KR102087187B1

KR102087187B1 - 피부 개선용 키트

Info

Publication number: KR102087187B1
Application number: KR1020130149433A
Authority: KR
Inventors: 김형준; 최민식; 정지용; 손의동; 채민정; 이태룡; 신동욱
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2020-03-11
Also published as: KR20150064580A

Abstract

본 발명에 따른 키트는 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트는 조사부를 포함함으로써, 피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 증가된 피부를 정상화 개선시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 블루/바이올렛 라이트를 조사하여 항균성 펩티드의 발현 및 단백질의 S-나이트로실레이션 정도를 감소시켜 피부 면역, 각질화 등을 정상화시킴으로써, 아토피성 피부염, 자가면역, 건선, 어린선, 로사시아, 표피각화, 여드름, 지루성 피부염, 가려움증 등의 피부 상태를 개선할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 정상피부를 블루/바이올렛 라이트로부터 보호하여 줄 수 있다.

Description

피부 개선용 키트{Kit for improving skin}

본 명세서에 기재된 내용은 태양광을 이용하여 피부 세포내 특정 유전자의 발현을 조절하여 피부를 보호 및 개선하는 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

태양광(태양에너지)은 빛의 파장이 긴 쪽에서부터 차례로 라디오파, 초단파, 적외선, 가시광선, 자외선, X선 및 γ선 등으로 이루어진다. 그리고 태양광의 피부에 대한 부정적인 영향이 알려지면서, 이러한 태양광으로부터 피부를 보호하기 위한 많은 제품이 개발되었다. 그러나, 대부분 태양광 중 자외선을 차단하는 기술에 대하여만 초점을 맞추어 개발되어 왔고, 그 결과 자외선 이외에 가시광선과 같은 태양광의 피부에 대한 영향에 대한 개발은 미흡한 실정이다.

또한, 기존의 제품들은 자외선을 차단하는 기술들이 대부분으로, 태양광 자체를 피부 상태를 개선하는데 사용하는 기술은 개발된 바 없었다.

국내 공개특허공보 제10-2010-0099849호

본 발명의 일측면은 태양광, 구체적으로 블루/바이올렛 라이트의 피부에 대한 기능을 이용하여 피부를 개선하기 위한 키트 또는 이를 차단하는 조성물을 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구현예는 태양광 중 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light) 조사부를 포함하고, 피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 정상피부보다 증가된 피부의 상기 항균성 펩티드의 양을 감소시키는 용도인 피부 개선용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명의 일 구현예는 태양광 중 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)을 차단하는 유효성분을 포함하고, 상기 유효성분은 피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 정상인 정상피부의 피부 보호용도인 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 키트는 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트는 조사부를 포함함으로써, 피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 정상피부보다 증가된 피부의 상기 항균성 펩티드의 양을 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 블루/바이올렛 라이트를 조사하여 항균성 펩티드의 발현 및 단백질의 S-나이트로실레이션 정도를 감소시켜 피부 면역, 각질화 등을 정상화시킴으로써, 아토피성 피부염, 자가면역, 건선, 어린선, 로사시아, 표피각화, 여드름, 지루성 피부염, 가려움증 등의 피부 상태를 개선할 수 있다. 나아가 상기와 같이 피부 세포내 항균성 펩티드의 양이 정상피부보다 증가됨으로 인해 저하된 피부 탄력을 개선함으로써 염증 또는 면역 질환 피부의 주름 생성을 개선하고 보습, 미백 효과를 제공할 수 있다. 또한, 화장품을 바르기를 꺼려하는 피부 염증 또는 면역 질환 환자의 경우 화장 전에 블루/바이올렛 라이트를 조사함으로써 피부 메이크업 효과를 극대화 시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예로서 사용되는 항균성 펩티드인 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, Psoriasin, Dermcidin, RNase7의 각 유전자 발현량(Relative mRNA Level)의 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)과 조사후(Blue)를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 사람정상각질피부세포에 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C와 플라젤린을 처리한 경우의 각 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7 유전자 발현량 변화를 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)과 조사후(Blue)로 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 사람정상각질피부세포에 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C를 처리하고, 이와 더불어 산화 질소 스캐빈저인 PTIO과 활성산소종 스캐빈저인 NAC를 각각 처리하였을 때의 각 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7 유전자 발현량 변화를 블루/바이올렛 라이트 조사전(-)과 조사후(Blue)로 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 사람정상각질피부세포에 블루/바이올렛 라이트 조사한 경우 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-protiens)의 생성량 변화를 비교한 결과(SDS-PAGE 겔의 모습)를 나타낸 것이다.
도 5는 사람정상각질피부세포에 자외선을 조사한 경우 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-protiens)의 생성량 변화를 비교한 결과(SDS-PAGE 겔의 모습)를 나타낸 것이다.

본 명세서에서 “태양광(sunlight)”이라 함은 자외선뿐만 아니라 라디오파, 초단파, 적외선, 가시광선, X선 및 γ선 등 태양광의 모든 파장을 포함하는 최광의의 개념이다. 또한, 본 명세서에서 "피부세포"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직의 세포를 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 몸 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발에 존재하는 세포를 포함하는 최광의의 개념이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 구현예는 태양광 중 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light) 조사부를 포함하고, 피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 정상피부보다 증가된 피부의 상기 항균성 펩티드의 양을 감소시키는 용도인 피부 개선용 키트를 제공한다. 이때 상기 피부세포 내 항균성 펩티드의 양의 정상피부보다 증가된 피부는 예를 들면 정상피부보다 1.2배 이상의 항균성 펩티드 양을 포함하는 피부이나, 정상피부와 비교하여 상대적으로 증가된 양의 항균성 펩티드를 포함하는 피부이면 그 증가된 양의 정도에 제한되지 않고 모두 포함된다.

일 구현예 따르면, 상기 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트는 상기 항균성 펩티드(AMPs)의 발현량을 감소시킨다. 또한, 상기 블루/바이올렛 라이트는 각종 사이토카인(cytokine) 및 이와 관련된 유전자, 단백질로서 RANTES(Human CCL5), CCL 2(Chemokine ligand 2), IL-6(Interleukin-6), IL-8(Interleukin-8), TNF-α(Tumor necrosis factor-α), COX-2(Cyclooxygenase-2) 등의 발현량을 감소시킬 수 있다.

구체적으로 상기 항균성 펩티드는 작은 분자량을 가진 단백질로, 박테리아, 바이러스 및 곰팡이와 같은 병원균에 의한 감염을 예방하는 항균 활성을 갖는다. 상기 항균성 펩티드는 혈관신생, 창상치유 및 화학주성을 유도하는 것으로 보고되고 있으며, 양전하를 띠면서 친수성 및 소수성 부위를 동시에 가지고 있는 구조적인 특징이 있다. 상기 항균성 펩티드(AMPs)로는 HBD-1(Human beta-defensin-1, ACCESSION NP_005209, VERSION NP_005029.1 GI: 4885181), HBD-2(Human beta-defensin-2, ACCESSION NP_004933, VERSION NP_004933.1 GI: 4826692), HBD-3(Human beta-defensin-3, ACCESSION AAG02237, VERSION AAG02237.1 GI: 49931627), LL-37(Cathelicidin-37, ACCESSION NP_004336, VERSION NP_004336.3 GI: 348041314) 서라이아신(Psoriasin, ACCESSION AAA60210, VERSION AAA60210.1 GI: 190668), 더미시딘(Dermcidin, ACCESSION NP_444513, VERSION NP_444513.1 GI: 16751921) 및 리보핵산가수분해효소 7(RNase 7, ACCESSION CAC84458, VERSION CAC84458.1 GI: 40643235) 등을 예로 들 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 HBD(Human beta-defensin)-1, HBD-2, HBD-3, LL(Cathelicidin)-37, 서라이아신(Psoriasin), 더미시딘(Dermcidin), 리보핵산가수분해효소(RNase) 7은 선천 면역 인자로서 피부 소화기 호흡기 안구 결막에 존재, 그람 양/음성세균과 진균 바이러스를 죽이거나 성장을 억제. 이들은 각질형성세포 이외에 피부의 땀샘과 피지 선의 분비물에 존재하며 땀과 피지를 통하여 피부 표면으로 분비되고 침착되어 항균 장벽 형성에 기여한다. 그리고 이들은 아토피성 피부염, 건선, 자가면역 질환 등을 가지고 있는 환자들에게는 정상인 보다 증가된 수치를 나타낸다. 또한, 상기 항균성 펩티드들은 자외선 조사시에는 블루/바이올렛 조사시와 반대로 발현량이 증가하는 특성을 가지고 있다. 상기 자외선에 대한 항균성 펩티드의 발현특성은 Glaser R. et al. UV-B radiation induces the expression of antimicrobial peptides in human keratinocytes in vitro and in vivo, J Allergy Clin Immunol. 2009 May;123(5):1117-23. 에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.

S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질은 자외선 조사시 발현량이 증가하지만, 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트는 상기 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량을 감소시킨다. 구체적으로, 생체내의 많은 기능과 연관된 질소 (nitric oxide)는 활성 시스테인 잔기와 반응하여 단백질 S-나이트로실레이션을 생성할 수 있고, 단백질 인산화 과정처럼 단백질 S-나이트로실레이션은 단백질 활성 등의 세포 신호전달을 조절할 수 있다. 그리고 상기 블루/바이올렛 라이트는 생체내 정상적으로 나이트로실레이션, 즉 상기와 같이 S-나이트로실레이션되어 있는 단백질에서 산화질소(Nitric Oxide)를 떼어내는 디-나이트로실레이션(De-Nitrosylation)을 유도할 수 있다. 그리고, 블루/바이올렛 라이트에 의한 상기와 같이 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량이 감소되면, 항균성 단백질(AMPs)도 감소된다.

상기 항균성 펩티드의 유전자 또는 S-나이트로실레이션된 단백질의 발현 수준은 예를 들어 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 노던 블롯(northern blot) 분석, 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역 블롯(immuneblot), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 비오틴-스위치 어세이(Biotin-switch assay) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 측정될 수 있다.

이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기와 같은 상기 피부세포 내 항균성 펩티드의 양이 정상피부보다 증가된 피부는 염증 또는 면역 질환 피부를 포함한다. 구체적으로, 아토피성 피부염, 건선 등의 피부 염증 또는 면역 질환은 면역계의 이상에 의한 것으로, 항균성 펩티드(AMPs) 발현량이 정상인보다 증가된 수치를 나타낸다. 아토피 피부염의 경우를 예를 들면, IL-4(인터류킨-4), IL-5, IL-10 등이 분비되며, 이중 IL-4는 IgE(Immunoglobulin E)의 증가에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 또한, 상기와 같은 피부의 염증은 표피의 탄력을 저해하므로 피부 주름 생성의 주요 원인이 되며, 피부 염증으로 인해 멜라닌 색소의 침착이 증가하여, 피부 노화가 촉진될 수 있다.

따라서, 상기 블루/바이올렛 라이트를 조사하여 상기와 같은 피부세포 내 항균성 펩티드의 양이 정상피부보다 증가된 피부내의 항균성 펩티드의 발현 및 단백질의 S-나이트로실레이션 정도를 감소시키고, 이를 조절하여 피부 면역, 각질화 등을 정상화시킴으로써, 아토피성 피부염, 자가면역, 건선, 어린선, 로사시아, 표피각화, 여드름, 지루성 피부염, 가려움증 등의 피부 상태를 개선할 수 있다. 나아가 상기와 같은 피부의 주름 생성을 개선하고 보습, 미백 효과를 제공할 수 있다.

반면, 피부세포 내 항균성 펩티드의 양이 정상인 피부는 반대로 상기와 같은 블루/바이올렛 라이트로 인한 항균성 펩티드의 양이 감소하는 것을 방지해주어야 하므로, 본 발명은 다른 일 구현예는 태양광 중 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트를 차단하는 유효성분을 포함하고, 상기 유효성분은 피부세포 내 항균성 펩티드의 양이 정상인 정상피부의 피부 보호용도인 조성물을 제공한다. 일 구현예로서, 상기 블루/바이올렛 라이트를 차단하는 유효성분은 선스크린 제품에 포함되는 태양광을 차단하는 성분이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 티타늄옥사이드(TiO₂), 징크옥사이드(ZnO) 및 티나솔브 중 1종 이상을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 상기와 같은 피부 개선용 키트의 일 구현예로서, 상기 블루/바이올렛 라이트의 세기는 0.1mW/cm²~10W/cm², 보다 구체적으로 1mW/cm²~100mW/cm²일 수 있다. 상기 범위 미만이면 효능이 미미하거나 없으며, 상기 범위 초과이면 색소침착, DNA 손상 등이 유도될 수 있다.

본 발명의 상기와 같은 피부 개선용 키트의 일 구현예로서, 상기 블루/바이올렛 라이트의 조사시간은 0.5분~120분, 보다 구체적으로 1분~60분일 수 있다. 상기 범위 미만이면 효능이 미미하거나 없으며, 상기 범위 초과이면 색소침착, DNA 손상 등이 유도될 수 있다.

일 구현예로서, 상기 블루/바이올렛 라이트 조사부는 태양광 투과성 물질을 포함할 수 있다. 상기 태양광 투과성 물질은 블루/바이올렛 라이트를 투과시키는 것이면 모두 사용이 가능하며, 예를 들면 석영판(Quartz Plate) 또는 목표로 하는 광선영역만 투과시키는 대역(帶域)통과필터(Band pass filter) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 일 구현예로서, 상기 피부 개선용 키트는 사용자의 피부 상태에 따라 상기 블루/바이올렛 라이트의 세기를 조절하는 정보 및 상기 블루/바이올렛 라이트의 조사시간을 조절하는 정보 중 하나 이상을 포함하는 설명서를 더 포함할 수 있다.

예를 들면, 청소년 이하(20세 이하) 의 경우 피부가 성인보다 민감하거나 약할 수 있으므로 성인사용량의 동량을 사용할 수는 있으나 더 적합하게는 1/2 ~ 9/10 광량으로 조사할 수 있다, 또한 병변의 크기 및 정도의 약함, 보통, 심한 정도에 따라 1 J/cm² ~ 100 J/cm²로 광량을 조절할 수 있다.

상기 설명서는 블루/바이올렛 라이트의 조사시기에 대한 정보를 더 포함할 수 있다. 사용시기는 하루 중 언제든 사용이 가능하고 여러 번 조사하는 것은 가능하며, 예를 들면 외출 전 30분 전까지의 사용 또는 반복적인 조사시 하루 3회 이하로 조사할 수 있다.

한편, 상기와 같은 본 발명의 다른 일 구현예는 태양광 중 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)을 차단하는 유효성분을 포함하고, 상기 유효성분은 피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 정상인 정상피부의 피부 보호용도인 조성물.

이하, 시험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 시험예, 실시예 및 비교예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[시험예 1]

본 발명의 일 구현예로서, 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)를 피부세포에 조사시 항균성 펩티드의 발현량 변화를 측정하는 실험을 하기와 같이 실시하였다.

먼저, 본 발명에서 사용하는 사람정상각질피부세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 상용적으로 확보되어 권장하는 방법으로, 론자사(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌(Walkersville) 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO₂ 배양기(CO₂ incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500 ml의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2 ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5 ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5 ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5 ml, 및 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다.

그 다음, 상기 사람정상각질피부세포가 배양된 배지에 400~500 nm의 블루/바이올렛 라이트(10 J/cm²)를 조사한 다음 사람정상각질피부세포의 배양액을 제거하고, 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 이후 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다.

분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다.

HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.

유전자 명칭	프라이머
HBD-1	Hs00608345_m1
HBD-2	Hs00175474_m1
HBD-3	Hs00218678_m1
LL-37	Hs00189038_m1
서라이아신(Psoriasin)	Hs00161488_m1
더미시딘(Dermcidin)	Hs00364976_m1
RNase7	Hs00922963_s1

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 선천면역 유전자, 즉 항균성 펩티드인 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, Psoriasin, Dermcidin, RNase7 모두 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)보다 조사후(Blue)에서 각 유전자 발현량(Relative mRNA Level)이 감소함을 알 수 있다. 이는 블루/바이올렛 라이트를 조사하면 피부 세포내 항균성 펩티드 발현량을 조절할 수 있음을 의미한다.

[시험예 2]

이때, 상기 블루/바이올렛 라이트(10 J/cm²) 조사 전과 후로 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C와 플라젤린(Flagellin, invivogen, San Diego, California, USA)를 처리하였다.

그 다음, 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다.

HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 1과 같다.

도 2는 사람정상각질피부세포에 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C와 플라젤린을 처리한 경우의 각 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7 유전자 발현량 변화를 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)과 조사후(Blue)로 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 2에 나타난 바와 같이 Poly I:C와 플라젤린에 의해 항균성 펩티드인 상기 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7이 증가되었을 때, 블루/바이올렛 라이트의 조사로 상기 각 유전자의 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 증감은 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다. 이는 블루/바이올렛 라이트를 조사하면 피부 세포내 항균성 펩티드 발현량을 조절할 수 있음을 의미한다.

[시험예 3]

이때, 상기 블루/바이올렛 라이트(10 J/cm²) 조사 전과 후로 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C를 처리하였다. 이와 더불어, 산화 질소 스캐빈저(Nitric oxide scavenger)인 PTIO(2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt)과 활성산소종 스캐빈저인 NAC(N-Acetyl-L-cysteine)를 각각 처리하였다(Sigma, St. Louis, MO, USA).

HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 1과 같다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 상기 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 발현량이 Poly I:C에 의해 증가되었을 때 블루/바이올렛 라이트 조사에 의해 감소되는 것을, 처리한 두 스캐빈저 중 산화 질소 스캐빈저인 PTIO을 처리한 군에서는 블루/바이올렛 라이트 조사에도 항균성 펩티드(AMPs)들의 발현량이 감소되지 않았다. 이는 블루/바이올렛 라이트가 S-나이트로실레이션 생성 및 항균성 펩티드(AMPs)의 발현 조절에 관여함을 의미한다.

[시험예 4]

본 발명의 일 구현예로서, 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)를 피부세포에 조사시 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 변화를 측정하는 실험을 하기와 같이 실시하였다.

상기 배양세포에 400~500 nm의 블루/바이올렛 라이트를 각각 10, 30, 60 J/cm²로 조사한 다음 사람정상각질피부세포의 배양액을 제거하고, 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 단백질 S-나이트로실레이션 검출을 위한 비오틴-스위치 어세이(Biotin-switch assay)를 수행하였다. 구체적으로, 상기 세척된 세포를 HENTS용액(HEPES, Triton X100, SDS, protease inhibitor, EDTA)으로 10분간 용해시켜 상등액만 취하였다. 단백질 정량 후 HEN(HEPES, protease inhibitor, EDTA) 용액을 이용하여 600ug/200ul 로 맞추었다. S-나이트로실레이션 되지 않은 시스테인(cystein)의 반응을 막기위해 MMTS(Sigma)를 10mM이 되도록 추가한 후 50℃에서 15분간 반응시켰다. 아세톤으로 단백질 침전 후, 1mM HPDP-비오틴(Pierce)이 포함된 50mM 아스코르빈산(Sigma) HENS용액(HEPES, SDS, protease inhibitor, EDTA)에 녹여 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 S-나이트로실레이션된 시스테인에 비오틴을 결합시켰다. 아세톤으로 단백질 침전 후, HENS용액으로 녹이고, 보정을 위한 투입(input)을 5% 덜어둔 뒤, 아비딘-아가로스 비드(avidin-agarose bead, Pierce)를 각각 20μl씩 가해 4℃에서 12시간 반응시켰다. 비드를 neutralization 용액(HEPES, EDTA, NaCl, Triton X 100)으로 5회 씻은 후 샘플 버퍼(sample buffer)를 넣고 끓인 뒤 투입(input)과 함께 SDS-PAGE를 수행한다. 그 후 은 염색(Silver staining)을 통해 나이트로실레이션 (S-Nitrosylation) 된 단백질을 SDS-PAGE 겔로 확인하였고, 이를 도 4에 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 블루/바이올렛 라이트를 조사하지 않은 대조군(cont)와 비교할 때, 블루/바이올렛 라이트 조사 강도가 증가할수록 생체내의 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-proteins)가 감소함을 확인할 수 있다. 이는, 블루/바이올렛 라이트 대신에 자외선(20mJ)을 조사한 것을 제외하고는 상기 실험과 동일한 조건 및 방법으로 실시한 실험결과, 자외선 조사시에는 생체내의 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-proteins)가 증가한 것과 대비되는 결과이다(도 5 참조). 이는 같은 태양광이어도 그 파장에 따라 피부에 대하여 다르게 작용하며, 블루/바이올렛 라이트는 자외선과 달리 특이적으로 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량을 감소시킬 수 있음을 의미한다.

Claims

태양광 중 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light) 조사부를 포함하고,
피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 정상피부보다 증가된 피부의 상기 항균성 펩티드의 양을 감소시키는 용도이고,
상기 블루/바이올렛 라이트는 피부 세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현량을 감소시키는 것인 피부 개선용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 상기 피부세포 내 항균성 펩티드의 양이 정상피부의 1.2배 이상인 피부의　개선용　키트.
제 1 항에 있어서, 상기 피부세포 내 항균성 펩티드의 양이 정상피부보다 증가된 피부는 염증 또는 면역 질환 피부인 키트.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 블루/바이올렛 라이트는 피부 세포 내 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 피부 개선용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 블루/바이올렛 라이트의 세기는 0.1mW/cm² ~ 10W/cm²인 피부 개선용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 블루/바이올렛 라이트의 조사시간은 0.5분 ~ 120분 인 피부 개선용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 블루/바이올렛 라이트 조사부는 태양광 투과성 물질을 포함하는 피부 개선용 키트.
제 8 항에 있어서, 상기 태양광 투과성 물질은 석영판(Quartz Plate) 또는 대역(帶域)통과필터(Band pass filter)인 피부 개선용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 피부 개선용 키트는
사용자의 피부 상태에 따라 상기 블루/바이올렛 라이트의 세기를 조절하는 정보 및 상기 블루/바이올렛 라이트의 조사시간을 조절하는 정보 중 하나 이상을 포함하는 설명서를 더 포함하는 피부 개선용 키트.
태양광 중 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)을 차단하는 유효성분을 포함하고,
상기 유효성분은 피부세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 양이 정상인 정상피부의 피부 보호용도이고,
상기 블루/바이올렛 라이트는 피부 세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현량을 감소시키는 것인 조성물.
삭제
제 11 항에 있어서, 상기 블루/바이올렛 라이트는 피부 세포 내 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.