KR102086624B1

KR102086624B1 - 브라제인 고발현용 형질전환 담배 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102086624B1
Application number: KR1020180099208A
Authority: KR
Inventors: 공광훈; 최효은; 이지인
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2020-03-10
Also published as: KR20190102964A

Abstract

본 발명은 식물체에서 브라제인을 대량으로 생산하기 위하여 식물 형질전환용 재조합 발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 담배 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터는 식물세포에서 브라제인 단백질을 활성 있는 형태로 발현시킬 수 있다. 이렇게 식물에서 대량 생산된 브라제인은 야생형의 브라제인과 그 활성이 동일하여 추후 감미료 사업화에 이바지할 수 있다.

Description

브라제인 고발현용 형질전환 담배 및 이의 제조방법{Transgenic tobacco for high expression of brazzein and method for producing thereof}

본 발명은 브라제인 고발현용 형질전환 담배 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

당류(Saccharides)와 폴리올(Polyols) 뿐만 아니라 펩타이드나 아미노산, 그리고 몇몇 화합물들은 단맛을 가지고 있다. 반면에 대부분의 단백질들은 맛이나 향을 나타내지 않는다. 그러나 몇몇 단백질들은 인간에게 있어 단맛을 느끼게 해주는데 그 예로 네오큐린(Neoculin), 마빈린(Mabinlin), 펜타딘(Pentadin), 미라큘린(Miraculin), 모넬린(Monellin), 리소자임(Egg lysozyme), 타우마틴(Thaumatin)) 그리고 브라제인(Brazzein)이 있다. 대부분의 감미단백질들은 아프리카의 열대지역의 식물에서 유래되었으며 감미단백질의 감미도에 따라 다르지만 대략 설탕 한 분자에 비해 100,000배 정도 높은 단맛을 나타낸다.

현대사회에 들어서면서 삶의 질이 향상됨에 따라 당뇨, 고혈압, 비만과 같은 각종 성인병이 주요한 질병으로 야기되고 있다. 이러한 질병을 가지고 있는 사람들은 칼로리가 높은 음식을 요구함에 있어 더욱더 살을 찌우게 함에 따라 건강상의 큰 문제를 가질 확률이 높다. 따라서 이를 해결하고자 전 세계적으로 설탕이 들어간 음식, 음료 제품에 칼로리가 낮은 설탕 대체재를 사용하고 있다. 감미단백질은 설탕보다 높은 단맛을 나타내나 칼로리는 매우 낮기 때문에 설탕 대체재로 사용하기에 매우 적합하다. 이들 대부분은 아프리카의 특수한 열대지역에서 자생하고 있으므로 감미료로 상용화하기 위해서는 효모나 식물 발현계 등을 이용한 식품친화성 생물 공학적 연구가 필수적이다.

브라제인은 1994년 미국의 Wisconsin-Madison 대학에 의해 서아프리카에서 자생하는 열대과일 오블리(Oubli, Pentadiplandra brazzeana Bailon)의 씨를 둘러싸고 있는 펄프 조직에서 처음으로 발견된 감미단백질이다. 이는 1989년에 발견된 감미단백질 펜타딘(Pentadin) 이후로 오블리 과일에서 발견된 두 번째 감미단백질로서, 54개의 아미노산으로 구성되어 있으며 감미단백질 중 분자량이 6.5 kDa으로 가장 작고, 하나의 α-helix와 세 개의 β-sheet의 형태로 이루어져 있다. 이는 무게대비 2% 설탕 수용액과 비교하여 약 2,000배가 달며, 분자량 대비 9,500배가 단 특징이 있으며 감미료 중 설탕과 가장 유사한 맛을 나타내고 후미 또한 깔끔하다. 또한 분자 내 4개의 이황화 결합이 존재하여 다른 단백질들에 비해 높은 열과 넓은 pH 범위에서 안정하기 때문에(98℃에서 2시간, pH 2.5-8.0) 감미료나 식품 첨가제로 매우 적합하다.

브라제인은 오블리 무게의 0.05-0.2% 비율로 존재하며, N-말단 아미노산 잔기에 따라 두 가지 타입이 존재한다. 하나는 80%로 존재하는 주 타입(pGlu-1-brazzein) 브라제인으로 N-말단에 pyroglutamate(Pyro Glu, Pyro E)가 있다. 그리고 나머지 하나는 20%로 존재하는 부 타입(des-pGlu-1-brazzein) 브라제인으로 N-말단에 pyroglutamate가 없으며 53개의 아미노산으로 구성되어 있다.

식물 발현계를 이용하여 재조합 단백질을 생산할 경우 포유동물, 효모, 다양한 세포주, 박테리아 발현계를 사용했을 때와는 또 다른 장점이 존재한다. 세포 내 소포체와 골지체가 있어 번역 후 수식화(Post-translational modification) 과정이 가능하여 원핵생물 발현계에서는 할 수 없는 수식된 단백질을 생산할 수 있으며, 동물세포나 실험동물을 이용하여 단백질 생산을 할 경우에 비해 인수공통병원체의 감염 우려가 없다. 또한, 빛, 땅, 물만 있으면 단백질을 무한정 생산할 수 있고, 실험실 내에서도 아가 한천배지만 있으면 지속적인 계대 배양이 가능하기 때문에 경제적인 면에서도 매우 효율적이다. 또한, 종자(Seed) 형태로 단백질을 오랫동안 저장하고 보관이 가능하다.

그러나 이러한 식물 발현계의 경우에도 발현량 증대 문제에 있어서 어려움이 존재한다.

2005년 미국에서 아그로박테리움을 매개로 하여 브라제인을 옥수수 식물체에서 발현하였다(Lamphear et al., 2005). 이 발현계에서는 옥수수 1 g 당 브라제인 53.75 ㎍이 과발현되었는데(비특허문헌 1), 2008년 텍사스의 기업인 Prodigene과 Nectar Worldwide에서 옥수수 1톤으로부터 1-2 ㎏의 브라제인을 산출하여 이를 미국 식품 의약국(Food and Drug Administration, FDA)으로부터 GRAS (Generally Recognized as Safe) 인정을 받은 뒤 감미료로 상용화 하려 하였으나 다른 농작물 간 교차오염의 문제가 대두되어 옥수수 작물 전량이 폐기되었기 때문에 상용화가 진행되지 못하였다.

따라서, 감미단백질 중 높은 열과 넓은 pH 범위에서 매우 안정하며 2% 설탕 수용액 대비 2,000배 높은 단맛으로 감미료뿐만 아니라 식품첨가물로 상용화하기에 적합하다고 판단되는 브라제인을 식물 발현계를 이용하여 대량 생산할 수 있는 새로운 형질전환 식물체 구축이 필요한 실정이다.

Lamphear, B.J., Barker, D.K., Brooks, C.A., Delaney, D.E., Lane, J.R., Beifuss, K., Love, R., Thompson, K., Mayor, J., and Clough, R. (2005). Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener. Plant biotechnology journal, 3, 103-114.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 교차오염이 발생하지 않기 때문에 상용화 단계에서 머물렀던 교차오염 문제를 해결할 수 있으며, 다른 식물체에 비해 2-3 m 가량의 큰 성체로 성장할 수 있어 브라제인 대량 생산이 가능하며, 종자 형태로 오랜 기간 동안 활성이 유지되는 상태로 보관이 가능한 형질전환된 담배를 제작함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 담배 형질전환용 재조합 벡터, 이를 형질전환시킨 브라제인 고발현용 형질전환된 담배 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 담배로부터 브라제인을 생산하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서 및 브라제인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 담배 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입되며, 브라제인 단백질을 발현하는 형질전환된 담배를 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 소포체 신호 서열(endoplasmic reticulum signal peptide) 및 브라제인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 담배 형질전환용 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; 및

상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환된 담배를 제작하는 단계;

를 포함하는 브라제인 고발현용 형질전환 담배의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은

상기 재조합 발현 벡터로 담배를 형질전환하는 단계;

상기 형질전환된 담배를 재배하는 단계;

상기 재배한 담배를 수득하는 단계; 및

상기 수득한 담배로부터 브라제인을 회수하는 단계

를 포함하는 브라제인의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 브라제인 고발현용 형질전환된 담배 제작을 위한 재조합 발현 벡터를 이용하여 단맛 활성이 변성되지 않은 고품질 브라제인 단백질을 담배와 같은 식물 발현계에서 발현시켜 저비용, 고효율로 대량 생산할 수 있다. 식물에서 대량 생산된 브라제인은 야생형의 브라제인과 그 활성이 동일하여 추후 감미료 사업화에 있어서 이바지할 수 있을 것이라 기대된다.

도 1은 4가지 유형의 브라제인 발현용 담배 발현 벡터 제작 과정의 개략도를 나타낸 것이다[(A) 발현 벡터 카세트, (B) pBI525 벡터 및 (C)pBINPLUS].
도 2는 바이너리 벡터 pBI-BZ1, pBI-BZ2, pBI-BZ3 및 pBI-BZ4의 T-DNA 영역의 지도를 나타낸 것이다[35S-35SP: 복제 인핸서 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터; AMV: 알팔파 모자이크 바이러스 RNA4 인핸서; TEV: 담배 에칭 바이러스의 비번역 리더 서열; SP, 소포체 신호 서열; KDEL, 소포체(ER) 머무름 신호; NOS-T, NOS (Nopaline Synthase Gene) 터미네이터].
도 3은 전기영동을 통해 형질전환된 Agrobacterium LBA4404에서 브라제인 유전자를 확인한 것이다[검은 색 화살표는 브라제인 PCR 산물인 159bp 위치의 밴드를 나타냄. M: 100 bp 마커 (Civic Bioscience, Beloeil, Canada). pBI-BZ1-4: 형질전환 담배].
도 4는 형질전환 담배 제작 과정을 나타낸 모식도이다[사각형 박스에는 형질전환 담배 식물체를 제작하는 순서를 나타내고, 점선 화살표는 배지 조성을 나타냄].
도 5는 Agrobacterium-매개된 담배 형질전환 과정을 나타낸 것이다[A: 야생형 담배 식물; B: 공동 배양; C: 캘러스 유도; D-F: 슈트 유도; G: 루트 유도; H: 미니 배양; 나, 대 배양].
도 6은 pBI-BZ1~4로 형질전환된 담배 대표적인 4종 사진이다[pBI-BZ1: 좌측 상단, pBI-BZ2: 우측 상단, pBI-BZ 3: 좌측 하단, pBI-BZ 4: 우측 하단].
도 7은 K. lactics GG799의 브라제인 발현 및 정제 과정을 나타낸 것이다[STEP 1 ~ STEP 3: 발현 과정, STEP 4 ~ STEP 10: 정제 과정].
도 8은 SDS-PAGE 및 HPLC 단계 11 내지 단계 12를 사용한 정제 결과 분석은 분획 당 단백질 양의 분석을 나타낸 것이다. 또한, STEP 13은 0.206 ㎎/㎖ brazzein을 사용하여 순도를 분석한 것이다.
도 9는 ELISA 결과 분석을 위한 브라제인 표준 곡선이다.
도 10은 pBI-BZ1 담배 유전자 변형 계통의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-BZ1 T-DNA의 영역. (B) NPTⅡ 및 Brazzein 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 11은 pBI-BZ2 담배 유전자 변형 계통의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-BZ2 T-DNA의 영역. (B) NPTⅡ 및 Brazzein 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 12는 pBI-BZ3 담배 유전자 변형 계통의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-B3 T-DNA의 영역. (B) NPTⅡ 및 Brazzein 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 13은 pBI-BZ4 담배 유전자 변형 계통의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-BZ4 T-DNA의 영역. (B) NPTⅡ 및 Brazzein 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 14는 pBI-BZ1 담배의 형질전환 계통의 반정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-BZ1 T-DNA의 영역. (B) EF-1α 및 브라제인 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 15는 pBI-BZ2 담배의 형질전환 계통의 반정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-BZ2 T-DNA의 영역. (B) EF-1α 및 브라제인 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 16은 pBI-BZ3 담배의 형질전환 계통의 반정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-BZ3 T-DNA의 영역. (B) EF-1α 및 브라제인 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 17은 pBI-BZ4 담배의 형질전환 계통의 반정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다[(A) pBI-BZ4 T-DNA의 영역. (B) EF-1α 및 브라제인 유전자의 확인; M, 100 bp plus ladder; P, 양성 대조군, 아그로박테리움으로부터 추출된 플라스미드; WT, 야생형 담배 식물; 1~5, 형질전환 담배 식물 라인].
도 18은 본 발명에 따른 형질전환 담배로부터 브라제인을 정제하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 19는 담배 잎에서 CM-세파로스 크로마토그래피로 정제된 브라제인의 SDS-PAGE 분석 결과이다[레인 M; 트리플 컬러 단백질 마커; 레인 1~5: CM-세파로스 크로마토그래피에 의해 용출된 분획].
도 20은 단맛 검사 체크 리스트이다.
도 21은 야생형 담배 잎과 pBI-BZ3 유전자로 형질전환된 담배 잎 사이의 브라제인 발현 수준을 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석 결과이다[레인 M, FroggaBio BLUelf Prestained 단백질 래더; 레인 1: 야생형 담배 잎의 조 추출물 20 μg; 레인 2: 형질전환 담배의 조 추출물 30 μg; 레인 3: 형질전환 담배의 조 추출물 20 ㎍].
도 22는 황산암모늄 침전에 의해 침전된 브라제인 수준의 비교를 위한 SDS-PAGE 분석 결과이다[레인 M: 크포마테인 전염색된 단백질 래더; 레인 1: 황산 암모늄 20 ~ 30%에 의해 침전된 단백질; 레인 2: 황산 암모늄 30 ~ 40%에 의해 침전된 단백질; 레인 3, 황산 암모늄 40 ~ 50%에 의해 침전된 단백질; 레인 4: 황산 암모늄 50 ~ 60%에 의해 침전된 단백질; 레인 5, 황산 암모늄 60 ~ 70%에 의해 침전된 단백질; 레인 6: 황산 암모늄 70 ~ 80%에 의해 침전된 단백질; 레인 7: 황산 암모늄 80 ~ 90%에 의해 침전된 단백질].
도 23은 열 처리로 정제된 브라제인 수준의 비교를 위한 SDS-PAGE 분석 결과이다[레인 M: FroggaBio BLUelf Prestained 단백질 래더; 레인 1, 단백질은 1시간 동안 열 처리한 후에 잔류함; 레인 2: 단백질은 2시간 동안 열 처리 후에 잔류함; 레인 3: 단백질은 3시간 동안 열 처리 후에 잔류함; 레인 4: 단백질은 4시간 동안 열 처리 후에도 잔류함].
도 24는 열 처리 및 DEAE-세파로스 크로마토그래피로 정제된 브라제인의 SDS-PAGE 분석 결과이다[레인 M: 크포마테인 전염색된 단백질 래더; 레인 1: 단백질은 2 시간 동안 열처리 후에 잔존하였다; 레인 2: DEAE-세파로스 크로마토그래피에 의한 용출 분획; 레인 3: DEAE-세파로스 크로마토그래피에 의한 통과액 분획].
도 25는 CM-세파로스 크로마토그래피로 정제된 브라제인의 SDS-PAGE 분석 결과이다[레인 M: 크포마테인 전염색된 단백질 래더; 레인 1: DEAE-세파로스 크로마토그래피에 의한 통과액 분획. 레인 2: CM-세파로스 크로마토그래피로 정제된 브라제인].
도 26은 본 발명의 형질전환 담배(Nicotiana tabacum) 및 Kluyveromyces lactis에서 발현되어 정제된 재조합 브라제인의 HPLC 패턴을 나타낸 것이다[(A): Kluyveromyces lactis, (B): Nicotiana tabacum].
도 27은 에드만 분해법에 의한 N-말단 아미노산 서열 분석 결과이다.
도 28은 본 발명의 형질전환 담배(Nicotiana tabacum)에서 발현된 재조합 브라제인의 1차 구조 및 N 말단 아미노산 서열 분석 결과이다[(A) des-pE1M-brazzein의 아미노산 서열, (B) 담배 잎으로부터 정제 된 des-pE1M-brazzein 및 brazzein의 N 말단 아미노산 서열].
도 29는 Kluyveromyces lactis에서 발현된 재조합 브라제인의 원편광 이색성 분광 스펙트럼을 나타낸 것이다[Far-UV CD 스펙트럼은 2.5, 5.0, 10 및 20 μM의 단백질 농도에서 얻어졌다].
도 30은 본 발명의 형질전환 담배(Nicotiana tabacum)에서 발현된 재조합 브라제인의 원편광 이색성 분광 스펙트럼을 나타낸 것이다[Far-UV CD 스펙트럼은 2.5, 5.0, 10 및 20 μM의 단백질 농도에서 얻어졌다].
도 31은 본 발명의 형질전환 담배(Nicotiana tabacum)의 재조합 브라제인과 Kluyveromyces lactis 간의 MRE(mean residue ellipticity)의 비교를 나타낸 것이다[실선: Nicotiana tabacum; 점선: Kluyveromyces lactis. Far-UV CD 스펙트럼은 10 μM의 단백질 농도에서 얻어졌다].
도 32는 LC-MS/MS에 의해, 본 발명의 형질전환 담배(Nicotiana tabacum)로부터 얻은 재조합 브라제인의 분자량 및 아미노산 서열 분석한 결과이다.
도 33은 본 발명의 형질전환 담배(Nicotiana tabacum)의 정제된 재조합 브라제인의 감미료 활성 테스트 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서 및 브라제인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환 담배 제작용 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에서, 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 소포체 신호 서열(endoplasmic reticulum signal peptide) 및 브라제인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 담배 형질전환용 재조합 벡터를 포함한다.

본 발명에서 '재조합 발현벡터'란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오타이드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기에서 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서는 35S 프로모터 하부에 위치하여 전사를 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서의 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서는 공지된 서열을 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 GenBank Accession No. M10851에 개시되어 있는 것으로 서열번호 1로 표시되는 염기서열일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 벡터에 소포체 신호 서열(endoplasmic reticulum signal peptide)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 소포체 신호 서열(endoplasmic reticulum signal peptide)은 브라제인의 대량 생산을 위해 소포체에 축적시키는 역할과 올바른 폴딩(folding) 구조를 가지도록 하기 위하여 브라제인 유전자의 상부에 위치하는 것이 바람직하다.

상기 브라제인은 야생형 브라제인 또는 브라제인 변이체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 브라제인은 브라제인 주타입, 부타입, 변이체를 모두 포함할 수 있다. 상기 브라제인 변이체는 브라제인 부타입(서열번호 1)의 1차 내지 4차로 변이한 변이체를 의미하며, 구체적으로 국내 등록 특허 제 981087호, 국내 등록 특허 제 108340호, 국내 등록 특허 제1416892호, 국내 등록 특허 제1416892호, 또는 국내 등록 특허 제1416892호에 개시된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예로서, 브라제인 유전자 다음에 reverse TEV(untranslated leader sequence of tobacco etch virus) 및 His-tag를 추가 포함시킬 수 있다. 상기 reverse TEV(untranslated leader sequence of tobacco etch virus)은 정제 시 뒷 서열인 His-tag를 제거하여 브라제인의 단맛 활성 유지를 위해 삽입되고, 서열번호 7로 표시된다.

본 발명의 브라제인 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 재조합 벡터는 공지의 식물 형질전환용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환 시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 식물 형질전환용 벡터이므로, 당업계에 알려진 다양한 식물체-기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 브라제인 발현을 위해서 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 소포체 신호 서열(endoplasmic reticulum signal peptide) 및 브라제인은 프로모터와 작동 가능하게 연결된다.

상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

상기 프로모터로는 칼리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT)프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터 및 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터를 포함하며, 바람직하게는 칼리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터[서열번호 5]를 사용한다.

또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein) 유전자, GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등을 포함하지만 그것에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있지만, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제가 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 가지는 pBI-BZ2, pBI-BZ3 또는 pBI-BZ4일 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 pBI-BZ3일 수 있다.

본 발명의 식물 형질전환용 벡터 pBI-BZ2의 경우에는 선택 표지 유전자로서 NOS(nopaline synthase gene) 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터, 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 소포체 신호 서열, 브라제인 유전자, reverse TEV(untranslated leader sequence of tobacco etch virus), His-tag 및 NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터가 순차적으로 연결된 유전자 구조물을 포함한다.

본 발명의 식물 형질전환용 벡터 pBI-BZ3의 경우에는 선택 표지 유전자로서 NOS(nopaline synthase gene) 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터, 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 소포체 신호 서열, 브라제인 유전자 및 NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터가 순차적으로 연결된 유전자 구조물을 포함한다.

본 발명의 식물 형질전환용 벡터 pBI-BZ4의 경우에는 선택 표지 유전자로서 NOS(nopaline synthase gene) 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터, 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 브라제인 유전자 및 NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터가 순차적으로 연결된 유전자 구조물을 포함한다.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움속 미생물(agrobacterium spp.)에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 내로 브라제인 유전자가 도입되도록 하였다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 형질전환된 세포로는 아그로박테리움속 미생물(agrobacterium spp.), 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefacience)또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)일 수 있다.

본 발명에서는 또한 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 담배를 제공한다. 상기 형질전환된 담배는 브라제인을 과발현하며, 담배의 세포, 조직 또는 그 배양물일 수 있으며 담배의 일부 또는 전체를 포함한다.

본 발명에서의 담배는 바람직하게는 씨(종자)를 만들고 퍼뜨려 번식하는 종자식물에 속한다. 상기 종자식물은 크게 영양 기관인 뿌리, 줄기, 잎, 그리고 생식기관인 꽃으로 구성되어 있고, 발달하지 않은 배아 상태의 식물인 종자가 있다. 본 발명에서의 담배는 완전한 구조를 갖는 전체 담배 식물체이거나 상기 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 등 기관, 조직 또는 다수의 세포로 이루어진 담배의 일부일 수 있다. 담배의 일부는 전체 식물체에 연결된 상태일 수도 있고, 분리된 것일 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 형질전환된 담배의 세포 또는 조직은 담배에서 유래한 것이라면 종류가 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서의 담배는 담배 세포 또는 조직의 배양물을 포함한다. 상기 '배양물(culture)'은 식물 세포나 조직이 식물 전체의 형태를 형성하거나 식물체를 재생하는 능력인 전형성능을 이용하여 식물의 세포, 조직, 기관, 배, 종자 등 식물의 일부를 영양소가 첨가된 배지에서 배양한 산물을 의미한다. 상기 식물의 세포/조직 배양 산물로는 예를 들어, 배 배양, 절편 배양, 캘러스(callus) 배양, 현탁 배양, 약 배양(화분 배양), 원형질체 배양 등의 배양물일 수 있으나 여기 제한되는 것은 아니다. 원형질체는 식물 세포벽을 제거하고 분리해 낸 세포 내용물을 의미한다.

본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L.나 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 담배는 당업계에 공지된 식물의 형질전환 방법을 제한 없이 사용하여 제조할 수 있다. 식물의 형질전환 방법으로는 예를 들어, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 리포좀과 식물 원형질체를 융합하는 방법, PEG를 이용하여 재조합 발현 벡터를 식물 원형질체로 주입하는 방법, 상기 재조합 발현 벡터의 식물 세포로의 직접주입법, 미세입자충격법, 유전자총, 전기천공법(electroporation), 바이러스를 이용한 형질전환법, 진공을 이용한 형질전환법(vaccum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한,

프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 소포체 신호 서열(endoplasmic reticulum signal peptide) 및 브라제인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 담배 형질전환용 재조합 벡터를 제작하는 단계;

상기 벡터를 담배에 형질전환시켜 형질전환된 담배를 제작하는 단계;

를 포함하는 브라제인 고발현용 형질전환 담배의 제조방법을 포함한다.

(1) 단계는 담배 형질전환용 재조합 벡터를 제작하는 단계로, 본 발명에 따른 재조합 발현벡터의 제조방법에서 상술한 바와 같다.

(2) 단계는 상기 벡터를 담배에 형질전환시키는 단계로, 구체적으로 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법으로 상기 벡터를 담배에 형질전환시킬 수 있다.

상기 '아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법'은 식물의 뿌리와 줄기에 종양을 일으키는 토양의 그람 음성세균인 아그로박테리움을 이용하여 식물 세포에 외부 유전자를 전달하는 방법이다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등의 아그로박테리움에서 발견되는 종양 유발 플라스미드(tumor-inducing plasmid, Ti plasmid)의 T-DNA(transfer DNA)가 식물의 유전체(genome)에 삽입되는 현상을 이용한 방법이다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환에서는 식물에 도입하려는 외부 유전자(exogenous DNA)와 T-DNA(외부 유전자의 양쪽 가장자리에 위치하는 LB와 RB 서열)를 포함하는 바이너리 플라스미드(또는 바이너리 벡터) 및 T-DNA가 식물 유전체에 삽입되도록 하는 보조 플라스미드(helper plasmid)의 두 가지 플라스미드로 이루어진 바이너리 시스템을 이용하는 것이 일반적이다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법은 잎, 줄기, 뿌리 등 다양한 식물의 조직에 사용할 수 있으며, 어린 조직이 형질전환이 잘되는 경향이 있다.

본 발명에서의 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 이용하여 브라제인 유전자를 일과성 발현(transient expression)할 수도 있고, 안정적 발현(stable expression)할 수도 있다. 일과성 발현을 위해서는 식물의 일부, 예를 들어 식물의 잎을 재조합 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환하고, 목적하는 단백질이 충분히 발현될 수 있는 시간이 지난 뒤 식물에서 감염된 부분을 수득할 수 있다. 안정적 발현을 위하여 식물의 세포나 조직을 배양하여 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환한 뒤, 추가 배양하여 적합한 형질전환체를 선별하고 재분화 과정을 거친 뒤 완전한 구조를 갖는 형질전환 식물체로 배양할 수 있다. 상기 형질전환된 식물체에서 종자를 수득하고 발아시킴으로써 다음 세대에서도 안정적으로 형질전환 식물체를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은

상기 재조합 발현 벡터로 담배를 형질전환하는 단계;

상기 형질전환된 담배를 재배하는 단계;

상기 재배한 담배를 수득하는 단계; 및

상기 수득한 담배로부터 브라제인을 회수하는 단계

를 포함하는 브라제인의 대량 생산 방법을 포함한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 브라제인의 대량 생산 방법에서, (1) 단계는 상기 재조합 발현 벡터로 담배를 형질전환하는 단계이다.

상기 재조합 발현 벡터, 식물의 형질전환 방법, 그리고 형질전환의 대상이 되는 식물의 범위와 종류에 대하여서는 앞서 상술한 바와 같다.

(2) 단계는 상기 형질전환된 담배를 재배하는 단계이다.

상기 담배를 재배하는 단계는 담배를 형질전환한 후, 목적하는 바에 부합하는 양의 단백질을 발현하는 시간 동안 담배의 성장에 필요한 빛, 온도, 습도 등의 환경 조건과 물, 무기염류, 영양소, 호르몬 등 식물 성장에 필요한 요소들을 제공하는 것을 의미한다. 식물에서 분리된 세포, 조직 또는 이들의 배양물을 형질전환한 경우, 상기 물, 영양소, 무기염류, 생장조절제 등 담배 조직 배양에 필요한 요소들은 배양 배지(culture media)를 통해 전달될 수 있다. 또한 유도성 프로모터를 이용하여 식물에서 본 발명에 따른 브라제인을 발현시킨 경우, 상기 유도성 프로모터를 활성화하는데 필요한 해당 자극, 예를 들어 빛, 열 또는 호르몬 등을 가하면서 재배할 수 있다.

(3) 단계는 재배한 담배를 수득하는 단계이다.

상기 식물을 수득하는 단계는 형질전환되어 목적하는 단백질을 과발현하는 담배의 전체 또는 일부를 수득하는 것을 의미한다. 본 발명의 브라제인을 과발현하는 뿌리, 줄기, 잎 등의 형질전환된 부분 또는 형질전환된 식물체의 종자를 수득하는 것일 수 있으며, 식물 세포나 조직의 배양물, 예를 들어 브라제인 유전자로 형질전환된 캘러스나 원형질체 등을 수득하는 것일 수도 있다.

(4) 단계는 상기 수득한 담배로부터 브라제인을 회수하는 단계이다.

상기 단계는 형질전환 담배로부터 브라제인을 분리하는 단계로, 형질전환 담배를 분쇄하고 여과하여 단백질을 추출한다. 염석, 열 처리, 음이온 크로마토그래피 및 양이온 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 정제하여 브라제인을 고순도로 분리해낼 수 있다.

상기 염석은 30~80% 농도의 황산암모늄 용액으로 침전시켜 수행하는 것이 바람직하다.

상기 열 처리는 70~90℃에서 1~3시간 동안 실시하는 것이 바람직하다.

상기 음이온 크로마토그래피는 음이온 교환 수지인 DEAE-세파로스 (diethylamnioethyl-Sepharose)를 이용하여 수행하고, 상기 양이온 크로마토그래피는 양이온 이온 수지인 CM-세파로스(carboxymethyl-Sepharose)를 이용하여 수행하는 것이 바람직하다.

단백질을 추출하기 위하여 담배를 냉동, 건조시키는 등의 전처리를 할 수 있다. 본 발명에 따른 브라제인를 과발현하는 형질전환체 담배를 대량으로 급속 증식하여 브라제인을 대량 생산할 수 있다.

이렇게 제작된 형질전환 담배 식물체로 브라제인을 생산할 경우 교차오염이 발생하지 않기 때문에 상용화 단계에서 머물렀던 교차오염 문제를 해결할 수 있다. 또한, 형질전환 담배 식물체를 사용하여 유용단백질을 생산할 경우 다른 식물체에 비해 2-3 m 가량의 큰 성체로 성장할 수 있어 브라제인의 대량 생산이 가능하며, 종자 형태로 오랜 기간 동안 활성이 유지되는 상태로 보관이 가능한 장점이 있다.

특히, 형질전환 담배에서 수율을 다소 적게 나타났지만, 생산비가 많이 드는 효모 발현계에 비해 대량으로 재배했을 때 생산 단가 또는 관리 면에서 담배 발현계가 보다 산업상 이용 가능성이 높다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

<재료 및 실험방법>

1. 식물 발현 벡터 구축

1.1 4 종류의 유전자 발현 카세트 설계

형질전환 담배 식물체 내에서 브라제인 발현양을 비교하기 위해 발현 유전자 카세트를 네 가지로 달리하여 구축하였다. 카세트 양 말단에는 Nco I과 BamH I 제한효소 자리를 포함하여 합성하였다.

발현 유전자 카세트 중 Design 1과 Design 2는 폴리펩타이드 C 말단에 소포체 내에 단백질을 축적시키는 역할을 하는 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) 아미노산 서열의 유무에 따라 발현양의 차이를 비교하기 위해 설계하였다(도 1의 (A)). 그리고 브라제인의 N-말단이 단맛에 있어서 매우 중요하기 때문에 브라제인 유전자 서열 양 끝에 TEV(Tobacco etch virus) protease 서열을 넣어 정제 후 브라제인만 절단되도록 하였다.

Design 3과 Design 4의 경우에는 리보솜에서 만들어진 1차 형태의 폴리펩타이드가 소포체 내로 들어가게 해주는 소포체 신호서열(signal peptide, SP)[서열번호 4]의 유무에 따라 발현양의 차이를 비교하기 위해 설계하였다(도 1의 (A)).

AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서: 서열번호3 TTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCA

소포체 신호 서열(endoplasmic reticulum signal peptide): 서열번호 4

GCTACCCAAAGGAGAGCAAACCCTAGTTCTCTACATCTTATCACTGTGTTCTCACTGCTTGCTGCAGTAGTTTCCGCCGAAGTTGAT

칼리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터: 서열번호 5

GCATGCCTGCAGGTCCGATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATGGTCCGATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTAGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGG

NOS terminator: 서열번호 6

CCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG

reverse TEV(untranslated leader sequence of tobacco etch virus): 서열번호 7

ggccagttttacctcaatgag

NOS(nopaline synthase gene) 프로모터: 서열번호 8

gggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgca

네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자: 서열번호 9

atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga

1.2 pBI-BZ 벡터 구축

식물 형질전환 벡터는 아그로박테리움 플라스미드에 기초하여 제작하였다. NPTⅡ 선택 마커 유전자를 가지고 있는 pBINPLUS[중앙대학교 의과대학 생체단백질공학연구실]와 강력한 duplicated-enhancer CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) 35S promoter[서열번호 5], AMV reader (Alfalfa Mosaic Virus RNA4)[서열번호 3] 그리고 NOS terminator[서열번호 6]가 존재하는 pBI525 벡터(Datla, R.S., Bekkaoui, F., Hammerlindl, J.K., Pilate, G., Dunstan,D.I., and Crosby, W.L. (1993). Improved high-level constitutive foreign gene expression in plants using an AMV RNA4 untranslated leader sequence. Plant science, 94, 139-149.)[중앙대학교 의과대학 생체단백질공학연구실]를 ligation하여 pBI-BZ 벡터를 구축하였다(도 1의 (B)).

pBI525 벡터와 브라제인 유전자 카세트 4개를 각각 Nco I, BamH I 제한효소(TAKARA, Shiga, Japan)를 처리한 다음 0.7% 아가로스 겔에 전기영동 하였다. FavorPrep GEL/PCR Purification Mini Kit (FAVORGEN, Ping-Tung, Taiwan)를 사용하여 겔에서 추출(gel extraction) 후 20 ng/㎕ 농도의 pBI525 5 ㎕, 유전자 카세트 21 ㎕를 T4 ligase 1 ㎕, 10X ligase buffer 3 ㎕ (Promega, CA, USA)와 섞은 후 4℃에서 16시간 동안 연결(Ligation)하였다. Ligation sample 30 ㎕을 E. coli TOP10에 형질전환 후 ligation이 확인된 콜로니(Colony)를 클로닝(Cloning)하여 pBINPLLUS (도 1의 (c))와 각각 Hind Ⅲ, EcoRⅠ 제한효소(TAKARA, Shiga, Japan)를 처리한 다음 위와 동일한 방법으로 서브클로닝(Subcloning)하여 네 종류 브라제인 발현벡터 pBI-BZ1-4 (pBI-BZ1, pBI-BZ2, pBI-BZ3, pBI-BZ4)를 구축하였다(도 2).

2 식물 재료 및 형질전환

2.1 식물 재료

본 실험의 재료인 담배 Nicotiana tabacum cv. 'Xanti'는 중앙대학교 의과대학 생체단백질공학연구실에서 분양받아 MS(Murashige,T., and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 15, 473-497) 배지에서 계대배양하여 증식시킨 다음, 계대배양 1-2주 된 담배 식물체로부터 자엽을 채취하여 그 절편체(10 × 2 ㎜)를 형질전환 재료로 사용하였다.

2.2 배지 조성

형질전환에 사용된 배지는 아그로박테리움 감염배지, 공동배양 배지, 식물체 재분화 배지 및 발근배지로 구분하였으며 그 세부적 조성은 다음과 같다. 아그로박테리움 감염배지는 0.48% MS 무기염에 B5 비타민, 100 μM acetosyringone이 첨가되었고(Gamborg, O.L., Miller, R.A., and Ojima, K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental cell research, 50, 151-158), 공동배양 배지는 0.48% MS 무기염에 B5 비타민, NAA (A-naphthalene Acetic Acid) 0.1 ㎎/L, BA (BenzylAdenine, 6-Benzyl-Amino-purine) 1 ㎎/L 및 400 μM acetosyringone을 첨가하였다. 잎 절편체로부터 캘러스 유도 및 재분화를 위해 acetosyringone이 포함되지 않은 공동배양 배지에 kanamycin 100 ㎎/L 및 cefotaxime 250 ㎎/L을 첨가 하였으며, 발근 배지에는 0.48% MS 무기염에 B5 비타민, kanamycin 100 ㎎/L을 사용하였다. 아그로박테리움 감염배지를 제외한 모든 고체배지에 3% sucrose,0.8% phyto agar (Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands)가 첨가되었고 pH 5.6-5.8으로 조정하여 121℃, 1.2기압에서 15분간 고압 멸균 후 100 × 20 ㎜ 플라스틱 페트리 접시나 플랜트 박스에 분주하여 사용하였다.

2.3 아그로박테리움 형질전환

pBI-BZ1-4 binary vector (pBI-BZ1, pBI-BZ2, pBI-BZ3, pBI-BZ4)를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404[중앙대학교 의과대학 생체단백질공학연구실]로 형질전환 하기 위하여 MicroPulser electroporation system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하였다. A. tumefaciens LBA4404 electro-cells 20 ㎕에 각각의 pBI-BZ1-4 1 ㎍을 혼합하고 1 ㎜ 큐벳(cuvette)에 주입하여 1.25 KV의 전기충격을 가한 후 SOC 배지[2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10Mm NaCl, 2.5Mm KCl, 10Mm MgCl_2, 10Mm MgSO₄, 20mM glucose가 포함되어 있으며 형질전환 시 recovery에 사용됨]를 첨가하여 28℃, 200 rpm으로 1시간 진탕 배양하였다. 이후 100 ㎍/㎖ 농도로 카나마이신(Kanamycin)이 함유된 LB plate에 도말하여 37℃에서 배양한 후 colony PCR을 수행하여 형질전환된 콜로니를 선별하여 담배 형질전환에 사용하였다.

브라제인 유전자를 확인하기 위해 사용된 PCR용 올리고뉴클레오타이드 프라이머(Primer)는 브라제인 특이적 primer로 Forward 1: 5'-GAT AAG TGC AAG AAG GTT TAC GAG-3', Forward 2: 5'-GAC AAG TGT AAG AAG GTG TAC-3', Reverse: 5'-ATA CTC GCA GTA GTC GCA GAT-3'가 사용되었다. pBI-BZ1, pBI-BZ2, pBI-BZ3은 forward 1과 reverse primer를 사용하여 PCR을 수행하였으며 pBI-BZ4는 forward 2와 reverse primer를 사용하여 PCR을 수행하였다(표 1 및 표 4). PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후 94℃에서 20초, 55℃에서 10초, 72℃에서 20초로 하여 30회 수행하고 충분한 PCR 산물을 얻기 위해 마지막에 72℃에서 5분간 extension을 수행하였다(표 2). Colony PCR 반응 수행 시 Maxime PCR PreMix Kit (i-StarTaq) (Intron biotechnology, Gyeonggi-do, KOREA)를 사용하였다. PCR 완료 후 2% agarose gel 전기영동을 통해 브라제인 밴드를 확인하였다(도 3).

2.4 담배 형질전환

pBI-BZ1-4로 형질전환시킨 A. tumefaciens LBA4404를 100 ㎍/㎖의 kanamycin이 첨가된 두 개의 LB plate에 격자 모양으로 streaking 하여 28℃, 암조건 상태에서 48시간 배양하였다. 이후 전체 cell을 scraper로 긁어 모아 아그로박테리움 감염배지에 OD₆₀₀(Optical density 600 ㎚)=25가 되도록 현탁한 후 28℃, 암조건 상태에서 3-4시간 동안 활성화시켜 담배 잎 절편 접종에 사용하였다. 무균 배양한 담배 잎 절편을 활성화 된 아그로박테리움 감염배지에서 1분간 흔들어 주면서 접종 한 후 공동배양 배지에 잎 절편 윗면이 위로 가게 치상하여 3일 동안 25℃에서 암배양 하였다. 공동배양 후 기공이 있는 잎 절편체 뒷면을 위로가게 하여 선발을 겸한 캘러스 유도 및 식물체 재분화 배지에 치상하여 25℃, 16시간 광조건에서 1주마다 계대 배양하였고, 배양 2-3주 후 잎 절편체에서 형성된 캘러스를 분리하여 동일배지에서 계대배양을 계속하였다. 배양 후 약 3-4주째에 캘러스로부터 슈트가 발생하기 시작하면 슈트 부분만을 잘라 동일 배지에서 계대배양하여 소식물체로 생육시켰고, 1-2주 후 이를 발근배지로 옮겨 뿌리를 유도하였다. 4주 동안 발근이 유도되면 뿌리를 수세한 후 원예용 배양토에 식재하여 1주일간 순화과정을 거쳐 온실에서 생육하였다(도 4).

pBI-BZ1 벡터의 T-DNA 부분이 도입된 형질전환 라인에서는 100개의 잎 절편을 사용하여 74개의 캘러스를, BI-BZ2 벡터의 T-DNA 부분이 도입된 형질전환 라인에서는 100개의 잎 절편을 사용하여 82개의 캘러스를, BI-BZ3 벡터의 T-DNA 부분이 도입된 형질전환 라인에서는 100개의 잎 절편을 사용하여 96개의 캘러스를 얻었으며 마지막으로 BI-BZ4 벡터의 T-DNA 부분이 도입된 형질전환 라인에서는 100개의 잎 절편을 사용하여 77개의 캘러스를 확보하였다. 이들 캘러스로부터 부정아를 유도하여 독립적인 형질전환체 pBI-BZ1 11개체, pBI-BZ2 9개체, pBI-BZ3 15개체, pBI-BZ4 10개체를 생산하여 순화단계를 거쳐 온실에서 재배하였다.

3 형질전환 담배 식물체 분석

3.1 Anti-brazzein 항체 제작

웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 사용되는 1차 항체는 효모 Saccharomycetaceae의 종 중 하나인 Kluyveromyces lactis Strain GG799에서 53개의 아미노산을 가진 부타입 브라제인 유전자를 발현시켜 순도 높게 정제한 샘플 5 ㎎을 미국의 ProSci (12170 Flint Place Poway, CA 92064, USA)에 제작을 의뢰하여 제공받아 사용하였다. New Zealand white rabbits을 사용하여 제작되었으며 polyclonal serum 상태로 pre-immune 7.5 ㎖, bleed #1 25 ㎖, bleed #2 25 ㎖, bleed #3 25 ㎖를 제공받았다.

ELISA 수행 결과, bleed #3의 경우 1:1,000의 희석배율에서는 OD₄₅₀ 값이 1.384, 1:5,000의 희석배율에서는 OD₄₅₀ 값이 0.678, 1:250,000 값에서는 OD₄₅₀ 값이 0.221의 결과를 얻었다. ELISA와 western blot에 사용할 경우 Bleed #3의 serum을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 그 상층액을 0.22 μm filter를 사용하여 거른 다음 1:2,000의 비율로 희석하여 사용하였다.

3.2 TSP(Total soluble protein) 추출

1.5 ㎖ tube에 형질전환 담배 잎 또는 대조군으로 사용할 야생형 담배 잎 100 ㎎과 pH 7.4의 PBS buffer(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄) 300 ㎕를 넣고 균질기(homogenizer)를 사용하여 잎을 파쇄하였다. 4℃, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 그 상층액을 취하였다.

3.3 BCA (Bicinchoninic acid)를 이용한 TSP 정량

담배 잎에서 추출된 TSP을 1:5의 부피 비율로 희석한 뒤, Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Erembodegem, Belgium)를 이용하여 30분간 37℃에서 반응시킨 뒤, ELISA reader EPOCH (Biotek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 562 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

실험은 총 세 번 반복하여 진행하였다.

3.4 ELISA를 통한 형질전환 식물체 선별

Carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.2)를 사용하여 1.35 ㎎/㎖의 농도로 모든 형질전환체 및 야생형의 TSP 농도를 맞추고 indirect ELISA를 진행하였다. 96-well culture plate (Nunc, Roskilde, Denmark)에 각 well 당 TSP 100 ㎕를 코팅하고 4℃에서 16시간 배양하였다. PBS-T buffer 200 ㎕로 1분간 4번 wash를 진행한 후 3% BSA (Bioworld, Dubiln, Ohio, USA)로 150 ㎕씩 RT(Room temperature)에서 2시간 동안 blocking 하였다. 같은 방법으로 washing을 진행한 후 1차 항체를 100 ㎕씩 처리하여 37℃에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 사용된 1차 항체는 bleed #3의 serum을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 그 상층액을 0.22 μm filter기를 사용하여 거른 다음 1:2,000의 비율로 희석하여 사용하였다. 1차 항체 처리가 끝나면 wash를 진행한 후 2차 항체를 1:10,000의 부피 비율로 희석하여 100 ㎕씩 분주하여 RT에서 2시간 동안 배양하였다. 2차 항체는 goat poly anti-rabbit igG (H&L), HRP (Komabiotech, Yeongdeungpo, Seoul, Korea)를 구매하여 사용하였다. 배양이 끝나면 wash 후 기질 3.3',5.5'-tetramethylbenzidine (TMB) (KPL, Gaithersburg, MA)를 100 ㎕씩 5분간 반응시킨 다음 TMB stop 용액(KPL, Gaithersburg, MA)을 100 ㎕넣어 준 다음 ELISA reader EPOCH (Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

3.5 PCR을 통한 genomic DNA 내 T-DNA 삽입 여부 확인

선발과정을 거친 순화된 형질전환 담배 잎 100 ㎎에서 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 프로토콜에 따라 genomic DNA를 분리하여 발현벡터 내 T-DNA region이 제대로 삽입 되었는지 NPTⅡ와 브라제인 유전자를 PCR 분석을 수행하여 확인하였다.

NPTⅡ 유전자 확인용 PCR에 사용된 primer는 NPTⅡ 특이적 primer (Forward: 5'-ATG ATT GAA CAA GAT GGA TTG CAC-3', Reverse: 5'-TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG G-3')이다(표 4). PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후 94℃에서 20초, 62℃에서 10초, 72℃에서 40초로 하여 30회 수행하고 충분한 PCR 산물을 얻기 위해 마지막에 72℃에서 5분간 extension을 수행하였다(표 3).

브라제인 유전자를 확인하기 위해 사용된 primer는 브라제인 특이적 primer로 (Forward 1: 5'-GAT AAG TGC AAG AAG GTT TAC GAG-3'), (Forward 2: 5'-GAC AAG TGT AAG AAG GTG TAC-3'), (Reverse: 5'-ATA CTC GCA GTA GTC GCA GAT-3')가 사용되었다. pBI-BZ1, pBI-BZ2, pBI-BZ3은 forward 1과 reverse primer를 사용하여 PCR을 수행하였으며 pBI-BZ4는 forward 2와 reverse primer를 사용하여 PCR을 수행하였다(표 1, 4). PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후 94℃에서 20초, 55℃에서 10초, 72℃에서 20초로하여 30회 수행하고 충분한 PCR 산물을 얻기 위해 마지막에 72℃에서 5분간 extension을 수행하였다(표 3). 모든 PCR 반응 수행 시 Maxime PCR PreMix Kit (i-StarTaq) (Intron biotechnology, Gyeonggi-do, KOREA)를 사용하였다.

3.6 Total RNA 추출 및 cDNA 합성

RT-qPCR 및 semi-quantitative RT-PCR을 실시하기 위하여 형질전환 및 야생형 담배 잎 50-100 ㎎을 취한 다음 액체질소를 넣고 균질기를 사용하여 파쇄하였다. 1 ㎖의 TRIzol (Invitrogen Inc. Carlsbad, CA)를 넣고 상온에서 5분간 방치하였다. 이후 chloroform (Usb, GE Healthcare) 200 ㎕을 처리하고 15초간 흔든 뒤 상온에서 15분간 방치한 다음 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 하여 DNA, RNA, 단백질 층을 분리하였다. 분리한 RNA 500 ㎕에 iso-propanol 500 ㎕을 넣고 얼음에서 10분간 방치한 다음 동일조건으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. DEPC distilled water (DEPC D.W)가 들어간 75%의 에탄올 1 ㎖와 100%의 에탄올 1 ㎖를 사용하여 한번 더 washing 해 준 뒤, 에탄올 제거 후 DEPC D.W 40 ㎕를 이용하여 RNA를 녹여 내었다. Spectrophotometer (Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 230 ㎚, 260 ㎚ 및 280 ㎚에서 흡광도를 측정한 다음 전체 RNA의 농도 및 순도를 확인하였다. 260/280 ㎚의 값이 1.8-2.0 사이의 값인 순도 높은 RNA 1 ㎍을 QuantiTect^ⓡ Reverse Transcription Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 cDNA (Complements DNA) 20 ㎕를 합성하였다.

3.7 Semi-quantitative RT-PCR

브라제인 및 housekeeping gene으로 사용된 EF-1 α (Nicotiana tabacum elongation factor 1-alpha)의 mRNA 발현량을 확인하기 위해 합성된 cDNA를 1:20의 부피 비율로 희석하여 PCR의 template로 사용하였다. RT-PCR에 사용한 모든 primer는 Integrated DNA Technologies (IDT)의 PrimerQuest Tool을 이용하여 Macrogen (Seoul, Korea)에서 합성하여 사용하였다. 브라제인 발현량 확인 primer는 브라제인 특이적 서열을 기반으로 합성하였다(pBI-BZ1: Forward 5'-GAA CTA CCC AGT GAG CAA GTG-3', Reverse 5'-GGA GAT TGC GTT TCT CGT CAT A-3'; pBI-BZ2: Forward 5'-TCA GTT GGC GAA CCA ATG TA-3', Reverse 5'-CGC AAA TGC ACT GGA GAT TG-3'; pBI-BZ3: Forward 5'-ACG ACT GCA AGC TCG ATA AA-3', Reverse 5'-TAC TCG CAG TAG TCG CAA ATG-3'; pBI-BZ4: Forward 5'-TGT CAG CTT GCT AAC CAA TGT A-3', Reverse 5'-ACT CGC AGT AAT CGC AGA TG-3') (표 4).

Housekeeping gene의 EF-1 α 발현량 확인 primer는 (Forward: 5'-GTC AAG AAT GTT GCG GTT AAG G-3', Reverse: 5'-TGA TGA TAG CTT GGG AGG TAA AG-3')로 합성하여 사용하였다(표 4). 각 시료는 Maxime PCR PreMix Kit (i-StarTaq) (Intron biotechnology, Gyeonggi-do, KOREA)를 사용하여 94℃에서 2분간 변성 시킨 후 94℃ 20초, 55℃ 10초, 72℃ 20초로 하여 26회 수행하고 충분한 PCR 산물을 얻기 위해 마지막에 72℃에서 5분간 extension을 수행하였다(표 5). PCR이 끝나면 2% agarose gel에 5 ㎕씩 loading하여 EF-1 α 발현량 대비 브라제인 발현량을 확인하였다.

4.1. 형질전환 담배에서 브라제인 정제

4.1.1 단백질 추출

브라제인 발현양이 가장 높은 BI-BZ3으로 형질전환된 담배에서 단백질을 추출하기 위해서는 길이가 1 m 이상 자란 담배 식물체에서 잎을 채취하고, 잎을 저온냉동고(-70 ℃)에서 동결하였다. 담배 잎에서 단백질 추출을 하기 위해서는 완충용액(buffer)이 필요한데 사용되는 plant extraction buffer (tris 40 mM, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, sodium citrate 55 mM, sodium thiosulfate 12 mM, pH 6.7)는 121 ℃와 1.2기압에서 15분간 고압 멸균 후 4 ℃에 보관하였다. 이때 잎 1 g당 plant extraction buffer 4 mL 비율로 계산하여 진행하였다. 이 다음으로 동결된 잎 400 g을 차가운 상태의 plant extraction buffer 1600 mL와 함께 믹서기(National, NC250d, Japan)로 잎을 완전히 파쇄하였다. 믹서기로 충분히 균질화시킨 추출액을 분리시키기 위해 원심분리기에서 7,500 rpm, 30분의 조건으로 원심분리 후 상층액은 miracloth rapid를 이용해 떠다니는 부유물을 제거하였다. 분리된 상층액에서 엽록소를 제거하기 위해 아세트산(acetic acid)을 이용해 pH 4.0로 조정한 후 7,500 rpm, 30분의 조건으로 원심 분리하여 miracloth rapid를 이용해 엽록소를 제거하였다.

4.1.2 황산암모늄 침전법

상기 4.1.1의 추출액에서 아세트산(acetic acid)를 이용해 엽록소 제거 후 염석법(황산암모늄 침전법)을 이용하여 단백질을 침전시켰다. 이에 황산암모늄의 농도 조건을 0%부터 90%까지 10% 간격으로 침전시키고, 이 모든 단백질 침전 과정은 변성을 최대한 방지하기 위하여 4 ℃ cold chamber에서 실험을 진행하였다. 각각의 10% 간격의 황산암모늄 농도 조건에서 단백질이 침전되었고, 이를 7,500 rpm, 30분 조건에서 원심분리하여 펠렛(pellet)을 10 mL 증류수에 녹였다. 브라제인은 수용성이기 때문에 증류수에 녹여 브라제인을 가용화시켜 주었다. 10 mL 증류수에 녹아있는 단백질들을 다시 7,500 rpm, 30분 조건에서 원심분리한 후 상층액은 miracloth rapid를 이용하여 떠다니는 부유물을 제거하였다. Miracloth rapid를 이용하여 부유물을 제거 후, pore size가 0.45 μm인 filter paper(Advantec)를 이용해 2차 필터를 하여 부유물을 제거하였다. 황산암모늄의 농도 조건을 10% 간격으로 0%부터 90%까지 진행한 각각의 샘플을 모두 필터한 후 염을 제거하기 위해 증류수에서 투석을 진행하였다.

4.1.3 열 처리

위에서 언급한 것과 같이 황산암모늄의 농도 조건 실험을 통하여 브라제인이 침전되는 농도를 확인 후 해당 농도의 샘플을 모아 증류수에 투석을 하였다. 열 처리법은 고온에서 안정한 브라제인의 특성을 이용하여 다른 단백질들을 제거하고자 하였다. 투석이 완료된 샘플을 2 mL씩 4개의 마이크로 튜브(micro tube)에 담아 80 ℃를 유지하고 있는 heat block에서 1시간 간격으로 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 동안 열 처리를 진행하였다. 열 처리가 끝난 샘플들은 다시 7,500 rpm, 30분 조건에서 원심분리한 후 상층액은 miracloth rapid를 이용해 떠다니는 부유물을 제거하였다. 부유물 제거 후 브라제인이 녹아있는 상층액을 pore size가 0.45 μm인 filter paper (Advantec)를 이용하여 상층액만 필터를 하여 부유물을 걸러주었다.

4.1.4 이온크로마토그래피(Ion chromatography)

브라제인 정제에는 음이온 교환수지와 양이온 교환 수지를 이용한다. 이온 교환 수지를 사용하기 전 해당 수지에 맞는 평형완충용액에 정제할 샘플들을 투석하여 해당 수지에 로딩이 가능한 상태가 되도록 하였다. 먼저, 사용할 수지는 음이온 교환 수지인 DEAE (diethylamnioethyl) fast flow로 해당 수지의 평형완충용액인 tris-HCl (20 mM, pH 8.0)에 투석을 진행하였다. DEAE fast flow 수지를 컬럼(column)에 충진한 뒤 수지 부피의 15배 정도의 평형 완충용액을 흘려주어 평형 상태를 만든 후 샘플을 로딩(loading)하였다. 음이온 교환 수지에는 브라제인 외에 다른 단백질들이 결합하고 브라제인은 용출 되기 때문에 컬럼 용출액을 받았다. 모든 용출액을 받은 후에 용출액을 양이온 교환 수지의 평형완충용액인 50 mM sodium acetate (pH 4.0)에 투석을 하였다. 양이온 교환수지인 CM(carboxymethyl)-Sepharose fast flow 역시 이용하기 전 컬럼에 해당 수지를 충진한 뒤 수지 부피의 15배 정도의 평형 완충용액을 흘려주어 평형 상태를 만들었다. 평형 상태의 수지에 샘플을 유속 2 mL/min으로 로딩하였다. 로딩이 완료되면 OD₂₈₀값이 변화가 없을 때까지 충분히 세척완충용액(50 mM sodium acetate, 50 mM sodium chloride, pH 4.0)을 흘려준 뒤, 용출완충용액(50 mM sodium acetate, 400 mM sodium chloride, pH 7.0)을 사용하여 9 mL씩 용출 용액을 받았다. 용출 용액을 OD₂₈₀에서 측정한 후에 일정 구간을 모아서 증류수에 투석하고, 투석 후에 OD₂₈₀값 측정하여 동결건조 시켰다. 동결건조 된 샘플을 투석 후에 측정한 OD₂₈₀값을 기준으로 단백질 총량을 동일하게 하여 일부를 16.5% tris-tricine gel에서 브라제인의 순도를 확인하였다(도 18).

4.2. 형질전환 담배에서 정제한 브라제인의 특성 분석

4.2.1 고속액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography)

브라제인을 정제한 후 단백질의 순도와 구조의 변화를 확인하기 위해 HPLC(high-performance liquid chromatography)를 사용하였다. 2개의 reverse-phase를 이용하여 분석을 하고, reverse-phase HPLC column을 사용하여 Kluyveromyces lactis(K. lactis)와 담배 잎에서 정제된 브라제인의 순도를 확인하였다. 컬럼은 Shiseido사(Tokyo, Japan)의 C18 UG-120 column (5 μm, 4.6 mm x 250 mm)를 Gilder HPLC에 적용해서 순도를 확인하였다. 여기서 브라제인의 순도를 확인하기 위한 eluent는 0.1% trifluoroacetic acid 수용액(TFA; solvent-1), 70% acetonitrile와 0.1% TFA의 mixture (solvent-2)를 이용하였고, 20%부터 80%까지 gradient를 실시하였다. 유속은 0.3 mL/min으로 하였고 UV 영역인 210 nm에서 elution profile을 확인하였다(Jo, H. J., Noh. J. S., and kong, K. H. (2013). Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis. Protein Expr. Purif., 90, 84-89).

4.2.2 N-말단 아미노산 서열분석(N-Terminal amino acid sequencing)

N-말단 아미노산 서열 분석을 통하여 담배 잎에서 정제한 브라제인이 des-pE1M-brazzein의 아미노산 서열과 일치하는지 확인하였다. 담배 잎에서 정제한 브라제인을 10 μg/mL를 H₂O에 녹여 Life Science Laboratories(Seoul, Korea)에 분석 의뢰를 하였다. N-말단 아미노산 서열 분석은 Edman sequencing 방법으로 진행하였고 장비는 automated Edman sequencer를 이용하였다. 분석은 브라제인 단백질을 전기영동을 하여 PVDF에 blot된 단백질 밴드 또는 RP-HPLC C18 column 을 통하여 정제된 단백질 시료를 micro-glass fiber filer에 고정시켰다. Micro-glass fiber filer에 고정된 시료를 PITC(phenylisothiocyanate) 커플링 반응을 통한 N 말단의 폴리펩타이드 사슬들이 형성되는 초기 반응을 개시로 PTC (phenylthiocarbamyl)-폴리펩타이드, ATZ (anilinothiazolamine)-아미노산 그리고 최종 PTH(phenylthiohydantoin) 유도체 아미노산 형태의 안정화된 구조 형성을 통해 PTH-C18 컬럼을 기반으로 하는 HPLC에 주입하여 그 아미노산 유도체를 순차적으로 서열을 확인하는 방법으로 진행을 하였다.

4.2.3 원평광이색성 분석법

원편광이색성(circular dichroism, CD) 측정을 통해 담배에서 정제된 브라제인의 고차구조의 변화와 단백질 2차 구조의 구성 요소를 확인하였다. K. lactis 발현계에서 정제된 브라제인은 선행연구를 통해 단백질 구조가 확인되었다(Jo, H. J., Noh. J. S., and kong, K. H. (2013). Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis. Protein Expr. Purif., 90, 84-89). 그러므로 K. lactis 에서 정제된 브라제인과 담배 잎에서 정제된 브라제인을 비교 분석을 하였다.

브라제인 야생형 유전자가 삽입된 K. lactis Strain GG799 균주를 YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, dextrose 2%) 에 배양하여 세포를 성장 시킨 후, 유도제인 galactose가 포함된 YPGal (yeast extract 1%, peptone 2%, galactose 2%) 에 접종하여 배양하였다. 배양이 완료되면 원심분리(7,000 rpm, 30 min) 후에 상층액을 양이온 교환 수지인 CM-Sepharose를 이용하여 정제하였다. 용출이 완료된 브라제인 용액을 증류수에 투석하여 용출 용액에 포함되어있던 염을 제거한 후 동결건조 하여 16.5% tris-tricine gel에 순도를 파악하였다.

K. lactis 와 담배 잎에서 정제된 브라제인의 원편광 이색성 스펙트럼 측정은 인하대학교 표준분석 연구원에 위치한 J-815 spectrometer (Jasco co., Ltd)를 이용하였다. 광원으로는 150 W 제논 램프를 사용하였고, high performance UV-Vis-NIR avalanche photo-diode fluorescence monochromator를 이용하여 측정하였다. 실시간 측정되는 데이터는 spectra managerTM 소프트웨어로 기록, 분석하였다. 측정 전 scan 범위는 180 nm에서 260 nm로, scan 속도를 100 nm/min으로 설정한 뒤 시료를 넣지 않은 채 baseline의 흡광을 측정하였다. 이후 담배 잎과 K. lactis 에서 정제된 브라제인 샘플을 H₂O에 각각 2.5, 5.0, 10, 20 μM로 농도를 맞추어 측정하였다.

4.2.4 분자량 확인

담배 잎에서 정제한 브라제인의 분자량을 확인할 수 있는 방법은 여러 가지가 있다. 주로 질량분석기를 사용해서 질량을 측정하는데, 이는 시료의 이온화를 통해 보다 정확한 질량을 측정하여 이에 맞는 화학물질을 저장되어 있는 데이타베이스(database)인 library system (예컨데, NIST Standard Reference System)에서 맞춰 질량에 맞는 분자량을 통해 물질을 예측하였다. 이 연구에서 사용된 질량분석기는 LC-ESI-MS/MS로, 두 개의 질량분석기로 분석을 하는 시스템이다. 질량분석기의 수에 따라 질량분석기와 텐덤질량분석기로 나뉘고, 감도가 확연하게 다른 장비이며 좀 더 자세하게 분석을 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 구체적으로, 질량분석기는 이온(ion)들을 분석하지만, 텐덤질량분석기는 CID(collision-induced dissociation) 또는 ETD (electron-transfer dissociation) 방법을 통해 fragmentation시켜서 다른 MS detector로 보내게 되고 이를 통해 펩타이드 서열을 끊어 서열들을 분석하여 보다 높은 감도의 실험을 통한 결과를 얻을 수 있다. 브라제인을 확인하기 위해 업체에 의뢰하여 LC-ESI-MS/MS를 측정하였고, 얻은 결과들을 NCBI blast를 이용하여 브라제인과 비교할 것이다.

이 연구에서는 담배 잎에서 정제한 샘플이 브라제인과 분자량(6.5 kDa)이 동일한지 LC-ESI-MS/MS, Thermo LTQ orbitrap XL with ETD System을 통하여 확인하였다. 시료는 16% tris-tricine gel에 내려 6.5 kDa 부분의 밴드를 오려내어 증류수가 담긴 micro tube에 담아 프로테움텍(Seoul, Korea)에 LC-ESI-MS/MS를 의뢰하였다(도 19).

4.2.5 브라제인의 단맛 활성 측정

브라제인은 당이 아닌 단백질이기 때문에 당도계를 이용하여 측정이 불가능하다. 당도계를 이용하여 브라제인의 당 수치를 정확하게 측정할 수 없지만 객관적으로 평가하기 위해 설탕 역치 실험으로 ascending 법(Jo, H. J., Noh. J. S., and kong, K. H. (2013). Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis. Protein Expr. Purif., 90, 84-89)을 도입하였다. 사람마다 단맛을 느끼는 정도의 역치 값(threshold value)이 다르기 때문에 설탕 용액과 브라제인 샘플의 단맛을 느끼게 되는 농도를 비교하여 활성을 측정하였다. 실험은 증류수에 희석된 샘플을 사용하는데, 이때 희석해야 하는 가장 진한 농도의 샘플의 정확하게 맞춰야 제대로 된 희석이 이루어 지며 이를 통해 절대 역치 값을 정확하게 구할 수 있다. 가장 진한 농도의 브라제인 시료는 증류수에 100 μg/mL 가 되게 만들었으며, 이 용액을 기준으로 90 μg/mL, 80 μg/mL, 70 μg/mL, 60 μg/mL, 50 μg/mL 40 μg/mL, 30 μg/mL, 25μg/mL, 12.5 μg/mL, 10 μg/mL의 샘플로 희석하였다. 본 실험은 암맹 평가로 진행되며, 실험 참여자는 비흡연자로 구성하였다. 실험 전날 금주, 실험 시작 전 2시간에서 3시간은 금식을 하여 실험 조건을 최적화하였다. 실험 방법은 실험 참여자가 준비된 생수로 입안을 헹군 뒤, 샘플을 200 μL씩 낮은 농도에서 시작하여 점차적으로 고농도를 맛 보게 하여 단맛을 느끼게 되는 농도를 평가표에 체크하도록 하였다(도 20). 결과 데이터는 최소, 최대치를 제외하여 표준편차를 최소화 한 평균 값을 내었다. 그 평균 값으로 수크로오스(sucrose)의 역치 값을 구하여 담배 잎에서 정제한 브라제인의 단맛의 활성을 확인하였다.

<실험 결과>

3.1 형질전환 담배 식물체 형성

아그로박테리움을 매개로 한 담배 형질전환을 통하여 pBI-BZ1이 포함된 형질전환 식물체 11개체, pBI-BZ2 9개체, pBI-BZ3 15개체, pBI-BZ4 10개체를 확보하였다. 이중 발현이 가장 좋은 대표 개체 각 1종씩 선별하였다(도 6).

3.2 효모 Kluyveromyces lactics GG799로부터 정제한 브라제인을 이용한 항체 제작

브라제인 특이적 1차 항체 (Rabbit-anti-brazzein)를 제작하기 위해 5 ㎎의 브라제인 파우더를 효모 K. lactics GG799로부터 정제한 뒤 SDS-PAGE와 HPLC를 통해 순도 확인 후(도 6 및 도 7) 미국의 ProSci 사에 의뢰하여 사용하였다.

3.3 ELISA를 통한 형질전환 식물체 선별

BCA 단백질 정량을 통해 형질전환 및 야생형 식물체의 TSP의 농도를 1.35 ㎎/㎖로 고정시킨 후 ELISA를 진행하여 각 형질전환 라인별로 브라제인 발현량이 제일 높은 식물체를 선별하였다.

그 결과 signal peptide와 브라제인 서열로만 되어있는 pBI-BZ3 식물체에서 가장 높은 브라제인 발현을 보였다. 소포체 머무름 신호인 KDEL 아미노산 서열이 없는 pBI-BZ2 식물체의 경우 pBI-BZ1 유전자가 들어있는 식물체에 비해 약 64.31배 높은 발현을 나타내었으며, signal peptide가 있는 pBI-BZ3이 pBI-BZ4에 비해 약 6.39배의 높은 발현을 보였다(표 6).

이를 브라제인 standard curve와 비교해본 결과, pBI-BZ1 유전자가 삽입된 담배 식물체에서 0.0073 ng/㎖의 브라제인이, pBI-BZ2 유전자가 삽입된 담배 식물체에서 0.4714 ng/㎖, pBI-BZ3 유전자가 삽입된 담배 식물체에서 0.9020 ng/㎖ 그리고 pBI-BZ4 유전자가 삽입된 담배 식물체에서 0.1412 ng/㎖의 브라제인이 발현되는 것을 확인하였다(표 6).

ELISA에 의한 4가지 형질전환 계통의 브라제인 발현 수준 분석

Transgenic line	ELISA (OD ₄₅₀ )	Concentration (ng/㎖)	Fold change
pBI-BZ1	0.01	0.0073	1
pBI-BZ2	0.1625	0.4714	64.31
pBI-BZ3	0.304	0.9020	123.05
pBI-BZ4	0.054	0.1412	19.27

3.4 PCR을 통한 genomic DNA 내 T-DNA 삽입 여부 확인

브라제인 특이적 Primer와 NPTⅡ 유전자 특이적 primer를 사용하여 PCR을 실시한 결과 pBI-BZ1, pBI-BZ2, pBI-BZ3, pBI-BZ4 담배 형질전환체 모두 T-DNA가 증폭되었음을 확인하였다(도 10~14).

3.5 Semi-quantitative RT-PCR을 통한 mRNA 발현량 분석

앞의 ELISA 결과 유전자별로 브라제인 발현량이 가장 높다고 판단되는 상위 다섯 개 형질전환 식물체를 사용하여 semi-quantitative RT-PCR을 진행하였다. EF-1 α를 housekeeping gene으로 사용하여 브라제인의 발현량을 비교해본 결과 pBI-BZ1, pBI-BZ2, pBI-BZ3, pBI-BZ4 유전자가 들어간 담배 식물체 모두 야생형 담배 식물체 대비 브라제인이 과발현되었으며, pBI-BZ2 유전자가 도입된 담배 식물체의 경우 브라제인 발현이 월등히 높음을 확인하였다(도 14~17. 표 7).

semi-quantitative RT-PCR에 의한 4가지 형질전환 계통의 브라제인 mRNA 발현 수준 분석

Transgenic line	2 ^△△CT			Average (2 ^△△CT )	Fold change
pBI-BZ1	45.43	47.36	46.31	46.37	1.16
pBI-BZ2	2409.12	2403.73	2280.65	2364.50	59.05
pBI-BZ3	40.20	39.89	40.05	40.04	1.00
pBI-BZ4	2748.09	3618.40	2886.36	3084.28	77.02

4.1 형질전환 담배 잎에서 브라제인 정제

형질전환된 담배 잎에서 브라제인을 추출하기 위해서 가장 먼저 식물 추출 완충용액(plant extraction buffer)으로 모든 단백질을 추출하여 브라제인이 제대로 추출되었는지 확인하였다(도 21). 브라제인이 확인된 조주출물(crude extracts) 에서 다른 단백질과 엽록소를 제거하기 위해서 pH 조정 후 황산암모늄 침전법(ammonium sulfate precipitation)을 이용한 염석법과 열 변성을 이용하는 열 처리법을 진행하였다.

우선, 브라제인이 확인된 상층액에 대해 황산암모늄(ammonium sulfate)을 이용하여 0% - 90%까지 10% 간격으로 침전하여 브라제인의 침전 농도를 확인 결과 브라제인은 0% - 30%, 90% 이상에서는 침전되지 않고 주로 30% - 80%에 침전되는 것을 확인하였다(도 22). 브라제인이 확인된 농도만 취합하여 침전물(pellet)을 증류수에 녹여 투석을 통하여 염을 제거하고 열 처리를 하였다. 많은 단백질들은 열에 불안정하지만 브라제인은 80 ℃에서 4.5시간까지 안정하기 때문에 1시간에서 4시간까지 한 시간 간격으로 열 처리를 진행하여 단백질 제거의 최적 시간이 2시간임을 확인하였다(도 23). 1시간 열 처리한 것은 2시간부터 4시간 열 처리한 것 보다 제거되지 않은 단백질이 보였다. 2시간부터 4시간 열 처리한 것을 비교하여 보았을 때는 많은 차이를 보이지 않기 때문에 2시간 열 처리를 진행한 것이 가장 최적의 시간이라고 판단된다. 따라서 2시간의 열 처리 후에 음이온 교환 수지를 이용하여 정제를 진행하였지만 단일 밴드로 정제되지 않았다(도 24). 단일 밴드로 정제되지 않은 샘플을 취합하여 다음 단계인 양이온 교환 수지에서 브라제인 정제를 진행하였다. 양이온 교환 수지를 이용하여 정제한 브라제인을 SDS-PAGE로 확인한 결과 단일밴드(single band)임을 알 수 있었다(도 25). 단일밴드임을 확인 후 용출액을 증류수에 투석한 후 동결건조를 하여 분말 형태의 브라제인을 얻어, 정제한 브라제인의 순도와 활성을 확인하기 위하여 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 분석을 진행하였다. HPLC 측정 시 K. lactis에서 정제한 브라제인과 비교 측정을 하였다. 분석 결과 선행연구를 통해 이미 순도가 확인된 K. lactis에서 정제된 브라제인의 경우 13.234분에 나왔고, 담배에서 발현된 브라제인은 13.294분에 검출되었다. 둘의 차이는 0.06분으로 이는 거의 같은 물질로 예상되었다(도 26).

4.2.1 브라제인 정제 수율

지금까지 담배 잎에 브라제인 유전자를 형질전환하여 브라제인이 발현된다는 것을 확인할 수 있었다. 브라제인은 표 8에서 볼 수 있듯이 다양한 발현계에서 발현을 시도하였으며, 발현계에 따라 수율도 달랐다. 식물에서 형질전환을 통해 브라제인을 생산하는 연구의 역사는 길지 않지만, 다른 발현계를 이용해 브라제인을 생산하는 방법은 이미 많은 연구가 되어있다(표 8).

식물 중에서 가장 간편하고 쉽게 접근할 수 있는 담배 잎을 사용해 브라제인을 생산하는 일은 의미가 있고, 이 일을 성공시키기 위해 여러 정제 과정을 거치게 되는데, 각 단계별에서 전체 단백질(total protein) 양, 브라제인 양, 순도(purity), 정제도(fold) 와 수율(yield)을 표로 정리하였다(표 9). 정제 단계에 따라 전체 단백질의 양이 감소하며 브라제인의 양도 크게 감소하였다.

담배에서 발현되고 정제했을 때 1.9mg/Kg의 수율은 결코 적은 양이 아니다. 생산비가 많이 드는 효모 발현계에 비해 대량으로 재배했을 때 생산 단가 면이나 관리 면에서 담배 발현계가 더 좋을 수 있으므로 의미가 있다.

재조합 브라제인 생산 및 특성화에 사용되는 발현 숙주

Host	E.coli	K. lactis	Zea mays*	N. tabacum
Brazzein yield	1.8 mg/L	55 mg/L	53.8 mg/kg	1.9 mg/kg

*Not purified

4.2.2 N-말단 아미노산 서열 분석(N-Terminal amino acid sequencing)

형질전환 담배 잎에서 정제한 단백질이 목적 단백질인지 확인하기 위하여 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 정제된 샘플 10 μg/mL를 제공하였으며 Edman sequencing 방법으로 5개의 아미노산 서열을 밝혔으며, 브라제인 서열과 비교해 보았다.

담배 잎에 형질전환된 브라제인 유전자는 N-말단에 pyroglutamate가 없이 53개의 아미노산으로 구성되어 있는 minor type 브라제인였다. 서열은 D - K - C - K - K 로 진행되는데 분석 결과 D - K - X - K - K 로 세 번째 아미노산을 제외한 서열들이 일치함을 확인하였다(도 27). 데이터 상으로 읽히지 않은 세 번째 아미노산은 Edman sequencing 분석 방법 특성상 common amino acid인 경우 시스테인(cysteine)일 가능성이 제일 크기 때문에 시스테인(cysteine) 이라고 판단된다. 따라서 결과적으로 담배 잎에서 정제된 단백질은 minor type의 브라제인의 서열과 일치함을 확인하였다(도 18).

4.2.3 원편광 이색성 분광 측정법을 통한 브라제인의 고차구조 분석

원평광 이색성 분광 측정법(circular dichroism spectroscopy)을 통해 식물 발현계와 효모 발현계를 이용하여 발현, 정제한 브라제인의 고차 구조를 비교, 분석하였다. 식물에서 정제된 브라제인과 효모에서 발현된 브라제인의 평균 타원율 MRE(mean residue ellipticity)을 190 nm부터 250 nm까지의 범위에서 2.5, 5.0, 10, 20 μM 농도로 측정하였다(도 29 및 30). 측정 결과 5 μM에서 두 샘플 모두 215 nm에서 최저 흡수도가 나타났고 전체적인 스펙트럼이 유사한 것으로 보아 효모에서 정제된 브라제인과 담배 잎에서 정제된 브라제인의 고차 구조는 매우 유사한 것으로 판단된다(도 31). 또한, 10 μM 에서 측정된 각각의 값을 K2D3 프로그램을 이용하여 α나선 구조와 β가닥 구조의 함량을 구하였다.

그 결과, K. lactis 에서 정제된 브라제인은 7.41% α-나선 구조와 17.16% β-가닥 구조를 포함하고 있으며, 담배 잎에서 정제된 브라제인은 9.9% α-나선 구조와 19.7% β-가닥 구조를 포함하고 있는 것으로 나타나 약간의 차이는 있으나 큰 구조적 변화는 없다고 판단된다(표 10:K2D3에 의한 Kluyveromyces lactis 및 Nicotiana tabacum의 2차 구조 조성의 평가).

4.2.4 LC-MS/MS

담배 잎에서 정제한 브라제인의 분자량을 확인할 수 있는 방법은 여러 가지가 있다. 우선 기본적으로 질량분석기를 사용해서 정확한 분자량을 확인할 수 있고, 본 연구에서 사용된 LC-ESI-MS/MS, 이름에서 확인할 수 있듯이 두 개의 질량분석기를 이용해 분리 및 분석을 할 수 있다. 질량분석기와 텐덤질량분석기는 감도 자체가 확연히 다른 장비이고, 좀 더 확실하게 분석을 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 질량분석기는 이온들을 분석해서 분자량을 확인한다면, 텐덤질량분석기는 여기에 펩타이드를 끊어 서열을 맞춤으로서 보다 더 정확한 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.

LC-ESI-MS/MS를 분석하기 위해서 업체에 의뢰를 하였고, 분석결과는 도 32에 나타내었다. 브라제인의 54개의 서열 중에서 10개의 아미노산이 브라제인의 아미노산 서열과 일치함을 붉은 글자의 밑줄 친 부분에서 확인할 수 있다. 이는 하단의 스펙트럼(spectrum)에서 확인할 수 있는데, 여러 피크(peak)들 중에서 current와 정확도가 높은 피크들을 선정하여 서열을 맞춰 분석 대행업체에서 결과를 받을 수 있었다. 이렇게 이 서열들을 NCBI blast(ncbi.nlm.nih.gov)에서 검색결과 P56552.1의 코드를 가지고 있고, 이는 브라제인의 검색 결과로 확인할 수 있었다

4.2.5 브라제인의 단맛 활성 측정

담배 잎에서 발현 정제된 브라제인의 단맛의 정도를 수크로오스 (sucrose)에 대비하여 측정하였다. 우선 고순도로 정제된 브라제인의 농도를 정확히 구하기 위해 3번씩 BCA 정량하여 평균값을 구하였다. 브라제인 단맛 시험은 10명의 참여자에게 단계별 농도로 녹인 브라제인 샘플의 맛을 보고 단맛을 느끼는 단계에 체크하여 수크로오스와 단맛의 상대 활성을 측정하였다.

그 결과 담배 잎에서 발현된 브라제인은 수크로오스 대비 약 1,330배 정도 더 단맛을 나타내었다(도 33).

고찰

1990년대부터 모넬린, 미라큘린, 타우마틴, 브라제인 등의 감미단백질들을 식물을 이용하여 재조합 단백질로 발현시키는 연구가 활발히 진행되어 왔다. 타우마틴의 경우에는 감자에서의 발현을 시작으로 딸기, 배, 오이, 토마토에서 단백질을 과발현시키고자 하였으나 발현량은 매우 낮았다(Witty, 1990; Szwacka et al., 2002; Bartoszewski et al., 2003; Lebedev et al., 2000; Schestibratov and Dolgov, 2005). 브라제인의 경우 2005년 미국에서 옥수수에서 발현을 시켰고 그 결과 옥수수에서 브라제인은 1 kg 당 정제되지 않은 브라제인 53.75 mg 을 얻을 수 있었다(Lamphear, B.J., Barker, D.K., Brooks, C.A., Delaney, D.E., Lane, J.R., Beifuss, K., Love, R., Thompson, K., Mayor, J., and Clough, R. (2005). Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener. J. Plant Biotech., 3, 103-114). 그러나 후에 다른 농작물 간의 교차 오염의 문제가 야기되어 형질전환 옥수수 작물 전량이 폐기되어 후속 연구 진행에 어려움이 있었다. 이런 연구 결과 바탕으로 본 연구에서는 다른 식물과 비교하였을 때 2-3 m 가량의 큰 성체로 성장할 수 있어 대량 생산이 가능하고, 단백질을 종자 형태로 장기간 활성이 유지되는 상태로 보관이 가능한 장점이 있는 담배를 이용하여 연구를 진행하였다. 감미단백질 브라제인을 담배 식물체에서 재조합 단백질로 발현시키기 위하여 유전자 카세트를 달리하여 네 종류의 pBI-BZ1-4 발현 벡터를 제작하여 브라제인이 발현된 형질전환 담배 식물체를 구축하였다. 그리고 형질전환 담배 식물체를 PCR, semi-quantitative RT-PCR, RT-qPCR을 통해 식물 염색체 DNA에 T-DNA 삽입 여부와 mRNA 발현양을 확인하였다. 그 결과 pBI-BZ-3에서 가장 많은 발현양을 보였으며, 담배 잎 1 kg 당 15.3 mg 이 발현되었다. 이렇게 발현된 재조합 브라제인을 담배 잎으로부터 정제하였으며, 구조 및 특성 분석을 실시하였다. 정제 과정을 종합해 본 결과 황산 암모늄 침전법, 열처리, 양이온 크로마토그래피법, 음이온 크로마토그래피법의 정제 과정을 거쳐 브라제인을 추출, 정제하여 담배 잎 1 kg 당 1.9 mg 의 브라제인을 얻을 수 있었다. 이렇게 추출한 브라제인이 단맛 활성을 가지고 있는지 그리고 발현, 정제한 단백질이 브라제인인지를 확인하기 위하여 일차구조와 고차구조 및 단맛특성 분석을 진행하였다. 우선 SDS-PAGE로 대략적인 분자량을 확인하였으며, HPLC를 이용하여 순도 및 단백질 접힘을 확인하였다. 확인된 시료에 대해 원편광 이색성 분광법을 이용하여 단백질의 2차 구조를 확인한 결과, 효모에서 정제된 브라제인과 α-나선 구조와 β-가닥 구조의 함량을 비교하였을 때 담배 잎에서 정제된 브라제인과 약간의 차이는 있으나 큰 구조적 변화는 없다고 판단된다. N-말단 아미노산 서열 분석을 통하여 브라제인의 서열과 일치함을 확인하였으며, LC-MS/MS에서도 분자량 및 내부서열이 브라제인과 일치함을 확인하였다. 수크로오스와 단맛 비교 결과 약 1,330배 단맛을 나타난다는 결과를 얻었다. 다른 발현계에서 발현, 정제된 브라제인의 단맛과 비교분석 결과 수크로오스 대비 K. lactis에서 정제된 브라제인은 1,820배, E. coli에서 정제된 브라제인은 1,280배의 단맛 활성을 나타내었다. 원핵생물인 E. coli에서 발현된 브라제인은 재접힘(refolding) 과정을 통해 정제하기 때문에 폴딩(folding)이 다를 수 있어 진핵생물에서 정제된 브라제인 보다 단맛 활성이 다소 낮다고 판단된다. 그러나 진핵생물인 k. lactis와 담배 잎에서 정제된 브라제인의 단맛 활성은 비슷해야 하지만 약 27% 정도의 차이가 난다. 형질전환 되지 않은 담배 잎에서도 브라제인의 분자량과 비슷한 크기의 단백질이 존재한다. 그렇기 때문에 단백질 정량을 하였을 때 K. lactis에서 정제된 샘플과 다르게 담배 잎에서 정제된 샘플은 브라제인 외 다른 단백질이 포함되어있어 최종 단백질 농도는 같지만 브라제인의 농도가 다르기 때문에 단맛 활성이 낮아졌다고 판단된다. 또 한 가지 가능성은 LC-MS/MS로 측정한 형질전환 담배에서 정제한 브라제인의 분자량은 6,958로 minor type 브라제인과는 약 500정도 분자량이 크게 나타난다. 따라서 번역 후 수식과정에 의해 브라제인에 수식이 일어났을 가능성이 있으며, 이러한 수식이 단맛에 영향을 주었을 것으로 시사된다. 담배 잎에서 정제된 브라제인의 분석 결과를 종합하면 브라제인은 높은 순도와 정확한 접힘으로 정제되었고 수크로오스 대비 높은 단맛을 나타낸다. 또한, 담배 잎에서 발현된 재조합 브라제인 양은 15.3 mg 이며, 다단계의 과정을 거쳐 정제된 브라제인은 1 kg 당 1.9 mg으로 수율이 다소 낮아 보이긴 하지만 이는 결코 적은 양이 아니다. 생산비가 많이 드는 효모발현계에 비해 대량으로 재배했을 때 생산 단가 면이나 관리 면에서 담배 발현계가 더 좋을 수 있으므로 의미가 있다. 따라서, 이로부터 브라제인을 대량 생산하여 추후 감미료 사업화에 있어서 이바지할 수 있을 것이라 판단된다. 더 나아가 담배 식물만이 아닌 교차오염에 문제가 없는 과육이 맺히는 식물에 형질전환을 한다면 감미료 사업을 포함해서 농산물 시장에도 큰 도움이 될 것이라고 판단된다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Transgenic tobacco for high expression of brazzein and method for producing thereof <130> P18U21C1134 <150> KR 10-2018-0022801 <151> 2018-02-26 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein minor type <400> 1 Asp Lys Cys Lys Lys Val Tyr Glu Asn Tyr Pro Val Ser Lys Cys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Asn Gln Cys Asn Tyr Asp Cys Lys Leu Asp Lys His Ala Arg 20 25 30 Ser Gly Glu Cys Phe Tyr Asp Glu Lys Arg Asn Leu Gln Cys Ile Cys 35 40 45 Asp Tyr Cys Glu Tyr 50 <210> 2 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> brazzein minor type <400> 2 gacaaatgca aaaaagttta cgaaaattac ccagtttcta agtgccaact ggccaatcaa 60 tgcaattacg attgcaagct tgataagcat gctcgatctg gagaatgctt ttacgatgaa 120 aagagaaatc ttcaatgcat ttgcgattac tgcgaatac 159 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMV enhancer <400> 3 ttttattttt aattttcttt caaatacttc ca 32 <210> 4 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> endoplasmic reticulum signal peptide <400> 4 gctacccaaa ggagagcaaa ccctagttct ctacatctta tcactgtgtt ctcactgctt 60 gctgcagtag tttccgccga agttgat 87 <210> 5 <211> 623 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaMV 35S promoter <400> 5 gcatgcctgc aggtccgatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg 60 gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct 120 cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca 180 gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 240 ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat tgagactttt caacaaaggg 300 taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga 360 tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg 420 ttgaagatgc ctctgccgac agtagtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg 480 tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca 540 ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag 600 gaagttcatt tcatttggag agg 623 <210> 6 <211> 257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOS terminator <400> 6 ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 60 cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 120 gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 180 acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 240 ctatgttact agatcgg 257 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse TEV <400> 7 ggccagtttt acctcaatga g 21 <210> 8 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOS promoter <400> 8 gggtttctgg agtttaatga gctaagcaca tacgtcagaa accattattg cgcgttcaaa 60 agtcgcctaa ggtcactatc agctagcaaa tatttcttgt caaaaatgct ccactgacgt 120 tccataaatt cccctcggta tccaattaga gtctcatatt cactctcaat ccaaataatc 180 tgca 184 <210> 9 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPT II gene <400> 9 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795

Claims

NOS(nopaline synthase gene) 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터, 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, AMV(Alfalfa Mosaic Virus RNA4) 인핸서, 소포체 신호 서열, 브라제인 유전자 및 NOS(nopaline synthase gene) 터미네이터가 순차적으로 연결된 유전자 구조물을 포함하는 형질전환 담배 제작용 재조합 발현 벡터.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 가지는 pBI-BZ3인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 1 항의 재조합 발현벡터가 도입되며, 브라제인 단백질을 발현하는 형질전환된 담배.
제 1 항의 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; 및
상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환된 담배를 제작하는 단계;
를 포함하는 브라제인 고발현용 형질전환 담배의 제조방법.