNA를 처리한 군에서는 ZAG와 FLG 모두 감소된다. rhZAG를 처리한 후에는 ZAG와 FLG모두 발현량이 증가한다.

도 5d는 상기 3D-SKIN에서 1번 및 2번 정상 그룹 (NL) 과 3D-SKIN에 ZAG를 13㎍ 처리한 3번 그룹 그리고 ZAG를 40㎍ 처리한 4번 그룹에서 FLG 유전자와 ZAG 유전자의 발현량을 RT-q-PCR 방식으로 확인한 것이다. 도 5d를 참조하면, 1번 정상 그룹 (1. NL) 과 비교하여 rhZAG를 정상 혈중 농도인 40㎍을 처리한 4번 그룹에서 FLG과 ZAG 유전자가 증가한다.

실시예 6: ZAG를 처리한 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 에 대한 평가

본 평가를 위해, 실시예 1에 전술된 방법과 동일한 방법으로 설정한 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 모델과 정상의 마우스 피부 (NL) 을 이용한다. 이때, 대조군으로는, 무처리 대조군의 NL 및 처리 대조군의 AD1과 AD2를 설정하고 실험군으로는, AD 모델에 총 12 ㎍/ml ZAG를 처리한 AD3, AD 모델에 총 24 ㎍/ml ZAG를 처리한 AD4 및 AD 모델에 48 ㎍/ml ZAG를 처리한 AD5를 설정한다. 구체적으로, AD1은 AD 모델 이고, AD2는 AD 모델에 ZAG의 vehicle로 이용하는 글리세롤을 함께 처리한 모델이다. AD3는 AD 모델에 50%의 글리세롤에 녹아있는 ZAG 1 ㎍/ml을 일주일에 두 번, 6 주 동안 처리한 모델이고, AD4는 AD 모델에 50%의 글리세롤에 녹아있는 ZAG 2 ㎍/ml을 일주일에 두 번, 6 주 동안 처리한 모델이며 AD5는 AD 모델에 50%의 글리세롤에 녹아있는 ZAG 4 ㎍/ml을 일주일에 두 번, 6 주 동안 처리한 모델이다.

도 6a는 정상의 피부 모델, 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델에서의 조직학적 분석결과를 나타내는 실험결과이다. 이때, H&E 염색을 이용하여 표피층을 염색하였다. 도 6a를 참조하면, 처리 대조군의 AD1 그룹과 AD2 그룹은 무처리 대조군의 NL과 대조적으로 표피층이 두꺼워진 것을 알 수 있다. 또한, ZAG를 처리한 AD3 그룹, AD4 그룹 및 AD5 그룹은 AD1 그룹 및 AD2 그룹과 대조적으로 표피층이 얇아진다. 특히, AD3 그룹의 표피층은 무처리 대조군인 NL과 유사한 수준으로 얇아진다. 이에, ZAG를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물들은 알러지성 질환의 아토피 피부염을 개선할 수 있는 효과가 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 표피층을 정상으로 회복시킬 수 있어, 아토피피부염을 포함하는 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

도 6b는 정상의 피부 모델, 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델에서의 피부염 발생점수 및 경피 수분손실량 (TEWL, transepidermal water loss) 의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다. 이때, 피부염 발생점수는 SCORAD index에 따라 홍반 및 출혈, 흉터 및 각질, 부종, 탈락의 4 가지 항목에 대해 점수를 매겨 측정한다. 각 현상에 대해 0 (없음), 1 (약함), 2 (보통), 3 (심각) 으로 점수를 매기며, 총 SCORAD 점수는 이들의 합으로 계산하고, SCORAD 점수는 일주일에 한 번 측정한다. 나아가 TEWL의 측정은 제모된 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 모델의 등과 목 부위에 대한 피부장벽의 손상도를 테와미터 (Tewameter) TM210 장비를 이용함으로써 수행된다. 도 6b를 참조하면, 처리 대조군의 AD1 그룹과 AD2 그룹은 무처리 대조군의 NL과 대조적으로 피부염 발생점수와 TEWL 수준이 증가한다. 이와 대조적으로, ZAG를 처리한 AD3 그룹, AD4 그룹 및 AD5 그룹은 피부염 발생 점수 및 TEWL 수준 모두 감소한다. 특히, AD3 그룹에서의 피부염 발생 점수 및 TEWL 수준은 나머지 실험군의 AD4 그룹 및 AD5 그룹에 비하여 큰 폭으로 감소한다. 즉, 아토피피부염 모델에 총 12 ㎍/ml의 ZAG를 처리한 AD3에서 피부염 발생점수 및 TEWL 수준은 큰 폭으로 낮아진다. 이에, ZAG를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에서의 조성물들은 피부염 발생점수를 낮추며, 수분 손실량을 줄일 수 있어, 아토피피부염에 대한 개선의 효과가 있을 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 피부염 발생점수 및 TEWL 수준을 낮춤으로써, 아토피피부염을 포함하는 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

도 6c는 정상의 피부 모델, 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델내의 혈청에서의 IgE의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다. 이때, 6개의 그룹 (NL, AD1, AD2, AD3, AD4 및 AD5) 의 마우스로부터 혈청을 이용한다. 구체적으로, IgE의 수준의 측정을 위해, 마우스로부터 100 μl의 혈액을 채혈하고, 이를 원심분리하여 혈청을 수득한다. 수득한 혈청은 분석 하루 전, 96-웰 플레이트상에 포획 항체 (capture antibody) 를 코팅하여 4 ℃ 에 보관한다. 이후 분석을 위해, 보관된 혈청을 워싱 버퍼 (PBS with 0.05% Tween20) 로 세척한 후 1X assay diluent로 상온에서 1시간 처리한 뒤, 1:100으로 희석한 혈청 샘플을 처리한다. 그 다음, 처리 혈청을 세척한 후, 세척한 혈청에 검출 항체 (detection antibody) 를 상온에서 1시간 처리한다. 여기에 Avidin-HRP를 30분간 처리하면 혈청이 발색된다. 혈청에 TMB를 10분간 처리한 후, 동량의 stop solution (KPL) 을 넣어줌으로써, 혈청의 발색이 중단된다. 이후 마이크로플레이트 리더 (microplate reader) 를 이용하여, 450nm 파장에서 발색된 혈청의 흡광도를 측정하여 IgE의 수준을 측정한다. 도 6c를 참조하면, 처리 대조군의 AD1 그룹과 AD2 그룹은 무처리 대조군의 NL과 대조적으로 IgE의 수준이 3주차까지 유의하다 증가하다가 4주차에 감소하는 경향을 보인다. 그리고 IgE의 수준은 다시 6주차까지 지속적으로 증가한다. 이와 대조적으로, ZAG를 처리한 AD3 그룹, AD4 그룹 및 AD5 그룹은 처리 대조군에 비하여 IgE의 수준이 작은 폭으로 증가한다. 나아가, AD3 그룹, AD4 그룹 및 AD5 그룹은 AD1 그룹 및 AD2 그룹과 마찬가지로 3주차에 IgE의 수준이 큰 폭으로 증가한다. 그러나, 4주차에 다시 이의 수준이 유의하게 감소한다. 이에, 히스타민의 분비와 관련 있는 IgE의 수준이 감소함에 따라, ZAG를 포함하는 본 발명의 조성물들은 항알러지 효과가 있을 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 면역반응을 조절함으로써, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

도 6d는 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델내의 림프절에서의 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다. 도 6e는 아토피피부염의 피부 모델, ZAG를 처리한 아토피피부염 피부 모델내의 비장에서의 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 측정한 결과를 나타내는 실험결과이다. 이때, 림프절에서의 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 측정하기 위해, 6개의 그룹 (NL, AD1, AD2, AD3, AD4 및 AD5) 의 마우스로부터 림프절을 적출한 뒤, 40 μm의 메쉬에 적출한 림프를 갈아 단일세포를 수득한다. 나아가, 비장에서의 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 측정하기 위해, 5개의 그룹 (AD1, AD2, AD3, AD4 및 AD5) 의 마우스로부터 비장을 적출한 뒤, 40 μm의 메쉬에 적출한 비장을 갈아 단일세포를 수득한다. 비장의 단일세포의 경우, 적혈구 용해 용액 (Sigma-Aldrich, 8.3　g/L ammonium chloride in 0.01　M Tris-HCl buffer) 을 상온에서 5분간 처리하여 적혈구를 제거한다. 이렇게 수득한 림프절 및 비장의 단일세포는 항-마우스 CD3와 -CD28이 코팅된 플레이트에서 배양한다. 두 세포 내에 존재하는 인자 염색을 위해, 배양된 두 세포는 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), ionomycin, monensin이 포함된 Cell Stimulation Cocktail로 6시간 내지 16시간 동안 처리된다. 그 다음, 두 세포는 fixable viability dye로 4 ℃에서 30 분간 염색된 후 세척 된다. 이후, 두 세포에서 형광 표지된 항-마우스 CD4, CD8, CD25항체와 형광 표지 된 항-마우스 IL-4, IL-10, IL-17 및 Foxp3이 염색된다. 이들 염증성 사이토카인과 Treg 세포의 수준은 BD LSR FortessaTM flow cytometer 장비로 형광도를 측정하고, FlowJo Software로 결과를 분석한다. 도 6d를 참조하면, 림프구내의 염증성 사이토카인인 IL-4, IL-13, IL-17 및 IFN-γ의 수준은 처리 대조군과 대조적으로 ZAG를 처리한 AD3 그룹, AD4 그룹 및 AD5 그룹에서 유의하게 감소한다. 나아가, Th2 세포의 활성을 억제시킴으로써 알러지 반응 기작에 필수인 염증성 사이토카인의 생성을 최소화할 수 있는 Treg 세포의 수준은, 처리 대조군과 대조적으로 ZAG를 처리한 AD3 그룹, AD4 그룹 및 AD5 그룹에서 유의하게 증가한다. 도 6e를 참조하면, 비장 내의 염증성 사이토카인인 IL-4, IL-13 및 IL-17의 수준은 처리 대조군과 대조적으로 ZAG를 처리한 AD3 그룹, AD4 그룹 및 AD5 그룹에서 유의하게 감소한다. 나아가, Treg 세포의 수준은 처리 대조군과 대조적으로 ZAG를 처리한 AD3 그룹과 AD4 그룹에서 유의하게 증가한다. 이에, ZAG 단백질을 포함하는 본 발명의 다양한 실시예의 조성물들은 항염증 반응, 나아가 항알러지 반응과 연관이 있는, 염증성 사이토카인의 수준을 낮출 수 있어, 항알러지 약학 조성물 더 나아가, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물로서 제공될 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 염증반응과 면역반응을 조절함으로써, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

이상의 실시예 6의 결과로, 아토피피부염 유발 마우스 피부 (AD) 모델에 대하여 ZAG단백질을 처리했을 때, 피부염 점수, 경피 수분 손실량이 줄어드는 효과를 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, AD 모델에 ZAG 단백질 처리했을 때 면역반응, 나아가 염증반응과 연관이 있는 IgE, IL-4, IL-13, IL-17 및 IFN-γ의 수준이 감소하였으며, 면역 조절세포인 Treg 세포의 수준의 증가하였다. 여기서 IgE와 IL-4, IL-13은 아토피피부염의 발생에 따라, 아토피피부염 환자의 혈액 내에서 수준이 높아질 수 있다. 또한, 면역 조절능의 Treg 세포는 알러지성 질환을 가진 환자에게서 감소될 수 있다. 따라서, 이들의 수준을 조절하는 ZAG 단백질을 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물 및 항알러지 약학 조성물은 아토피피부염의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 다양한 실시예에서의 조성물들은 염증반응과 면역반응을 조절함으로써, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

나아가 ZAG을 포함하는 본 발명의 다양한 약학 조성물들은 피부의 수분 손실량을 줄임으로써 보습 효과를 부여하는 동시에, 면역반응과 이에 따른 염증반응을 억제함으로써 아토피피부염에 대한 실질적인 치료 효과를 나타낸다. 이에 따라, 본 발명의 약학 조성물들은 기존의 아토피피부염, 알러지성 질환의 치료제로 이용되던 스테로이드성 약제들을 대체할 수 있는 새로운 치료제로 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 약학 조성물들은 보습 효과를 갖는, 아토피피부염 치료제, 나아가 항염증제로 이용될 수 있어, 스테로이드성 약제의 단점을 극복할 수 있을 것으로 사료된다.

또한, 실시예 6의 결과에서 전반적으로 12 ㎍/ml (약 0.1 ㎎/kg) 내지 24 ㎍/ml (약 0.2 ㎎/kg) 의 ZAG 단백질을 처리했을 때 아토피피부염 모델에 대하여 효과적일 수 있다. 따라서, 이의 결과를 고려하여 본 발명의 다양한 실시예에서의 조성물들에 대한 ZAG 단백질의 비율을 결정할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 조성물의 제형, 개체의 알러지성 질환의 진행 정도, 목적 부위등에 따라 당업자에 의해 용이하게 조절될 수 있다.

실시예 7: ZAG를 처리한 면역세포에 대한 평가

본 평가를 위해, B 림프구 세포주, 호염구/비만 세포주, 대식세포주 및 각질형성세포주의 면역세포를 이용한다. 보다 구체적으로, B 림프구 세포주로는 RPMI 1788 세포를, 호염구/비만 세포주로는 RBL-2H3 세포를, 대식세포주로는 Raw 264.7 세포를 이용하여, ZAG 단백질에 대한 효과를 예시적으로 설명한다. 마지막으로, 각질형성세포주로는 NHEK 세포 및 HaCaT 세포를 이용하여, ZAG 단백질에 대한 효과를 예시적으로 설명한다. 그러나, 면역세포에 대한 ZAG 단백질의 효과는 전술한 세포들에 제한되는 것은 아니다.

도 7a는 ZAG 처리에 따른, B 림프구 세포주에서의 IgE의 수준을 나타내는 실험결과이다. IgE의 수준을 측정하기 위해, RPMI 1788 세포에 ZAG를 11 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 24시간 처리 한 후, 면역반응 유도를 위해 0.5 ㎍/ml LPS를 24 시간 처리 하고 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한다. 배양액 중 일부를 취해, human IgE ELISA kit 를 이용하여 IgE의 생성 수준을 측정한다. 도 7a를 참조하면, IgE의 수준은 LPS 단독처리 그룹에서, 아무것도 처리하지 않은 NL 그룹에 비해 증가하였고, 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 처리한 ZAG 처리 그룹 모두에서 유의하게 정상 그룹 수준으로 IgE의 수준이 유의하게 감소한다. 이의 결과로, B 림프구 세포주에서 IgE의 수준을 낮출 수 있는 ZAG를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에의 조성물들은 항알러지 효과가 있을 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 면역반응을 조절함으로써, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

도 7b는 ZAG 처리에 따른, 호염구/비만 세포주에서의 히스타민 및 염증성 사이토카인의 수준을 나타내는 실험결과이다. 먼저, 호염구/비만 세포주에서의 ZAG 단백질의 처리에 따른 히스타민 및 염증성 사이토카인의 수준을 측정하기 위해, RBL-2H3 세포에 ZAG를 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 24 시간 처리 한다. 그 다음, 면역반응 유도를 위해 PMA와 A23187를 각각 50 nM 농도로 처리 하고 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 6시간 (히스타민 수준 측정) 또는 24 시간 (염증성 사이토카인 수준 측정) 배양한다. 배양액 중 일부를 취해 히스타민 분비 수준을 assay kit를 이용하여 측정하고, ELISA kit를 이용하여 IL-6, IL-4 및 IL-13의 수준을 측정한다. 도 7b를 참조하면, 히스타민의 수준은 PMA + A23187 처리 그룹에서, 아무것도 처리하지 않은 NL 그룹에 비해 증가하였고, 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 처리한 모든 ZAG 처리 그룹에서 히스타민의 수준이 유의하게 감소한다. 나아가, IL-6, IL-4 및 IL-13의 수준은 PMA + A23187처리군보다 유의하게 감소한다. 이의 결과로, 호염구/비만 세포주에서 히스타민 및 염증성 사이토카인의 수준을 낮출 수 있는 ZAG를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에의 조성물들은 항알러지 효과가 있을 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 염증반응과 면역반응을 조절함으로써, 염증반응을 억제할뿐만 아니라 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

도 7c는 ZAG 처리에 따른, 대식세포주에서의 염증성 사이토카인의 수준을 나타내는 실험결과이다. 먼저, 대식세포주에서의 ZAG 단백질의 처리에 따른 염증성 사이토카인의 수준을 측정하기 위해, Raw 264.7 세포에 ZAG를 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 24 시간 처리 한다. 그 다음, 면역반응 유도를 위해 LPS를 0.5 ㎍/ml 농도로 처리 하고 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한다. 배양액 중 일부를 취해 ELISA kit를 이용하여 IL-6, IL-4 및 IL-13의 수준을 측정한다. 도 7c를 참조하면, IL-6, IL-4 및 IL-13의 수준은 ZAG를 처리한 모든 그룹에서 LPS 처리군보다 유의하게 감소 되었고, 특히, IL-6의 수준은 ZAG 처리 농도에 의존적으로 감소한다. 이의 결과로, 대식세포주에서 염증성 사이토카인의 수준을 낮출 수 있는 ZAG를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에의 조성물들은 항알러지 효과가 있을 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 염증반응과 면역반응을 조절함으로써, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

도 7d는 ZAG 처리에 따른, 각질형성세포주에서의 염증성 사이토카인의 수준을 나타내는 실험결과이다. 먼저, 각질형성세포주에서의 ZAG 단백질의 처리에 따른 염증성 사이토카인의 수준을 측정하기 위해, NHEK 세포 및 HaCaT 세포에 ZAG를 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 24 시간 처리 한다. 그 다음, 면역반응 유도를 위해 TNF-α 및 IFN-γ를 각각 50 ng/ml 농도로 처리 하고 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한다. 배양액 중 일부를 취해 ELISA kit를 이용하여 TARC (thymus and activation-regulated chemokine) 의 수준을 측정한다. 도 7d를 참조하면, TARC의 수준은 ZAG를 처리한 모든 그룹에서 TNF-α + IFN-γ 처리군보다 유의하게 감소되었다. 여기서, TARC는 흉선 및 활성화 조절 케모카인으로서, 아토피피부염 환자에게서 높은 수준으로 나타나는 사이토카인 중 하나이다. 이의 결과로, 각질형성세포주에서 염증성 사이토카인의 수준을 낮출 수 있는 ZAG를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에의 조성물들은 항알러지 효과가 있을 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 염증반응과 면역반응을 조절함으로써, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

도 7e는 ZAG 처리에 따른, B 림프구 세포주, 호염구/비만 세포주, 대식세포주 및 각질형성세포주의 세포증식 효과를 나타내는 실험결과이다. 본 실험은 모든 in vitro 실험에서 ZAG 처리에 따라 세포들이 정상의 세포증식능을 갖는지 확인하기 위한 실험이다. 세포 증식효과를 분석하기 위해, 먼저, RPMI 1788 세포, RBL-2H3, Raw 264.7, NHEK 세포를 준비한다. 이들 중 RPMI 1788 세포는 96-웰 플레이트에 1 x 10⁵/well이 되도록 분주하고, ZAG를 0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도 별로 처리한 후 각각 24시간과 48시간 동안 배양한다. 배양액에 WST solution (Roche) 을 10 μl 처리하고 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 3시간 내지 4시간 배양한 후 440 nm에서 흡광도를 측정한다. 나머지 RBL-2H3 세포, Raw 264.7 세포, NHEK 세포는 96-웰 플레이트에 1 x 10⁵/well이 되도록 분주하고, ZAG를 0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도 별로 처리한 후 각각 24시간과 48시간 동안 배양한 후 MTT assay를 이용하여 세포 증식능을 측정한다. 각 웰에 MTT를 첨가한 후, 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 3시간 내지 4시간 배양한 후 배양액을 제거한 후 세포에 DMSO를 첨가해 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 도 7e를 참조하면, RPMI 1788 세포, RBL-2H3 세포, Raw 264.7 세포 및 NHEK 세포 모두에서, ZAG를 0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 24시간 처리 시 세포증식효과가 80% 이상을 나타낸다. 이에 따라, 전술한 in vitro test는 ZAG 농도 0.5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 2 ㎍/ml 및 4 ㎍/ml 농도로 24시간 처리하는 것으로 결정하였다.

이상의 실시예 7의 결과로, B 림프구 세포주, 호염구/비만 세포주, 대식세포주 및 각질형성세포주의 면역세포에 대하여 ZAG 단백질을 처리했을때, IgE의 수준, 히스타민의 수준 및 염증성 사이토카인의 수준이 감소하는 효과를 확인할 수 있었다. 이는 실시예 6의 in vivo 실험의 결과와 함께, in vitro 에서도 ZAG의 효과가 입증된 분석 결과이다. 특히, 아토피피부염과 연관된 각질형성세포에서의 TARC의 수준의 감소의 결과는 ZAG 단백질이 아토피피부염의 개선에 효과적인 것을 의미할 수 있다. 이에 따라, IgE의 수준, 히스타민의 수준 및 염증성 사이토카인의 수준을 감소시키는 ZAG 단백질을 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에서의 조성물들은 아토피피부염의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물 및 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물은 염증반응과 면역반응을 조절함으로써, 아토피피부염을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다. 또한, 본 발명의 다양한 약학 조성물들, 특히 항알러지 약학 조성물은 염증반응과 면역반응을 조절함으로써, 염증 반응을 억제하고, 아토피피부염을 포함하는 다양한 알러지성 질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 있을 수 있다.

나아가, 본 발명의 약학 조성물들은 기존의 아토피피부염, 알러지성 질환의 치료제로 이용되던 스테로이드성 약제들을 대체할 수 있는 새로운 치료제로 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 약학 조성물들은 보습 효과를 갖는, 아토피피부염 치료제, 나아가 항염증제로 이용될 수 있어, 스테로이드성 약제의 단점을 극복할 수 있을 것으로 사료된다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY <120> OMPOSITION FOR IMPROVING DRY SKIN OR SKIN BARRIER FUNCTION AND COMPOSITION FOR ANTI ALLERGY <130> 16PD5771-1KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Ala Gly Gln Glu Asn 1 5 10 15 Gln Asp Gly Arg Tyr Ser Leu Thr Tyr Ile Tyr Thr Gly Leu Ser Lys 20 25 30 His Val Glu Asp Val Pro Ala Phe Gln Ala Leu Gly Ser Leu Asn Asp 35 40 45 Leu Gln Phe Phe Arg Tyr Asn Ser Lys Asp Arg Lys Ser Gln Pro Met 50 55 60 Gly Leu Trp Arg Gln Val Glu Gly Met Glu Asp Trp Lys Gln Asp Ser 65 70 75 80 Gln Leu Gln Lys Ala Arg Glu Asp Ile Phe Met Glu Thr Leu Lys Asp 85 90 95 Ile Val Glu Tyr Tyr Asn Asp Ser Asn Gly Ser His Val Leu Gln Gly 100 105 110 Arg Phe Gly Cys Glu Ile Glu Asn Asn Arg Ser Ser Gly Ala Phe Trp 115 120 125 Lys Tyr Tyr Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Glu Phe Asn Lys Glu Ile 130 135 140 Pro Ala Trp Val Pro Phe Asp Pro Ala Ala Gln Ile Thr Lys Gln Lys 145 150 155 160 Trp Glu Ala Glu Pro Val Tyr Val Gln Arg Ala Lys Ala Tyr Leu Glu 165 170 175 Glu Glu Cys Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Leu Lys Tyr Ser Lys Asn 180 185 190 Ile Leu Asp Arg Gln Asp Pro Pro Ser Val Val Val Thr Ser His Gln 195 200 205 Ala Pro Gly Glu Lys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Ala Tyr Asp Phe Tyr 210 215 220 Pro Gly Lys Ile Asp Val His Trp Thr Arg Ala Gly Glu Val Gln Glu 225 230 235 240 Pro Glu Leu Arg Gly Asp Val Leu His Asn Gly Asn Gly Thr Tyr Gln 245 250 255 Ser Trp Val Val Val Ala Val Pro Pro Gln Asp Thr Ala Pro Tyr Ser 260 265 270 Cys His Val Gln His Ser Ser Leu Ala Gln Pro Leu Val Val Pro Trp 275 280 285 Glu Ala Ser 290

Claims

ZAG(Zinc-alpha-2-glycoprotein)를 포함하는, 항 알러지 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ZAG는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된, 항 알러지 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 ZAG의 농도는 상기 약학 조성물의 부피를 기준으로, 0.1 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml인, 항 알러지 약학 조성물.
ZAG(Zinc-alpha-2-glycoprotein)를 포함하는, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
상기 ZAG는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
상기 알러지성 질환은, 과민증 (anaphylaxis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 천식 (asthma), 아토피피부염, 곤충알러지, 식품알러지, 약품알러지 및 두드러기 (urticaria) 중 적어도 하나인, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
상기 알러지성 질환은, 아토피피부염인, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
상기 ZAG의 농도는 상기 약학 조성물의 부피를 기준으로, 0.1 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml인, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물.
제4항 내지 8항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하고,
상기 개체는 인간을 제외한 포유 동물인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법.
제9항에 있어서,
상기 ZAG가 도포된 개체의 염증성 사이토카인의 수준은, 상기 ZAG가 도포되지 않은 무처리 개체에 비하여 1.2 배 내지 2 배 감소된 수준인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법.