KR102077715B1

KR102077715B1 - 비만 억제 활성을 갖는 락토바실러스 파라카제이 ao356 균주 및 이를 포함하는 비만 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102077715B1
Application number: KR1020170168105A
Authority: KR
Inventors: 남영도; 이소영; 신희순; 박소림; 정원형; 이은숙; 송은지; 신동욱
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2020-02-14
Also published as: KR20190068078A

Abstract

본 발명의 신규한 락토바실러스 파라카제이 AO356 균주는, 인체로부터 분리된 균주로 안정성이 높고, 시험관시험에서 지방세포 분화 억제 및 M1, M0 대식세포의 M2 대식세포로의 분화유도 활성을 보이며, 동물실험에서 백색지방의 갈색화를 통한 체중감소활성 및 혈중지질농도 감소를 보이는 등 비만 개선, 예방 또는 치료 활성이 우수하다. 따라서 본 발명의 새로운 균주는 부작용 발생 가능성이 낮으므로, 부작용 문제를 가지고 있던 종래 다이어트 기능식품 혹은 약물들과는 달리 먹는 양을 조절하지 않고 다이어트 효과를 나타낼 수 있으므로, 비만 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물로 활용될 수 있다.

Description

비만 억제 활성을 갖는 락토바실러스 파라카제이 AO356 균주 및 이를 포함하는 비만 개선 또는 치료용 조성물{Lactobacillus paracasei AO356 strain with Anti-Obesity Ability and Composition for treatment or improvement or preventing of obesity comprising the same}

본 발명은 신규한 락토바실러스 파라카제이 AO356 균주 및 이를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 및 비만 개선용 조성물에 관한 것이다.

인류가 풍요로운 사회로 점점 발전해 감에 따라 비만은 심각한 만성 질환 중 하나로 대두되고 있다. 비만은 다양한 원인에 의해 나타나는데, 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생되는 대사성 질환으로, 형태학적으로 볼 때 체내 지방 세포의 크기 증가(hypertrophy) 또는 수의 증가(hyperplasia)에 의해 초래된다고 알려져 있다.

비만은 심리적으로 개인을 위축시킬 뿐만 아니라 사회적으로도 여러 가지 성인병의 발병 위험을 증가시키는 직접적인 원인이 되고 있으므로, 국가 의료 지출액 증가의 주 원인이다.

구체적으로 비만은 2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심질환 등 여러 가지 성인병의 유병율 증가와 직접적인 관련이 있으며, 비만과 관련된 질환들을 함께 묶어서 대사증후군(metabolic syndrome) 또는 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)이라고 한다. 이들은 동맥경화증 및 심혈관질환의 원인으로 작용한다.

비만은 서구사회에서 가장 흔한 영양장애일 뿐만 아니라, 최근 우리나라에서도 경제발전에 의한 식생활의 향상과 생활 방식의 서구화로 비만의 빈도가 급속히 증가하는 추세에 있고, 한국성인 비만 비율이 해마다 3%씩 증가하고 있는 추세이기 때문에, 그 문제성이 점차 심각해지고 있는 상황이다. 따라서, 비만을 치료하고, 예방하기 위한 치료제 혹은 치료방법의 개발이 요구되고 있다.

현재까지 알려진 비만치료제로는 제니칼(Xenical, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(Reductil, 에보트사, 미국), 엑소리제(Exolise, 아토파마, 프랑스) 등으로 크게 식욕억제제, 에너지소비 촉진제, 지방흡수억제제로 분류되며, 대부분의 비만치료제는 시상하부와 관련된 신경전달물질을 조절함으로써 식욕을 억제하는 식욕억제제이다. 그러나 종래의 치료제들은 심장질환, 호흡기질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성도 낮아, 더욱 개선된 비만치료제의 개발이 필요하고 또한, 현재 개발되고 있는 제품도 부작용없이 만족할 만한 치료 효과를 가지는 치료제는 거의 없어 새로운 비만치료제의 개발이 요구되고 있다.

이에 반해 안전한 미생물로 여겨져 온 유산균을 이용하여 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키고자 하는 노력 역시 많이 이루어졌다. 유산균은 당류를 에너지원으로 사용한 대사산물로 다량의 유산을 생성하고, 그 외 여러 유기산 및 박테리오신 (bacteriocin) 등의 항균물질도 함께 생성하나, 사람이나 동물의 장에 해로운 인돌, 스케톨, 페놀, 아민 또는 암모니아 등은 생성하지 않아 부패를 방지하고 유해균을 억제하며 사람에게 도움이 되는 생리활성을 보이는 유익한 세균이다. 이 중에서도 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질 내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래 전부터 알려져 왔고 미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 락토바실러스 균주 모두 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정수준(Bio-safty Level) 1'로 분류되어 있다.

대한민국등록특허공보 제10-1471033호에는 비만 억제능이 우수한 웨이젤라 에스피(Weissella sp.) F22(수탁번호: KACC 91867P) 균주가 개시되어 있고, 대한민국등록특허공보 제10-0264361호에는 콜레스테롤 저하능을 가지며, 6 종류의 포합 담즙산에 대한 탈포할 활성일 갖는 락토바실러스 플란타룸 PMO08(KFCC-11028) 균주가 개시되어 있다.

그러나, 상업적으로 성공할 만큼 항비만 효과가 우수한 유산균 관련 기술은 출현하지 않고 있으므로, 본 발명자들은 체내 부작용이 없고, 비만 치료 효과가 우수한 프로바이오틱스에 대한 연구를 수행하던 중, 새롭게 락토바실러스 파라카제이 AO356 균주를 발견하고, 상기 균주가 동물의 체내에서 높은 생존력과 활성을 나타내며, 균체 자체를 식품 및 의약품의 유효성분으로 직접 첨가하여도 비만 개선, 예방, 치료 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

특허문헌 1. 대한민국등록특허공보 제10-1471033호 특허문헌 2. 대한민국등록특허공보 제10-0264361호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 비만억제 활성을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P)를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스(probiotics)를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 비만에 의한 염증 개선용 식품 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 비만억제 활성을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P)를 제공한다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스(probiotics)를 제공한다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

상기 조성물은 지방세포 분화를 억제시키는 것일 수 있다.

상기 조성물은 M2 타입의 대식세포로의 분화를 유도하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 체중을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만에 의한 염증 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는, 인체로부터 분리된 균주로 안정성이 높고, 시험관시험에서 지방세포 분화 억제능 및 M1, M0 대식세포의 M2 대식세포로의 분화유도 활성을 보이며, 동물실험에서 백색지방의 갈색화를 통한 체중감소활성 및 혈중지질농도 감소를 보이는 등 비만 개선, 예방 또는 치료 활성이 우수하다. 따라서 본 발명의 새로운 균주는 부작용 발생 가능성이 낮으므로, 부작용 문제를 가지고 있던 종래 다이어트 기능식품 혹은 약물들과는 달리 먹는 양을 조절하지 않고 다이어트 효과를 나타낼 수 있으므로, 비만 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물로 활용될 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 새로운 균주는 비만을 예방하고, 개선하며, 치료하는데 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실험예 1에 따라 비만 억제 활성을 갖는 균주를 선별하기 위한 일련의 분석 과정이 도시되어 있는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1에 따라 측정된 36종 균주 각각의 Oil red O 염색법을 이용한 지방 축적도(Lipid accumulation)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2에 따라 비만 억제 활성을 갖는 균주를 선별하기 위한 일련의 분석 과정이 도시되어 있는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실험예 2에 따라 사균형태의 36종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 사이토카인 분비량(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예 2에 따라 사균형태의 36종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 IL-12에 대한 IL/10의 비(ratio)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실험예 2에 따라 생균형태의 36 종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 사이토카인 분비량(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예 2에 따라 생균형태의 36 종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 IL-12에 대한 IL-10의 비(ratio)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예 3에 따른 실험동물 및 실험군을 설정하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 실험예 3에 따른 각 실험군에서의 체중변화량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실험예 5에 따른 각 실험군에서의 체중변화량을 주별로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실험예 5에 따른 각 실험군에서의 체중증가량을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실험예 5에 따른 각 실험군에서 체중 대비 간(a), 부고환 지방(b), 후복막 지방(c), 서혜 지방(d), 견갑간 지방(e)의 지방 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실험예 5에 따른 각 실험군으로부터 분리한 혈장에서 측정한 LDL-cholesterol(a), 트리글리세리드(triglyceride; TG)(b), HDL-cholesterol(c), 글루코스(d), 인술린(e), HOMA-IR(f)을 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실험예 5에 따른 각 실험군으로부터 분리한 부고환 백색 지방으로부터 RNA를 추출하고, 이로부터 qPCR 분석을 실시하여 기방 대사 관련 유전자의 mRNA 발현량을 분석하여 나타낸 그래프이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일측면은 비만억제 활성을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 인체로부터 분리한 균주로, 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 11월 2일자로 기탁된 균주이다.

본 발명에 따른 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 그람 염색시 보라색을 나타내는 그람양성균이고, 탄소원으로 글루코스, 갈락토스, 말토스, D-리보오소, 슈크로스, 락토스, 트레할로스 라피노스 등을 이용한다.

또한, 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 비만활성 외에, 비만에 의한 염증 억제 활성을 더 나타낼 수 있다. 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 경구 투여를 통해 섭취할 경우, 지방세포의 분화를 억제하고, M2 대식세포로의 분화를 유도하여 비만을 억제하며, 숙주의 식이지방 흡수를 감소시키는 반면 식이지방 배출은 증가시킴으로써 숙주의 체중을 감소시킨다.

또한 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 위산 또는 담즙에 대하여 생존능이 우수하여, 동물의 체내에서 높은 생존력을 나타내므로, 비만 억제 활성을 체내에서 오래 유지할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스(probiotics)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 배양상태를 그대로 사용하거나, 건조 분말의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에서 배양액이란, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에, 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 일정기간 배양하여 얻는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 이에 포함된다.

상기 배양액은 원심분리 또는 여과과정을 거친 것이거나, 농축된 것일 수 있으며, 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다.

본 발명에서 프로바이오틱스란, 건강에 도움이 되는 장내 세균총 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물 즉 생균류를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다.

본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 프로바이오틱스로 알려진 락토바실러스 속의 균주로, 위산과 담즙에 대한 생존능이 우수하고, 그 자체로 비만 활성 효과를 가지므로, 프로바이오틱스, 즉 생균제로 이용될 수 있다.

상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주( KCCM12145P ) 또는 이의 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 조성물 내 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주의 생균수가, 5×10⁷CFU 미만의 농도로 포함되도록 투여될 수 있으나, 이는 환자 및 상황에 따라 선택되어야 할 사항으로 상기 조성물 내 생균수에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 배양액이란, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에, 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 일정기간 배양하여 얻는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 이에 포함된다. 상기 균주가 제거된 배양액은 배양액을 멸균하여 사균체를 포함하게 할 수도 있고, 여과 또는 원심분리를 통해 균체를 제거한 여액 또는 원심분리 상등액일 수 있다.

상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주(KCCM12145P) 또는 이의 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50 중량%로 포함되고, 이를 바로 사용할 수도 있고, 농축하여 사용할 수도 있으며, 농축 또는 건조한 후 희석하여 사용할 수 있다.

본 발명의 비만의 개선, 치료 또는 예방 효과는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei ) AO356 균주가 증식하면서 비만세포의 분화를 억제하고, M2 타입의 대식세포로의 분화를 유도하며, 숙주의 식이지방 흡수를 감소시키는 반면 식이지방 배출은 증가시킴으로써 숙주의 체중을 감소시키는 것으로 예상되며, 상기 조성물은 액상 그 자체로 사용할 수도 있고, 이를 건조하여 분말화할 수도 있다.

상기 '유효성분으로 포함하는'이란 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주 또는 이의 배양액의 비만 개선, 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

상기 조성물의 투여로 비만의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료는 상기 조성물의 투여로 비만의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 식품 조성물이란, 상기 조성물을 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태로 제제화 한 것일 수 있고, 또는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 식품 조성물에 있어서의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주 또는 이의 배양액 첨가량은, 대상인 식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 식품 조성물의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.

상기 식품 조성물은 유효성분으로서 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주 혹은 이의 배양액 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.

향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주 혹은 이의 배양액 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

또한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주 혹은 이의 배양액을 유효성분으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주의 생균수는 5×10⁷CFU 미만, 바람직하게는 5×10³내지5×10⁷CFU의 농도로 포함되도록 투여될 수 있으나, 이는 환자 및 상황에 따라 선택되어야 할 사항으로 상기 조성물 내 생균수에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

또한 상기 조성물에서 상기 배양액은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 인체로부터 분리된 균주로 생균으로 과량 투여된다 하더라도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

상기 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10g/㎏이다.

상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실시예 1. 36종의 균주

비만 억제 활성을 갖는 프로바이오틱스(probiotics)의 후보군을 선별하기 위해서 인체 유래 36종의 균주(표 1)를 수집하였고, 각각의 균주를 분리하여 동정하여 표 1에 나타내었다. 각 균주는 MRS 배지(Difco, 288110)로 37 ℃, 18-24 시간동안 배양하였다.

번호	균주명
1	Lactobacillus sakei subsp. Sakei
2	Streptococcus infantarius subsp. Coli
3	Bacillus licheniformis
4	Bacillus siamensis
5	Lactobacillus sakei subsp. Carnosus
6	Enterococcus faecalis
7	Enterococcus hirae
8	Carnobacterium maltaromaticum BA
9	Lactobacillus reuteri
10	Enterococcus faecium
11	Enterococcus faecium
12	Enterococcus faecium
13	Lactobacillus fermentum
14	Lactobacillus mucosae
15	Lactobacillus paracasei AO365
16	Lactobacillus acidilactici
17	Lactobacillus zeae
18	Enterococcus faecium
19	Lactobacillus reuteri
20	Lactobacillus johnsonii
21	Lactobacillus pentosus
22	Lactobacillus gasseri
23	Lactobacillus ruminis
24	Lactobacillus mesenteroides subsp. Mesenteroides
25	Obesumbacterium proteus
26	D29
27	I01-7
28	I02-4
29	M40a
30	Lactobacillus acidophilus
31	Lactobacillus rhamnosus
32	pediococcus pentosaceus
33	Bifidobacterium lactis
34	Bifidobacterium breve
35	Lactobacillus acidophilus
36	Lactobacillus intestinalis

실험예 1. 지방세포 형성 억제 활성을 갖는 균주 선별

상기 상위 후보 균주들의 항비만 효능을 평가하기 위하여, 전지방세포(3T3-L1세포)의 지방세포로의 분화 억제능(실시예 1)과 대식세포(splenic macrophage isolated from mice) 조절능(실시예 2)을 분석 및 비교하였다.

(1) 실험방법

지방세포내에 지질이 축적되는 것은 비만의 가장 대표적인 특징이다. 지방세포(adipocyte)는 줄기세포에서 유래하는 지방전구세포(pre-adipocyte)의 분화에 의하여 형성되는데, 3T3-L1 세포(전지방세포)가 지방세포(adipocyte)로 분화되는 동안 형태학적, 생화학적 변화를 통하여 세포내 지방구가 형성되고, 분화가 진행될수록 지방구의 크기는 커지게 된다. 대부분의 지방구는 트리글리세리드(triglyceride)와 perilipin A와 같은 단백질로 구성되어 있으므로, 세포내 트리글리세리드(triglyceride) 함량을 측정함으로써, 지방분화 정도를 확인할 수 있다.

따라서 대표적인 전지방세포인 3T3-L1 세포에 상위 후보 균주들을 각각 처리하고, 분화를 유도하여 세포내 트리글리세리드(triglyceride;TG)함량을 측정함으로써 지방세포 형성(adipogenesis)을 억제하는 활성을 평가하였다.

상술한 TG 함량 측정 실험을 위하여 세포배양은 최소 8일 이상 유지하였다. 또한, 3T3-L1 세포의 생장에 대한 상위 후보 균주들의 영향을 배제하기 위하여 상위 후보 균주들은 사균 형태로 처리되었다.

TG 실험에 앞서, 상위 후보 균주들에 대하여 WST(water soluble tetrazolium) 분석을 통해 세포 독성을 확인한 결과, 1×10⁷ 내지 1×10⁶ CFU 에서 세포독성을 나타내지 않았으므로, 지방세포 형성(adipogenesis) 억제활성을 측정하기 위하여, 처리되는 상위 후보 균주의 사균농도는 1×10⁷ 내지 1×10⁶ CFU/well로 고정하여 수행하였다.

구체적으로 지방분화과정에서 지방 축적 정도에 상기 후보 균주가 미치는 효과를 알아보기 위하여 Negrel과 Dani의 방법에 따라 Oil Red O 염색을 실시하였다. 100% 컨플루언트(confluent)된 3T3-L1 세포에, 상기 36종의 상위 후보 균주룰 각각 1×10⁷ CFU/mL로 처리하여, MDI 배지(DMEM + FBS + PS + Insulin + Dexamethasone + IBMX + Insulin)에서 배양하였다. 10일의 분화 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 10% 포름알데히드로 10분간 고정시켰다. 10% 포름알데히드를 제거하고 다시 포화된 포름알데히드를 넣어 1시간 이상 세포를 고정시켰다. 그 후 60% 이소프로판올을 넣고 바로 제거한 후 증류수로 세척하고 Oil red O 염색용액으로 30분간 지방구를 염색한 후 증류수로 세척하였다. 염색된 지방구의 세포내 지방축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안적으로 36종 균주가 지방분화시 지방축적에 미치는 영향을 관찰하였다. 축적된 지방 확인을 위해 잘 건조된 상태에서 이소프로판올을 첨가하여 Oil red O dye를 용출한 뒤 multi-plate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 이소프로판올을 blank로 사용하였다.

(2) 결론

도 1은 본 발명의 실험예 1에 따라 비만 억제 활성을 갖는 균주를 선별하기 위한 일련의 분석 과정이 도시되어 있는 도면이고, 도 2는 본 발명의 실험예 1에 따라 측정된 36종 균주 각각의 Oil red O 염색법을 이용한 지방 축적도(Lipid accumulation)를 나타낸 그래프이다.

도 2에 나타난 바와 같이, 각 36종 균주의 세포내 트리글리세리드(triglyceride;TG) 함량을 비교한 결과, 균주번호 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 15, 16, 21, 24, 28, 29의 균주에서 10% 이상 TG 함량이 감소하였음을 확인하였고, 이 중에서도 15, 21번 균주는 지방세포 형성(adipogenesis) 억제활성이 가장 우수한 것을 확인하였다.

실시예 2. 대식세포(splenic macrophage isolated from mice) 조절능 평가

지방세포(adipose tissue)내에는 아디포사이트(adipocytes)이외에 염증반응을 조절하는 대식세포(macrophage)가 존재한다. 따라서 비만이 발생할 경우 지방세포 내에 존재하는 대식세포에 의해서 만성적인 염증 또는 당뇨도 동반된다.

정상적인 상태에서는 지방세포에 M2 type의 대식세포가 존재하는데, 이는 염증을 완화하고, 인슐린 저항성이 생기지 않도록 유지 및 보호하는 활성을 갖는 항염증(anti-inflammatory) 대식세포이다. 이에 반해 비만의 경우, 대식세포는 지방세포안으로 침투(infiltration)하게 되고, M2 type의 대식세포가 M1 type의 대식세포로 변환(switching)하게 된다. M1 type 대식세포는 염증성 대식세포로, 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)과 케모카인(chemokines)이라는 화학물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 IL-1beta, TNF-alpha, IL-6, IL-12 등의 사이토카인들의 생산을 유도하여 염증을 발생시키고, 인슐린 저항성을 촉진시킨다.

따라서 비만에 의해 동반되는 질환, 염증, 당뇨 등을 예방하기 위하여, M1 type에서 M2 type 대식세포로 전환되는 정도와, M0 type 대식세포에서 M2 type 대식세포로 분화를 유도하는지 여부를 분석하여, 각 균주의 대식세포 조절능을 평가하였다.

(1) 실험방법

대식세포(macrophage)를 조절할 수 있는 균주를 선별하기위해 마우스로부터 비장을 분리 후, 지라세포(splenocyte; 단핵구)를 분리하였으며, 지라세포(splenocytes)안에는 T 세포, B 세포 등 다양한 면역세포가 존재하기 때문에 MACS 시스템을 이용하여 CD11b과 대식세포(macrophages)만을 분리하여 실험을 수행하였다. 분리된 대식세포를 96 well plate에 1x10⁶ cells/well로 분주한 후 2 시간이상 배양하고, 대식세포들이 well 바닥에 안정적으로 부착이 되면 100 ng/ml의 LPS와 3x10⁷ CFU/well의 36 종의 균주(사균 또는 생균형태)들을 각각 첨가한다. 48시간 후, 상등액을 회수하여 생산된 IL-12와 IL-10의 분비량을 ELISA법을 이용하여 측정하였다. 이때 IL-12는 M1 type 대식세포의 확인인자이고, IL-10은 M2 type 대식세포의 확인인자이다.

도 3은 본 발명의 실험예 2에 따라 비만 억제 활성을 갖는 균주를 선별하기 위한 일련의 분석 과정이 도시되어 있는 도면이고, 도 4는 본 발명의 실험예 2에 따라 사균형태의 36종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 사이토카인 분비량(%)을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 5는 본 발명의 실험예 2에 따라 사균형태의 36종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 IL-12에 대한 IL/10의 비(ratio)를 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 6은 본 발명의 실험예 2에 따라 생균형태의 36 종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 사이토카인 분비량(%)을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 7은 본 발명의 실험예 2에 따라 생균형태의 36 종 균주 각각을 처리하였을 때, 대식세포에서의 IL-12에 대한 IL-10의 비(ratio)를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 4, 5를 살펴보면, 사균을 처리하였을 경우 Il-10/IL-12의 비가 2 배 이상 증가한 균주 12종(균주번호 : 1, 3, 6, 8, 10, 16, 20, 21, 22, 30, 31, 33)을 확인하였다.

도 6, 7에서와 같이 생균을 처리하였을 경우 Il-10/IL-12의 비가 3 배 이상 증가한 균주 총 11 종(균주번호 : 1, 3, 5, 6, 7, 8, 13, 14, 15 16, 23)을 확인하였다.

상술한 결과를 바탕으로 확인된 균주들 중에서, 지방분화억제활성이나 대식세포 조절능이 우수하지 않더라도, 동시에 두 활성을 모두 나타내는 균주를 우선적으로 하여 선별하였고, 이를 통해 총 4종의 균주를 선별하였다. 구체적으로 3, 6 균주는 인 비트로 상에서 지방세포 형성 억제 활성이 있고, Il-10/IL-12의 비가 가장 높은 것으로 확인되어 선별하였고, 13번 균주는 인 비트로 상에서 지방세포 형성 억제활성과 대식세포 조절 활성을 모두 보이는 균주인 것으로 확인되어 선별하였다.

또한, 15번 균주인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356는 지방분화억제활성이 가장 뛰어났고, 비교적 높은 IL10/IL12 비율을 갖는 것으로 확인되었으므로 선별하였다.

(3) 종합

실험예 1, 2의 결과를 종합하여, 지방세포 형성(adipogenesis) 억제 활성이 우수하면서, 대식세포에 대한 조절 활성이 뛰어난 균주 4종(균주번호 : 3, 6, 13, 15)을 선별하였고, 선별된 4종의 균주 중에서 생체 내에서도 우수한 비만 억제 활성을 나타내는 균주를 2차적으로 선별하고자, 후술하는 인 비보상에서 실험을 통해 생체 내에서 비만 억제 활성을 비교하였다.

실험예 3. 선별된 4종의 균주에 따른 동물실험을 통한 비만 억제 활성 효과 확인

가. 실험동물 및 실험군

실험동물은 C57BL/6 6 주령 수컷을 (주)중앙실험동물에서 구입하여 사용하였으며, 온도 20±2 ℃, 습도 55±5%, 12 시간 명암조건에서 사육하였다. 실험동물은 구입후 2 주일 동안 순화한 다음, 각 군당 5마리씩을 배치하여 표 2와 같이 실험군을 설정하였다.

구분 (N=5)	실험군
Normal diet	일반 사료를 섭취하는 정상 대조군(ND, 10% fat), PBS를 주 5회, 8주 동안 100 ㎕/head 경구투여
high fat diet	비만유발을 위해 고지방 사료를 섭취하는 음성 대조군(HFD, 45% fat), PBS를 주 5회, 8주 동안 100 ㎕/head 경구투여
A	비만유발을 위한 고지방 사료를 섭취하고, 균주번호 3(Bacillus licheniformis)를 0~4주 동안 주 5회 10⁸ CFU/head를 경구투여한 후, 5~8주 동안 주 5회 5X10⁸ CFU/head를 경구투여
B	비만유발을 위한 고지방 사료를 섭취하고, 균주번호 6(Enterococcus faecalis)를 0~4주 동안 주 5회 10⁸ CFU/head를 경구투여한 후, 5~8주 동안 주 5회 5X10⁸ CFU/head를 경구투여
C	비만유발을 위한 고지방 사료를 섭취하고, 균주번호 13(Lactobacillus fermentum)를 0~4주 동안 주 5회 10⁸ CFU/head를 경구투여한 후, 5~8주 동안 주 5회 5X10⁸ CFU/head를 경구투여
D	비만유발을 위한 고지방 사료를 섭취하고, 균주번호 15(Lactobacillus paracasei AO356)을 0~4주 동안 주 5회 10⁸ CFU/head를 경구투여한 후, 5~8주 동안 주 5회 5X10⁸ CFU/head를 경구투여

정상 대조군(Normal diet), 음성 대조군(Hihg fat diet)를 제외한 모든 실험군은 각각의 균주를 사료에 혼합한 후, 사료와 균주를 함께 경구투여 하였다. 도 8에 본 발명의 실험예 3에 따른 실험동물 및 실험군을 설정하는 과정을 나타내었다.

나. 체중, 사료 섭취량 및 음수량

모든 실험군은 사료를 급식한 시점부터 실험동물을 희생시킬 때까지의 실험동물의 체중변화량(g), 사료 섭취량(g), 음수량(㎖)을 확인하였다. 주 3회 사료, 물 섭취량 측정하였으며, 주 2회 케이지를 교환해 주었고, 주 1회 체중을 측정하여 비교하였다.

도 9는 각 실험군에서의 체중변화량을 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 15번 균주인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356에서 체중증가량의 감소가 명확하게 확인되었다.

실험예 4. 선별된 균주의 동정

16S rDNA 분석

최종 선별된 균주는 PCR 반응을 위해 Universal bacterial primer (518F, 800R)를 사용하여 세균의 염기보존 서열인 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였다 (서열번호 1). 그 결과는 NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 해석하였다.

본 발명자들은 Lactobacillus paracasei AO356을 각각 "락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356(KCCM12145P:)"로 명명하고 이를 한국미생물보존센터에 2017년 11월 2일자로 기탁하였다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12145P

수탁일자 : 20171102

실험예 5. 선별된 최종 AO356 균주의 동물실험에서 비만 억제 활성 효과 확 인

가. 균주 배양

최종 선별된 최종 락토바실러스 파라카제이 AO356 균주(Lactobacillus paracasei AO356)를 생산하기 위하여, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 고체 배지(Lactobacilli MRS Agar; BD Difco Co, USA)에 획선 접종하고, 37 ℃, 24시간 배양하였다. 배양과정에 균체에 오염이 발생했는지, 단일집락을 형성하였는지 여부를 꼼꼼하게 확인한 후 다음실험을 진행하였다. 배양이 완료된 후, 각 고체배지로부터 콜로니(colony)를 취한 다음, 이를 액체 배지(Lactobacilli MRS broth; BD Difco Co, USA) 5 mL에 접종하고 37 ℃, 140 rpm, 24시간 배양한 후, 이를 준비된 다른 액체 배지(Lactobacilli MRS broth; BD Difco Co, USA) 200 mL에 1 %(v/v) 접종하여 단계적으로 증균시켰다. 활성화된 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 2.4L - 5L의 본 배양을 진행하여 37℃ 조건에서 140rpm, 24시간 배양한 뒤 6000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리(Avanti J-E, Beckman Coulter, USA)하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 멸균한 0.85% 생리식염수로 2회 washing 한 후 동결건조(FDCF-12003, OPERON, Korea)하여 파우더화하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.

나. 실험동물 및 실험군

실험동물은 6주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 (주)중앙실험동물에서 구입하여 사용하였으며, 온도 20±2 ℃, 습도 55±5%, 12 시간 명암조건에서 사육하였다. 실험동물은 구입후 2 주일 동안 순화한 다음, 무작위 난괴법 (randomized complete block design)으로 각 군당 10마리씩을 배치하여 표 3과 같이 실험군을 설정하였다.

순화기간 동안에는 상기 동물모델에서 장내미생물 균총의 균일화를 위하여 2~3일 간격으로 깔짚을 혼합하여주었다. 이후 실험군당 10마리씩 배치하여 Normal diet (ND)군은 정상식이를 나머지 군은 고지방식이 (Rodent diet with 45%kcal Fat, Research Diets, USA)를 공급하였다. 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 5×10⁷ CFU/head의 농도로 맞추어 무게를 측정한 뒤 멸균된 PBS에 현탁하여 경구투여를 통해 10주간 주당 5회씩 일정한 시간에 투여하였다.

실험기간이 종료된 시점에 실험동물을 12시간 이상 절식시킨 후, 안와채혈을 통해 혈액을 채취하여 상온에 30분 이상 방치한 후 1,690×g에서 10분간 원심분리하여 분리한 혈청을 실험에 사용하였다. 간, 부고환 지방, 후복막 지방, 서혜 지방, 견갑간 갈색지방을 적출하여 식염수로 씻어 물기를 제거하고 견갑간 갈색지방 조직에 붙은 백색지방을 제거한 후, 각각의 무게를 측정하였다.

구분 (N=10)	실험군
ND	일반 사료를 섭취하는 정상 대조군(ND, 10% fat), PBS를 주 5회, 10주 동안 100 ㎕/head 경구투여
HFD	비만유발을 위해 고지방 사료를 섭취하는 음성 대조군(Rodent diet with 45%kcal Fat, Research Diets, USA), PBS를 주 5회, 10주 동안 100 ㎕/head 경구투여
L.paracasei AO356	비만유발을 위한 고지방 사료를 섭취하고, 최종 선별된 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 10주 동안 주 5회 5×10⁷ CFU/head를 경구투여

다. 체중, 사료 섭취량 및 음수량

모든 실험군은 사료를 급식한 시점부터 실험동물 희생시킬 때까지의 실험동물의 체중변화량(g), 사료 섭취량(g/day), 음수량(g/day)을 확인하였다. 매일 사료, 물 섭취량 측정하였으며, 주 2회 케이지를 교환해 주었고, 주 1회 체중을 측정하여 비교하였다.

도 10은 각 실험군에서의 체중변화량을 주별로 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 11은 각 실험군에서의 체중증가량을 분석하여 나타낸 그래프이고, 사료 섭취량(g/day), 음수량(g/day), 칼로리 섭취량(kcal/day)은 표 4에 나타내었다.

	ND	HFD	L. paracasei AO356	P value
Average of daily food intake (g/day)	3.56±0.05	2.64±0.04	2.55±0.05	<0.001
Average of daily water intake (g/day)	3.81±0.08	2.96±0.09	2.99±0.20	0.003
Average of daily calorie intake (kcal/day)	12.83±0.17	13.36±0.21	12.88±0.23	N.S.

도 10, 11 및 표 4에 따르면 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 고지방 사료를 섭취한 마우스에게 10 주간 투여한 결과, 고지방사료만을 공급한 HFD 군에 비해 유의적인 체중증가 억제 현상이 발현되는 것을 알 수 있다.

즉, 고지방사료를 섭취한 HFD 군보다 10.63% 적은 체중을 얻게 되는 것을 확인하였으므로, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 고지방 사료를 섭취함에도 불구하고, HFD 군에 비해 31.33%의 체중증가가 억제되었음을 확인한 바, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주는 체중 증가 억제 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

섭취한 칼로리양은 섭취한 사료양을 통해 계산하였다. 평균 일일 사료 섭취량과 물 섭취량은 ND 군과 HFD 군이 서로 유의적 차이를 보였다. 이는 사료의 구성성분 및 성상의 차이로 인한 것이라 예상되며, HFD 군에 비해 ND 군이 더 많은 사료를 섭취하는 한편, 물의 섭취량도 함께 증가하였음을 확인하였다.

HFD 군과 L. paracasei AO356 군은 서로 사료, 물, 칼로리 섭취량에 차이가 없음을 확인하였는 바, 이를 통해 앞서 실험을 통해 증빙한 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주에 의한 체중증가 억제 활성이 사료 또는 칼로리 섭취 감소에 의한 영향이 아님을 알 수 있다.

라. 간, 부고환 지방, 후복막 지방, 서혜 지방, 견갑간 지방의 분석

실험기간이 종료된 시점에서 12시간이상 절식시킨 후, 간, 부고환 지방, 후복막 지방, 서혜 지방, 견갑간 갈색지방을 적출하여 식염수로 씻어 물기를 제거하고 견갑간 갈색지방 조직에 붙은 백색지방을 제거한 후, 체중 대비 무게를 측정하여, 하기 표 5와 도 12a~e에 나타내었다. 표 5 및 도 12a~e에서 Liver는 간 지방, EFT는 부고환 지방이고, RFT는 후복막 지방이며, IFT는 서혜 지방이며, iBAT는 견갑간 갈색 지방 조직(interscapular brown adipose tissue)을 의미한다.

Tissue weight (mg)	ND	HFD	HFD + L. paracasei AO356	P value
Liver	834.6±15.48	916.16±28.37	838.88±17.99	N.S.
EFT	270.49±19.51^a	1741.68±188.37^c	1149.36± 104.31^b	<0.001
RFT	82.00±22.96^a	642.58±57.26^c	414.01±50.25^b	<0.001
IFT	159.19±14.20^a	873.74±84.50^c	567.89±54.80^b	<0.001
iBAT	54.27±2.59^a	88.10±5.91^c	64.05±5.43^b	0.001
Serum leptin (pg/ml)	0.296±0.034^a	7.200±1.482^c	3.435±0.756^b	<0.001

도 12 및 표 5에 따르면 고지방식이를 섭취한 HFD 군은 ND 군과 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356를 투여한 군에 비해 간조직의 무게가 약간 증가하였음을 확인하였다.

또한, 고지방식이를 섭취한 HFD 군은 부고환 백색 지방 조직(EFT), 후복막 백색 지방 조직(RFT), 서혜 백색 지방 조직(IFT), 견갑간 갈색 지방 조직(iBAT)의 무게가 크게 증가하였는데 반해, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356를 투여할 경우, 각 조직에서의 지방 무게가 유의적으로 감소함을 확인할 수 있다.

한편 렙틴(serum leptin)은 지방조직에서 분비되는 사이토카인으로, 지방조직의 증가와 비례하여 증가한다고 알려져 비만의 대표적인 지표 중 하나이다. 이의 변화를 살펴본 결과 고지방식이를 섭취한 HFD 군에서 증가하였다가, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356를 투여할 경우, 유의적으로 감소하였음을 알 수 있다.

마. 혈청의 생화학적 분석

실험이 종료된 동물모델을 12시간이상 절식시킨 후, 안와채혈을 통해 혈액을 채취하여 상온에 30분이상 방치한 후 1,690×g에서 10분간 원심분리 하여 분리한 혈청을 사용하였다.

상기 혈청을 이용하여, 효소면역측정법 (ELIZA based assay) 키트로 혈청 내 인슐린과 렙틴의 농도를 측정하였다. Homeostasis model assessment for insulin resistance(HOMA-IR)은 측정된 혈청 글루코오스와 혈청 인슐린 농도를 이용하여 다음과 같은 계산식으로 구하였다. 혈청 중성지방, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol 농도는 colorimetry를 이용하여 측정하였고, 혈청 글루코오스 농도는 UV spectrophotometry를 이용하여 측정하였다.

[식 1]

HOMA-IR = fasting glucose(mg/dL) × fasting insulin(μU/mL)/2430

도 13은 본 발명의 실험예 5에 따른 각 실험군으로부터 분리한 혈장에서 측정한 LDL-cholesterol(a), 트리글리세리드(triglyceride; TG)(b), HDL-cholesterol(c), 글루코스(d), 인술린(e), HOMA-IR(f)을 나타낸 그래프이다.

도 13에 나타난 바와 같이, 반복된 고지방식이를 섭취할 경우(HFD 군) 혈중 포도당 및 인슐린의 농도가 증가하고, hyperglycaemia와 hyperinsulinaemia를 유발하여 인슐린 저항성(insulin resistance)을 촉진하게 된다. 이는 본 발명의 실험예를 통해서도 확인되었다.

구체적으로 HFD 군이 ND 군에 비해 혈중 포도당과 인슐린의 농도가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 나아가 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 투여할 경우(L. paracasei AO356 군), LDL-cholesterol, 트리글리세리드(triglyceride; TG), HDL-cholesterol, 글루코스, 인슐린이 전체적으로 감소하였음을 확인하였다.

또한 공복 혈중 포도당과 인슐린농도를 이용하여 산출하여 인슐린저항성의 지표로 사용되고 있는 HOMA-IR 또한 HFD 군에서는 증가하였으나, 동일한 식이를 제공하지만 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주를 투여한 L. paracasei AO356 군에서는 유의적으로 수치가 감소되는 것을 확인하였다.

인슐린은 지방세포내 지방분해를 억제하고 혈중 지방산과 글루코오스를 세포내로 이동시켜 중성지방의 형태로 축적하는 기능을 하는데, HFD 군에서와 같이 인슐린 저항성 상태에서는 이러한 인슐린의 작용이 제대로 발휘되지 못하여 지방산의 유리가 촉진되고 lipoprotein lipase (LPL)의 활성이 감소하게 되고, 결과적으로 혈중 LDL cholesterol이나 중성지방이 증가하는 dyslipidaemia가 발생할 수 있다. 즉 HFD 군에서는 혈청 중성지방, LDL콜레스테롤의 농도가 증가하는 등의 dyslipidaemia가 발생하였으나, 동일한 고지방식이를 공급하지만 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주가 투여되는 L. paracasei AO356 군에서는 이와 같은 현상을 유의적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

바. RNA 침전 및 qPCR 분석

각 실험군의 부고환 백색 지방을 일부 잘라 RNeasy lipid tissue kit를 이용하여 총 RNA를 추출하였고, oligo-dT primer를 이용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR은 SYBR green qPCR (Qiagen) 키트를 이용하여 수행하였다.

도 14는 본 발명의 실험예 5에 따른 각 실험군으로부터 분리한 부고환 백색 지방으로부터 RNA를 추출하고, 이로부터 qPCR 분석을 실시하여 지방 대사 관련 유전자의 mRNA 발현량을 분석하여 나타낸 그래프이다.

일반적으로 체내의 지방조직 중 갈색지방은 열발생을 통해 에너지를 소비하는 기능을 하고 백색지방은 주로 에너지를 지방의 형태로 저장하는 기능을 맡는다고 알려져있다. 따라서 본 발명에서는 최종 선정된 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주가 백색지방을 갈색지방으로 변환시켜, 비만과 같은 질병을 치료하는 효과를 가지고 있는지 확인하고자 하였다.

백색지방에서 UCP1의 발현율 증가는 백색지방의 미토콘드리아의 열발생 능력을 촉진하며, β3-adrenergic agonist 또는 cold exposure, 운동을 통한 UCP1 유전자 발현율 증가를 통해 백색지방의 갈색화(browning/beige fat)를 촉진하고, 체지방의 감소 등을 통한 항비만 효과가 보고된 바 있다.

UCP1는 백색 내장지방의 갈색화에 있어 중요한 기능을 하는데, 도 14를 살펴보면 HFD 군에서 감소되었던 UCP1의 유전자 발현율이 L. paracasei AO356 군에서 회복되는 것을 확인할 수 있다.

또한, PGC1α는 UCP1의 발현을 촉진하는 호르몬인 irisin을 분비하는 단백질 Fndc5의 발현율 촉진하여 백색지방의 갈색화에 관여하는 중요한 기능을 수행하는 유전자로, HFD 군에서 PGC1a 발현율이 감소되었고, L. paracasei AO356 군에서 PGC1a 발현율이 유의적으로 회복되었음을 알 수 있다.

더불어 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주의 투여를 통해 PRDM16, Cidea, PPARγ 유전자의 발현량이 증가하였음을 알 수 있는데, 이들은 백색지방조직의 갈색화를 위한 유전자 프로그래밍을 조절하는 전사인자이다.

한편 도 14c에서 HFD 군에서 감소되었던 CD36이, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주의 투여에 의해 유의적으로 증가하였음을 확인하였고, 이는 갈색지방의 정상 기능이 발휘되는데 필요한 것으로, fatty acids 특히 고도불포화지방산을 세포내로 이동시키는 역할을 하며 고도불포화지방산은 PPARγ의 가장 친화력이 높은 ligands로서 작용하여 PPARγ를 활성화시키는 역할을 한다.

종합하면, 고지방식이로 유도된 비만 동물모델에서 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주의 투여는 고지방식이에 의한 체지방 감소 및 체중 증가 억제의 항비만 활성을 가질 뿐만 아니라, 백색지방의 갈색화와 관련된 유전자들의 발현을 증가시키는 효과를 갖고 있음을 확인하였다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Lactobacillus paracasei AO356 strain with Anti-Obesity Ability and Composition for treatment or improvement or preventing of obesity comprising the same <130> HPC-7705 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rDNA of Lactobacillus paracasei AO356 <400> 1 ggatgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa cgagttctcg ttgatgatcg 60 gtgcttgcac cgagattcaa catggaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgccctta agtgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcat agatccaaga 180 accgcatggt tcttggctga aagatggcgt aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg 240 tattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcgatg atacgtagcc gaactgagag 300 gttgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt 420 cgggtcgtaa aactctgttg ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt tgtcggcgtg 480 acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg 600 atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag cgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag 660 aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720 gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 780 acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt 840 ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca 900 aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag 1020 gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt 1140 gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga 1260 gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta ggctgcaact 1320 cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt 1380 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg 1440 gcgtaaccct tt 1452

Claims

비만억제 활성을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주( KCCM12145P ).
제1항의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주( KCCM12145P ) 또는 이의 배양액을 포함하는 프로바이오틱스(probiotics).
제1항의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주( KCCM12145P ) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주( KCCM12145P ) 또는 이의 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 지방세포 분화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 M2 타입의 대식세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 체중을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주( KCCM12145P ) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항의 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) AO356 균주( KCCM12145P ) 또는 이의 배양액을 포함하는 비만에 의한 염증 개선용 식품 조성물.