KR102103232B1 - 응집된 미생물성 배지 - Google Patents

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Abstract

건식의 유동성 응집 영양 배지의 제조 방법이 제공된다. 방법은 분말화된 영양소를 포함하는 영양 성분과 응집용 액체를 관류형 응집 챔버를 포함하는 응집기로 도입하는 단계, 미리 결정된 기간 동안 응집 챔버 내에서 응집용 액체로 영양 성분을 습식 괴상화하여 응집 영양 배지 입자를 형성하는 단계 및 응집 영양 배지 입자를 소정의 기간 동안 건조 조건에 노출시켜 건식의 응집 영양 배지를 형성하는 단계를 포함한다. 영양 성분은 미생물의 성장을 촉진시킨다. 건식의 유동성 응집 영양 배지를 포함하는 조성물, 용품 및 키트가 또한 제공된다.

Description

응집된 미생물성 배지 {AGGLOMERATED MICROBIOLOGICAL MEDIA}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2012년 7월 25일자로 출원된 미국 가출원 제61/675,624호의 이익을 주장한다.
영양 배지 제형을 사용하여 동물, 식물 및 미생물 세포를 포함하는 다수의 세포 유형들을 배양해 왔다. 배양 배지에서 배양된 세포는 사용 가능한 영양소를 이화(異化)하고, 단일클론항체, 호르몬, 성장인자, 바이러스 등의 유용한 생물학적 물질을 생성한다. 이러한 생성물은 치료적 적용을 가지며, 재조합 DNA 기술의 출현을 이용하여 세포는 조작(engineered)되어 이들 생성물을 대량 생산할 수 있다. 따라서, 세포를 생체 외(in vitro) 배양하는 능력은 세포생리학의 연구에서 중요할뿐만 아니라, 비용 효율적인 방법에 의해 얻어질 수 없는 유용한 물질의 생성에도 필요하다.
미생물 배양 배지의 전형적인 성분은 단백질 가수분해물, 무기 염류, 비타민, 미량 금속 및 탄수화물을 포함할 수 있으며, 성분의 유형과 양은 주어진 미생물의 종의 특정 요건에 따라 달라질 수도 있다. 이들 성분은 탈수된 형태(dehydrated form)에서 더 안정적인 경향이 있어서, 흔히 건식의 분말화된 제형으로 제공된다. 분말화된 제형은 물에 첨가되고, 임의로 사용 전에 멸균된다.
배양 배지는 전형적으로 액체 형태 또는 분말 형태로 생성된다. 이들 형태 각각은 특정 이점과 문제점을 갖는다.
예를 들어, 액체 배양 배지는 바로 사용 가능하게 제공되고(영양소나 다른 성분의 보충이 필요하지 않는 한), 제형이 특정 세포 유형에 최적화되었다는 이점이 있다. 그러나, 액체 배지는 특정 미생물 배양에 있어서 최적의 성능을 위해, 보충물(예를 들어, 비타민 또는 보조인자, 및 항생제)의 첨가를 요구할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 대부분의 액체 배지는 시간이 걸리고/걸리거나 비용이 많이 들 수 있는 공정인, 일종의 멸균(예를 들어, 오토클레이브, 여과)을 필요로 한다.
문제점의 일부를 해소하도록 액체 배양 배지를 농축된 형태로 만들 수 있다; 농축물은 사용 전에 작업 농도로 희석될 수도 있다. 이 접근법은 표준 배양 배지보다 더 크고 가변적인 회분 크기를 만들 수 있는 능력을 제공하고, 농축된 배지 제형 또는 이의 성분은 종종 더 긴 저장 수명을 갖는다. 미국 특허 제5,474,931호는 배양 배지 농축물 기술에 관한 것이고, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 그러나, 이들 이점에도 불구하고, 농축된 액체 배지는 보충물의 첨가를 필요로 하고, 경제적으로 멸균시키기 어려울 수 있다는 문제점을 여전히 가지고 있다.
액체 배지의 대안으로 분말화된 배양 배지가 종종 사용되고 있다. 이 접근법은 더 큰 회분 크기를 생산할 수 있고, 분말화된 배지는 전형적으로 액체 배지보다 더 긴 저장 수명을 가지며, 배지가 조제 후에 조사(예를 들어, 감마선 또는 자외선 조사) 또는 에틸렌 옥사이드 침투에 의해 멸균될 수 있다는 이점을 갖는다. 그러나, 분말화된 배지는 몇 가지 명백한 문제점을 갖는다. 예를 들어, 분말화된 배지의 일부 성분은 동결 건조 시에 응집되거나 불용성이 되어, 재가용화하기 어렵거나 불가능하다. 또한, 분말화된 배지는 전형적으로 미세 먼지 입자를 포함하여 약간의 물질 손실 없이 이들을 이동시키고/시키거나 재구성하기 특히 어려울 수 있고, 또한 GMP/GLP, USP 또는 ISO 9000 규정이 적용되는 다수의 생명 공학 생산 시설에서 사용하기에 비실용적일 수 있다.
재수화 가능한 배지의 발전에도 불구하고 다양하게 대량으로 제조할 수 있고 멸균 처리할 수 있는, 영양학적으로 복합 안정성 건식 분말 영양 배지, 배지 보충물, 배지 서브그룹(subgroup) 및 완충제를 신속하게 용해하기 위한 필요성이 여전히 존재한다.
본 개시내용은 일반적으로 미생물(예를 들어, 세균, 효모, 곰팡이)의 성장을 촉진시키는 데 사용되는 영양 배지에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 하나 이상의 분말화된 영양 성분을 응집하여 건식의 응집 영양 배지를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 선택된 화학 조성, 크기, 밀도, 함수량, 또는 상기 특성의 둘 이상의 조합을 갖는 응집 입자를 제공하는 공정 조건을 포함한다. 다른 국면에 있어서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시되어 있는 방법에 따라 제조된 건식의 응집 영양 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 국면에 있어서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시되어 있는 건식의 응집 영양 조성물을 포함하는 용품과 키트를 제공한다.
유리하게는, 본 개시내용의 조성물은 수성 용매에 의해 입자의 표면을 적시는 것을 촉진시키는 화학 조성을 갖는다. 더 유리하게는, 본 개시내용의 조성물은 수성 용매 내에서 입자의 침지를 촉진시키도록 선택된 밀도(예를 들어, 중력 충전된 평균 입자 밀도(gravity-packed mean particle density))를 갖는다. 보다 더 유리하게는, 본 개시내용의 건식의 응집 영양 배지는 수성 용매 내에서 입자의 신속한 용해를 촉진시키도록 선택된 입도 분포를 갖는다.
하나의 국면에 있어서, 본 개시내용은 건식의 유동성 응집 영양 배지의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 분말화된 영양소를 포함하는 영양 성분과 응집용 액체(agglomeration liquid)를 관류형(flow-through-type) 응집 챔버를 포함하는 응집기로 도입하는 단계; 상기 응집 챔버 내에서 미리 결정된 기간 동안 상기 응집용 액체를 이용하여 상기 영양 성분을 습식 괴상화(wet-massing)하여 응집 영양 배지 입자를 형성하는 단계; 및 상기 응집 영양 배지 입자를 소정의 기간 동안 건조 조건에 노출시켜 건식의 응집 영양 배지를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 영양 성분은 미생물의 성장을 촉진시킨다. 응집용 액체는 분무 스프레이(atomized spray)로서 도입된다. 방법의 실시양태에 있어서, 응집용 액체가 물로 구성될 수 있다. 방법의 실시양태에 있어서, 응집용 액체가 미생물의 성장을 촉진시키는 용해된 영양소를 갖는 용매를 포함할 수 있다. 상기 방법의 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 영양 성분을 도입하는 단계는 두 가지 이상의 분말화된 영양소의 실질적으로 균일한 혼합물을 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 응집기는 혼합 블레이드를 추가로 포함할 수 있고, 영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 약 50 ㎏/hr 내지 약 1000 ㎏/hr의 공급량(feed rate)으로 도입하는 단계를 포함하며; 응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계는 응집용 액체를 약 15 ㎏/hr 내지 약 300 ㎏/hr의 분무량(spray rate)으로 도입하는 단계를 포함하고; 혼합 블레이드는 약 500 rpm 내지 약 4000 rpm의 블레이드 회전 속도로 회전하며; 응집 영양 배지를 건조 조건에 노출시키는 단계는 응집 영양 배지를 약 60℃ 내지 약 85℃의 미리 결정된 온도에 노출시키는 단계를 포함하고; 공급량, 분무량, 블레이드 회전 속도 및 미리 결정된 온도는 5중량% 미만으로 미리 선택된 평균 함수량을 갖는 건식의 응집 영양 배지를 생산하도록 선택된다. 상기 방법의 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 응집기는 혼합 블레이드를 추가로 포함할 수 있고, 영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 약 50 ㎏/hr 내지 약 1000 ㎏/hr의 공급량으로 도입하는 단계를 포함하며; 응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계는 응집용 액체를 약 15 ㎏/hr 내지 약 300 ㎏/hr의 분무량으로 도입하는 단계를 포함하고; 혼합 블레이드는 약 500 rpm 내지 약 4000 rpm의 블레이드 회전 속도로 회전하며; 응집 영양 배지를 건조 조건에 노출시키는 단계는 응집 영양 배지를 약 60℃ 내지 약 85℃의 미리 결정된 온도에 노출시키는 단계를 포함하고; 공급량, 분무량, 블레이드 회전 속도 및 미리 결정된 온도를 선택하여, 중력 충전된 밀도가 0.2 내지 0.5 g/㎤인 건식의 응집 영양 배지를 생산한다. 상기 방법의 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 응집기는 혼합 블레이드를 추가로 포함할 수 있고, 영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 약 50 ㎏/hr 내지 약 1000 ㎏/hr의 공급량으로 도입하는 단계를 포함하며; 응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계는 응집용 액체를 약 15 ㎏/hr 내지 약 300 ㎏/hr의 분무량으로 도입하는 단계를 포함하고; 혼합 블레이드는 약 500 rpm 내지 약 4000 rpm의 블레이드 회전 속도로 회전하며; 응집 영양 배지를 건조 조건에 노출시키는 단계는 응집 영양 배지를 약 60℃ 내지 약 85℃의 미리 결정된 온도에 노출시키는 단계를 포함하고; 공급량, 분무량, 블레이드 회전 속도 및 미리 결정된 온도는, 제1 입도 분포 범위가 약 105 μ 내지 약 2000 μ인 입자를 갖는 건식의 응집 영양 배지를 생산하도록 선택된다. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 방법은 제1 입도 분포 범위보다 좁은 약 149 μ 내지 약 1000 μ의 제2 입도 분포 범위를 갖는, 입자의 하위 그룹(subpopulation)을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 분말화된 영양소는 단백질, 탄수화물, 염 및 상기 분말화된 영양소들의 두 가지 이상의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 방법은 건식의 응집 영양 배지에 대해 상기 건식의 응집 영양 배지 중의 생존 가능한 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 국면에 있어서, 본 개시내용은 전술된 청구항들 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 건식의 유동성 응집 영양 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물의 실시양태에 있어서, 특정 질량의 건식의 응집 영양 배지는 응집 영양 배지의 제조에 사용된 동일 질량의 영양 성분보다 더 신속하게 용해될 수 있다.
또 다른 국면에 있어서, 본 개시내용은 조성물의 상기 실시양태를 포함하는 키트를 제공한다. 키트의 실시양태에 있어서, 조성물은 미리 결정된 질량의 건식의 응집 영양 배지를 포함하는 패키지에 배치될 수 있고, 미리 결정된 질량은 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있는 재구성된 배지를 만들기 위해 수성 희석제 90 mL 내지 99 mL와 혼합될 수 있다. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 키트는 백(bag), 병 및 샘플 취득 기구로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 키트는 선택제(selective agent) 및/또는 지시 시약을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 국면에 있어서, 본 개시내용은 박막 배양 기구를 제공한다. 배양 기구는 제1 주 표면과 제2 주 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재; 제1 주 표면의 적어도 일부분 위에 배치된 접착제 층; 접착제 층의 적어도 일부분 위에 배치된 상기 실시양태의 조성물을 포함하는 코팅; 및 영양 배지와 유체 접촉하도록 위치된 건식의 냉수 가용성 겔화제를 포함할 수 있다. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 박막 배양 기구는 기재의 일부분에 커플링된, 제1 주 표면과 대면하는 제1 측(side)을 갖는 커버 시트를 추가로 포함할 수 있다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게"는 소정의 환경 하에서 소정의 이득을 제공할 수 있는 본 발명의 실시양태를 말한다. 그러나, 동일하거나 또는 다른 상황 하에서 다른 실시양태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시양태의 언급은 다른 실시양태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시양태를 배제하고자 하는 것은 아니다.
용어 "포함하다" 및 그 변형은, 이들 용어가 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 나타나는 경우, 제한적 의미를 갖지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어(a, an, the), "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 호환적으로 사용된다. 따라서, 예를 들어, 단수형(a) 입자는 "하나 이상의" 입자를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 전부, 또는 열거된 요소들의 둘 이상의 조합을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 설명은 그 범위 이내에 포함된 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
본 발명의 상기의 개요는 본 발명의 각각의 개시되어 있는 실시양태 또는 모든 구현예를 설명하고자 하는 것은 아니다. 이하의 기재는 예시적인 실시양태를 더 구체적으로 예증한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통하여 지침이 제공되며, 상기 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 단지 대표적인 군으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안 된다.
이들 및 다른 실시양태의 추가의 상세 사항이 첨부 도면 및 이하의 상세한 설명에 기재되어 있다. 다른 특징, 목적 및 이점들은 상세한 설명 및 도면과 특허청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
도 1은 본 개시내용에 따르는 박막 배양 기구의 하나의 실시양태의 부분 단면 평면도이다.
본 개시내용의 실시양태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그의 응용에 있어서 하기의 설명에 기재되거나 하기의 도면에 도시되는 구성요소의 구성 및 배열의 상세 사항으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 실시양태 및 다양한 방식으로 실행 또는 실시될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 어법 및 용어는 설명의 목적을 위한 것으로, 제한으로서 여겨져서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 "구비하는", "포함하는" 또는 "갖는" 및 이들의 변형의 사용은 그 뒤에 열거된 항목 및 그 등가물뿐만 아니라 추가의 항목을 포괄하는 것으로 여겨진다. 다른 실시양태가 이용될 수 있으며, 구조적 또는 논리적 변화가 본 개시내용의 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
일반적으로, 본 개시내용은 수용성 분말로 만들어진 건식의 유도성 응집 입자와 상기 응집체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에 있어서, 방법을 이용하여 미생물의 성장 촉진용 영양 배지를 제조할 수 있다. 응집 입자의 제조에 사용된 분말의 적어도 하나와 대조적으로 그리고 다른 응집 입자 조성물과 대조적으로, 본 발명의 응집 입자의 개체군은 유리하게는 매우 바람직한 2가지 특성을 지닌다: 1) 응집 입자는 수용성 액체의 표면 상에 부어질 때, 신속하고(즉, 즉시 또는 거의 즉시) 실직적으로 양적으로 수용성 액체의 표면 아래로 가라앉는다. 그리고 2) 응집 입자는 수용성 액체로 신속하게 용해된다. 이론에 제한되지 않고, 이들 매우 바람직한 특성은 평균 크기, 표면적, 표면 구성, 밀도 및/또는 본 개시내용에 따라 제조된 응집 입자의 개체군에서 발견되는 상기 물리적 특질의 둘 이상의 특유한 조합이 원인이라 믿어지고 있다. 따라서, 하나의 국면에 있어서, 본 개시내용은 수용성 액체에서 약간의 수동 교반 또는 기계 교반으로, 또는 교반 없이 신속하게 분산되고 용해되는 영양 배지가 제공된다.
따라서 본 개시내용은 응집 영양 배지의 제조 방법으로서, 응집 배지는 미생물의 회복 및/또는 성장을 촉진시키기에 적합하고, 방법은 i) 분말화된 영양소를 포함하는 영양 성분과 응집용 액체를 관류형 응집 챔버(즉, "슈기형(Schugi-type)" 응집 챔버)로 도입하는 단계, ii) 응집 챔버 내에서 최대 30초의 기간 동안 응집용 액체로 영양 성분을 습식 괴상화하여 응집 영양 배지를 형성하는 단계, 및 iii) 응집 영양 배지를 소정의 기간 동안 건조 조건에 노출시키는 단계를 포함하는 영양 배지의 제조 방법을 제공한다. 본 개시내용의 방법에 따라, 영양 성분(예를 들어, 적어도 하나의 분말화된 영양소)은 미생물의 성장을 촉진시킨다. 또한, 본 개시내용의 방법에 따라, 응집용 액체는 분무 스프레이로서 도입된다.
응집용 액체의 매우 짧고 집중적인 적용 단계와 영양소를 포함하는 조성물의 습식 괴상화로 건식의 유동성 영양 배지의 제조에 적합한 응집 입자가 개체군화되는 것으로 밝혀졌다.
응집용 액체의 적용 단계와 습식 괴상화 공정 시간은 사용되는 장치에 따라 달라질 수 있다. 구체적인 실시양태에 있어서, 단계 ii)의 습식 괴상화는 최대 약 20초 예를 들어, 최대 약 15초, 최대 약 10초 또는 최대 약 5초 등의 시간 동안 수행된다.
본 방법에 사용하기에 특히 적합한 기기는 비팩스 인터내셔널 엘엘씨(BEPEX International LLC)에 의해 제작된 수직 경로(vertical-path) 관류형 응집 챔버이다. 모델 FX- 100 슈기 플렉스-오-믹스(FLEX-O-MIX) 혼합기/응집기는 본 개시내용의 방법에 바람직하나, 본 발명은 이 특정 모델 또는 제조사의 사용으로 한정되는 것은 아니며, 상기 언급된 것처럼 습식 괴상화 단계를 매우 빠르게 하는 유사한 구조를 가진 다른 모델 및 기기 또한 본 개시내용의 범주에 있다. 예를 들어 슈기 플렉스-오-믹스에서, 단계 ii)의 습식 괴상화는 최대 약 1초, 바람직하게 최대 약 0.5초, 최대 약 0.4 초, 최대 약 0.3 초 또는 최대 약 0.2초의 시간 안에 수행된다.
당업자는 사용되는 장치의 크기, 영양 분말 조성물을 가진 응집 챔버의 공급량 및 응집용 액체의 유량에 따라 달라질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
보통 본 개시내용에 따라 사용되는 바와 같은 관류형 응집 장치에 있어서, 응집 챔버에는 약 50 내지 약 1000 kg/h, 예를 들어, 50 내지 약 850 ㎏/h, 약 50 내지 약 750 ㎏/h, 50 내지 약 500 ㎏/h, 약 50 내지 약 250 ㎏/h, 약 50 내지 약 200 ㎏/h, 약 100 ㎏/h 또는 약 200 ㎏/h 등의 약 100 내지 약 200 ㎏/h 의 공급량을 이용하여 영양 성분(예를 들어, 분말화된 영양소)이 공급된다.
매우 빠른 생산에 사용될 저-관류형 응집 장치에 있어서, 응집 챔버에는 예를 들어 약 1100 내지 약 1300 ㎏/h 등의 약 1000 내지 약 1500 ㎏/h의 공급량을 이용하여 공급된다.
응집용 액체의 적용과 조성물의 습식 괴상화의 빠르고 효율적인 단계를 얻기 위해 관류형 응집기 챔버에서 응집용 액체의 유량도 중요한 매개변수(parameter)이다. 보통, 응집용 액체는 조성물 상에 약 15 내지 약 100 ㎏/h 범위의 분무량으로 분무된다. 다시 말해서, 유량은 장치의 크기(예를 들어, 챔버 부피)에 좌우된다; 더 큰 장치는 더 작은 장치보다 높은 유량을 가능하게 한다. 상기 기재되어 있는 예시적인 기기에서(모델 FX- 100 슈기 플렉스-오-믹스 혼합기/응집기), 응집용 액체는 약 15 내지 약 80 ㎏/h(포괄적 의미); 예를 들어, 약 20 내지 약 60 ㎏/h(포괄적 의미); 약 20 내지 약 50 ㎏/h(포괄적 의미) 약 20 내지 약 40 ㎏/h(포괄적 의미); 또는 약 25 내지 약 35 ㎏/h(포괄적 의미) 등의 범위의 분무량으로 조성물 상에 분무될 수 있다. 당업자는 사용된 장치에 따라 액체 유동을 조절하는 방법을 알게될 것이다. 실시예에서 사용된 것보다 큰 장치를 위한 지침서로서, 응집용 액체는 예를 들어 약 50 내지 약 300 ㎏/h(포괄적 의미); 예를 들어, 약 60 내지 약 200 ㎏/h(포괄적 의미); 약 65 내지 약 150 ㎏/h(포괄적 의미); 약 70 내지 약 125 ㎏/h(포괄적 의미); 또는 약 75 내지 약 105 ㎏/h(포괄적 의미) 등의 범위의 분무량으로 조성물 상에 분무될 수 있다.
실시양태에 있어서, 영양 성분과 응집용 액체는 동시에 및/또는 연속적으로 응집 챔버로 공급될 수 있다. 분말 조성물과 응집용 액체의 연속적인 공급은 공정을 계속되게 할 수 있고, 즉 예를 들어 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상 또는 7일 이상 등의 1일 이상의 기간 동안 계속될 수도 있다. 원칙적으로, 기간은 생산될 건식의 응집 배지의 양에 기초하여 결정되지만, 결국 세정이 필요한 장치의 부품들의 막힘에 의해 중단될 수도 있다.
슈기 플렉스오믹스 장치(또는 유사한 장치)를 사용하는 구체적인 실시양태에 있어서, 분말화된 영양소를 포함하는 영양 성분은(예를 들어, 완충 펩톤수를 만드는 분말화된 원료) 응집 챔버의 상부를 통해 공급되고 중력에 의해 챔버를 통과한다. 챔버는 영양 성분의 강도 높은 습식 괴상화를 가능하게 하는 많은 블레이드를 포함한다. 고-전단 혼합 공정과 비교하여, 본 방법에 따르는 응집용 액체의 적용 단계와 습식 괴상화 단계는 훨씬 더 빠르다.
영양 성분
본 개시내용의 방법은 응집용 액체로 영양 성분을 습식 괴상화하는 단계를 포함한다. 영양 성분은 미생물(예를 들어, 세균, 효모, 곰팡이)의 성장을 촉진시키는 적어도 하나의 영양소를 포함한다. 실시양태에 있어서, 영양 성분은 미생물의 성장을 촉진시키는 두 가지 이상의 영양소의 혼합물을 포함할 수도 있다. 적합한 영양소의 비제한적인 예에는 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당 또는 다당류), 단백질, 단백질 가수분해물, 세포 추출물(예를 들어, 효모 추출물), 염, 완충 성분, 선택제(예를 들어, 항생제), 및 상기 영양소들의 둘 이상의 조합이 포함된다.
실시양태에 있어서, 영양 성분은 실질적으로 건식 제형(예를 들어, 실질적으로 건식 분말)일 수 있다. 분말화된 배지는 전형적으로 배양 배지의 건식 성분을 혼합 공정, 예를 들어 볼 밀링(ball-milling)을 통해 혼합함으로써 또는 미리 만들어진 액체 배양 배지를 동결 건조함으로써 생산된다. 본 개시내용의 방법에 사용되는 예시적인 영양 배지는 분말로써, 예를 들어 옥소이드 리미티드(Oxoid Limited) (Hampshire, UK) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (St.Louis, MO)를 포함하는 다양한 제조업자로부터 상업적으로 입수 가능한 완충 펩톤수이다.
본 개시내용에 따라 응집될 수 있는 기타 분말화된 영양 배지 제형은 완충 펩톤수, 트립티카제 대두 브로쓰(trypticase soy broth), 락토스 브로쓰, UVM 변형 리스테리아 증균 브로쓰, 완충 리스테리아 증균 브로쓰("BLEB"), 데미-프레이저 브로쓰(Demi-Fraser broth), 및 당업계에 공지된 {미생물용 기타 배양 배지를 생산하도록 재수화되는 제형을 포함하고, 예를 들어 전체적으로 본 명세서에 참고로서 포함되는 문헌[Handbook of Microbiological Media, R. Atlas, ed., 4th Edition, 2010, CRC Press, Ann Arbor, MI]에서 찾을 수 있다.
응집용 액체
응집용 액체는 영양 성분의 더 작은 개개의 입자(예를 들어, 분말 입자)의 더 큰 응집 입자로의 응집을 촉진하도록 응집 챔버로 분무된다. 실시양태에 있어서, 응집용 액체는 물(예를 들어, 증류 및/또는 탈이온수)을 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 응집용 액체는 물(예를 들어, 증류 및/또는 탈이온수)로 본질적으로 이루어질 수 있다. 실시양태에 있어서, 응집용 액체는 물(예를 들어, 증류 및/또는 탈이온수)로 이루어질 수 있다. 실시양태에 있어서, 응집용 액체는 유기 용매(예를 들어, 에탄올, 아이소프로판올)를 포함할 수도 있다.
선택적으로, 실시양태에 있어서, 바인더(binder), 특히 수용성 바인더는 영양 성분의 응집을 촉진시키는 데 유용할 수도 있다. 바인더는 영양 성분에 첨가될 수도 있거나(예를 들어, 분말 등의 실질적으로 건식의 입자 형태로), 응집용 액체 내에서 용해되거나 현탁될 수도 있다.
적합한 바인더의 비제한적인 예에는 생체적합성 중합체(예를 들어 단백질, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 덱스트린, 말토덱스트린, 미세결정성 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 전분, 및 상기 중합체의 생체적합성 유도체)와 당(예를 들어, 덱스트로스, 과당, 포도당, 이노시톨, 에리트리톨, 아이소말트, 락티톨, 젖당, 말티톨, 맥아당, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 타가토오스, 트레할로스 및 자일리톨)이 포함된다. 실시양태에 있어서, 바인더는 미생물의 성장을 촉진시키는 물질일 수도 있다(예를 들어, 완전 배지 또는 적어도 하나의 영양소를 포함하는 희석제). 한 예로서, 응집 완충 펩톤수 배지로 적합한 응집용 액체는 1 내지 50중량%의 완충 펩톤수 용액일 수 있고 응집 트립티카제 대두 브로쓰 배지에 적합한 응집용 액체는 1 내지 50중량%의 트립티카제 대두 배지 수용액일 수 있다.
영양소를 포함하는 조성물 중의 바인더의 농도는 사용되는 특정 바인더에 따라 넓은 범위에 걸쳐 달라질 수도 있으나, 일반적으로 예를 들어 약 0.2 내지 약 35% w/w, 약 0.3 내지 약 30% w/w 또는 약 0.4 내지 약 25% w/w 또는 약 0.4 내지 약 24.2% w/w 등의 약 0.1% 내지 약 40% w/w이다. 소르비톨의 경우에 있어서, 농도는 보통 약 20 내지 30% w/w 이고, 소르비톨을 제외한 당 알코올의 경우에 있어서 농도는 보통 약 30 내지 약 40% w/w 등의 더 높은 범위이다.
바람직하게는, 응집용 액체는 수성 배지이다. 응집용 액체 내에 바인더가 포함되는 경우, 응집용 액체는 바인더를 물에 용해시킴으로써 제조된다. 대안적으로 바인더는 분말에 건식 형태로 혼합될 수 있다.
응집 영양 배지는 적합한 건조 챔버 내에서 건조 처리될 수 있다. 건조 챔버가 응집 장치와 작동가능하게 연결될 수 있다. 건조 챔버는 회분식으로 또는 연속식으로 작동될 수도 있고, 임의로 둘 이상의 독립적으로 제어되는, 상이한 온도에서 작동되는 건조 구역으로 분리될 수도 있다.
실시양태에 있어서, 응집용 액체는 미생물의 성장을 촉진시키는 영양 배지를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에 있어서, 응집용 액체는 완충 펩톤수 브로쓰(물, 10.0 g/L 펩톤, 5.0 g/L 염화나트륨, 9.0 g/L 오르토인산수소이나트륨 12H2O 및 1.5 g/L 오르토인산이수소칼륨)를 포함할 수도 있다.
본 개시내용에 따르는 방법은 응집 영양 배지(예를 들어, 건조된 습식-응집 영양 배지)의 제조에 사용된다. 응집 영양 배지는 미생물(예를 들어, 세균, 효모, 곰팡이)의 성장을 촉진시키는 응집 미생물성 영양 배지일 수도 있다. 본 개시내용의 방법은 분말화된 영양소를 포함하는 영양 성분과 응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계를 포함한다. 응집 챔버는 응집 입자를 만들도록 슈기 혼합 방법을 사용하는 시스템의 구성 성분일 수 있다(예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌["The Art of Agglomeration", 1999, Powder Handling & Processing, volume 11, page 368] 참조). 예시적인 시스템은 비팩스 인터내셔널 엘엘씨 (Minneapolis, MN)로부터 입수 가능한 수직 경로 슈기 플렉스오믹스 FXD-100 혼합기/응집기이다. 응집 챔버는 제1 단부, 제1 단부와 대향하는 제2 단부, 및 그 사이에 배치된 혼합 블레이드(예를 들어, 나이프 블레이드(knife blade))를 가질 수 있다. 챔버는 챔버의 제1 단부로부터 챔버의 제2 단부까지 물질의 통과를 위한 실질적으로 수직인 경로가 구비될 수 있다.
몇몇 실시양태에 있어서, 혼합 블레이드는 혼합 블레이드가 부착되는 샤프트(shaft)와 각도를 형성한다. 샤프트에 대한 블레이드 각도는 75° 내지 105°에서 조정될 수 있다. 당업자는 블레이드 각도가 응집 영양 배지 입자의 입도 및 입도 분포의 최적 제어를 달성하도록 조정될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시양태에 있어서, 영양 성분과 응집용 유체(agglomeration fluid)는 챔버의 제1 단부에 근접한 응집 챔버로 도입될 수 있다. 실시양태에 있어서, 영양 성분은 분말 디스펜서(powder dispenser)를 통해 응집 챔버로 공급(예를 들어, 중력 유동에 의해)될 수 있다. 실시양태에 있어서, 응집용 유체는 분무 스프레이를 형성하는 하나 이상의 노즐을 통해 챔버로 도입될 수도 있다(예를 들어, 공기 구동 분무 스프레이). 영양 성분은 본 명세서에 기재되어 있는 임의의 적합한 영양 성분일 수 있다. 실시양태에 있어서, 영양 성분은 두 가지 이상의 분말화된 영양소의 실질적으로 균일한 혼합물을 포함할 수 있다.
실시양태에 있어서, 본 개시내용의 방법은 응집 챔버 내에서 미리 결정된 기간 동안(예를 들어, 최대 약 30초; 최대 약 20초; 최대 약 10초; 최대 약 5초; 최대 약 1초; 바람직하게는 최대 약 0.5초; 최대 약 0.4초; 최대 약 0.3초; 또는 최대 약 0.2초) 응집용 액체로 영양 성분을 습식 괴상화하여 응집 영양 배지를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에 있어서, 미리 결정된 기간은 특정 함수량 또는 특정 함수량의 범위를 갖는 응집 입자가 되도록 선택될 수 있다. 실시양태에 있어서, 혼합 블레이드(예를 들어, 회전 나이프 블레이드)는 영양 성분과 응집용 유체 사이의 접촉을 촉진시키고/촉진시키거나 응집 영양 배지 입자의 크기를 제한하기 위해 사용될 수 있다.
실시양태에 있어서, 본 방법은 응집 영양 배지 입자를 소정의 시간 동안 건조 조건에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다. 실시양태에 있어서, 응집 영양 배지 입자는 입자의 건조를 야기하도록 바람직하게는 주위 온도 또는 더 높은 온도에서 기체(예를 들어, 공기)에 노출될 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조 조건(예를 들어, 온도, 시간, 및 기체 또는 공기 유동)은 미리 선택된 평균 함수량 및/또는 미리 선택된 함수량의 범위를 갖는 응집 영양 배지 입자를 생산하도록 선택될 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조 온도는 약 60℃ 내지 약 85℃(포괄적 의미)일 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조 온도는 약 60℃ 내지 약 65℃(포괄적 의미)일 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조 온도는 약 65℃ 내지 약 70℃(포괄적 의미)일 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조 온도는 약 70℃ 내지 약 75℃(포괄적 의미)일 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조 온도는 약 75℃ 내지 약 80℃(포괄적 의미)일 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조 온도는 약 80℃ 내지 약 85℃(포괄적 의미)일 수 있다.
몇몇 실시양태에 있어서, 혼합 챔버는 건조기(예를 들어, 유동 베드 건조기)에 작동 가능하게 연결될 수 있어서 응집 영양 배지 입자가 혼합 챔버의 제1 단부에서 제2 단부를 지나간 후(예를 들어, 중력 유동에 의해), 입자는 건조 구역(예를 들어, 유동 베드 건조기)으로 이동한다. 이들 실시양태에 있어서, 온도, 기체(예를 들어, 공기) 유동 및 건조 구역에서의 체류 시간은 미리 선택된 함수량을 가진 입자를 생산하도록 미리 선택될 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조기는 입자를 가공 처리하기 위해 각각의 구역이 특정 온도와 체류 시간 매개변수를 갖는, 복수의 분리된 건조 구역들을 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 건조기는 냉각 구역을 포함할 수 있다.
방법의 실시양태에 있어서, 응집용 액체는 미생물의 성장을 촉진시키는 하나 이상의 용해된 영양소를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에 있어서, 응집용 액체는 완충 펩톤수를 포함한다.
본 개시내용에 따르는 방법은 영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계를 포함한다. 실시양태에 있어서, 영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 소정의 공급량으로 도입하는 단계를 포함한다. 당업자는 영양 성분과 응집용 액체의 도입량은 응집 입자의 물리적 매개변수(예를 들어, 크기, 질량, 밀도 및 형상)에 영향을 줄 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 공급량은 전형적으로 응집 챔버의 부피와 기하학적 구조에 따라 달라질 것이다. 따라서, 응집 공정이 호소카와 미크론(Hosokawa Micron)(Summit, NJ)으로부터 입수 가능한 슈기 플렉스오믹스 FX-100 응집기에서 수행되는 본 방법의 실시양태에 있어서, 영양 성분의 공급량은 약 200 내지 약 1000 ㎏/h(예를 들어, 300 내지 약 850 ㎏/h, 약 300 내지 약 750 ㎏/h, 300 내지 약 700 ㎏/h, 약 350 내지 약 650 ㎏/h, 약 400 내지 약 600 ㎏/h, 약 500 ㎏/h 등의 약 450 내지 약 550 ㎏/h)일 수 있다.
본 개시내용에 따르는 방법은 응집 챔버로 응집용 액체를 도입하는 단계를 포함한다. 실시양태에 있어서, 응집 챔버로 응집용 액체를 도입하는 단계는 응집용 액체를 소정의 분무량으로 도입하는 단계를 포함한다. 당업자는 영양 성분과 응집용 액체의 도입량은 응집 입자의 물리적 매개변수(예를 들어, 크기, 질량, 밀도 및 형상)에 영향을 줄 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 분무량은 전형적으로 응집 챔버의 부피와 기하학적 구조, 분말의 공급량과 조성물에 따라 달라질 것이다. 따라서, 응집 공정이 호소카와 미크론(Summit, NJ)으로부터 입수 가능한 슈기 플렉스오믹스 FX-100 응집기에서 수행되는 본 방법의 실시양태에 있어서, 응집용 액체의 분무량은 약 15 내지 약 80 ㎏/h(포괄적 의미); 예를 들어, 약 20 내지 약 60 ㎏/h(포괄적 의미); 약 20 내지 약 50 ㎏/h(포괄적 의미); 약 20 내지 약 40 ㎏/h(포괄적 의미); 또는 약 25 내지 약 35 ㎏/h(포괄적 의미) 등의 범위에 있을 수 있다. 당업자는 사용된 장치에 따라 액체 유동을 조절하는 방법을 알게 될 것이다. 슈기 플렉스오믹스 FX-100 응집기보다 큰 장치를 위한 지침서로서, 응집용 액체는 약 50 내지 약 300 ㎏/h(포괄적 의미) (예를 들어, 약 60 내지 약 200 ㎏/h(포괄적 의미); 약 65 내지 약 150 ㎏/h(포괄적 의미); 약 70 내지 약 125 ㎏/h(포괄적 의미); 또는 약 75 내지 약 105 ㎏/h(포괄적 의미))의 범위의 분무량으로 응집 챔버로 분무 될 수도 있다.
실시양태에 있어서, 본 개시내용의 방법에 사용되는 응집기는 혼합 블레이드를 포함할 수 있다. 혼합 블레이드는 샤프트에 결합 될 수도 있다. 혼합 블레이드는 응집 공정 동안 회전하여 i) 영양 성분과 응집용 액체 사이의 접촉을 촉진시키고/촉진시키거나, ii) 응집 입자의 입도를 제한하고/제한하거나, iii) 응집 챔버를 통한 입자의 이동을 촉진시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 기능을 수행한다. 실시양태에 있어서, 혼합 블레이드는 포괄적으로 약 500 rpm 내지 약 5000 rpm으로 회전할 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 혼합 블레이드는 3000 rpm으로 회전할 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 혼합 블레이드는 4000 rpm으로 회전될 수 있다. 당업자는 회전 속도 및/또는 혼합 블레이드의 기하학적 구조는 상기에 기재되어 있는 바와 같이 입자 형상, 유효 입도(예를 들어, 평균 입도 및/또는 입도 범위), 밀도, 및/또는 응집 영양 배지 입자의 충전 밀도(packed density)를 조절하는 데 사용될 수도 있다는 것을 인식할 것이다.
따라서, 공정 조건의 적어도 일부(예를 들어, 영양 공급량, 응집용 액체 분무량, 블레이드 회전 속도, 및/또는 미리 결정된 건조 온도)는 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 건식의 응집 영양 배지 입자의 하나 이상의 물리화학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 이들 특성은 평균 유효 입경, 평균 입경, 입자 형상, 평균 입자 질량, 평균 입자 함수량, 유효 입경의 범위, 입자 질량의 범위 및/또는 입자 함수량의 범위를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 하나 또는 둘 이상의 물리화학적 특성의 조합은 건식의 응집 영양 배지 입자의 유체역학적 특성(예를 들어, 수용액에서의 입자 강하율(sink rate), 수용액에서의 입자 용해 시간)에 영향을 미칠 수 있다.
실시양태에 있어서, 본 개시내용에 따르는 방법은 평균 유효 입경 및 제1 입도 분포 범위를 가진 건식의 응집 영양 배지 입자의 집단을 생산한다. 실시양태에 있어서, 제1 입도 분포 범위는 약 105 μ 내지 약 2000 μ의 유효 입경을 갖는 응집 입자를 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 제1 입도 분포 범위는 약 105 μ 내지 약 1000 μ의 유효 입경을 갖는 응집 입자를 포함할 수 있다.
실시양태에 있어서, 방법은 미리 선택된 평균 유효 입경을 갖고/갖거나 유효 입경이 제2 입도 분포 범위에 속하는 건식의 응집 영양 배지 입자의 하위 그룹을 단리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하위 그룹은 당업계에 공지된 입자 크기 선택법을 이용하여 단리될 수 있다(예를 들어, 미리 결정된 유효 입경을 갖는 입자의 체류 또는 통과를 가능하게 하는 체(sieve)를 이용함). 실시양태에 있어서, 하위 그룹은 약 149 μ 내지 약 1000 μ(포괄적 의미)의 유효 입경을 갖는 응집 입자를 포함할 수도 있다. 실시양태에 있어서, 하위 그룹은 약 149 μ 내지 약 850 μ(포괄적 의미)의 유효 입경을 갖는 응집 입자를 포함할 수도 있다. 실시양태에 있어서, 하위 그룹은 약 149 μ 내지 약 400 μ(포괄적 의미)의 유효 입경을 갖는 응집 입자를 포함할 수도 있다. 실시양태에 있어서, 하위 그룹은 약 250 μ 내지 약 400 μ(포괄적 의미)의 유효 입경을 갖는 응집 입자를 포함할 수도 있다.
본 방법의 실시양태에 있어서, 건식의 응집 영양 배지 입자는 미리 선택된 평균 함수량을 가질 수 있다. 당업자는 원하는 평균 함수량은 예를 들어, 분무량, 건조 온도 및/또는 건조 시간 등의 어떤 공정 매개변수를 조정함으로써 달성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 평균 함수량은 예를 들어 칼 피셔(Karl Fischer) 적정법을 이용하여 측정할 수 있다. 실시양태에 있어서, 평균 중량 퍼센트 물(mean weight percent water)은 약 5 중량 퍼센트 물 미만으로 미리 선택될 수 있다. 실시양태에 있어서, 평균 중량 퍼센트 물은 약 3 중량 퍼센트 물 이하로 미리 선택될 수 있다.
방법의 실시양태에 있어서, 건식의 응집 영양 배지 입자는 중력 충전된 밀도를 가질 수 있다. 건식의 응집 영양 배지 입자의 중력 충정된 밀도는 예를 들어, 미리 정해진 부피(예를 들어, 100 mL)의 입자를 메스실린더로 붓고 입자의 질량을 측정하여 평균 밀도를 계산함으로써 측정할 수 있다. 중력 충전된 밀도는 약 0.2 g/㎤ 내지 약 0.5 g/㎤일 수 있다.
상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 본 개시내용의 방법은 건식의 응집 영양 배지에 대해 건식의 응집 영양 배지 중의 생존 가능한 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 건식의 응집 영양 배지는 당업계에 공지된 방법에 따라 생존 가능한 미생물의 수를 감소시키기 위해 에틸렌 옥사이드 증기로 처리될 수 있다. 에틸렌 옥사이드 증기로 처리한 후, 영양 배지는 사용 전에 공기를 쐬게 하여 에틸렌 옥사이드 처리된 응집 배지 중의 잔류 에틸렌을 줄이거나 제거할 수 있다. 실시양태에 있어서, 건식의 응집 영양 배지는 이온화 방사선(예를 들어, 감마선) 또는 자외선 공급원 처리하여 당업계에 공지된 방법에 따라 생존 가능한 미생물의 수를 감소시킬 수 있다. 건식의 응집 배지는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,383,810호에 기재되어 있는 바와 같이 감마선 공급원의 조사에 노출시킬 수 있다.
건식의 유동성 응집 영양 배지의 제조 방법에 더하여, 본 개시내용은 본 명세서에 기재되어 있는 방법의 실시양태에 따라 제조된 건식의 유동성 응집 영양 배지의 조성물을 추가로 제공한다. 조성물은 샘플(예를 들어, 임상 샘플, 환경 샘플, 음식 샘플, 음료 샘플, 물 샘플) 안의 미생물의 회복 및/또는 성장을 촉진시키는 영양 배지를 제조하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 조성물은 미생물 배양용 용품에서 사용될 수 있다.
유리하게는, 본 개시내용의 조성물은 유동성이고(예를 들어, 하나의 용기에서 다른 용기로 부어질 수 있음), 실질적으로 먼지가(예를 들어, 응집 배지의 제조에 사용된 영양소의 더 작은 입자) 없으며, 응집 배지가 적어도 하나의 수용성 분말을 포함하는 실질적으로 건식의 시작 물질로부터 제조된 경우, 응집 배지는 시작 물질보다 실질적으로 더 빠르게 물에서 용해될 수 있다. 2.55 g 내지 4.44 g의 건식의 응집 영양 배지(예를 들어, 완충 펩톤수, 트립티카제 대두 브로쓰 또는 예를 들어, 변성 리스테리아 회복 배지(modified Listeria recovery medium)를 만들도록 사용되는 건식의 응집 영양 배지)를 100 mL의 탈이온수를 포함하는 용기에 부어 넣고, 용기를 휘젓지 않고 실온에서 유지함으로써 용해 시간을 측정할 때, 건식의 응집 배지는 5분 이내에 용해될 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 건식의 응집 배지는 4분 이내에 용해될 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 건식의 응집 배지는 3분 이내에 용해될 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 건식의 응집 배지는 2분 이내에 용해될 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 건식의 응집 배지는 1분 이내에 용해될 수 있다.
따라서, 또 다른 국면에 있어서, 본 개시내용은 미생물 배양용 용품을 제공한다. 본 개시내용에 따르는 용품의 비제한적인 예는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,565,783호와 미국 특허 제5,089,413호에 기재되어 있는 분말-코팅된 기구와 유사한 박막 배양 기구이다. 본 개시내용의 건식의 응집 영양 배지는 박막 배양 기구 내에서 분말화된 영양소를 대신하여 사용될 수 있다.
도 1은 본 개시내용에 따르는 박막 배양 기구의 하나의 실시양태를 나타낸다. 배양 기구(10)는 상부 표면과 하부 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재(12)를 포함하는 몸체 부재를 포함한다. 기재(12)는 바람직하게는 상대적으로 강성인 필름의 물질(폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌 등)이며, 상기 필름은 물을 흡수하지 않거나 달리 물에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 대략 0.004 내지 0.007 in(0.1 내지 0.2 mm) 두께의 폴리에스테르 필름, 대략 0.004 내지 0.008 in(0.1 내지 0.18 mm) 두께의 폴리프로필렌 필름 및 대략 0.015 in(0.38 mm) 두께의 폴리스티렌 필름이 잘 작용하는 것으로 밝혀졌다. 기타 적합한 기재는 폴리에틸렌 또는 기타 방수 코팅을 포함하는 종이를 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 코팅지 기재의 예는 "쉘러 유형(Schoeller Type) MIL" 사진 인화지(쉘러 풀라스키(Pulaski), (New York, NY)로부터 상업적으로 입수 가능함)이다. 기재(12)는 박테리아 콜로니를 기재를 통하여 관찰하기를 원하는지에 따라 투명하거나 불투명할 수 있다. 박테리아 콜로니의 계수를 용이하게 하기 위하여 기재(12)는 바람직하게는 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호에 기재되어 있는 바와 같이, 기재 위에 인쇄된 정사각형 격자 패턴을 가진다.
기재(12)는 접착제(14) 층으로 그의 상부 표면이 코팅되며, 상기 접착제 층은 용이한 수화를 위하여 건조 겔화제 및/또는 영양소를 균일한 단층으로 유지하는 역할을 한다. 접착제(14)는 수불용성이고 미생물의 성장에 비저해성이어야 한다. 바람직하게는, 접착제는 습윤될 때 접착제로 코팅된 필름을 통해 박테리아 콜로니의 관찰이 가능하기에 충분히 투명하다. 접착제(14)는 감압성인 것이 바람직하다. 그러나, 더 낮은 융점의 물질이 더욱 높은 융점의 물질 위에 코팅된 열활성화 접착제가 또한 사용될 수 있다. 고무풀(mucilage) 등의 수분 활성화 접착제도 유용할 수 있다.
접착제(14)는 바람직하게는 분말화된 겔화제 및/또는 영양소의 입자의 직경보다 작은 두께로 기재(12) 상에 코팅되어야 한다. 그 목적은 상기 입자를 기재에 부착시키기에 충분하지만 입자를 접착제 중에 완전히 매립되게 할만큼 많은 것은 아닌 접착제를 도포하는 것이다. 분말(16)의 균일한 단층이 수화를 위해 노출되는 충분한 표면 영역에서 바람직하다. 일반적으로, 0.0002 내지 0.0005 in 두께 범위의 접착제 층이 적합하다. 본 개시내용의 건식의 응집 영양 배지를 포함하는 분말은 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호에 기재되어 있는 바와 같이 접착체 층 위에 코팅될 수 있다.
선택적인 커버 시트(22)는 몸체 부재의 스페이서(18)의 하나의 에지에 부착된다. 커버 시트(22)는 바람직하게는 박테리아 콜로니의 계수를 용이하게 하기 위해 투명하고 박테리아와 수증기에 대하여 실질적으로 불투과성이다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, "박테리아와 수증기에 대하여 실질적으로 불투과성인"은 기구의 보관 및 사용 동안 탈수된 배지의 원하지 않는 오염을 방지하고 인큐베이션 기간 동안 미생물의 성장을 지지할 환경을 제공하는 커버 시트를 명시한다. 일반적으로, 커버 시트는 기재(12)와 동일한 특성을 가질 것이지만, 강성일 필요는 없을 것이다.
도 1의 도시된 실시양태는 기구에 부착되는 커버 시트(22)를 포함하지만, 분말을 포함하는 실시양태는 덮여져 있지 않고 단순히 보관 및 인큐베이션 동안 살균 환경 내에 배치될 수 있음이 발명의 범주 내에서 또한 고려된다. 선택적으로, 커터 시트(22)는 접착제 층(도시되어 있지 않음)과 분말(도시되어 있지 않음)을 추가로 포함할 수 있다. 커버 시트에 부착된 접착제와 분말은 상기에 기재되어 있는 접착제(14) 및 분말(16)과 유사한(또는 동일한) 특성 및/또는 조성을 가질 수 있고 접착제(14)와 분말(16)이 기재(12)에 적용되는 것과 동일한 방식으로 커버 시트에 적용될 수 있다.
다른 국면에 있어서, 본 개시내용은 키트를 제공한다. 키트는 본 명세서에 기재되어 있는 건식의 응집 영양 배지를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 키트는 건식의 응집 영양 배지를 사용하기 위한 지침(instruction)을 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 키트는 샘플을 얻고 샘플을 가공처리하기 위한 및/또는 미생물을 배양하기 위한 용품을 추가로 포함할 수 있다. 용품은 백, 병, 샘플 취득 기구(예를 들어, 피펫, 면봉, 스펀지), 및 상기 용품의 둘 이상의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 키트는 선택제(예를 들어, 항생제)를 추가로 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 선택제는 용액 내에 또는 실질적으로 건식 형태로 제공될 수 있다. 실시양태에 있어서, 선택제는 미리 결정된 부피의 샘플에 추가될 수 있는 단위 용량 형태(예를 들어, 정제, 튜브 또는 앰플)로 제공될 수 있다. 실시양태에 있어서, 키트는 샘플 중의 미생물의 존재 여부를 검출하도록 사용되는 지시 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 실시양태들 중 어느 하나에 있어서, 키트는 건식의 응집 영양 배지의 미리 결정된 질량을 포함하는 패캐지를 포함할 수 있다. 실시양태에 있어서, 미리 결정된 질량은 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있는 재구성된 배지를 만들기 위해 미리 결정된 부피(예를 들어, 9.9 mL, 10 mL, 90 mL, 99 mL, 100 mL, 225 mL, 1.0 L 또는 3.375 L)의 수성 희석제와 혼합되기 충분한 양일 수 있다.
방법의 소정의 실시양태, 조성물, 용품 및 본 개시내용의 키트는 하기의 실시양태 목록에서 설명된다.
실시양태
실시양태 A는 건식의 유동성 응집 영양 배지의 제조 방법으로서,
분말화된 영양소를 포함하는 영양 성분과 응집용 액체를 관류형 응집 챔버를 포함하는 응집기로 도입하는 단계;
-영양 성분은 미생물의 성장을 촉진시키고;
-응집용 액체는 분무 스프레이로서 도입됨;
응집 챔버 내에서 미리 결정된 기간 동안 응집용 액체를 이용하여 영양 성분을 습식 괴상화하여 응집 영양 배지 입자를 형성하는 단계; 및
응집 영양 배지 입자를 소정의 기간 동안 건조 조건에 노출시켜 건식의 응집 영양 배지를 형성하는 단계를 포함하는, 건식의 유동성 응집 영양 배지의 제조 방법이다.
실시양태 B는 응집용 액체가 물로 구성되는 실시양태 A의 방법이다.
실시양태 C는 응집용 액체가 미생물의 성장을 촉진시키는 용해된 영양소를 갖는 용매를 포함하는 실시양태 A의 방법이다.
실시양태 D는 용매가 물을 포함하고 영양소가 펩톤, 염화나트륨, 및 인산나트륨 또는 인산칼륨인 실시양태 C의 방법이다.
실시양태 E는 영양 성분을 도입하는 단계는 두 가지 이상의 분말화된 영양소의 실질적으로 균일한 혼합물을 도입하는 단계를 포함하는 실시양태 A 내지 실시양태 D 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 F는
영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 약 50 ㎏/hr 내지 약 1000 ㎏/hr의 공급량으로 도입하는 단계를 포함하며;
응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계는 응집용 액체를 약 15 ㎏/hr 내지 약 300 ㎏/hr의 분무량으로 도입하는 단계를 포함하고;
응집기는 약 500 rpm 내지 약 4000 rpm의 블레이드 회전 속도로 회전하는 혼합 블레이드를 추가로 포함하며;
응집 영양 배지를 건조 조건에 노출시키는 단계는 응집 영양 배지를 약 60℃ 내지 약 85℃의 미리 결정된 온도에 노출시키는 단계를 포함하고;
공급량, 분무량, 블레이드 회전 속도 및 미리 결정된 온도는 5중량% 미만의미리 선택된 평균 함수량을 갖는 건식의 응집 영양 배지를 생산하도록 선택되는 실시양태 A 내지 실시양태 E 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 G는
영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 약 50 ㎏/hr 내지 약 1000 ㎏/hr의 공급량으로 도입하는 단계를 포함하며;
응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계는 응집용 액체를 약 15 ㎏/hr 내지 약 300 ㎏/hr의 분무량으로 도입하는 단계를 포함하고;
응집기는 약 500 rpm 내지 약 4000 rpm의 블레이드 회전 속도로 회전하는 혼합 블레이드를 추가로 포함하며;
응집 영양 배지를 건조 조건에 노출시키는 단계는 응집 영양 배지를 약 60℃ 내지 약 85℃의 미리 결정된 온도에 노출시키는 단계를 포함하고;
공급량, 분무량, 블레이드 회전 속도 및 미리 결정된 온도를 선택하여 중력 충전된 밀도가 0.2 내지 0.5 g/㎤인 건식의 응집 영양 배지를 생산하는 실시양태 A 내지 실시양태 F 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 H는
영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 약 50 ㎏/hr 내지 약 1000 ㎏/hr의 공급량으로 도입하는 단계를 포함하며;
응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계는 응집용 액체를 약 15 ㎏/hr 내지 약 300 ㎏/hr의 분무량으로 도입하는 단계를 포함하고;
응집기는 약 500 rpm 내지 약 4000 rpm의 블레이드 회전 속도로 회전하는 혼합 블레이드를 추가로 포함하며;
응집 영양 배지를 건조 조건에 노출시키는 단계는 응집 영양 배지를 약 60℃ 내지 약 85℃의 미리 결정된 온도에 노출시키는 단계를 포함하고;
공급량, 분무량, 블레이드 회전 속도 및 미리 결정된 온도는 제1 입도 분포 범위가 약 105 μ 내지 약 2000 μ인 입자를 갖는 건식의 응집 영양 배지를 생산하도록 선택되는 실시양태 A 내지 실시양태 G 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 I는 제1 입도 분포 범위보다 좁은 약 149 μ 내지 약 1000 μ의 제2 입도 분포 범위를 갖는, 입자의 하위 그룹을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 실시양태 A 내지 실시양태 H 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 J는 하나 이상의 분말화된 영양소가 단백질, 탄수화물, 염 및 상기 분말화된 영양소들의 두 가지 이상의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 실시양태 A 내지 실시양태 I 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 K는 건식의 응집 영양 배지에 대해 건식의 응집 영양 배지 중의 생존 가능한 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 실시양태 A 내지 실시양태 J 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 L은 건식의 응집 영양 배지에 대해 생존 가능한 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계는 건식의 응집 영양 배지를 이온화 방사선에 노출시키거나, 에틸렌 옥사이드 증기에 노출시키는 단계를 포함하는 실시양태 K의 방법이다.
실시양태 M은 실시양태 A 내지 실시양태 L 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 건식의 유동성 응집 영양 배지를 포함하는 조성물이다.
실시양태 N은 특정 질량의 건식의 응집 영양 배지는 응집 영양 배지의 제조에 사용된 동일 질량의 영양 성분보다 더 신속하게 용해되는 실시양태 M의 조성물이다.
실시양태 O는 실시양태 M 또는 실시양태 N의 조성물을 포함하는 키트이다.
실시양태 P는 조성물이 미리 결정된 질량의 건식의 응집 영양 배지를 포함하는 패키지에 배치되어 있고, 미리 결정된 질량은 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있는 재구성된 배지를 만들기 위해 수성 희석제 9.9 mL, 10 mL, 90 mL, 99 mL, 100 mL, 225 mL, 1.0 L 또는 3.375 L와 혼합되도록 선택되는 실시양태 O의 키트이다.
실시양태 Q는 백, 병 및 샘플 취득 기구로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용품을 추가로 포함하는 실시양태 O 또는 실시양태 P의 키트이다.
실시양태 R은 선택제 및/또는 지시 시약을 추가로 포함하는 실시양태 O 내지 Q 중 어느 하나의 키트이다.
실시양태 S는
제1 주 표면과 제2 주 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재;
제1 주 표면의 적어도 일부분 위에 배치된 접착제 층;
접착제 층의 적어도 일부분 위에 배치된 실시양태 M 또는 실시양태 N의 조성물을 포함하는 코팅; 및
영양 배지와 유체 접촉하도록 위치된 건식의 냉수 가용성 겔화제를 포함하는 박막 배양 기구이다.
실시양태 T는 기재의 적어도 일부분에 커플링된 커버 시트를 추가로 포함하고, 커버 시트는 제1 주 표면과 대면하는 제1 측을 갖는 실시양태 S의 박막 배양 기구이다.
실시양태 U는 겔화제는 커버 시트의 제1 측에 부착되어 있는 실시양태 T의 박막 배양 기구이다.
본 발명의 목적과 이점은 하기 예에 의해 추가로 예시되지만, 이들 실시예에서 언급된 특정 재료 및 이의 양뿐만 아니라 기타 조건과 세부사항이 본 발명을 지나치게 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1. 슈기 응집 공정을 이용한 응집 영양 배지 입자의 생산
수직 슈기 플렉스오믹스 FXD-100 혼합기/응집기(비팩스 인터내셔널 엘엘씨, Minneapolis, MN)가 습식 응집에 사용된다. 3M 컴패니(St.Paul, MN)로부터 입수한 탈수된 완충 펩톤수 25 ㎏("BPW", ISO 제형, 카탈로그 번호 BPW010)을 300 ㎏/hr의 공급량으로 분말 디스펜서를 통해 연속적으로 공급한다. 혼합기/응집기 또한 15 L /hr의 공급량으로 탈이온수와 함께 연속적으로(4개의 분사 노즐의 어레이를 통해) 공급한다. 회전 나이프 블레이드는 4000 rpm의 속도로 설정한다. 혼합기-응집기의 출구에서 수분 과립화된 분말을 중력 하에서 3개의 구획과 연결된 유동 베드 건조기로 연속적으로 쏟아 부었다. 60 내지 65℃로 가열된 공기를 이용하여 습식의 응집 생성물을 건조하기 위해 제1 구역만을 사용한다. 생성물은 배출 공기가 약 45℃에 도달할 때까지 건조하게 유지시킨다. 건식의 응집 생성물을 채질하여, 효율 직경이 40 내지 60 메시(즉, 약 250 μ 내지 약 400 μ)인 주요부(예를 들어, 40% 이상)를 갖는 20 내지 140 메시의 분말을 수거한다. 이 공정을 사용하여 수득한 자유 낙하 응집 BPW 입자는 약 0.3 내지 0.5 g/㎤의 중력 충전된 밀도와 탈이온수에서 5분 이내의 용해 시간을 포함하는 특유의 성질을 갖는다. 응집 BPW 입자의 함수량은 5% 미만이다.
실시예 2 내지 실시예 4. 슈기 응집 공정을 이용한 응집 영양 배지 입자의 생산.
실시예 2 내지 실시예 4에 있어서, 작동 조건과 기구 설정(즉, 분말 공급량, 액체 공급량, 블레이드 회전 속도, 건조 온도)이 표 1에 나타낸 값으로 조정된 것을 제외하고 실시예 1에 기재되어 있는바와 동일한 과정을 따른다.
[표 1]
Figure 112015017292034-pct00001
실시예 5 내지 실시예 7. 슈기 응집 공정을 이용한 응집 영양 배지 입자의 생산.
N13 노즐 콤보/유체 베드 FB-5(비팩스 인터내셔널 엘엘씨, Minneapolis, MN)를 구비한 수직 슈기 플렉스오믹스 FX-100가 습식 응집에 사용된다. 3M 컴패니(St.Paul MN)로부터 입수한 탈수된 완충 펩톤수 25 ㎏ ("BPW", ISO 제형, 카탈로그 번호 BPW010)을 136 ㎏/hr의 공급량으로 분말 디스펜서를 통해 연속적으로 공급한다. FX100/FB5를 또한 11.3 L/hr(실시예 5), 12.9 L/hr (실시예 6), 및 8.3 L/hr의 10% (w/w) BPW 용액(실시예 7)의 공급량으로 탈이온수와 함께 연속적으로(4개의 분사 노즐의 어레이를 통해) 공급한다. 회전 나이프 블레이드는 4000 rpm의 속도로 설정한다. 혼합기-응집기의 출구에서 수분 과립화된 분말을 중력 하에서 3개의 구획과 연결된 유동 베드 건조기로 연속적으로 쏟아 부었다. 80℃ 미만으로 가열된 공기를 이용하여 습식의 응집 생성물을 건조하기 위해 제1 구역만을 사용한다. 생성물은 배출 공기가 약 45℃에 도달할 때까지 건조하게 유지시킨다. 표 2는 각각의 실시예에 대한 작동 조건을 나타내고, 표 3은 공정으로부터 얻은 입자 분석을 나타낸다.
[표 2]
Figure 112015017292034-pct00002
[표 3]
Figure 112015017292034-pct00003
모든 특허, 특허 출원, 및 공보, 그리고 전자적으로 입수 가능한 본 명세서에서 언급된 자료의 완전한 개시가 참고로 포함되었다. 본 출원의 개시 내용과 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문서의 개시 내용(들) 사이에 임의의 모순이 존재하는 경우, 본 출원의 개시 내용이 좌우할 것이다. 상기 상세한 설명 및 예들은 단지 명확한 이해를 위해 주어졌다. 이로부터 어떠한 불필요한 제한 사항도 이해되지 않을 것이다. 당업자에게 자명한 변화가 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주 내에 포함될 것이므로, 본 발명은 도시되고 설명된 정확한 상세 사항으로 제한되지 않는다.
모든 표제는 독자의 편리함을 위한 것이며, 그렇게 특정되지 않는 한 표제 이후의 본문의 의미를 한정하기 위하여 사용되어서는 안된다.
본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들 및 기타 실시 형태는 하기의 특허청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (20)

  1. 건식의 유동성 응집 영양 배지의 제조 방법으로서,
    분말화된 영양소를 포함하는 영양 성분과 응집용 액체(agglomeration liquid)를 관류형(flow-through-type) 응집 챔버를 포함하는 응집기로 도입하는 단계;
    -상기 영양 성분은 미생물의 성장을 촉진시키고;
    -상기 응집용 액체는 분무 스프레이(atomized spray)로서 도입됨;
    상기 응집 챔버 내에서 미리 결정된 기간 동안 상기 응집용 액체로 상기 영양 성분을 습식 괴상화(wet-massing)하여 응집 영양 배지 입자를 형성하는 단계;
    상기 응집 영양 배지 입자를 소정의 기간 동안 건조 조건에 노출시켜 건식의 응집 영양 배지를 형성하는 단계; 및
    입자의 하위 그룹(subpopulation)을 선택하는 단계
    를 포함하고,
    상기 영양 성분을 응집 챔버로 도입하는 단계는 영양 성분을 50 kg/h 내지 1000 kg/h의 공급 속도로 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 응집용 액체를 응집 챔버로 도입하는 단계는 응집용 액체를 15 kg/h 내지 300 ㎏/h의 분무 속도로 도입하는 단계를 포함하고,
    상기 응집기는 혼합 블레이드를 추가로 포함하고, 상기 혼합 블레이드는 500 rpm 내지 4000 rpm의 블레이드 회전 속도로 회전되고,
    상기 응집 영양 배치를 건조 조건에 노출시키는 단계는 응집 영양 배지를 60℃ 내지 85℃의 미리 결정된 온도에 노출시키는 단계를 포함하고,
    상기 공급 속도, 상기 분무 속도, 상기 블레이드 회전 속도, 및 상기 미리 결정된 온도는 105 μm 내지 2000 μm의 제1 입도 분포 범위의 입자를 가지는 건조된 응집 영양 배지를 생성하도록 선택되고,
    상기 하위 그룹은 상기 제1 입도 분포 범위보다 좁은 149 μm 내지 1000 μm의 제2 입도 분포 범위를 갖는, 건식의 유동성 응집 영양 배지의 제조 방법.
  2. 제1항에 따른 방법에 의해 생산된 건식의 유동성 응집 영양 배지를 포함하는 조성물로서,
    특정 질량의 상기 건식의 응집 영양 배지는 상기 응집 영양 배지의 제조에 사용된 동일 질량의 영양 성분보다 더 신속하게 용해되는 조성물.
  3. 제1 주 표면과 제2 주 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재;
    상기 제1 주 표면의 적어도 일부분 위에 배치된 접착제 층;
    상기 접착제 층의 적어도 일부분 위에 배치된 제2항에 따른 조성물을 포함하는 코팅; 및
    영양 배지와 유체 접촉하도록 위치된 건식의 냉수 가용성 겔화제를 포함하는 박막 배양 기구.
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