KR102075952B1 - 개의 수혈 적합성 판별 방법, 및 이를 위한 키트, 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개의 수혈 적합성 판별 방법, 및 이를 위한 키트, 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 구체적으로 수혈용 개 혈액이 수혈받을 개에서 면역반응을 일으키는지를 검증할 수 있도록 항체를 사용하여 수혈용 개 혈액 시료와 수혈받을 개의 혈액 시료를 대상으로 항원-항체 반응을 수행하되, 상기 항체로 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 상기 각 시료와 접촉시키고, 항원-항체 결합을 검출하는 것을 특징으로 하는 개의 수혈 적합성 판별 방법 및, 이를 위한 키트, 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 기존의 대표적인 개 수혈 적합성 판별 방법인 DEA 혈액형 시스템 뿐만 아니라 Dal 및 Shigeta 시스템과는 별개의 독립적인 개 혈액의 항원을 이용하는 방법으로, 기존 개 수혈 적합성 판별의 문제점을 효과적으로 보완할 수 있다. 특히 본 발명의 단일클론항체는 각 항원에 대해 특이성이 높아 매우 정확하고 용이한 판별을 가능하게 한다.

Description

개의 수혈 적합성 판별 방법, 및 이를 위한 키트, 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주{Method for determinating dog blood transfusion compatibility, and kit, monoclonal antibodies and hybridoma cell-line for the same}
본 발명은 개의 수혈 적합성 판별 방법, 및 이를 위한 키트, 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 구체적으로 수혈용 개 혈액이 수혈받을 개에서 면역반응을 일으키는지를 검증할 수 있도록 항체를 사용하여 수혈용 개 혈액 시료와 수혈받을 개의 혈액 시료를 대상으로 항원-항체 반응을 수행하되, 상기 항체로 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 상기 각 시료와 접촉시키고, 항원-항체 결합을 검출하는 것을 특징으로 하는 개의 수혈 적합성 판별 방법 및, 이를 위한 키트, 단일클론항체 및 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
사람이 수혈을 받기 위해서는 수혈부작용을 최소화하기 위하여 면역거부반응을 일으키지 않는지 등을 사전에 확인하는 과정이 필수적이며, 적합하지 않은 혈액을 수혈할 경우 즉각 사망에 이를 수 있을 정도로 위험하다. 사람 이외의 다른 동물 또한 면역거부반응을 일으키는 혈액을 수혈할 경우 사망에 이를 수 있으므로, 수혈하기 전 적합성을 판별하는 것이 필요하다.
사람에 대해서는 많은 연구가 이루어져 혈액형 검사, 항체 선별 검사, 교차 적합 시험 등 수혈 적합성을 판별하기 위한 효과적인 방법들이 개발되어 사용되고 있다. 반면, 개의 경우 몇몇 적합성 판별 방법이 개발되어 있기는 하지만 이에 대한 문제가 발생하고 있다.
대표적으로 개 수혈에 따른 민감성 실험을 기초로 1974년 국제위원회에 의해 8개의 DEA(Dog Erythrocyte Antigen)가 다클론 동종항체로 분류되었고, 이들 항원을 이용하여 개의 혈액형을 판별하기 위한 기술들이 개발된 바 있다. 그러나 이들 항원 중 DEA 1에 대한 시약 만이 상업적으로 이용 가능하며, DEA 1의 경우 DEA 1.1과 1.2의 구분이 필요한데 아직까지 이것이 명확하지 않다는 문제와 민감도의 개선이 필요하다는 문제가 있다. 또한 Dal(Dalmatian) 및 Shigeta 개 혈액형을 포함하여 공식적으로 분류되지 않은 적혈구 항원(RBC)이 개에서 확인되었고, 2차 수혈로 급성 용혈성 수혈 반응을 보이는 경우 뿐만 아니라 1차 수혈 후 주요 교차적합 불화합성을 보이는 경우도 보고되어, DEA 혈액형 시스템을 보완하거나 대체하기 위한 새로운 수혈 적합성 판별 방법의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 기존 개 수혈 적합성 판별 기술의 문제점들을 보완 또는 대체할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다. 이와 관련하여 연구를 통해 Kai 1 및 Kai 2라고 명명한 항원으로 개의 혈액형을 구분할 수 있음을 증명한 바 있으나(J Vet Intern Med 2016;30:1642-1647), 수혈 적합성에 대해서는 알 수 없었다. 이후 추가 연구를 통해 이들 항원에 대한 단일클론항체로 수혈 적합성을 판별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
J Vet Intern Med 2016;30:1642-1647.
따라서 본 발명의 주된 목적은 DEA 혈액형 시스템과 같은 기존 개의 수혈 적합성 판별 방법을 보완 또는 대체할 수 있는 새로운 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 새로운 개의 수혈 적합성 판별 방법에 필요한 항체 및 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수혈용 개 혈액이 수혈받을 개에서 면역반응을 일으키는지를 검증할 수 있도록 항체를 사용하여 수혈용 개 혈액 시료와 수혈받을 개의 혈액 시료를 대상으로 항원-항체 반응을 수행하되, 상기 항체로 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 상기 각 시료와 접촉시키고, 항원-항체 결합을 검출하는 것을 특징으로 하는 개의 수혈 적합성 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 판별 방법을 수행하기 위한 키트로, 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 포함하는 개의 수혈 적합성 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 판별 방법에 필요한 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체, 및 이 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 판별 방법에 필요한 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체, 및 이 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 방법은 기존의 대표적인 개 수혈 적합성 판별 방법인 DEA 혈액형 시스템 뿐만 아니라 Dal 및 Shigeta 시스템과는 별개의 독립적인 개 혈액의 항원을 이용하는 방법으로, 기존 개 수혈 적합성 판별의 문제점을 효과적으로 보완할 수 있다. 특히 본 발명의 단일클론항체는 각 항원에 대해 특이성이 높아 매우 정확하고 용이한 판별을 가능하게 한다.
도 1은 본 발명의 단일클론항체를 SDS-PAGE로 분리한 결과이다. (A) 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체(이하, '항-Kai 1 항체'라 한다), (B) 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체(이하, '항-Kai 2 항체'라 한다), M: 마커(kDa), Lane 1: 생쥐의 IgG, Lane 2 및 3: 정제된 항체.
도 2는 본 발명의 단일클론항체의 동종형을 확인하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. (A) 항-Kai 1 항체, (B) 항-Kai 2 항체.
도 3은 본 발명의 단일클론항체의 항원을 확인하기 위한 면역블롯 결과를 나타낸 것이다. (A) 항-Kai 1 항체, (B) 항-Kai 2 항체, M: 마커(kDa), Lane 1: Kai 1+/Kai 2- 적혈구, Lane 2: Kai 1-/Kai 2+ 적혈구, Lane 3: Kai 1-/Kai 2- 적혈구.
도 4는 본 발명의 단일클론항체의 항원을 확인하기 위한 친화 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. (A) 친화 크로마토그래피 과정을 나타낸 모식도, (B) Kai 1+ 적혈구의 막단백질 중 항-Kai 1 항체에 결합하는 단백질을 친화 크로마토그래피로 확인한 결과 - M: 마커(kDa), Lane 1: Kai 1+ 적혈구에서 정제된 막단백질(10㎍), (C) Kai 2+ 적혈구의 막단백질 중 항-Kai 2 항체에 결합하는 단백질을 친화 크로마토그래피로 확인한 결과 - M: 마커(kDa), Lane 1: 소혈청알부민(2㎍), Lane 2: Kai 2+ 적혈구에서 정제된 막단백질(10㎍).
도 5는 Kai 불일치 수혈 모델의 21일 후 응집 결과를 나타낸 것이다. (A) Kai 2+/DEA 1+ 혈액을 수혈받은 Kai 2-/DEA 1+ 개의 응집 결과, (B) Kai 1+/DEA 1+ 혈액을 수혈받은 Kai 1-/DEA 1+ 개의 응집 결과. 기준막대 : 200㎛.
본 발명의 개의 수혈 적합성 판별 방법은 수혈용 개 혈액이 수혈받을 개에서 면역반응을 일으키는지를 검증할 수 있도록 항체를 사용하여 수혈용 개 혈액 시료와 수혈받을 개의 혈액 시료를 대상으로 항원-항체 반응을 수행하되, 상기 항체로 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체(이하, '항-Kai 1 항체'라 한다) 및 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체(이하, '항-Kai 2 항체'라 한다)를 상기 각 시료와 접촉시키고, 항원-항체 결합을 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단일클론항체는 상기 각 하이브리도마 세포주를 사용하여 통상적인 단일클론항체 생산방법에 따라 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하이브리도마 세포를 쥐에 복강 내 접종하여 복수를 얻고 정제하는 방법으로 수득할 수 있다.
본 발명의 항체는 각각 Kai 1, Kai 2라 명명된 항원에 특이적으로 결합하는 항체로 항-Kai 1 항체는 IgM 카파(kappa) 타입의 항체이며, 항-Kai 2 항체는 IgG3 람다(lamda) 타입의 항체이다. 항원인 Kai 1 및 Kai 2는 개의 적혈구(red blood cell, RBC)의 막단백질(membrane protein)로 이중 Kai 1은 약 200kDa 및 약 50kDa의 분자량 크기, Kai 2는 약 80kDa의 분자량 크기를 나타낸다.
본 발명에서 항원-항체 결합의 검출은 통상적인 항원-항체 반응 검출 방법, 예를 들어 침강반응, 응집반응, 보체결합반응, 면역부착반응 등의 방법에 따라 수행될 수 있다. 사람의 ABO 혈액형 검사를 위해 통상적으로 사용되는 방법과 같이 항체가 함유된 시약을 시험관 또는 플레이트 상에서 적혈구와 반응시켜 응집이 일어나는지를 육안으로 확인하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 개 혈액은 Kai 1+/Kai 2-(이하, 'Kai 1 혈액형'이라 한다), Kai 1-/Kai 2+(이하, 'Kai 2 혈액형'이라 한다) 또는 Kai 1-/Kai 2-(이하, 'Kai - 혈액형'이라 한다)의 3가지로 분류될 수 있다. 이때 'Kai 1+'는 항-Kai 1 항체에 항원-항체 반응을 나타내는 것, 'Kai 1-'는 항-Kai 1 항체에 항원-항체 반응을 나타내지 않는 것, 'Kai 2+'는 항-Kai 2 항체에 항원-항체 반응을 나타내는 것, 'Kai 2-'는 항-Kai 2 항체에 항원-항체 반응을 나타내지 않는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, Kai 1 또는 Kai 2가 개의 수혈 시 항원으로 작용하여 면역반응을 일으킨다. 즉, Kai 1+인 개 혈액은 Kai 1-인 개에게 수혈하는 것이 부적합하고, Kai 2+인 개 혈액은 Kai 2-인 개에게 수혈하는 것이 부적합하다.
따라서 다음과 같이 수혈 적합성을 판별할 수 있다.
1) Kai 1 혈액형(Kai 1+/Kai 2-)의 개에게는 Kai 1 혈액형(Kai 1+/Kai 2-)의 혈액 또는 Kai - 혈액형(Kai 1-/Kai 2-)의 혈액을 수혈하는 것이 적합
2) Kai 2 혈액형(Kai 1-/Kai 2+)의 개에게는 Kai 2 혈액형(Kai 1-/Kai 2+)의 혈액 또는 Kai - 혈액형(Kai 1-/Kai 2-)의 혈액을 수혈하는 것이 적합
3) Kai - 혈액형(Kai 1-/Kai 2-)의 개에게는 Kai - 혈액형(Kai 1-/Kai 2-)의 혈액을 수혈하는 것이 적합
상기와 같이 본 발명의 항체는 기존 DEA 혈액형 시스템, Dal 및 Shigeta 시스템과 전혀 다른 양상의 항원-항체 반응을 나타내므로, 본 발명의 방법은 기존의 시스템과는 다른 새로운 개 혈액의 항원을 바이오마커로 이용하는 개의 수혈 적합성 판별 방법이라고 할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기와 같은 본 발명의 개의 수혈 적합성 판별 방법을 효율적으로 수행할 수 있도록 할 수 있는 키트로, 상기 항-Kai 1 항체 및 항-Kai 2 항체를 포함하며, 이 밖에 본 발명의 방법에 필요한 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 완충제 등의 항체의 안정화를 위한 시약, 슬라이드 글라스 등의 항원-항체 반응을 수행하는데 필요한 기구 등이 더 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1-1. 실험방법
1-1-1. 동물 및 샘플
암컷 생쥐(BALB/c, 6주령)를 사용하였다. 모든 생쥐는 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며, 12시간의 명암주기를 유지하였다. 수혈받지 않은 개와 수혈받은 개의 EDTA 혈액 샘플은 동물병원과 한국동물혈액은행(KABB)에서 제공받았다. 치료 중에 수집된 혈액샘플을 실험에 사용할 수 있도록 개 소유자로부터 서면 동의를 얻었다. 모든 동물실험은 대구한의대의 실험동물운영위원회의 승인을 받아 수행되었다.
1-1-2. 개 혈액에 대한 단일클론항체의 스크리닝 및 생산 : Kai 1 및 Kai 2
한국의 마스티프(Mastiff)견 두 마리로부터 RBC를 얻어 6마리의 쥐에 감작하는 방법으로 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 제작하였다.
1. Rapid Vet-H DEA 1.1(DMS Laboratories, Inc, Flemington, NJ, USA)을 통해 DEA 1.1+로 분류되고, Shigeta 1.1B+이며(Shigeta Animal Pharmaceutical Inc, Oyabe, Japan), 다클론 항혈청(KABB, Sokchosi, South Korea)을 통해 DEA 1.1+로 분류된 개를 단클론 항-Kai 1 항체의 생산에 적용
2. Rapid Vet-H DEA 1.1을 통해 DEA 1.1-로 분류되지만, Shigeta 1.2B+이고, 다클론 항혈청(KABB, Sokchosi, South Korea)을 통해 DEA 1.2+로 분류된 개를 단클론 항-Kai 2 항체의 생산에 적용
항응고 처리한 개의 혈액을 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.2)로 세척 한 후, 샘플을 1 x 108 cells/㎖의 RBC로 조절하였다. 수집하기 17, 10 및 3일 전에 RBC 현탁액 1㎖를 생쥐에 복강 내 주사하였다. 이소플루란 마취 하에 생쥐를 희생시키고, 비장세포를 얻었다. 50% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 5 : 1의 비율로 세포를 생쥐 골수종 세포(P3X63Ag8.653; ATCC, Manassas, VA, USA)와 융합시켰다. 100μM 히포크산틴, 0.4μM 아미노프테린 및 16μM 티미딘이 함유된 히포크산틴 - 아미노프테린 - 티미딘 배지로 하이브리도마 세포를 분리한 후, 감작에 사용된 혈액에 특이적인 응집을 나타내는 하이브리도마 세포를 직접 적혈구응집반응 분석으로 선별하였다. 양성 하이브리도마 세포를 새롭게 준비된 암컷 BALB/c 생쥐(n = 6)에 복강 내 접종하여 단클론항체를 함유하는 복수를 얻었다.
1-1-3. 항체 정제
복수를 0.45㎛ 시린지 필터로 여과하고 PBS로 5배 희석한 다음, protein L 또는 protein G 컬럼(GenScript, Piscataway, NJ, USA)에 통과시켰다. 컬럼 레진은 PBS로 3회 세척하였고, 면역글로불린은 0.1M 글리신(pH 3.0) 완충액으로 용출하였으며, 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가하여 중화시켰다. 정제된 단클론항체를 PBS로 추가 희석하고 BCA(bicinchoninic acid) 및 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 생쥐 IgG(Abcam, Cambridge, UK)와 비교하여 분석하였다.
1-1-4. Kai 항체의 동종형 결정
염소 항-생쥐 중쇄 항체(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA 및 IgM) 또는 염소 항-생쥐 경쇄 항체(카파 또는 람다)가 코팅된 ELISA 플레이트(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하였다. 두 개 혈액 샘플에 대한 정제된 항체를 각 웰에 첨가하고 광학밀도 0.2 이상에서 450nm에서 흡광도를 측정하여 동종형을 결정하였다.
1-1-5. 개 RBC 막 단백질을 사용한 웨스턴블롯
당단백질 분리 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 개 RBC 막 단백질을 침전시키고, 단백질 농도를 결정하였다(Bio-Rad DC protein assay kit II, Bio-Rad, CA, USA). 50±100㎍의 단백질을 함유하는 세포용해물을 4x NuPAGETM-LDS 샘플 완충액에 혼합하고, 단백질을 1x NuPAGE MES SDS 전개 완충액을 사용한 NuPAGF™ Bis-Tris 겔로 분리하였다(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). 전이 완충액(25mM Tris, 250mM 글리신, 20% 메탄올)을 사용하여 300mA로 90분간 겔을 Hybond ECL 전이 막으로 전기-전이시켰다. 비특이적 결합부위를 차단하기 위해, 막을 5% 탈지분유가 함유된 Tween 20 함유 Tris-완충 식염수(TBST)로 상온(약 22℃)에서 90분간 처리하였다. 막을 Kai 1(1:250 titer) 또는 Kai 2(1:100) 항체가 함유된 3% 탈지분유 함유 TBST로 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 막을 TBST로 30분간 3회 세척하고 염소 항-생쥐 IgM 또는 IgG HRP 접합 2차 항체(1:3000)가 함유된 3% 탈지분유 함유 TBST로 상온에서 90분간 반응시켰다. 2차 항체로 반응시킨 후, 막을 TBST로 상온에서 30분간 3회 세척하였다. 단백질을 화학발광 검출 시스템으로 검출하였다.
1-1-6. Kai 항체의 친화 크로마토그래피
친화 정제를 Affi-Gel affinity chromatography를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다(Bio-Rad, CA, USA). 보다 구체적으로, 1㎎의 항-Kai 1 항체 또는 항-Kai 2 항체를 Affi-Gel 슬러리가 채워진 컬럼에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시킨 다음 컬럼 레진을 100mM 에탄올아민으로 블록시키고 PBS로 3회 세척하였다. IgM 또는 IgG에 대한 친화 단백질을 항체 정제에 사용된 것과 같은 컬럼을 사용하여 정제하였다.
1-1-7. Kai 타입과 DEA 1 테스트 키트의 개 혈액형 비교
Kai 타입과 DEA 1 사이의 관계를 결정하기 위해, Rapid Vet-H DEA 1 카드 테스트(DMS Laboratories, Flemington, NJ, USA)로 분류된 DEA 1+ 또는 DEA 1- 샘플(총 n = 50)을 Kai 항체로 분류된 결과와 비교하였다.
1-1-8. 동종항체의 검출
항-Kai 1 항체 및 항-Kai 2 항체를 적용하는 것 뿐만 아니라 항-Kai 1 항체 및/또는 항-Kai 2 항체의 존재를 확인하기 위해 개(n = 4)의 혈액을 튜브 응집 분석으로 테스트하였다. 보다 구체적으로, 혈액을 공급하는 개와 Kai 1+ 또는 Kai 2+ 혈액을 수혈받을 개에게서 혈액 샘플을 얻고, 생리식염수로 세척한 다음 생리식염수에 2 ~ 3%로 재현탁하고, 3㎖ 튜브에서 같은 부피의 플라스마와 RBC 현탁액을 혼합하고 37℃에서 15분간 반응시켰다. 튜브를 1000g에서 1분간 원심분리한 다음 부드럽게 혼합하여 펠렛화한 RBC를 제거하였다. 응집 정도는 육안으로 관찰하여 음성(0) ~ 양성(4+)으로 등급화하였다.
1-2. 실험결과
1-2-1. 단클론항체 생산
생쥐의 감작에 사용된 개 혈액에 특이적인 하이브리도마 세포를 총 4800 웰에서 스크리닝하였다. 비특이적으로 응집되거나 모든 RBC에 교차반응하는 세포주는 제거하였다. 각각 DEA 1.1과 DEA 1.2로 분류된 두 개의 RBC에 대한 서로 다른 항체를 생산하지만 교차반응하지 않는 2가지의 하이브리도마 세포주를 분리하고, Kai 1(KCTC13495BP) 및 Kai 2(KCTC13496BP)라 명명하였다. Kai는 '개'를 의미한다. 복수에 함유된 항-Kai 1 항체 및 항-Kai 2 항체는 각각 1:2056 및 1:32 희석까지 RBC 응집 테스트에 반응하였으며, 어떠한 용혈활성도 나타내지 않았다.
1-2-2. 정제된 항-Kai 항체의 동종형
Protein L 및 G 컬럼, 그리고 SDS-PAGE를 사용하여, Protein L 컬럼에서 각각 ~80kDa 및 ~25kDa의 밴드로 항-Kai 1 면역글로불린(Ig)을 확인하였다. 이것은 생쥐의 IgG와 다른 중쇄 및 경쇄의 Ig를 나타내는 것이므로 IgM이라는 것을 의미한다(도 1A 참조). 반면, 항-Kai 2 Ig는 Protein G 컬럼에서 쥐의 IgG의 중쇄 및 경쇄에 해당하는 ~50kDa 및 ~20kDa의 밴드로 나타났다(도 1B 참조).
또한, 염소 항-생쥐 중쇄 항체(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA 및 IgM) 또는 염소 항-생쥐 경쇄 항체(카파 또는 람다)로 코팅된 ELISA에 의해 항-Kai1 항체가 카파 경쇄를 갖는 IgM으로 분류되었고, 항-Kai 2 항체는 IgG3 중쇄 및 람다 경쇄에 대한 항체와 반응하였다. 이러한 결과는 항-Kai 1 항체 및 항-Kai 2 항체가 각각 IgM 카파와 IgG 람다의 서브클래스에 속한다는 것을 나타낸다(도 2 참조).
1-2-3. DEA 1+ 및 DEA 1- 개에서 Kai 타입의 분포
기존 튜브 응집 분류 분석에 이들 두 단일클론항체를 이용하면 개 혈액과 강한 양성(3+/4+) 또는 음성(0) 응집 반응을 나타내었다. 한국의 203마리의 개(대부분 한국 마스티프 종)를 조사한 결과, Kai 1+/Kai 2-가 42%, Kai 1-/Kai 2+가 37%, Kai 1-/Kai 2-가 20%로 나타났다. 그러나 항-Kai 1 및 항-Kai 2 단일클론항체 모두에 응집 반응을 나타내는 혈액 샘플은 단 하나도 없었다.
추가로, 상업적으로 이용할 수 있는 DEA 1 테스트 키트(Rapid Vet-H DEA 1)로 50마리 이상을 확인한 결과와 이들의 Kai 타입의 결과를 비교하였을 때, DEA 1+ 개는 Kai 1+/Kai 2- 또는 Kai 1-/Kai 2+인 반면, DEA 1- 개는 Kai 1+/Kai 2- 또는 Kai 1-/Kai 2+, 또는 Kai 1-/Kai 2-가 될 수 있었다. 이러한 결과는 DEA 1+ 혈액이 Kai 1+, Kai 2+ 또는 완전히 Kai -가 될 수 있다는 것을 의미한다(표 1 참조).
DEA 1 Kai 1+ Kai 2+ Kai - 총계%(n)
DEA 1+(n=19) 15 4 - 38%(19)
DEA 1-(n=31) 21 7 3 62%(31)
총계%(n) 72%(36) 22%(11) 6%(3) 100%(50)
1-2-4. Kai 단일클론항체에 의한 Kai 1 및 Kai 2 항원의 확인
환원 조건에서의 면역블롯에 의해, 항-Kai 1 단일클론항체는 Kai 1+ 샘플에서 >170kDa의 주요 밴드와 ~55 및 ~70kDa의 마이너 밴드를 검출하였고, Kai 1- 혈액에서는 검출하지 못했다(도 3A 참조). 항-Kai 2 단일클론항체를 사용한 경우에는 Kai 2+ 개의 샘플에서 70 및 130kDa 사이의 단일밴드만이 나타났다(도 3B 참조). Kai 1 또는 Kai 2 항체에 특이적인 단백질 밴드를 보다 정확하게 확인하고자 친화 크로마토그래피를 수행한 결과, 항-Kai 1 단일클론항체로 ~200kDa의 주요 밴드와 ~50kDa의 분할 밴드가 나타났다. 한편, 항-Kai 2 단일클론항체는 ~80kDa에서 두드러진 밴드에 결합하였다(도 4 참조).
1-2-5. Kai 1 및 Kai 2에 대한 동종항체 검출
Kai 1 및 Kai 2를 이용한 수혈 적합성 판별의 유효성을 검증하기 위하여, 수혈 전 응집 테스트를 통해 동종항체의 검출을 시도하였다.
DEA 1 혈액형 테스트를 통해 수혈받는 개의 혈액형과 수혈 혈액의 혈액형이 모두 DEA 1+로 분류되어 수혈이 적합한 것으로 나타났지만, Kai 타입이 서로 다른 경우(표 2의 1번 및 2번 실험군), DEA 1 타입과 상관없이 Kai 타입이 서로 다른 경우(표 2의 3번 및 4번 실험군)를 대상으로 테스트한 결과, 초기 교차검사에서는 모두 응집반응이 나타나지 않아 적합한 것으로 보이지만, 응집 테스트 21일 후에는 모두 응집반응이 나타났으며, 특히 DEA 1 혈액형 테스트를 통해 수혈이 적합한 것으로 판별된 경우에도 Kai 타입이 다르면 응집반응이 나타났다.
또한 수혈받는 개의 혈액형이 Kai 2-/DEA 1+이고 수혈 혈액의 혈액형이 Kai 2+/DEA 1+인 경우, 그리고 수혈받는 개의 혈액형이 Kai 1-/DEA 1+이고 수혈 혈액의 혈액형이 Kai 1+/DEA 1+인 경우, 응집 테스트 21일 후에 많은 혈전이 관찰되었다(도 5 참조).
이러한 결과는 Kai 1 및 Kai 2를 이용한 수혈 적합성 판별 방법이 유효하다는 것을 의미하며, 또한 DEA 1 시스템으로 판별할 수 없는 경우도 수혈 적합성을 판별할 수 있다는 것을 의미한다.
Day 0 Day 21
개 수혈받는 개의 혈액형 수혈 혈액의 혈액형 교차검사결과 응집 세기
1 Kai 1+, DEA 1+ Kai 2+, DEA 1+ 적합 1+
2 Kai 2+, DEA 1+ Kai 1+, DEA 1+ 적합 1+
3 Kai 1+ Kai 2+ 적합 3+
4 Kai 2+ Kai 1+ 적합 3+
한국생명공학연구원 KCTC13495BP 20180315 한국생명공학연구원 KCTC13496BP 20180315

Claims (6)

  1. 수혈용 개 혈액이 수혈받을 개에서 면역반응을 일으키는지를 검증할 수 있도록 항체를 사용하여 수혈용 개 혈액 시료와 수혈받을 개의 혈액 시료를 대상으로 항원-항체 반응을 수행하되,
    상기 항체로 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 상기 각 시료와 접촉시키고, 항원-항체 결합을 검출하는 것을 특징으로 하는 개의 수혈 적합성 판별 방법.
  2. 제 1항의 방법을 수행하기 위한 키트로,
    기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 포함하는 개의 수혈 적합성 판별용 키트.
  3. 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체.
  4. 제 3항의 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC 13495BP의 하이브리도마 세포주.
  5. 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체.
  6. 제 5항의 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC 13496BP의 하이브리도마 세포주.
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