KR102084755B1 - 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법 - Google Patents

젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 맥주박이 포함된 혼합물에 젖산균을 접종하여 발효시켜 사료 원료를 제조하고 그 사료 원료를 배합하여 완전혼합발효 사료를 제조함으로써 아미노산 등의 함량이 높아 발효사료의 영양학적 효용성 개선되고 우수한 항산화력을 가져 한우의 육질등급을 높일 수 있는 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은, 맥주박이 포함된 원료 혼합물에 젖산균을 접종하여 젖산 발효시켜 발효사료 원료를 제조하는 단계와, 상기 발효사료 원료와 완전혼합사료(TMR, Total Mixed Ration)를 혼합하여 숙성시키는 완전혼합발효 사료를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING TOTAL MIXED FERMENTATION FEED USING LACTIC ACID FERMENTATION}
본 발명은 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 맥주박이 포함된 혼합물에 젖산균을 접종하여 발효시켜 사료 원료를 제조하고 그 사료 원료를 배합하여 완전혼합발효 사료를 제조함으로써 아미노산 등의 함량이 높아 발효사료의 영양학적 효용성 개선되고 우수한 항산화력을 가져 한우의 육질등급을 높일 수 있는 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에 관한 것이다.
완전혼합사료(TMR, total mixed ration)는 조사료와 농후사료(또는 상업용 배합사료)를 영양소요구량에 맞도록 적절한 비율로 배합하고 각종 첨가제를 추가하여 만든 것으로, 조사료와 농후사료를 따로 먹이는 경우에 비하여 사료지급의 편의성이 향상된다.
완전혼합발효사료(TMF, total mixed fermentation)는 완전혼합사료에 효모균 또는 발효제와 물을 적정량 첨가한 것으로, 일반 사료에 비하여 소화 흡수율이 30% 이상 향상된 사료이다.
대한민국 등록특허 제10-1564886호(발효수분조절제 및 이를 포함하는 완전혼합발효사료), 대한민국 등록특허 제10-1032654호(완전혼합발효사료 제조 방법)에는 완전혼합발효 사료를 제조하는 기술이 개시되어 있으며, 완전혼합발효사료를 만들기 위해서는 조사료와 농후사료를 배합하고 총 수분함량이 약 40% 정도가 되도록 수분을 보충하고 발효시키게 되는데, 비용 절감을 위해 소주의 증류박이나 맥주 폐효모 등의 폐기되는 산업 부산물들을 주로 활용하고 있다.
그러나, 종래의 완전혼합발효 사료의 경우 발효에 의해 소화 흡수율이 개선되는 등의 장점이 있으나 발효에 의해 한우의 품질에 영향을 미치는 영양성분이나 항산화성 향상과 같은 사료의 품질의 개선에 대한 효과에 대한 연구나 개발은 아직 미미한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1564886호 : 발효수분조절제 및 이를 포함하는 완전혼합발효사료 대한민국 등록특허 제10-1032654호 : 완전혼합발효사료 제조 방법
본 발명은 상기와 같은 점을 인식하여 안출된 것으로 본 발명의 목적은 맥주박이 포함된 혼합물에 젖산균을 접종하여 발효시켜 사료 원료를 제조하고 그 사료 원료를 배합하여 완전혼합발효 사료를 제조함으로써 아미노산 등의 함량이 높아 발효사료의 영양학적 효용성 개선되고 우수한 항산화력을 가져 한우의 육질등급을 높일 수 있는 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 맥주박이 포함된 혼합물에 젖산균을 접종하여 발효시켜 사료 원료를 제조하고 그 사료 원료를 배합하여 완전혼합발효 사료를 제조함으로써 아미노산 등의 함량이 높아 발효사료의 영양학적 효용성 개선되고 우수한 항산화력을 가져 한우의 육질등급을 높일 수 있는 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은, 맥주박이 포함된 원료 혼합물에 젖산균을 접종하여 젖산 발효시켜 발효사료 원료를 제조하는 단계와, 상기 발효사료 원료와 완전혼합사료(TMR, Total Mixed Ration)를 혼합하여 숙성시키는 완전혼합발효 사료를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은, 상기 맥주박이 포함된 혼합물에는 당박, 펌믹스 1호, 파옥쇄 및 소맥분이 혼합된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은, 상기 맥주박이 포함된 혼합물은 중량기준으로 맥주박 30%, 당박 43.5%, 펌믹스 1호 12.5%, 파옥쇄 1.5% 소맥분 1.5%가 혼합된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은, 상기 젖산균에는 Lactobacillus casei KCTC3109(한국생명공학연구원 생물자원센터), Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652(한국생명공학연구원 생물자원센터), Lactobacillus plantarum KCTC 33131(한국생명공학연구원 생물자원센터), Leuconostoc pseudomesenteroides JLRI 01, KCCM 11443P(한국 미생물 보존센터) 중에서 어느 하나 이상이 선택된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은, 발효사료 원료의 젖산 발효는 20~30℃의 온도에서 7~10일간 혐기 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 구성에 의하여 본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은 맥주박이 포함된 혼합물에 젖산균을 접종하여 발효시켜 사료 원료를 제조하고 그 사료 원료를 배합하여 완전혼합발효 사료를 제조함으로써 아미노산 등의 함량이 높아 발효사료의 영양학적 효용성 개선되고 우수한 항산화력을 가져 한우의 육질등급을 높일 수 있는 장점을 갖는다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 젖산 발효를 위한 용기를 도시한 사진
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료 젖산 발효를 시키는 상태를 도시한 사진
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 발효기간에 따른 pH 변화를 도시한 그래프
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 발효기간에 따른 산도 변화를 도시한 그래프
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 발효기간에 따른 당도 변화를 도시한 그래프
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법의 공정을 도시한 흐름도
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 Polyphenol 함량을 도시한 그래프
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 Flavonoid 함량을 도시한 그래프
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 베타클루칸 함량을 도시한 그래프
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 젖산함량을 도시한 그래프
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 DPPH 함량을 도시한 그래프
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 Reducing power를 도시한 그래프
도 13은 전남 도축 한우, 나주 도축 한우 및 일우 발효균을 이용하여 발효시킨 발효사료 원료가 배합된 완전혼합발효 사료를 식이한 한우에 대한 등급 비율을 도시한 그래프
이하에서는 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료 원료의 제조 방법을 보다 상세하게 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 젖산 발효를 위한 용기를 도시한 사진이고, 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료 젖산 발효를 시키는 상태를 도시한 사진이며, 도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 발효기간에 따른 pH 변화를 도시한 그래프이고, 도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 발효기간에 따른 산도 변화를 도시한 그래프이며, 도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 발효기간에 따른 당도 변화를 도시한 그래프이고, 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법의 공정을 도시한 흐름도이며, 도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 Polyphenol 함량을 도시한 그래프이고, 도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 Flavonoid 함량을 도시한 그래프이며, 도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 베타클루칸 함량을 도시한 그래프이고, 도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 젖산함량을 도시한 그래프이며, 도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 DPPH 함량을 도시한 그래프이고, 도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 Reducing power를 도시한 그래프이며, 도 13은 전남 도축 한우, 나주 도축 한우 및 일우 발효균을 이용하여 발효시킨 발효사료 원료가 배합된 완전혼합발효 사료를 식이한 한우에 대한 등급 비율을 도시한 그래프이다.
본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은 맥주박이 포함된 혼합물에 젖산균을 접종하여 발효시켜 사료 원료를 제조하고 그 사료 원료를 배합하여 완전혼합발효 사료를 제조함으로써 아미노산 등의 함량이 높아 발효사료의 영양학적 효용성 개선되고 우수한 항산화력을 가져 한우의 육질등급을 높일 수 있는 완전혼합발효 사료를 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법을 도시한 도 6을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은 맥주박이 포함된 원료 혼합물에 젖산균을 접종하여 젖산 발효시켜 발효사료 원료를 제조하는 단계(S10)와, 상기 발효사료 원료와 완전혼합사료(TMR, Total Mixed Ration)를 혼합하여 숙성시키는 완전혼합발효 사료를 제조하는 단계(S20)를 포함하여 구성된다.
상기 발효사료 원료를 제조하는 단계(S10)에서 상기 맥주박이 포함된 혼합물에는 당박, 펌믹스 1호, 파옥쇄 및 소맥분이 혼합되는데, 그 배합비는 중량기준으로 맥주박 30%, 당박 43.5%, 펌믹스 1호 12.5%, 파옥쇄 1.5% 소맥분 1.5%가 혼합되는 것이 바람직하다.
상기와 같이 맥주박 등이 혼합된 혼합물은 건조 맥주박을 첨가하면서 수분을 40~50% 함량이 되도록 조절된 다음 젖산균을 접종하여 발효시킨다. 상기 젖산균에는 Lactobacillus casei KCTC3109(한국생명공학연구원 생물자원센터), Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652(한국생명공학연구원 생물자원센터), Lactobacillus plantarum KCTC 33131(한국생명공학연구원 생물자원센터), Leuconostoc pseudomesenteroides JLRI 01, KCCM 11443P(한국 미생물 보존센터) 중에서 하나 이상이 선택되어 이루어어지며, 젖산 발효는 20~30℃의 온도에서 7~10일간 혐기 조건에서 이루어진다.
<실시예 1 : 실험 재료>
- 맥주박 : 본 발명의 실시를 위한 실험에 사용된 맥주박은 (주)OB맥주에서 맥주를 생산하고 처리된 박을 구입하여 냉장보관하여 사용하였다.
- 당박 : 본 발명의 실시를 위한 실험에 사용된 당박은 (주)대상에서 구입하여 냉장보관하여 사용하였다.
- 건조맥주박 : 건조맥주박은 (주)OB에서 구입한 맥주박을 일우영농조합법인에서 건조된 것을 구입하여 냉장보관하여 사용하였다.
- 펌믹스 1호 : 펌믹스 1호는 TMR(Total Mixed Ration) 사료로 우성사료에서 구입하여 사용하였다.
- 파옥쇄, 소맥피 : 파옥쇄와 소맥피는 기영영농조합법인에서 구입하여 사용하였다.
- 시약 : MRS 배지, Bacto agar
- 젖산균 : Lactobacillus casei KCTC3109, Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652, Lactobacillus plantarum KCTC 33131를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 구입하여 MRS 선택 배지에 접종하여 37℃ 48시간 배양한 후 사용하였다.
<실시예 2 : 젓산 발효>
- 발효용기
본 발명의 시험에 사용된 발효용기는 그림과 같은 용기에 밀폐되도록 LDPE 비닐로 밀봉하고 도 1에 도시된 25×15cm 용기에 담아 사용하였다.
- 배합비
최적 배합비를 결정하기 위한 배합비 설정은 표 1(발효사료의 원료 배합비, 단위:g)과 같다. 맥주박과 건조맥주박의 농도를 달리하여 맥주박이 발효사료의 품질에 미치는 영향을 조사하고 하였으며, 성분조성을 맞추기 위하여 당박, 파옥쇄 및 소맥피의 비율을 달리하였다. 배합비를 달리한 발효원료의 일반성분은 표 2(배합비를 달리한 발효사료 원료의 일반성분, 단위:%)와 같다.
Sample 맥주박) 당박 건조맥주박 펌믹스 1호 파옥쇄 소맥피
1 265 400 200 125 0 0
2 265 400 185 125 15 0
3 300 435 100 125 15 15
4 200 535 70 125 30 30
5 0 600 235 125 15 15
Sample 탄수화물 조지방 조단백질 조섬유 조회분 수분
1 11.6 14.6 11.8 2.9 11.6 50.4
2 14.5 14.1 11.5 2.7 10.9 49
3 31.2 16.1 10.7 3 10.9 51.1
4 27 18.8 11.8 3.1 11.3 51.1
5 3.7 21.2 13.4 2.6 12.2 49.5
- 젖산 발효
발효균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 구입한 actobacillus casei KCTC 3109, Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC 3652, Lactobaccillus plantarum KCTC 33131를 선택배지 에 200ul을 도말하여 37℃에서 2일간 배양한 후 사용하였다. 젖산 발효는 표 1의 배합 시료에 종균 Lactobacillus casei KCTC 3109 (Lc), Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC 3652 (Leup), Lactobaccillus plantarum KCTC 33131 (Lp), Lc+Leup, Leup+Lp, 일우영농조합법인에서 사용하고 있는 발효균주(Ilwoo)인 Leuconostoc pseudomesenteroides JLRI 01, KCCM 11443P(한국 미생물 보존센터)를 1×109 cells/ml 이상으로 배양하고 시료의 1% 수준으로 첨가하여 상온에서 배양하였다. 발효 초기 3일 동안 종균의 혼합을 위해 1~2회 교반하였으며, 이후 도 2에서 보는 바와 같이 정치 배양하였다. 이후 10일 동안 발효를 진행하면서 발효경과를 분석하였다.
<실시예 3 : 발효사료원료 경과 분석 실험 및 배합비>
(1) 사료 제조
- 발효사료원료 경과분석 실험 배합비
발효경과 분석 및 최적 배합비 검토하기 위하여 표 3(맥주박을 이용한 발효사료 제조를 위한 균주)의 균주를 이용한 총 25종의 시료를 제조하였으며 그 배합비는 표 4(발효경과 분석 및 최적 배합비 선정을 위한 배합비 조성)와 같다.
Sample
Name		 Strain
Con -
Lc Lactobacillus casei
Leup Leuconostoc pseudomesenteroides
Lc+Lp Lactobacillus casei+Leuconostoc pseudomesenteroides
Ilwoo 일우영농조압법인 발효제
시료명 종균명 총 량 1,000g ( 100% / g )
맥주박 당박 건조맥주박 펌믹스1호 파옥쇄 소맥피 종균투입량
Figure 112017129858364-pat00001
 con1 무접종 265 400 200 125 0 0 10
con2 265 400 185 125 15 0 10
con3 300 435 100 125 15 15 10
con4 200 535 70 125 30 30 10
con5 0 600 235 125 15 15 10
Lc1 Lactobacillus casei KCTC3109 265 400 200 125 0 0 10
Lc2 265 400 185 125 15 0 10
Lc3 300 435 100 125 15 15 10
Lc4 200 535 70 125 30 30 10
Lc5 0 600 235 125 15 15 10
Lp1 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652 265 400 200 125 0 0 10
Lp2 265 400 185 125 15 0 10
Lp3 300 435 100 125 15 15 10
Lp4 200 535 70 125 30 30 10
Lp5 0 600 235 125 15 15 10
Lc+LP1 L. casei +L.pseudormesentemides 혼합균주 265 400 200 125 0 0 10
Lc+LP2 265 400 185 125 15 0 10
Lc+LP3 300 435 100 125 15 15 10
Lc+LP4 200 535 70 125 30 30 10
Lc+LP5 0 600 235 125 15 15 10
ilwoo1 기존 발효제 265 400 200 125 0 0 10
ilwoo2 265 400 185 125 15 0 10
ilwoo3 300 435 100 125 15 15 10
ilwoo4 200 535 70 125 30 30 10
ilwoo5 0 600 235 125 15 15 10
(2) 발효경과 분석
- 당도 분석 방법
당도는 시료 50ml을 원심분리기(Hanil, MF-80 General Purpose Centrifuge)를 이용하여 3200rpm으로 10분간 원심분리 후에 상등액을 취하여 디지털 당도계(PR-101 a,Atago. co. Ltd, Japan)를 이용하여 당도를 3회 반복 측정하여 평균값을 산출하였다.
- 산도 분석 방법
AOAC법에 의하여 발효액 20 mL를 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1 N NaOH 용액으로 적정한 후 0.1 N NaOH 소요량을 젖산 함량(%)으로 환산하였다.
- pH 분석 방법
시료용액의 pH는 pH meter(Orion 3 star, Thermo, USA)를 이용하여 측정하였다.
- pH 및 총산도 변화
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 이용되는 발효사료 원료 제조를 위해 맥주박 및 당박의 함량을 달리한 배합비와 균주를 달리하여 발효하는 과정에서 pH와 산도 변화를 분석한 결과는 도 3 및 도 4와 같다. pH 변화의 경우 초기 5.5∼6.0에서 12일 발효 후 대부분의 시료에서 평균 4.5 수준으로 감소하였다. pH 변화는 배합비의 영향은 크지 않았으며 맥주박 함량이 높은 시험구에서 감소폭이 큼을 알 수 있었으며 균주에 의한 영향이 높은 것으로 나타났다. 젖산균을 첨가하지 않는 대조구의 경우 pH와 산도의 변화가 상대적으로 작았으며 일우영농조합법인 균주(Ilwoo)가 가장 변화폭이 큼을 알 수 있었다. 젖산균 starter를 첨가하지 않은 대조구의 경우도 어느 정도 발효가 진행됨을 알 수 있었으며 이는 맥주박에 포함된 젖산균과 초산균에 의한 것으로 생각된다. 대조구의 경우 초산냄새가 더 강한 것으로 보였다. Lactobacillus casei KCTC3109와 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652의 혼합균주인 Lc+Lp도 비교적 우수한 결과를 보였다. 결과적으로 pH와 산도 변화를 분석한 결과 발효는 정상적으로 진행됨을 알 수 있었다.
- 당도 변화
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 이용되는 발효사료 원료 제조시 맥주박 및 당박의 함량을 달리한 배합비와 균주를 달리하여 발효하는 과정에서 당도의 변화를 조사한 결과는 도 5와 같다. 초기 당도는 맥주박이 들어가지 않는 시험구에서 3.7% 수준으로 맥주박이 혼합된 시험구의 2.5% 수준에 비하여 매우 높게 나타났다. 발효 6일 경과 후 대부분 1% 수준까지 감소됨을 확인할 수 있었으며 일우(Ilwoo) 균주와 Lc+Lp 혼합균주 시험구에서 상대적으로 높은 감소 경향을 보였다. 이는 pH와 산도 변화와 더불어 젖산발효가 우수하게 진행되었음을 알 수 있다.
(3) 최적 제조공정 개발
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 이용되는 발효사료 원료 제조 과정에서 맥주박을 안정화한 후 맥주박과 부재료(당박, 펌믹스 1호, 파옥쇄, 소맥비)를 혼합하여 1시간 정도 정치한 후 수분조절을 위해 건조 맥주박을 혼합하고 젖산균을 넣어 상온에서 유지하고 약 2주간 혐기적 조건에서 발효 시킨다. 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법의 공정을 도시한 흐름도이다.
- 배합비
맥주박은 사료적 가치가 높아 단위동물의 단백질 또는 보충 사료로 이용성이 높지만, 호프의 쓴맛이 함유되어 있어 가축의 사료로 기호성이 떨어진다. 또한 수분함량이 높아 부패성이 매우 높아 발효처리 및 기호성이 높은 사료와 혼합급여를 통하여 기호성의 증진과 곰팡이 등의 오염을 방지하지 위한 처리가 이루어 져야 한다. 본 발명에서는 표 1의 5가지 배합비에 5가지 형태의 균주를 접종하고 발효하여 발효경과, 발효사료원료의 품질특성을 종합하여 최적 배합비를 선정한 결과 맥주박 30%, 당박 43.5%, 펌믹스 1호 12.5%, 파옥쇄 1.5% 소맥분 1.5%를 발효사료원료의 최적 배합비로 선정되었다.
- 수분조절
배합한 원료의 수분을 40~50%수준으로 조절한다.
-젖산발효
수분을 조절한 원료에 젖산균 배양액 1%를 투입하여 발효한다. 발효조건은 20~30℃에서 7~10일간 혐기적 조건에서 발효한다.
- 젖산균을 이용한 발효사료 제조
젖산균의 함량이 풍부한 발효사료 원료에 TMR 사료를 혼합 후 숙성하여 발효사료를 제조한다.
<실시예 4 : 발효사료의 성분 분석>
실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 발효사료 원료에 대한 성분을 분석하였다.
(1)유리당 분석
- 유리당 분석은 0.45μm membrane filter와 Sep-pak C18 cartridge(Waters Associate, Milford, MA,USA)로 여과하여 색소 및 단백질 성분을 제거한 다음 HPLC로 분석하였다. Column은 IonPac AS11-HS analytical(4×250 mm, 9μm, Dionex Co., Ltd, Sunnyvale, CA, USA), 이동상은 23mM potassium hydroxide를 사용하였고, flow rate는 1.0 mL/min, injection volumn은 10 μL, detector는 ELSD detector를 사용하였다.
(2) 유기산 분석
유기산 분석은 0.45μm membrane filter와 Sep-pak C18 cartridge(Waters Associate, Milford, MA,USA)로 여과하여 색소 및 단백질 성분을 제거한 다음 HPLC로 분석하였다. Column은 Inertsil ODS-3V(4.6×250mm, 5μm, GL Sciences Inc., Tokyo, Japan), 이동상은 dihydrogenphosphate와 phosphoric acid(pH 2.5)를 사용하였고, flow rate는 1.0mL/min, injection volume을 20μL, detector는 RI detector를 사용하였다.
젖산을 함유한 유기산제는 사육우와 양돈사료의 첨가제로 이용되고 있다. 특히 송아지와 새끼돼지의 경우 위내에서 산 생성능이 낮아 단백질 소화효소 활성을 떨어뜨림으로써 소화기성 장애를 유발할 수 있다. 또한 사료내 산성화는 사료 자체의 박테리아 오염을 방지하여 주며 젖산을 함유한 사료는 항생제를 첨가하는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 젖산 함량을 분석한 결과는 도 10과 같다. 젖산종균을 첨가하지 않은 대조구의 경우 100 mg/Kg으로 Lactobacillus casei KCTC3109와 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652의 혼합균주인 Lc+Lp의 5,500 mg/Kg으로 55배 이상의 차이를 보였다. 그 다음으로 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652 (Lp) 종균을 이용하여 발효하 경우가 3,950 mg/Kg 수준이었이며 Lactobacillus casei KCTC3109 (Lc)와 일우사료 종균(ilwoo)의 경우 약 1,500 mg/Kg을 보였다. 따라서 젖산 생성능을 기준으로 볼 때 Lc+Lp 혼합종균을 사용한 경우가 가장 우수함을 알 수 있었다.
(3) 유리 아미노산
유리 아미노산 추출을 위한 전처리는 시료 10mL을 70% EtOH에 넣고 1 시간 동안 초음파추출 후 24 시간 상온에서 추출한 후 0.2μ 필터와 Sep-pak C18 cartridge로 여과하여 색소 및 단백질 성분을 제거한 후 분석시료로 사용하였다. HPLC 분석조건은 Dionex Ultimate 3000와 FL Detector (Emission 450nm , Excitation 340nm(OPA) Emission 305nm, Excitation 266nm(FMOC), UV Detector (338nm), Software는 Chromeleon 6.8을 사용하였다. 표준품으로 : 1 nmol/uL Amino acids 17종 std (0.1N-HCL 용해)를 사용하였으며 표준품의 농도는 3차 증류수로 희석하여 1000, 500, 100, 10pmol/uL 조절하였다. 표 5는 유리 아미노산의 분석 조건을 정리한 것이다.
Column VDSpher 100 C18-E (4.6mm x 150mm, 3.5um/VDS optilab, Germany
Mobile Phase A 40mM Sodium phosphate dibasic, pH 7
Mobile Phase B 3DW / Acetonitrile / Methanol( 10 : 45 : 45 v/v%)
Figure 112017129858364-pat00002
Injection Volume 0.5uL
Column Temperature 40℃
Sample Temperature 20℃
Reaction
protocol		 Pre Amino acids반응이 자동 수행되며 적은 양의 Borate buffer, OPA/MPA, FMOC 시약과 함께 시료를 단계적으로 혼합한 후 반응을 종결한다.
Reagent 시료: Amino acid standard (agilent 5061-3330, agilent 5062-2478)
Reagent A: Borate buffer (agilent 5061-3339)
Reagent B: OPA reagent (agilent 5061-3335)
Reagent C: FMOC solution (agilent 5061-3337)
Na2HPO4, Na2B4O7 : Sigma
ACN. MeOH : HPLC grade(Merck)
Injector program Draw 5uL from boratebuffer - Draw 1uL from sample - Draw 1uL from OPA - Draw 1uL from FMOC - Draw 32uL from water(Dilution) - Inject
참고 Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids’ (Agilent Technologies)
- 유리아미노산 분석 조건
아미노산은 단백질을 가수분해 할 때 생기는 아민기(-NH2) 와 카르복실기(-COOH)를 가지는 화합물이다. 생체에는 200종류이상의 아미노산이 있지만 사료의 단백질은 20개의 아미노산에 의해 구성되어 있다. 아미노산에는 필수아미노산과 비필수 아미노산으로 나뉘어진다. 체내의 단백질 합성에는 20종의 아미노산이 필요한데 대부분 체내에서 합성가능하며 반드시 섭취할 필요가 없는 아미노산을 비필수 아미노산이라고 하며 체내에서 합성되지 못하거나 합성되어도 요구량을 채우지 못해 사료로부터 섭취해야하는 아미노산을 필수아미노산이라고 한다. 다른 단위동물과 달리 반추동물은 대부분의 아미노산을 반추위미생물이 만들어낼 수 있어 추가급여의 필요가 없다고 인식되어 왔으나 아미노산 요구량은 반추위내에서 합성되어지는 아미노산만으로는 부족해 아르기닌, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린 등 필수 아미노산을 공급할 경우 성장이 더 우수한 것으로 알려져 있다. 맥주박 발효사료의 경우 효모로부터 양질의 단백질이 공급되며 특히 젖산발효과정에서 아미노산 형태로 분해되어 사육우 성장촉진에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 아미노산을 분석한 결과는 표 6(발효사료 원료의 유리아미노산 함량) 및 표 7(발효사료 원료의 유리아미노산 함량)에서 보는 바와 같다. 총 아미노산 함량은 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652 (Lp) 종균을 이용하여 발효하 경우가 5,573.41 mg/Kg으로 가장 함량l 높았으며 Lactobacillus casei KCTC3109와 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652의 혼합균주인 Lc+Lp의 경우 5,470.25 mg/Kg으로 거의 비슷한 수준을 보였다. 필수 아미노산의 경우 Leu > Val > Ile > Phe > Thr > Tyr > Met > Lys > Arg 순으로 높은 함량을 나타내었다. 비필수 아미노산 중에서는 GABA가 가장 많아 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652 (Lp) 종균을 이용하여 발효하 경우가 1,164.86 mg/Kg으로 가장 많았으며 Lc+Lp 혼합균주의 경우 1,046.23 mg/Kg으로 비슷한 값을 보였다. 감마 아미노낙산 또는 감마 아미노뷰티르산(γ-Aminobutyric acid, GABA)은 포유류의 중추신경계에 작용하는 억제 신경전달물질이다. GABA는 신경계에서 신경흥분을 조정하는 역할을 맡고 있으며, 인간의 경우 GABA는 근육의 상태를 직접적으로 조절하는데 관여한다. GABA는 엄밀하게 말하면 아미노산의 일종이지만, 알파 아미노산이 아니기 때문에 GABA는 단백질 조성에 관여하지 않는다. 이는 포유류의 뇌 속에서 존재하여 중추신경계에서 여러 신경전달물질의 분비를 막는 억제성 신경전달물질입니다. 쉽게 말하면 신경을 안정시키는 역할을 한다고 할 수 있습니다. 스트레스를 받거나 극도로 불안정, 활동항진의 때에 GABA는 두뇌의 알파파 활동을 증진시키며, 스트레스, 긴장을 초래하는 신경전달을 억제하여 두뇌기능을 정상화, 스트레스와 긴장, 신경불안정, 긴장으로 인한 고혈압, 간질, 정신분열증, 활동항진, 불면, 우울증 등의 증상을 개선하는 등 다양한 효능이 알려져 있다. 이는 사육우의 심신안정을 도모하고 질병을 예방함으로서 양질의 비육우 생산에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
mg/Kg Asp Glu Ser Gln Gly Thr Arg Ala GABA
Control 159.189 376.3076 208.0844 79.2506 190.7629 186.202 8.8281 956.2986 367.6702
LC-3 64.356 192.5429 126.6305 38.5662 268.0771 92.2589 84.1182 1173.934 777.9755
LP-3 14.902 78.3993 123.2001 40.5759 373.3125 79.583 4.1244 1552.908 1164.859
Lc+LP 31.167 142.9574 164.8443 27.6563 331.6392 137.2512 5.9208 1298.89 1046.227
ilwoo 67.092 155.3186 153.7619 45.046 344.6516 92.9583 6.6893 1350.335 1018.726
mg/Kg Tyr Val Met Phe Ile Leu Lys Pro Total
Control 40.9792 388.4751 15.8325 199.687 238.8957 540.5551 22.1545 367.7707 4,346.95
LC-3 38.8886 446.5346 10.1231 182.701 301.8489 623.6804 61.3826 281.6847 4,765.31
LP-3 9.9861 544.9483 44.9794 166.912 392.6461 714.2385 4.0397 263.795 5,573.41
Lc+LP 9.1696 483.0004 15.3336 240.926 354.1424 653.5198 22.7895 504.8107 5,470.25
ilwoo 13.1713 504.4379 48.3911 155.8761 368.8892 706.5337 19.0647 290.6357 5,341.58
(4) 총 폴리페놀 함량
총 폴리페놀함량은 Folin-Denis법(Folin and Denis 1912)으로 측정한다. 즉, 시료 0.1 mL에 증류수 2 mL, Folin-ciocalteu's phenol reagent 0.2 mL를 가하고 혼합 후 실온에서 5분간 반응시켰다. 여기에 Na2CO₃용액(15%) 1.5 mL를 가하여 2시간 동안 정치한 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총폴리페놀함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 구하였다.
(5) 총 플라보노이드 함량
총 flavonoid 함량을 측정 하기위하여 먼저 시료 용액(1mL)과 증류수(4mL), NaNO2 (5%) 용액 0.3 mL를 혼합하여 실온에서 5 분간 방치한 다음 AlCl3(10%) 시약 0.3 mL를 첨가한다. 6분간 정치 후에는 1M NaOH (2 mL)를 가하여 반응이 정지한 다음 증류수로 반응액의 부피를 10 mL로 만들다. 이 액은 510 nm에서 흡광도를 측정하고 rutin를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 flavonoid 함량을 구하였다.
(6) β-Glucan의 분석
발효사료 원료 내 베타글루칸 함량은 Mushroom and Yeast β-Glucan Kit를 사용하여 다음과 같이 정량 하였다. 발효사료 원료 베타글루칸 추출물은 분쇄한 뒤 100 mesh를 통과시켜 100 mg씩을 정량 하였다. 총글루칸 함량은 각 시료에 37% hydrochloric acid를 1.5 mL 첨가한 후, 30℃에서 45분간 반응시켰다. 반응액에 증류수 10 mL을 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 가열한 다음, 냉각시키고, 2 N KOH 10 mL과 200 mM sodium acetate buffer(pH 5.0)을 이용하여 100 mL까지 부피를 조정하였다. 1,500xg에서 10분간 원심분리 한 후 회수한 상등액 중 0.1 mL을 취하여 β-glucosidase(exo-1,3-β- glucanase(100 U/mL)와 β-glucosidase(20 U/mL)를 200 mM sodium acetate buffer(pH 5.0)에 용해하여 제조) 0.1 mL을 가하여 40℃에서 60분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 GOPOD 시약 3 mL을 첨가하여 40℃에서 20분 동안 반응 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 알파글루칸 함량은 시료 100 mg에 2 M KOH 2 mL을 첨가하여 20분간 냉각상태에서 반응시킨 다음, 1.2 M sodium acetate buffer(pH 3.8) 8 mL과 Amyloglucosidase(1,630 U/mL) 0.2 mL을 첨가하여 40℃에서 30분간 반응 시켰다. 1,500xg에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액 중 0.1 mL을 취하고, 여기에 200 mM sodium acetate buffer(pH 5.0) 0.1 mL과 GOPOD 시약 3.0 mL을 첨가하여 40℃에서 20분 동안 반응하였다. 반응액의 흡광도를 510 nm에서 측정하였으며, 총글루칸과 알파글루칸 함량의 차이를 베타글루칸 함량으로 계산하였다.
(7) Polyphenol 및 Flavonoid 함량
Polyphenol이란 녹색식물이 광합성 작용을 할 때 생성된 당분의 일부가 변화한 2차 대사 산물로 식물계에 8,000여 개의 구조를 가진 성분으로 존재하며 페놀 복합체를 일컫기도 한다. 사탕수수, 기장, 보리, 건콩, 땅콩, 과일, 채소, 차 류에 풍부하며 대체로 색이 짙고 쓴맛과 떫은맛을 지니고 있다. 이러한 폴리페놀은 Flavonoid와 Non-flavonoid 두 종류로 구성되는데, Flavonoid란 활성산소로부터 식물의 세포를 보호하는 물질의 총칭이다. Flavonoid와 Non-flavonoid 모두 항산화 작용을 하며 약 300여 종이 있다. 그 중 널리 그 기능이 알려져 있는 폴리페놀의 종류와 함유식품은 아래와 같다. 간 기능과 기억력 향상을 돕고, 특히 심장병 예방에 좋은 적포도주, 가지, 블루베리 등에 풍부하게 함유되어 있는 안토시아닌, 여성 호르몬의 밸런스를 조절하며, 대두와 대두 제품에 풍부한 이소플라본, 피로 회복, 스트레스 억제 효과가 있고, 코코아, 초콜릿에 풍부한 카카드마스 폴리페놀, 모세혈관을 강화하고 혈압을 낮추며 기억력을 향상시키며, 메밀국수와 옥수수에 풍부한 루틴, 관상동맥 경화예방 효과가 뛰어나며, 양파와 사과껍질에 풍부한 케르세틴, 녹차 등 차류에 풍부한 카테킨 등이 대표적이다. 또한 Flavonoid는 polyphenol에 속하는 수용성 식물색소로, 항산화 작용과 모세 혈관을 강하게 하는 효능이 있다. 플라보노이드는 식물에 포함된 주로 밝은 노란색 색소, 화학 구조상 2개의 벤젠 고리를 3 개의 탄소 원자에 이은 디 페닐 프로판 구조를 가지는 화합물의 총칭으로, 비타민 P 라고도 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 polyphenol과 flavonoid 함량을 분석한 결과는 도 7 및 도 8에서 보는 바와 같다.
일반적으로 식물은 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물과 같은 2차 대사산물을 함유하고 있는데 이들은 방향성 화합물로 고리구조상 -OH기로부터 전자를 공여하여 페놀 고리구조 공명에 의해 구조적 안정화되면서 항산화 활성을 나타내게 된다. 이러한 폴리페놀과 플라보노이드는 항산화, 항염증, 항암 등 생리활성에 관여하는 것으로 최근 많은 연구에서 밝혀지고 있다. 도 7에서 보는 바와 같이 대조구와 Lc+Lp 혼합균주 그리고 ilwoo 균주를 이용하여 발효한 경우 47 mg GAE/100g ∼ 55 mg GAE/100g 수준으로 큰 차이를 보이지 않았으나 Lc와 Lp 단독 균주의 경우 24∼30 mg GAE/100g 으로 다소 낮은 값을 보였다. 이 결과 만으로 이유를 설명하기는 어려울 것으로 판단된다. 권 등(Korean Journal of Food Preservation Vol.20 No.4 pp.583-591)의 연구에 의하면 Lactobacillus bifermentans를 이용한 율피 열수추출물과 발효 추출물의 폴리페놀 함량은 거의 없는 것으로 보고하였다. 도 8에서 보는 바와 같이 총 플라노노이드 함량은 종균을 첨가하지 않은 대조구의 0.085 mg/100g에서 젖산발효 후에 평균 0.033∼0.06 mg/100g으로 감소하는 경향을 보였는데 권 등의 연구에서도 율피추출물이 젖산 발효에 의해서 플라보노이드 계열의 물질이 감소되는 것으로 보고한 바 있다.
(8) 젖산발효 사료의 β-Glucan 함량
β-Glucan이란 glucose가 β-1,3 화학결합을 중심으로 중합된 다당류를 총칭하며, 버섯, 효모 등 미생물의 세포벽이나 세포외 다당류에서 분리함으로써 생산되는 미생물 유래의 β-glucan과 보리, 귀리와 같은 곡물의 식이섬유에서 추출 생산되는 식물성 β-glucan이 있다. β-glucan은 면역기능 향상 효과가 높은 물질로 알려져 있으며 미국 식품의약국안전청(FDA)의 GRAS (General Recognized as Safe)로 승인을 얻어 식품 첨가물로 널리 사용중이다. 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 베타클루칸 함량을 도시한 그래프를 도시한 도 9를 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 β-glucan 함량은 42.55 mg/g이었으며 대조구의 12.45 mg/g에 비하여 3.5배 수준이었다. 이는 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료를 첨가하여 제조한 완전혼합발효 사료가 사육우의 질병예방에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
<실시예 5 : 발효사료의 항산화성>
실시예 1 내지 3에서 얻은 시료에 대한 항산화성을 검토하였다.
(1) DPPH 라디칼 소거능
맥주박 및 당박의 시료 0.2 mL에 증류수 0.8 mL를 넣어 1 mL가 되게 한 후 1.5×104 DPPH 를 메탄올에 제조한 후 암소에서 2시간동안 방치한다. DPPH용액 160 μL에 시료 40 μL를 가하여 흡광도의 변화를 정확히 30분 후에 측정하였다. Ascorbic acid(1 mg/mL)를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 시료의 항산화력(AEAC,ascorbic acid equivalent antioxidant capacity, mg%)을 계산하였다.
DPPH 라디칼
소거 활성(%) ＝(1－ 시료첨가구의 흡광도/시료 무 첨가구의 흡광도 )×100
항산화제는 산화로 인한 여러 가지 바람직하지 않은 화합물의 형성을 방지하기 위해 지질 시스템 내에 첨가된다. 산화에 의해 생성되는 각종 산화 생성물은 DNA를 손상시키거나 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 페놀계 합성 항산화제로 널리 사용되고 있는 BHA (butylated hydroxy anisol)와 BHT (butylatedhydroxy toluene)는 그 효과와 경제성 안전성 때문에 많이 사용해 왔지만, 과량 섭취시 간, 위장점막, 폐, 신장, 순환계 등에 심각한 독성 작용을 일으키는 것으로 알려져 안전한 대체 항산화제의 개발이 요구 되었다. 식물로부터 유래된 페놀물질의 항산화제는 일부가 금속복합체를 형성하는 작용을 하나, 주요 기능은 이들의 항산화 활성에 있다. 따라서 식물추출물로부터 radical 소거 기능을 탐색함으로써 천연 항산화제를 개발할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 DPPH 함량에 대한 그래프를 도시한 도 11에서 보는 것과 같이 대조군(control)은 85.88% LC는 85.97%, LP 80.27%로 큰 차이를 나타나지 않았으나, LC+LP 와 ilwoo 의 DPPH는 51.57, 41.58%로 약 2배의 차이를 나타내었다.
(2) Reducing power
시료의 환원력은 철 이온을 Fe3 +에서 Fe2 +로 환원시키는 강도가 클수록 발색의 정도가 증가하는 원리를 이용하여 측정한다. 시료 용액을 1 mL씩을 취하고 여기에 2.5 mL의 인산완충용액(0.2M, pH 6.6)과 2.5 mL의 potassium ferricyanide (1%, w/v)를 첨가하여 섞은 후 50 도 에서 20분간 반응시켰다. 반응액에 2.5 mL의 trichloroacetic acid (10%, w/v)를 첨가하여 섞은후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 한다. 상층액 2.5 mL를취하여 시험관에 담고 2.5 mL의 증류수와 0.5 mL의 FeCl3 (0.1%, w/v)를 첨가하여 흡광도 700 nm에서 측정한다.
환원력을 측정하기 위하여 ‘Fe3 +- Fe2 +로 전환하는 능력을 측정하였다. 수소를 공여하여 유리라디칼을 안정화시켜 Fe2 + 로 전환하는 환원력을 흡광도를 값으로 나타낸 것이다. 항산화활성 실험에서 DPPH와 ABTS radical 실험과 관련이 높아 총 페놀의 함량과 비슷한 결과를 보이는 것으로 나타났다.
본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료의 젖산발효사료원료 Reducing power에 대한 그래프를 도시한 도 12에서 보는 바와 같이 일우(ilwoo) 발효균을 첨가한 시험구에서 O.D값 1.17±0.02 수준으로 가장 높았으며, 이는 대조구의 0.83±0.03보다 높은 수준을 보였다.
(3) ABTS 라디칼 소거 활성 분석 방법
발효사료 원료에 대한 ABTS radical 소거활성은 Van den Berg 등의 방법(16)을 변형하여 측정하였다. 1.0 mM의 AAPH는 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM의 ABTS와 혼합한 후 68oC의 온조에서 12분 동안 반응시켰다. ABTS 용액의 농도는 734 nm에서 흡광도가 0.650±10.2 정도가 되도록 정하였다. 발효사료 원료 시료 20 μL와 980 μL ABTS 용액을 37oC water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox®1 mg/mL을 사용하였다. 발효사료 원료의 ABTS radical 소거능은 다음의 식에 따라 계산하였다.
ABTS radical ＝ scavenging activity (%) (Blank O.D.－Sample O.D / Blank O.D.) ×100
<실시예 6 : 발효사료 식이에 의한 거세한우의 육질등급에 미치는 영향>
쇠고기의 품질을 향상 시키기 위한 연구는 육질등급과 도체조성 관련 연구(Garcia et al., 2008; Gruber, et al., 2006), 쇠고기의 화학적 특성연구(Gotoh, et al., 2009; Nelson, et al., 2004; Voges, et al., 2007), 물리적 특성 연구(Brooks, et al., 2009; Kim, et al., 2008; Schmidt, et al., 2010), 관능특성(Behrends, et al., 2005; Laster, et al., 2008) 및 이화학특성과 관능특성요인 간의 상관관계 연구 (Banoviæ, et al., 2009; Caine, et al., 2003; Destefanis, etal., 2008) 등 여러 분야에 걸쳐 연구가 진행되어 왔으며, 쇠고기 품질은 근내지방함량, 전단력, 보수성, 가열감량, pH , 도체냉각 방법 및 숙성 등 여러가지 요인이 작용된다고 보고되고 있다(George-Evins et al., 2004; Lorenzen et al., 2003; Muchenje et al., 2009; Rhee et al., 2004). 이들 연구 결과에서는 육질등급과 연도증진이 쇠고기 품질에 영향을 주는 주요요인으로 제시되고 있으나, 쇠고기의 식문화는 국가별로 다르고 향미, 연도, 다즙성 등 맛 관련 오감이 다르며, 국가별로 육질등급 판정기준 및 평가체계가 다르기 때문에 한우고기의 품질 차별화를 위해서는 우리 식문화에 적합한 과학적이고 체계적인 연구가 필요하다고 생각된다. 그 동안 한우고기의 품질 관련연구는 Kim과 Lee(2003), Kim 등(2008), Moon 등(2006), Song 등 (2010) 및 Yu 등(2008) 여러 연구가 있으나 미흡한 편이다. 육질등급의 개선을 위해서는 사육환경, 연령 등 다양한 인자가 있으나 가장 중요한 부분은 사료이다.
초지사료, 혼합사료, 발효사료 등 다양한 사료에 의해 소고기의 육질은 다른 것으로 판단되고 있으며 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료 제조 방법으로 제조된 완전혼합발효 사료의 식이에 의한 거세 한우의 등급 개선여부를 분석하기 위하여 2017년 1월 부터 2017년 11월까지 전남지역(42,180두), 나주지역(3,162두)의 거세 한우의 도축결과를 축산물품질관리원으로부터 받아 분석하였으며, 특히 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료가 배합된 완전혼합발효 사료를 식이한 거세 한우(122두)와 비교분석하였다. 도 13은 전남 도축 한우, 나주 도축 한우 및 일우 발효균 이용 사료 식이한 한우에 대한 등급 비율을 도시한 그래프이다. 본 발명의 일실시예에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서 발효사료 원료를 이용하여 완전혼합발효 사료를 제조하여 거세한 하우에 식이하여 육질등급에 미치는 영향을 확인한 결과 A등급에서 72%로 나주지역 A등급 평균 65%보다 높은 등급을 나타내었다.
- 발효사료원료의 품질
단미사료의 성분등록 사항(제 9조제1항관련) 사료등의 기준 및 규격 에 따르면, 섬유질 발효사료의 등록성분은 원료 및 발효처리방법 확인효능물질, 조섬유의 함량이 건물기준으로 15% 이상 (다만, 큰소비육 단계의 경우 10% 이상)여부 확인하여야 한다. 표 8은 발효사료의 기준 및 규격을 정리한 것이다.
명칭 등록성분 비고
최소량 최대량 기타
섬유질 발효사료 조단백질 조섬유 수분
조회분		 발효균주 원료 및 발효처리방법 확인
조섬유의 함량이 건물기준으로 15% 이상(다만, 큰소비육 단계의 경우 10% 이상) 여부확인
- 젖산균 수
젖산균을 접종하여 발효사료 원료를 제조한 다음 맥주박등의 발효사료 원료내 미생물상의 변화를 검토한 결과 표 9(발효사료원료의 젖산균)과 같다. 젖산균수는 대조구의 경우 1.0 × 106 cell/g 수준이었으나 Lp + Lc 시료의 경우 1.0 × 109 cell/g 수준으로 가장 높았으며 나머지는 1.0 ∼ 1.2 × 108 cell/g 수준이었다. Srigopalram et al.(2015)은 호밀에서 젖산균 접종에 따라 젖산균 수는 증가하고 효모나 곰팡이 수는 감소한다고 하였는데, 본 발명의 검증을 위한 실험에서도 비슷한 결과를 보였으며, 갈대 사일리지 젖산균 수와 양질의 목초 사일리지 젖산균 수는 비슷한 수를 유지하는 것으로 나타났는데, 이는 양질의 발효사료원료를 제조하기 위해서는 반드시 젖산균을 접종이 필요한 것으로 생각된다. 표 10은 발효사료 품질기준을 분석한 결과를 정리한 것이다.
시료명 분석성분 비고
발효사료원료 개발제품(CFU/g) 기준 목표
발효사료원료(대조구) 1.2106 없음 108이상
발효사료원료 LC 1.2108
발효사료원료LP 1.0108
발효사료원료LC+LP 1.0109
ilwoo 1.0108
시료명 분석성분 비고
발효사료 포유우(번식) 개발제품 기준 목표
수분 35.85 35.2 건물기준 조섬유 15%이상
 수분 40% 이하
조단백질 10.6 9
조섬유 15.02 16.56
조회분 7.82 2.13
ADF 21.22 21.77
NDF 31.5 36.7
큰소비육전기(육성) 수분 30.74 33.5
조단백질 12.75 11.82
조섬유 13.06 14.2
조회분 7.06 4.78
ADF 21.99 19.63
NDF 33.94 32.83
큰소비육중기(비육) 수분 33.5 34.53
조단백질 11.82 9.94
조섬유 14.2 12.74
조회분 4.78 1.15
ADF 19.63 16.66
NDF 32.83 29.26
- 결론
본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법에서는 발효사료의 부패와 저장기간을 늘리기 위한 발효제를 찾기 위해 맥주박 등의 발효사료 원료를 젖산균을 접종하여 발효기간을 지켜보았다. pH의 경우 4.26에서 4.74의 범위를 나타내었고, 총산도의 경우 0.8 ~ 2.3%까지 증가하였다. 이는 발효기간 중 발효기간 중 유기산, 젖산 기타 산 등이 생산되어 다른 미생물의 오염을 감소시켜 안전한 발효에 영향을 미친다. 당도의 경우 초기에는 높은 수준을 유지 하다가 젖산균의 증식에 따라 대부분 1%의 수준까지 감소됨을 확인할수 있었으며, 일우 균주와 Lc+Lp 혼합균주 시험구에서 상대적으로 높은 감소 경향을 보였다. 이는 pH 및 산도 변화와 더불어 젖산발효가 우수하게 진행됨을 알 수 있었다. 젖산균수는 대조구의 경우 1.0 × 106 cell/g 수준이었으나 Lp + Lc 시료의 경우 1.0 × 109 cell/g 수준으로 가장 높았으며 나머지는 1.0 ∼ 1.2 × 108 cell/g 수준이었다.
발효사료 원료의 이화학적 성분 분석 결과 유기산 경우 대조구의 경우 100 mg/Kg으로 Lactobacillus casei KCTC3109와 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652의 혼합균주인 Lc+Lp의 5,500 mg/Kg으로 55배 이상의 차이를 보였다. Lactobacillus casei KCTC3109 (Lc)와 일우사료 종균(ilwoo)의 경우 약 1,500 mg/Kg을 보였다. 따라서 젖산 생성능을 기준으로 볼 때 Lc+Lp 혼합종균을 사용한 경우가 가장 우수함을 알 수 있었다. 총 아미노산 함량은 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652 (Lp) 종균을 이용하여 발효하 경우가 5,573.41 mg/Kg으로 가장 함량l 높았으며 Lactobacillus casei KCTC3109와 Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652의 혼합균주인 Lc+Lp의 경우 5,470.25 mg/Kg으로 거의 비슷한 수준을 보였다. 필수 아미노산의 경우 Leu > Val > Ile > Phe > Thr > Tyr > Met > Lys > Arg 순으로 높은 함량을 나타내었다. GABA는 신경계에서 신경흥분을 조정하는 역할을 맡고 있으며, 포유류의 뇌 속에서 존재하여 중추신경계에서 여러 신경전달물질의 분비를 막는 억제성 신경전달물질입니다. 쉽게 말하면 신경을 안정시키는 역할을 한다고 할 수 있습니다. 폴리 페놀과 플라보노이드의 함량은 0.085에서 젖산발효 후에 평균 0.033~0.06 mg/100g으로 감소되는 것으로 보이며, 면역 기능 향상 효과가 높은 물질로 알려진 β-Glucan 함량은 대조구의 12.45 mg/g에 비하여 42.55 mg/g으로 3.5배 수준이었다.
발효사료 원료의 우수성을 검증하기 위해 발효사료원료의 항산화 실험을 진행 하였다. DPPH radical의 경우 41.58~85.88% 수준으로 나타났으며, 환원력은 0.83~ 1.17%로 대조구에 비해 비슷하거나 조금더 우수한 항산화력을 보여 주었다.
우수한 품질의 발효사료 원료를 이용하여 발효사료를 제조하여 거세한우의 육질등급에 미치는 영향을 확인한 결과 A등급에서 72%로 나주지역 A등급 평균 65%보다 높은 등급을 나타내었다.
본 발명에 따른 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법은 맥주박 등을 혼합하여 젖산균을 접종하여 발효 제조함으로써 시판 발효사료보다 한우의 육질등급을 높이고 발효사료의 영양학적 효용성을 겸비한 기능성 발효사료의 제조가 가능한 것으로 판단된다.
도면 및 앞에서 설명된 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법ㅇ은 본 발명을 실시하기 위한 하나의 실시예에 불과하며, 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 보호범위는 이하의 특허청구범위에 기재된 사항에 의해서만 정하여지며, 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 개량 및 변경된 실시예는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속한다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 맥주박이 포함된 원료 혼합물에 젖산균을 접종하여 젖산 발효시켜 발효사료 원료를 제조하는 단계와, 상기 발효사료 원료와 완전혼합사료(TMR, Total Mixed Ration)를 혼합하여 숙성시키는 완전혼합발효 사료를 제조하는 단계를 포함하되,
    상기 맥주박이 포함된 혼합물에는 당박, 펌믹스 1호, 파옥쇄 및 소맥분이 혼합되고,
    상기 맥주박이 포함된 혼합물은 중량기준으로 맥주박 30%, 당박 43.5%, 펌믹스 1호 12.5%, 파옥쇄 1.5% 소맥분 1.5%가 혼합된 것을 특징으로 하는 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 젖산균에는 Lactobacillus casei KCTC3109(한국생명공학연구원 생물자원센터), Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652(한국생명공학연구원 생물자원센터), Lactobacillus plantarum KCTC 33131(한국생명공학연구원 생물자원센터), Leuconostoc pseudomesenteroides JLRI 01, KCCM 11443P(한국 미생물 보존센터) 중에서 어느 하나 이상이 선택된 것을 특징으로 하는 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    발효사료 원료의 젖산 발효는 20~30℃의 온도에서 7~10일간 혐기 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 젖산발효를 이용한 완전혼합발효 사료의 제조 방법.
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