KR102105412B1 - 항암 활성을 갖는 크로만 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암 활성을 갖는 크로만 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 (I)로 표현되는 항암 활성을 갖는 크로만 화합물, 이를 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암 보조용 약학 조성물에 관한 것이다.
Figure 112018060773624-pat00006
화학식(I)

Description

항암 활성을 갖는 크로만 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물{A chroman compound having anti-cancer effect and pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the same}
본 발명은 항암 활성을 갖는 크로만 화합물 및 이를 유효 성분으로 포함하는 효과적인 암 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
급속도로 변화하는 현대 사회에서 잘못된 생활 습관에 따른 암, 고혈압, 협심증, 당뇨, 비만, 심근경색 등 다양한 생활습관병으로 많은 현대인들은 건강에 위협을 받고 있다. 세계보건기구의 통계자료에 따르면 생활습관병 중에서도 암은 전 세계적으로 사망률 1위로 현대인들의 생명을 위협하고 있는 현실이며 앞으로도 암으로 인한 사망률은 계속적인 증가를 보일 것으로 추정되고 있다.
특히, 현대인들이 과도한 스트레스와 운동량 부족, 육류 위주의 식습관 변화로 인해 다양한 생활습관 질환의 발병율이 높아지고 있으며, 그 중 2017년 통계청에 따르면 사망률이 높은 5대 암 중 대장암이 조사 이래 최초로 위암을 제치고 3위로 오를 만큼 대장암에 의해 사망하는 환자 수가 급증하고 있다. 대장암은 초기 증상이 평이하여 인지하지 못하는 경우가 많고 발견되었을 때 이미 많이 진행된 경우가 많다.
한편, 현대 의학의 발전과 다양한 의약품의 개발에도 불구하고 현재까지 사용되어온 항암제는 부작용 및 내성이 형성됨으로써 그 사용이 제한적이었다. 이러한 합성의약품 부작용 문제점의 대안으로, 천연물의 약리적 효과를 기본으로 하는 천연물 유래 항암제 개발에 관심이 높아지고 있다. 그러나 천연물 역시 고농도로 사용하게 되면 정상세포 독성이 나타날 뿐만 아니라 천연 생물 소재의 변질, 오염, 발암물질 검출 등 안전성 논란 등 다양한 원인으로 이러한 방법 적용에서 문제점이 제기되고 있다.
최근에는 방사선 조사기술(Radiation Technology)을 적용하여 유효 성분의 추출률 개선 및 유효 성분의 구조 변환에 따른 생리 활성 증진으로 인한 고부가가치 생물 소재 개발에 관한 연구가 진행 중에 있으며, 방사선 조사에 의한 특정 물질의 활성 증가, 특정 물질의 구조 변화 또는 함량을 증가시키는 연구도 보고되고 있으나(한국특허 제2009-0043706호, 한국특허 제2008-0046311호 등), 방사선 조사에 따른 다양한 화합물의 구조 변환 연구에 관해서는 아직까지 많은 연구가 진행되지 않고 있다.
따라서 방사선 조사 기술을 적용하여 화합물이 갖고 있는 고유의 생리 활성을 향상시킬 수 있는 기술이 개발되는 경우 국내 천연 생물 소재 이용 및 식품/의약품 개발의 관련 분야에 있어서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 항암 활성을 갖는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 항암 보조용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 하기 화학식 (I)로 표현되며 항암 활성을 갖는, 크로만 화합물이 제공된다.
화학식(I)
Figure 112018060773624-pat00001
(X는 히드록시기, 수소 및 C1- 6알킬히드록시기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, Y 중 적어도 하나는 페닐이며, 나머지는 C1- 6알킬 및 수소로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, n은 1 내지 4의 정수이며, m은 1 또는 2의 정수이다.)
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 화학식(I) 화합물을 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 화학식(I) 화합물을 포함하는, 항암 보조용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명에 의하면 항암 활성을 갖는 크로만 화합물이 획득될 수 있으며, 나아가 본 발명에 의한 화합물을 유효 성분으로 포함하는 효과적인 암 예방 및 치료용 약학 조성물, 및 항암 보조용 약학 조성물의 획득이 가능하다. 따라서, 이러한 성분은 항암 치료용 조성물 또는 항암 치료 과정 중 항암 요법의 보조제로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 방사선 조사된 크리신(1 mg/mL)의 HPLC 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1 화합물의 LC-MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3(a) 및 도 3(b)는 각각 실시예 1 화합물의 13C-NMR 및 1H-NMR을 나타낸 것이다.
도 4는 새로운 방사선 조사 산물인 실시예 1 화합물의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 MTT 분석을 통한 HT-29 세포에 대한 실시예 1 화합물의 독성 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HT-29 세포에 대한 실시예 1 화합물의 아포토시스 효과를 나타낸 것이다. HT-29 세포는 아넥신 V 및 PI로 염색하였고, 각 사분면 내 양성 세포의 비율을 개시하였다.
도 7은 Lumascope 620에 의한 세포의 형태학적 변화의 확인에 기초한 HT-29 세포 증식에 대한 실시예 1 화합물의 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 HT-29 세포에 대한 실시예 1 화합물의 아포토시스 효과를 나타낸 것이다. 비스-벤즈이미드(Hoechst 33258) 염색을 이용한 형광현미경법에 의해 특징적인 세포사멸적 형태 변화를 확인하였다.
도 9는 HT-29 세포에 대한 실시예 1 화합물의 아포토시스 효과를 나타낸 것이다. 형광현미경을 이용한 JC-1 염색 분석를 사용하여 실시예 1 화합물의 미토콘드리아 막전위를 분석하였다.
도 10은 HT-29 세포 내에서 실시예 1 화합물의 ROS(intracellular reactive oxygen species) 발생을 DCFH-DA(dichloro fluorescein-diacetate)을 이용하여 유세포 분석 및 형광현미경법에 의해 확인한 것이다.
도 11은 HT-29 세포 내에서 실시예 1 화합물의 영향을 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 항암 활성을 갖는 새로운 화합물이 제공되며, 보다 상세하게 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (I)로 표현되며 항암 활성을 갖는, 크로만 화합물인 것이다.
Figure 112018060773624-pat00002
화학식(I)
상기 화학식(I)에서, X는 히드록시기, 수소 및 C1- 6알킬히드록시기로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, Y 중 적어도 하나는 페닐이며, 나머지는 C1-6알킬 및 수소로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, n은 1 내지 4의 정수이며, m은 1 또는 2의 정수이다.
이때, X 및/또는 Y가 수소인 경우는 크로만 화합물의 해당 탄소 위치가 수소 이외의 다른 치환기로 치환되지 않고 수소가 존재하는 것을 의미하는 것이다.
본 발명의 크로만 화합물은 바람직하게는 치환된 페닐크로만 화합물, 예를 들어 치환된 2-페닐크로만 화합물인 것이다.
예시적인 바람직한 화학식(I) 화합물은 상기 화학식(I)에서 상기 n이 3이고, 상기 m이 1이며, Y는 페닐인 것이다.
보다 바람직한 화학식(I) 화합물은 상기 화학식(I)에서 상기 n은 3이고, 이때 적어도 하나의 X는 C1- 4알킬히드록시기이고, 나머지는 히드록시기이며, 상기 m은 1이고, Y는 페닐인 것이다. 이때, X 및 Y의 치환기로 명시되지 않은 탄소 위치는 수소가 다른 치환기로 치환되지 않은 채 존재하는 것을 의미하는 것이다.
예를 들어 상기 화학식 (I)로 표현되는 크로만 화합물은 하기 화학식 (Ia)로 표현되는 화합물일 수 있다.
Figure 112018060773624-pat00003
화학식 (Ia)
본 발명의 화학식 (I) 화합물은 당해 기술분야에 널리 알려진 어떠한 합성 공정에 의해 합성될 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 (I)로 표현되는 크로만 화합물, 예를 들어 상기 화학식 (Ia)로 표현되는 화합물은 크리신(Chrysin)에 대한 방사선 조사에 의해 크리신의 방사선 조사 산물로써 획득될 수 있다.
이때, 본 발명에 사용될 수 있는 상기 방사선은 감마선, 전자선 및 X선으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 감마선인 것이다.
또한, 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90, 및 세슘(Cs)-137으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성 동위원소로부터 방출될 수 있으며, 바람직하게는 상기 감마선은 코발트(Co)-60일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방사선은 크리신의 구조가 변화되어 향상된 항암 효과를 나타내는 화합물(들)이 획득될 수 있는 선량 이상, 그리고 크리신으로부터 생성된 방사선 조사 산물이 모두 분해되는 선량 미만으로 조사되는 것으로, 예를 들어 10 이상 100 kGy 이하의 선량으로 조사되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 50 이상 100kGy 이하의 선량으로 조사되고, 더욱 바람직하게는 약 50 kGy의 선량으로 조사되는 것이다.
상기 화학식 (I)로 표현되는 크로만 화합물, 예를 들어 상기 화학식 (Ia)로 표현되는 화합물은 크리신에 대한 방사선 조사 후 액체크로마토그래피, 예비(preparative)-HPLC, LC-MS, NMR 등의 과정을 통해 분리하여 획득할 수 있다.
이때, 상기 방사선을 조사하는 단계는 상온의 온도에서 수행될 수 있다.
상기 방사선을 조사하는 단계는 크리신을 유기 용매에 용해시켜 크리신 용액을 제조하는 단계에 후속적으로 크리신 용액에 대하여 수행될 수 있다.
보다 상세하게, 상기 화학식 (I)로 표현되는 크로만 화합물, 예를 들어 상기 화학식 (Ia)로 표현되는 화합물과 같이 항암 활성을 갖는 크리신의 방사선 조사 산물을 제조하는 방법은, 크리신을 유기 용매에 용해시켜 크리신 용액을 제조하는 단계; 및 상기 크리신 용액에 방사선을 조사하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
이때 사용될 수 있는 상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 견지에 의하면 상기 본 발명의 화학식 (I)의 크로만 화합물을 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암 보조용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명에 있어서, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
본 발명에서 "환자"는 본 발명의 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간과 그외 모든 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 인간(치료, 억제 또는 예방)뿐만 아니라 상업적으로 유용한 다른 동물들에게도 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효한 양의 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 암 예방 및 치료용 약학 조성물은 화학식 (I) 화합물을 포함하는 것으로, 택일적으로 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있으며, 이와 같은 약학 조성물을 환자에게 투여함으로써 암과 암 전이의 억제, 예방 및 치료 효과를 획득할 수 있다.
상기 암 예방 및 치료용 약학 조성물은 피부암, 폐암, 백혈병, 유방암, 위암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암의 치료용일 수 있으며, 바람직하게는 대장암 치료용인 것이다.
나아가, 본 발명의 조성물은 종래의 다른 암 치료제와 병행하여 투여할 수 있으며, 이러한 관점에서, 본 발명에 의하면, 화학식 (I) 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 항암 보조용 약학 조성물이 제공된다.
상기 항암 보조용 약학 조성물은 피부암, 폐암, 백혈병, 유방암, 위암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암에 대한 항암 보조 활성을 갖는 것일 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 항암 보조용 약학 조성물은 대장암 보조용 약학 조성물인 것이다.
본 발명의 상기 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암 보조용 약학 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암 보조용 약학 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암 보조용 약학 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암 보조용 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 조성물을 환자에게 투여함으로써 암과 암 전이를 억제하고, 예방 및 치료할 수 있으며, 본 발명의 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암 보조용 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 약제학적으로 유효한 양은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 1 내지 50 mg, 바람직하게는 1 내지 10 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1 내지 3 회로 나누어 투여할 수 있다.
그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험예 1: 크로만 화합물의 제조
메탄올을 용매로 하여 크리신(Chrysin) 분말을 1 mg/mL의 농도로 용해하여 크리신 용액을 제조한 후, 한국원자력연구원 첨단방사선 연구소 내에 설치된 감마선 조사시설을 이용하여, 실온에서 크리신에 감마선을 50 kGy로 조사하였고, 감마선을 조사하지 않은(0 kGy) 크리신을 비교예 1로 하였다.
상기 크리신에 감마선을 50 kGy로 조사한 결과 화합물의 HPLC 피크(peak)를 확인한결과 도 1에 나타난 바와 같이 2개의 방사선 유도 신규화합물(Radiolytic peak)의 생성이 증가되는 것으로 관찰되었으며, 두 개의 피크 중 앞쪽에서 증가한 화합물(실시예 1 화합물)의 분자량을 알아보기 위하여 LC-MS를 측정한 결과 299.08334으로 나타났다(도 2). 이때, 실시예 1 화합물이 아닌 다른 화합물을 비교예 2 화합물이라 지칭한다.
또한, 상기 실시예 1 화합물의 정확한 구조를 규명하기 위하여 1HNMR과 13CNMR을 수행하였으며, 이들 결과는 다음과 같이 나타났다(도 3(a) 및 도 3(b)).
1HNMR (500MHz, DMSO-d6): 11.8(1H,s), 7.4(2H,d), 7.4(2H,d,J=8.6Hz), 7.2(2H,d,J=8.7Hz), 5.9(1H,s), 5.8(1H,s), 5.1(1H,Br), 4.6(1H,Br), 3.7(3H,q,J=8.6Hz), 3.3(3H,m).
13CNMR (125MHz, DMSO-d6): 197.9, 166.9, 163.3, 160.8, 141.5, 139.8, 128.6, 127.8, 126.8, 101.4, 96.0, 86.4, 66.2, 60.0, 52.6.
이러한 결과를 종합하여 도 4와 같은 본 발명 실시예 1 화합물의 구조를 규명하였다.
상기 화합물의 화학식은 C17H16O5으로 나타내며, 화학명은 5,7-dihydroxy-3-(2-hydroxyethyl)-2-phenylchroman -4-one으로 칭하고, 본 명세서에서 상기 실시예 1 화합물을 화학식 (Ia) 화합물이라고도 지칭한다.
실험예 2: 실시예 1 화합물의 대장암세포(HT-29) 독성평가
상기 실험예 1에서 획득한 실시예 1 화합물은 예비(preparative) HPLC 1260 인피니티시스템(infinity system) (Agilent Technologies)을 이용하여 하기와 같은 구배 프로그램(The gradient program)으로 분획하여 항암활성 변화에 대한 연구를 진행하였다: 0-5 min (20% B), 12 min (40%), 25 min (55%), 30 min (80%) 38 min (80%)
인간으로부터 분리된 대장암세포주인 HT-29세포에 실시예 1 화합물 및 비교예 1 화합물을 각각 다양한 농도(12.5, 25, 50 및 100 μg/mL)로 처리하여 24시간 후 MTT 방법으로 세포 생존율을 알아보았다.
실험 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 모두 농도 의존적으로 세포독성이 증가하였으며, 실시예 1 화합물을 처리한 경우의 세포의 독성이 가장 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5). 도 5에서 컨트롤(control)은 HT-29 암세포에 아무것도 처리하지 않은 경우를 의미한다.
나아가, HT-29 암세포에 실시예 1 화합물 및 비교예 1 화합물을 각각 다양한 농도 (50, 100 μg/ml)로 처리한 후 유세포분석기(FACS) 장비를 활용하여 독성평가(Annexin V/PI의 apoptosis detection)를 진행하였다. 그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 HT-29 세포에 실시예 1 화합물을 처리하였을 때 비교예 1 화합물 처리군에 비하여 아포토시스(apoptosis)가 현저하게 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 현미경을 통하여 세포의 모양을 관찰한 결과 실시예 1 화합물을 처리한 경우의 세포가 더 많이 죽은 것을 육안으로 관찰 할 수 있었다(도 7).
이러한 결과로 미루어 보아 실시예 1 화합물은 암세포에 대한 세포 독성을 유의적으로 높게 증가시키며 이러한 연구는 새로운 바이오 소재 및 신약개발 측면에서 방사선 조사기술의 가능성 제시하는 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
실험예 3: 실시예 1 화합물의 대장암 세포(HT-29) 아포토시스 ( Apoptosis ) 유도 효과
(1) 실시예 1 화합물에 의한 대장암세포 (HT- 29)의 핵 변화 관찰
실시예 1 화합물 및 비교예 1 화합물에 의해 핵 변화를 관찰하기 위하여 Hoechst 33258 시약을 활용하여 관찰하였다. HT-29 세포에 실시예 1 화합물 및 비교예 1 화합물을 각각 처리하였을 때 세포 사멸을 나타내는 형태학적인 변화를 관찰하기 위하여, 실시예 1 화합물 및 비교예 1 화합물 각각 50, 100 μg/ml을 HT-29 세포에 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 DNA에 특이적으로 결합하는 Hoechst 33258 시약으로 세포핵을 염색하여 공초점 레이져 현미경을 통하여 세포핵의 변화를 확인 하였다(도 8).
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이 실시예 1 화합물 처리군에서 손상된 세포핵을 더 많이 관찰할 수 있었으며, 세포가 사멸하여 세포수가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 실시예 1 화합물이 세포자살을 유도하는데 더욱 효과가 있다는 것을 형태학적으로 확인할 수 있다.
(2) 실시예 1 화합물 처리에 의한 HT-29 세포의 미토콘드리아 막전위 변화
세포 내의 미토콘드리아는 세포에 필요한 ATP를 합성하여 세포에 영양분을 공급하고 세포의 생명 유지에 중요한 역할을 한다. 따라서 암 세포 증식에 있어서도 미토콘드리아의 역할은 매우 중요하며 암세포 자살과 관련하여 미토콘드리아에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다.
본 실험에서는 실시예 1 화합물이 HT-29 대장암세포의 증식을 억제한다는 상기 결과를 바탕으로 HT-29 대장암 세포에 실시예 1 화합물 및 비교예 1 화합물을 각각 50, 100 μg/ml 농도로 처리하여 암세포 자살에 있어 중요하게 작용하는 세포 내 미토콘드리아의 막전위 변화를 JC-1 형광 염색을 통해 형광현미경으로 관찰하였다(도 9).
그 결과 실시예 1 화합물을 처리한 세포에서 더욱 밝은 초록색 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 실시예 1 화합물을 처리한 세포의 미토콘드리아의 막전위가 농도 의존적으로 낮아졌으며 세포의 자살이 진행되고 있다고 분석할 수 있다.
(3) 실시예 1 화합물의 처리가 HT-29 세포의 ROS (Reactive Oxygen Species) 생성에 미치는 영향
실시예 1 화합물 및 비교예 1 화합물의 대장암세포주 HT-29 세포에서의 ROS 생성능을 평가하기 위하여 DCFH-DA(2',7'-dichlorofluorescein-diacetate) 시약으로 염색한 후 형광 현미경을 이용하여 측정하였다.
도 10은 형광 현미경을 통하여 HT-29 세포의 ROS 발현을 이미지 형태로 관찰하고, 형광의 세기를 측정한 결과이다. 그 결과 실시예 1 화합물을 처리한 세포에서 ROS 형광 세기가 농도 의존적으로 증가하는 것으로 관찰되었다. 결론적으로 실시예 1 화합물은 HT-29세포의 ROS 생성을 증가시켜 아포토시스를 일으키는데 영향을 미치는 것임을 알 수 있다.
실험예 4: 실시예 1 화합물의 대장암세포(HT-29) 아포토시스 기전확인
실시예 1 화합물의 HT-29 세포 사멸에 대한 기전에 관하여 알아보기 위하여 다양한 세포사멸의 기전에 관계되는 단백질의 발현을 웨스턴 블럿팅 방법을 통하여 측정하고 그 결과를 도 11에 나타내었다. 그 결과 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이 미토콘드리아 내부의 세포사멸과 관련되는 Bcl의 발현이 증가와 Bax의 활성화로 미루어 실시예 1 화합물의 경우 세포 내 소기관인 미토콘드리아와 관련하여 HT-29세포의 세포사멸을 촉진시키는 것으로 사료된다. 미토콘드리아 내에서 방출되는 시토크롬 C의 증가에 따라 세포사멸의 개시인자인 카스파아제-9을 활성화 시키고, 이로 인하여 초기집행자인 카스파아제-3를 증가시켜 가장 중요한 인자인 PARP의 분열(cleavage)을 일으켜 결국 세포가 사멸하는 것을 알 수 있다. 결론적으로 실시예 1 화합물의 항암 활성의 신호 메커니즘(signaling mechanism)을 확립하였다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 (Ia)로 표현되며, Bax 발현 증가 및 Caspase 활성 조절을 통한 세포사멸에 의해 항암 활성을 갖는, 크로만 화합물을 포함하는, 암 예방 및 치료용 약학 조성물:
    Figure 112019127826370-pat00019
    화학식(Ia)
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 암은 피부암, 폐암, 백혈병, 유방암, 위암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  7. 하기 화학식 (Ia)로 표현되며, Bax 발현 증가 및 Caspase 활성 조절을 통한 세포사멸에 의해 항암 활성을 갖는, 크로만 화합물을 포함하는, 항암 보조용 약학 조성물:
    Figure 112019127826370-pat00020
    화학식(Ia)
  8. 제7항에 있어서, 상기 항암 보조용 약학 조성물은 피부암, 폐암, 백혈병, 유방암, 위암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 암에 대한 항암 보조 활성을 갖는, 항암 보조용 약학 조성물.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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