KR102064862B1 - 금속나노입자-어피바디를 포함하는 elisa 키트 및 상기 키트를 이용한 표적 물질의 검출 방법 - Google Patents

금속나노입자-어피바디를 포함하는 elisa 키트 및 상기 키트를 이용한 표적 물질의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금속나노입자-어피바디를 포함하는 ELISA 키트 및 상기 키트를 이용한 표적 물질의 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 금속나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 어피바디로 이루어진 금속나노입자-어피바디 코어쉘 복합체를 포함하는 ELISA 키트, 및 상기 ELISA 키트를 이용한 표적물질의 검출방법에 관한 것이다.

Description

금속나노입자-어피바디를 포함하는 ELISA 키트 및 상기 키트를 이용한 표적 물질의 검출 방법{ELISA KIT COMPRISING METAL NANOPARTICLES-AFFIBODIES AND METHOD FOR DETECTING TARGET MATERIAL USING THE SAME}
본 발명은 금속나노입자-어피바디를 포함하는 ELISA 키트 및 상기 키트를 이용한 표적 물질의 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 금속나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 어피바디로 이루어진 금속나노입자-어피바디 코어쉘 복합체를 포함하는 ELISA 키트, 및 상기 ELISA 키트를 이용한 표적물질의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 금속나노입자-어피바디 코어쉘 복합체를 포함하는 ELISA 키트는 통상적인 ELISA 키트 보다 현저히 낮은 수준의 검출한계 값(LOD)을 나타내고, 반응시간이 단축되며, 고온 및 고염의 환경에서도 오류발생율이 감소하여 정확도가 증가하여 표적물질의 보다 효과적인 검출 및 정량에 활용될 수 있다.
최근 의학 기술의 비약적인 발전은 어떤 질병이라도 조기에만 발견하면 완치가 가능한 사회를 만들어가고 있기 때문에 인간 질병의 조기 진단은 갈수록 중요해지고 있다. 대표적인 진단 분야의 하나인 체외진단 (in vitro diagnostic: IVD)은 질병 진단, 병인 확인, 치료 방향 결정 및 치료 효과의 추적관찰, 질병 경과 판단, 질병 조기진단 및 예방, 환자 예후 판정 등을 목적으로 혈액, 뇨, 타액 등 인체에서 유래하는 시료를 검체로 하여 특정 지표 물질을 검출하거나 정량 분석하는 검사이다. 전 세계 체외진단 시장 가치는 2007년 370억 달러 (약 60조 원)를 기록했으며 2012년에는 500억 달러에 달할 전망이다(Global In Vitro Diagnostics (IVD) Market: An Analysis, Global Information Inc., 2009/01; Medical Product Outsourcing (www.mpo-mag.com)). 전체 체외진단 시장은 여러 가지 세부 분야로 구분될 수 있는데 20% 내외의 시장 점유율을 차지하고 있는 주된 분야들은 면역검사, 당뇨검사(포도당검사), 임상화학 분야이다. 항원-항체 반응의 검출로 대표되는 면역진단법은 오랜 기간 동안 다양한 진단 범위와 고감도의 검출 기술이 개발되어 왔으며, 혈액의 면역반응을 통한 암, HIV 등의 다양한 질병진단을 위해 널리 사용되고 있다.
현재 면역진단을 위해 가장 널리 사용되고 있는 방법은 효소 반응에 기반을 둔 ELISA(효소결합 면역흡수 진단법) 방법이다. ELISA의 원리는 항원 물질과 결합하는 1차항체와 이와 결합하는 2차항체-효소 결합체를 이용하여 특정 기질과 효소간의 반응을 일으켜 항원 또는 항체의 유무를 고감도로 검출하는 방식이다. 이 방법은 간편하고 저렴하다는 장점이 있기 때문에 면역진단 분야에서 가장 많이 사용되고 있다. 이러한 ELISA 기술에 있어서, 2차항체-효소 결합체에 가장 널리 사용되고 있는 효소는 과산화효소(peroxidase) 혹은 인산화효소(phosphatase) 등의 유기 효소이다. 하지만 이러한 효소 반응을 통한 목적 물질의 검출 방법은 효소 반응만으로는 신호를 증폭시키는 효과가 충분히 크지 않기 때문에 그 민감도가 충분히 높지 않다는 단점이 있다.
선행기술
대한민국 공개특허 제10-2008-0084029호
이에, 본 발명자들은 ELISA의 민감도를 증가시키기 위하여 예의 노력한 결과, 1차항체를 대체 할 수 있는 복수개의 어피바디(affibody)를 금나노입자로 이루어진 코어 주변에 결합시켜 ELISA에 사용하는 경우, 2차 항체가 상기 복수개의 어피바디에 결합하여 ELISA의 민감도가 현저히 증가할 뿐만 아니라, 고온 및 고염의 환경에서도 오류발생율이 감소하여 정확도가 증가함을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 하나의 목적은 금속나노입자-어피바디 코어쉘 복합체를 포함하는 ELISA 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 금속나노입자-어피바디 코어쉘 복합체를 포함하는 ELISA 키트를 이용한 표적물질의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “금속나노입자”는 평균 입경으로 나노 크기(nm)를 갖는 금속 입자를 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 금속나노입자는 예를 들면 금, 은, 니켈, 알루미늄 등의 금속, 또는 구리, 철 등의 전이 금속을 이용할 수 있고, 수십 nm 내지 수백 nm 의 크기로 형성되는 것 일 수 있다. 상기 금속나노입자의 형태는 구형, 4면체, 6면체, 8면체 및 막대 기둥 등 다양한 모양으로 형성될 수 있고, 하나의 모양으로 된 나노 입자만 이용할 수도 있고, 서로 다른 모양이 나노입자들을 혼합하여 이용할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “어피바디(affibody)”는 인공 단백질의 일종으로, 황색포도구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(SPA) 중 IgG 결합 영역인 58 아미노산 잔기를 사용한다. IgG와 결합 면을 형성하는 13 아미노산 잔기 부분을 무작위적인 배열과 치환한 라이브러리(library)를 구축하고, 그중에서 표적물질과 특이적으로 결합하는 것을 선별하는 것으로서 표적물질에 대한 어피바디(affibody)를 취득하게 되고 1차항체를 대체 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “표적물질”은 검출 또는 정량의 대상이 되는 물질을 의미하고, 상기 표적 물질은 질병을 진단하기 위한 질병표지물질(biological biomarker) 일 수 있다. 상기 질병표지물질을 표적 물질로 하여 본 발명의 방법에 의하는 경우 질병의 감염여부를 간단하고 신속하면서도 정확하게 진단할 수 있다
본 명세서에서 사용된 용어 "표지물질"은 본 발명에 따른 ELISA 키트에 포함된 자유 항체에 결합되어 상기 자유 항체가 표적물질에 결합되었는지의 여부를 확인할 수 있게 하는 수단을 의미한다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은
(i) 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 어피바디,
(ii) 금속나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 어피바디로 이루어진 금속나노입자-어피바디 코어쉘 복합체, 및
(iii) 표지물질과 직접 결합되고 어피바디에 특이적으로 결합할 수 있는 2차항체를 포함하고,
상기 2차항체는 상기 어피바디에 결합하여 금속나노입자-어피바디-2차항체-표지물질 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 것인, ELISA 키트를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 ELISA 키트에 있어서, 상기 표적물질은 단백질, 펩티드, DNA, RNA, 화학 물질, 호르몬, 바이러스 및 당으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 표적물질은 뎅기열 바이러스 NS1일 수 있다.
본 발명에 따른 ELISA 키트에 있어서, 상기 금속나노입자는 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag), 철(Fe) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 금속나노입자는 금(Au) 일 수 있다.
본 발명에 따른 ELISA 키트에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 ELISA 키트에 있어서, 상기 표지물질은 Q dot(Quantum dot), 효소, 콜로이드 금(Coloid gold), 형광물질(Fluorescein), 방사성 물질 또는 색소(Dye)인 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 또는 이들과 유사한 활성을 나타내는 유사체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 효소 또는 유사체를 사용할 경우에는 2차항체에 상기 효소 또는 유사체를 결합시킨 후, 상기 효소 또는 유사체에 의하여 발색반응을 나타낼 수 있는 기질을 추가하여 반응시킴으로써, 상기 표지물질의 결합여부를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 플루오르신이소티옥시아네이트(fluoresceine isothiocyanate), 피코빌리프로테인(phycobili proteins), 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM(5-carboxy fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichloroflorescein), Cy3(cyanine-3), Cy5(cyanine-5), 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine) 또는 TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ3(black hole quencher3)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 형광물질을 사용할 경우에는 2차항체에 상기 형광물질을 결합시킨 후, 형광현미경 등으로 형광물질을 검출함으로써, 상기 표지물질의 결합여부를 확인할 수 있다. 상기 방사성 물질은 125I, 131I, 14C 또는 3H가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방사성 물질을 사용할 경우에는 2차항체에 상기 방사성 물질을 결합시킨 후, X-선 필름 등으로 방사성 물질을 검출함으로써, 상기 표지물질의 결합여부를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 ELISA 키트에 있어서, 상기 ELISA 키트는 상기 어피바디가 고정된 지지체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 지지체는 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄, 화합물 반도체, 실리콘 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 지지체는 니트로쉘룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 또는 유리로 된 슬라이드글라스일 수 있다.
본 발명에 따른 ELISA 키트에 있어서, 상기 ELISA 키트는 발색 기질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 발색 기질은 ABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine), OPD(o-Phenylenediamine dihydrochloride), DAB(3,3’-diaminobenzidine), AmPlex-Red 및 이들의 혼합 물질로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은
(a) (i) 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 어피바디, (ii) 금속나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 어피바디로 이루어진 금속나노입자-어피바디 코어쉘 복합체, 및 (iii) 표지물질과 직접 결합되고 어피바디에 특이적으로 결합할 수 있는 2차항체를 포함하는 ELISA 키트에 표적물질을 포함하는 시료를 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 2차항체에 결합된 표지물질의 수준을 측정하여 표적물질의 양을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 표적물질의 검출방법에 있어서, 상기 표적물질은 뎅기열 바이러스 NS1인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 표적물질의 검출방법에 있어서, 상기 금속나노입자는 금(Au)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 표적물질의 검출방법에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 표적물질의 검출방법에 있어서, 상기 표지물질은 HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 이들의 유사체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 표적물질의 검출방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 2차항체에 결합된 표지물질을 발색기질과 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 한다. 상기 발색기질은 ABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine), OPD(o-Phenylenediamine dihydrochloride), DAB(3,3’-diaminobenzidine), AmPlex-Red 및 이들의 혼합 물질로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 금나노입자에 어피바디가 결합하였음을 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따라 금나노입자에 결합한 어피바디 수를 나타낸다.
도 3은 실시예 3에 따라 금나노입자와 어피바디-금나노입자의 파장을 나타낸다.
도 4는 실시예 4에 따라 어피바디-금나노입자의 고농도 염 안정성 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 5에 따라 어피바디-금나노입자의 온도 안정성 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 6에 따라 어피바디와 어피바디-금나노입자의 Enhanced ELISA 결과를 나타낸다.
본 발명을 첨부된 도면을 참고하여 이하 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1: 금나노입자 - 어피바디 코어쉘 복합체의 제조
뎅기열 바이러스를 비색진단하기 위해 어피바디를 금나노입자와 결합하였다. 먼저 MES 버퍼로 어피바디를 100ug/ml 농도가 되게 희석한 후, 어피바디와 금나노입자(15nm)를 각각 500ul씩 E-tube에 넣고 3시간동안 상온에서 rotator로 혼합하였다. 그 다음 4℃에서 12000rpm의 속도로 원심분리 하여 상층액을 덜어내고 MES 버퍼를 넣고 현탁시켜 금나노입자와 결합한 어피바디를 얻었다. 사이즈를 측정한 결과 금나노입자의 Z-Average(d.nm)는 21.04, 어피바디-금나노입자는 37.01의 수치가 나와 크기가 증가 했으므로 금나노입자에 어피바디가 결합했다는 것을 알 수 있다(도 1).
실시예 2: 금나노입자에 결합한 어피바디 수 측정
금나노입자에 어피바디가 얼마나 결합하였는지 알아보기 위해 실험을 진행하였다. 어피바디와 금나노입자를 혼합한 다음 원심분리하면 금나노입자와 결합된 어피바디는 pellet으로 가라앉고 결합 되지 않은 어피바디는 상층액에 남게 된다. 이를 이용하여 금나노입자와 혼합하기 전 어피바디와 혼합 후의 상층액을 Micro BCA assay를 하여 농도를 측정하였고 금나노입자에 결합한 어피바디의 수를 계산하였다. 총 3회 실시 하였고 평균적으로 약 152개~168개의 어피바디가 금나노입자에 결합하는 것을 알 수 있다(도 2).
실시예 3: 금나노입자와 금나노입자 - 어피바디 코어쉘 복합체의 파장 측정
금나노입자는 나노사이즈에서 520nm에서 최대흡수 파장을 가져 붉은 색을 띄게 되는데 어피바디와 결합한 금나노입자도 같은 파장을 가지는지 UV-Vis로 확인 하였다(도 3).
실시예 4: 금나노입자 - 어피바디 코어쉘 복합체의 고농도 염 안정성 실험
어피바디(100ug/ml) 500ul와 금나노입자(15nm) 500ul를 E-tube에 넣고 3시간 동안 상온에서 rotator로 혼합하였다. 그 다음 4℃에서 12000rpm의 속도로 원심분리 하여 상층액을 덜어내고 PBS-500mM NaCl 1ml 분주하여 현탁 시킨 후 520nm에서 파장을 측정하였고 매일 7일 동안 파장을 측정하였다. 아래의 결과를 보다시피 고농도 염에서 7일 동안 방치하여도 520nm에서 최대흡수 파장을 유지하는 것을 보아 안정하다는 것을 알수 있다(도 4).
실시예 5: 금나노입자 - 어피바디 코어쉘 복합체의 온도 안정성 실험
어피바디(100ug/ml) 500ul와 금나노입자(15nm) 500ul를 E-tube에 넣고 3시간 동안 상온에서 rotator로 혼합하였다. 그 다음 4℃에서 12000rpm의 속도로 원심분리 하여 상층액을 덜어내고 MES buffer를 1ml 분주하여 현탁 시킨 후 520nm에서 파장을 측정하였고 50℃ dry oven에 넣고 15일 뒤 파장을 측정하였다. 아래의 결과를 보다시피 520nm에서 최대흡수 파장을 유지하는 것을 보아 안정하다는 것을 알 수 있다(도 5).
실시예 6: 어피바디와 금나노입자 - 어피바디 코어쉘 복합체의 Enhanced ELISA
96웰 ELISA 플레이트에 5 ug/㎖의 NS1을 각 웰당 50㎕씩 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 어피바디를 1uM, 2.5uM, 5uM, 10uM, 20uM, 40uM로 만들고 금나노입자-어피바디 코어쉘 복합체는 32pM, 62pM, 125pM, 250pM, 500pM, 1nM, 2.5nM, 5nM로 만들어 well에 각각 100ul씩 분주 하였다. 이후 상온에서 1시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 anti-Affibody-antibody를 1:1,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 secondary antibody를 1:2,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다(도 6).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> ELISA KIT COMPRISING METAL NANOPARTICLES-AFFIBODIES AND METHOD FOR DETECTING TARGET MATERIAL USING THE SAME <130> DP-2017-0285 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Asp Cys Ala Leu Val Glu Ile 1 5 10 15 Val Leu Leu Pro Asn Leu Asn Val Phe Gln Ile Val Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 2 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Tyr Met Ala Ser Val Glu Ile 1 5 10 15 Leu Trp Leu Pro Asn Leu Asn Asn Lys Gln Gly Gln Ala Phe Ile Thr 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AFFIBODY <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Val Cys Ala Tyr Val Glu Ile 1 5 10 15 Leu Arg Leu Pro Asn Leu Asn Asn Ser Gln Met Asn Ala Phe Ile Ser 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60

Claims (12)

  1. (i) 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 어피바디,
    (ii) 금(Au) 나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 어피바디로 이루어진 금 나노입자-어피바디 코어쉘 복합체, 및
    (iii) 표지물질과 직접 결합되고 어피바디에 특이적으로 결합할 수 있는 2차항체를 포함하고,
    상기 2차항체는 상기 어피바디에 결합하여 금 나노입자-어피바디-2차항체-표지물질 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 것인, ELISA 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표적물질은 단백질, 펩티드, DNA, RNA, 화학 물질, 호르몬, 바이러스 및 당으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, ELISA 키트.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표지물질은 HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 이들의 유사체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, ELISA 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 ELISA 키트는 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄, 화합물 반도체, 실리콘 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 지지체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, ELISA 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 ELISA 키트는 BTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine), OPD(o-Phenylenediamine dihydrochloride), DAB(3,3’-diaminobenzidine), AmPlex-Red 및 이들의 혼합 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 발색 기질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, ELISA 키트.
  7. (a) (i) 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 어피바디, (ii) 금(Au) 나노입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 어피바디로 이루어진 금 나노입자-어피바디 코어쉘 복합체, 및 (iii) 표지물질과 직접 결합되고 어피바디에 특이적으로 결합할 수 있는 2차항체를 포함하는 ELISA 키트에 표적물질을 포함하는 시료를 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 2차항체에 결합된 표지물질의 수준을 측정하여 표적물질의 양을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는 표적물질의 검출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 표적물질은 뎅기열 바이러스 NS1인 것을 특징으로 하는 것인, 표적물질의 검출방법.
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서,
    상기 어피바디는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 것인, 표적물질의 검출방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 표지물질은 HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 이들의 유사체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 표적물질의 검출방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 2차항체에 결합된 표지물질을 발색기질과 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 표적물질의 검출방법.
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PLoS ONE vol.12, no.5, e0177592, pp.1-15 (2017.05.11.) 1부.*
Trends in Biotechnology, vol.35, no.8, pp. 691-712 (2017.08.) 1부.*

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