KR102050478B1 - 통증 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루타메이트 디카르복실라제 및 항염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자를 포함하는 통증의 완화 또는 치료용 조성물, 그리고 상기 조성물을 이용한 통증의 완화 또는 치료방법에 관한 것이다.

Description

통증 치료용 조성물
본 발명은 글루타메이트 디카르복실라제 및 항염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자를 포함하는 통증의 완화 또는 치료용 조성물, 그리고 상기 조성물을 이용한 통증의 완화 또는 치료방법에 관한 것이다.
국제통증연구학회(International Association for the Study of Pain)에서 사용하는 통증의 정의는 "실제 또는 잠재적인 조직 손상이나 그러한 손상과 관련된 불쾌한 감각 및 감정의 경험"이다. 통증은 손상 받은 상황으로부터 손상이 치유되는 동안 손상된 신체 일부를 보호하고, 앞으로 유사한 경험을 피하려고 하는 동기를 부여한다. 대부분의 통증은 원인 자극이 제거되면 서서히 완화되지만, 때때로 자극이 사라짐과 동시에 손상 부위가 분명히 치유되었음에도 불구하고 통증이 지속되거나, 어떠한 자극, 손상 또는 질병이 없는 상태에서 통증이 발생하기도 한다.
신경병증성 통증(Neuropathic pain)은 신경, 척수(spinal cord), 뇌의 이상에 의해 유발되고 인구의 1% 이상이 겪고 있는 것으로 추정되는 비악성(non-malignant) 만성 통증의 유형이다. 신경병증성 통증의 가장 흔한 원인은 외상 또는 대사성 및, 허혈성 장애 등이 있으며 이로 인해 병적 신경 자극(nerve impulse)이 척수를 통해 뇌로 전달되면서 통증이 발생하게 된다. 신경병증성 통증은 영향을 받는 위치에 따라 말초 신경병증성 통증 및 중추 신경병증성 통증으로 구분될 수 있다.
이들 신경병증성 통증이 장기간 지속될 경우 신체적인 고통뿐만 아니라 정신적인 고통으로 이어져 환자의 삶의 질 또한 저하 되기 쉽다. 그러므로 통증 완화를 위한 적극적인 치료가 이루어져야 한다. 현재는 통증 자체가 질병으로 인식되어 이에 대한 관심이 확산됨에 따라 진통제의 수요가 향후 꾸준히 증가할 것으로 예상된다. 현재 통증 치료에는 주로 아세틸살리실산, 이부프로펜, 아세트아미노펜 성분의 진통제가 널리 사용되고 있다. 아세틸살리실산을 주성분으로 하는 아스피린이 진통의 목적으로 사용되는 경우 최소한 500 mg이상 고용량이 투여되어야 한다. 하지만 아스피린은 비스테로이드성 소염진통제(NSAIDs)로서 위 보호 역할을 하는 프로스타글란딘의 생성을 촉진하는 효소(COX-1)를 차단하여 위 점막이 만들어지는 것을 막기 때문에 위장이 위산에 의해 쉽게 손상되고 위장관 출혈이 일어날 수 있으며, 혈전이 생기는 것을 방지하기 때문에 출혈을 일으킬 수 있다. 이부프로펜도 비스테로이드성 소염진통제 성분이므로 마찬가지로 위장 장애를 일으킬 수 있다. 타이레놀과 같은 아세트아미노펜을 주성분으로 하는 진통제의 경우 아세트아미노펜이 대부분 간에서 대사되기 때문에 간 손상을 일으킬 수 있어 최대복용량 하향 조절이 요구되는 등 안정성 논란이 있다. 뿐만 아니라 상기 진통제들은 초기에는 효과가 있더라도 장기간 사용 시 내성이 생겨 효과가 없어지는 경우도 빈번하며, 특히 신경병증성 통증의 경우 비스테로이드성 소염진통제가 환자별 최대용량에도 반응하지 않는 문제점이 있어 단기간 고용량 투여 처방을 하고 있는 실정이다. 따라서 부작용 없이 저용량으로도 진통 효과가 우수한 새로운 신경병증성 통증 진통제의 개발이 절실히 요구된다.
현재 여러 신규 물질이 신경병증성 통증 치료제로 개발되고 있다. 최근, 나트륨 채널 저해제(sodium channel blockers)에 대한 개발이 진행되고 있지만 이는 대부분 소분자(small molecules) 형태로써, 특정한 동형 단백질(isoform)에 선택성이 낮고 심장 독성(cardio toxicity), 거동 장애(motor impairment)등의 부작용이 존재하여 앞으로 더 많은 연구가 요구된다. 유전자 치료제로는 Periphagen Holdings 사에서 Herpes simplex virus (HSV) 유전자 전달체에 Opioid peptide인 enkephalin를 생성하는 유전자를 탑재한 치료제를 개발하였지만 임상 시험에서 진통 효과가 떨어지는 문제점이 발견되어 2상에서 진행이 중단되어 있는 상태이다. HSV는 피하로 투여하더라도 말초 신경으로 유전자를 전달할 수 있는 장점이 있었지만 실제로는 유전자 전달 효율이 떨어지고, Opioid peptide 인 enkephalin 하나만으로 통증을 억제하기 힘들었다고 볼 수 있다.
The Journal of the American Osteopathic Association, September 2005, Vol.105, S12-S19 Li H, Cheng Y, Ahl J, Skljarevski V, Drug, Healthcare and Patient Safety, 29 October 2014, Vol.6, Pages 167-174 Jonathan W. Theile, Theodore R. Cummins, Front. Pharmacol., 04 October 2011, Vol.2, Article 54
본 발명의 일예는 글루타메이트 디카르복실라제(Glutamate decarboxylase, glutamic acid decarboxylase, GAD) 및 항염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자를 포함하는 통증의 완화 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일예는 GAD 및 항염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자를, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 통증의 완화 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 글루타메이트 디카르복실라제(Glutamate decarboxylase, glutamic acid decarboxylase, GAD) 및 항염증성 사이토카인, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 통증의 완화 또는 치료용 약학 조성물, 그리고 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 통증의 완화 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 적은 양의 유전자 전달만으로 진통 작용을 나타낼 수 있으며, 단독으로 투여했을 때에 비해 적은 양으로도 통증 완화 효과를 관찰할 수 있다. GAD 유전자의 산물인 GABA는 통증 신호 전달을 차단하는 효과가 있으나 양이 지나치게 많아질 경우 심장 박동이 증가하거나 호흡이 빨라지는 등의 부작용과 더불어 가려움증이나 어지러움, 졸음 등의 증상이 나타날 수 있다. IL-10은 항염 작용을 하는 사이토카인으로 알려져 있으나, 전신으로 고용량이 사용되었을 경우, RBC level을 감소시키는 등의 부작용이 관찰되었다. 반면, 본 발명의 약학 조성물은 GAD와 IL-10을 병용 투여함으로써 단독 사용 시에 비해 적은 투여량으로도 우수한 진통 효과를 나타내는 바, 저용량 투여를 통해 종래의 부작용 및 독성을 낮출 수 있는 시너지 효과를 보인다.
도 1은 재조합 아데노 부속 바이러스 제작에 이용한 플라스미드 pAAV-hGAD65의 개열 지도를 나타내는 도면이다.
도 2는 재조합 아데노 부속 바이러스 제작에 이용한 플라스미드인 pAAV-rIL-10의 개열 지도를 나타내는 도면이다.
도 3은 재조합 아데노 부속 바이러스 제작에 이용한 플라스미드인 pAAV-rIL-4의 개열 지도를 나타내는 도면이다.
도 4는 GAD65, IL-10 또는 IL-4 유전자가 각각 도입된 아데노 부속 바이러스를 제조한 후 인체 배아신장 세포주인 293T 세포에 처리하고 48시간 후 세포 또는 배양 배지를 회수하여 웨스턴 블랏을 통해 각 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 5는 재조합 아데노 부속 바이러스 AAV-hGAD65에 의한 GABA 발현을 확인한 것으로서, 인체 배아신장 세포주인 293T 세포에 AAV-GAD65를 처리하고 48시간 후 배양 배지를 회수하여 ELISA를 통해 배지 내 GABA 양을 측정한 도면이다. 각 실험군별로 동일한 두 개의 샘플을 따로 제작하여 분석을 진행하였으며 막대 바는 각각의 샘플에 대한 값을 나타낸다.
도 6은 AAV-GAD65 및 AAV-IL-10 병용 투여와 Gabapentin 간 효능 비교 결과로서, 시중에서 신경병증성 통증 완화제로 사용되고 있는 gabapentin 과 비교하여 AAV-GAD65 및 AAV-IL-10 병용 투여의 상승적 효능의 차이를 동물 행동 분석에서 확인한 그래프이다.
도 7은 AAV-GAD65 와 AAV-IL-10의 병용 조성비에 따른 효능 확인 결과로서, 특히 AAV-GAD 대비 AAV-IL-10의 병용 조성비를 1:1, 1:5, 1:30으로 하여 동물 행동 분석에서 상승적 효과를 확인한 그래프이다.
도 8은 추간공 경유 경막외 주사(Transforaminal epidural injection)로 AAV-GAD65 와 AAV-IL-10를 1:10, 1:30으로 병용 투여 시 상승적 효과를 확인한 그래프이다.
도 9는 AAV-GAD65 와 AAV-IL-10, AAV-GAD65 와 AAV-IL-4 의 효능을 비교한 결과로서, 항염 효과를 가지고 있다고 알려진 IL-10과 IL-4를 GAD65와 각각 병용 사용하였을 때 동물 행동 분석에서 나타나는 상승적 효과를 비교 확인한 그래프이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일예는 상기 GAD 암호화 유전자 및 항염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자가 전달체에 포함된 형태로 제공되며, 상기 전달체는 바이러스성 벡터와 플라스미드나 리포좀 등의 비바이러스성 벡터를 포함한다.
상기 GAD를 암호화하는 유전자는 작동 가능하도록 제1벡터에 포함되고, 상기 항염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자는 작동 가능하도록 제2벡터에 포함된 것일 수 있다.
상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus) 및 폭스바이러스(Poxvirus)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 GAD 암호화 유전자를 포함하는 운반체(예를 들면 제1벡터) 및 항염증성 사이토카인의 암호화 유전자를 포함하는 운반체(예를 들면 제2벡터)는 단위 부피당 바이러스 역가 기준 혼합비가 1:1 내지 1:100, 1:1 내지 1:80, 1:1 내지 1:60, 1:1 내지 1:40, 1:1 내지 1:20, 1:1 내지 1:10, 1:3 내지 1:100, 1:3 내지 1:80,1:3 내지 1:60, 1:3 내지 1:40, 1:3 내지 1:20, 또는 1:3 내지 1:10 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 1:50, 가장 바람직하게는 1:5 내지 1:30 일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 적은 양의 유전자 또는 이를 포함하는 전달체로 진통 작용을 나타낼 수 있다. 본 발명의 조성물은 GAD 암호화 유전자를 포함하는 벡터와 신경 조직 내 항염 작용 유전자를 탑재한 벡터로 구성되어, 서로 다른 진통 메커니즘을 가진 물질들을 병용 투여함으로써 단독 투여 시에 비해 적은 양으로도 동등 또는 그 이상의 통증 완화 또는 치료 효과를 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 적은 양의 유전자 또는 이를 포함하는 전달체를 사용하게 되므로 독성은 낮추면서도 우수한 진통 효과의 시너지를 나타낸다.
본 발명의 일예에 따라, 상기 제1벡터와 제2벡터는 아데노 부속 바이러스일 수 있다. 상기 아데노 부속 바이러스는 특정 혈청형(serotype)에 한정되지 않으며, 바람직하게는 AAV1 내지 AAV5 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 GAD는 글루타메이트를 탈카르복실화시켜 GABA(gamma-aminobutyric acid)를 생성하는 효소이다. 본 발명에 적용 가능한 GAD 암호화 유전자는 두 가지 이소형태(isoform)인 GAD65 또는 GAD67일 수 있다. 상기 GAD65 은 사람 또는 래트(Rat) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 이의 구체적인 예는 NCBI accession no. NM_000818의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 또한 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 상기 GAD67 은 사람 또는 래트 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 이의 구체적인 예는 NCBI accession no. NM_000817의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 또한 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 염증성 사이토카인은 인터루킨-10 (interleukin-10, IL-10) 일 수 있으며, IL-10과 GAD65를 병용 투여하였을 때 상승적 통증 완화 효과가 나타난다.
상기 IL-10은 항염증성 사이토카인 중 하나로서 사람의 사이토카인 합성 저해인자(Cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)로도 알려져 있다. IL-10은 클래스II 사이토카인에 속하며, 178개 아미노산 길이의 서브유니트(subunit) 두 개로 이루어지는 호모 다이머(homodimer)이다. IL-10은 면역반응에서 NK(Natural killer)세포의 활성을 억제하는 기능을 수행하며, IL-10 수용체와 복합체를 형성하여 신호전달에 관여한다. IL-10 은 사람 또는 래트 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자일 수 있으며, 이의 구체적인 예는 NCBI accession no. NM_012854의 서열번호 6 또는 NCBI accession no. NM_000572의 서열번호 9인 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 또한 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 10의 염기서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 GAD 암호화 유전자 및/또는 IL-10 암호화 유전자 염기 서열은 이의 변이체를 포함하며, 이는 래트 또는 사람에 맞게 코돈을 최적화하여 변형된 염기 서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 본 발명에 따른 암호화 유전자 염기서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함되며, 상기 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되고, 비교 영역에서의 염기서열 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물의 치료적 유효량을 통증의 완화 및/또는 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 통증의 완화 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 투여하는 단계 전에 상기 환자를 통증의 완화 및/또는 치료가 필요한 환자로 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "치료적 유효량"은 원하는 효과, 통증의 완화 및/또는 치료 효과를 얻을 수 있는 활성 농도(active gradient) 양에 따를 수 있다.
본 발명에 따른 통증은 통각 통증, 심인성 통증, 조직 손상 및 면역 세포의 침윤과 관련된 염증 통증, 신경 시스템의 손상 또는 그것의 비정상적 기능에 의해 유발되는 질병 상태인 병적 통증(섬유 근육통, 과민성 대장 증후군, 긴장성 두통과 같은 기능 장애 통증) 등을 포함한다. 또한, 통증은 해부학상 구분되는 등 통증을 포함할 수 있다: 목 통증, 등 가운데 통증(middle back pain), 등 아래쪽 통증 또는 꼬리뼈 통증(tailbone pain). 또한, 통증은 신경병증성 통증, 편두통(migraine) 등과 같은 통증을 포함할 수 있다. 신경병증성 통증은 체성 감각(somatosensory) 시스템에 영향을 주는 손상 또는 질병에서부터 유발될 수 있다. 신경병증성 통증은 지각이상(dysesthesia)이라고 불리는 비정상적 감각, 및 통증 없는 자극에도 통증을 느끼는 이질통(allodynia)과 관련이 있을 수도 있다. 또한, 신경병증성 통증은 연속적 및/또는 간헐적(발작) 요소일 수 있다. 후자는 전기 충격에 비유된다. 일반적인 특성은 뜨거움 또는 추위, 다리가 저리는 감각(pins and needles), 무감각(numbness) 및 가려움(itch)을 포함한다.
대조적으로 통각 통증은 흔히 아픔(ache)으로 표현된다. 또한, 편두통은 다수의 자율신경계 증상과 관련되어 있으며 일반적인 정도부터 심각한 정도까지의 두통을 유발하는 만성적인 장애(chronic disorder)이다. 이들 편두통의 정확한 메커니즘은 현재까지 밝혀진 바 없다. 기본적인 이론은 대뇌피질(cerebral cortex)의 증가된 흥분도 및 뇌 줄기(brainstem)의 삼차 신경 핵(trigeminal nucleus)에서 통증 신경세포의 비정상적인 조절과 관련되어 있다.
구체적인 일예로, 통증은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 수술 후 통증(postoperative pain), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain), 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 편두통 등으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 구체적인 일예로, 통증은 요통(lumbago)과 관련된 근육 경련(muscle spasm)은 아닐 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 신경병증성 통증 (Neuropathic Pain), 만성 암통증 (Chronic Cancer Pain)의 완화 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 용어 "완화 또는 치료"란 본 발명의 조성물을 투여함으로써 통증 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 추가 일예는 GAD 및 항염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 통증의 완화 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 대상은 사람을 포함하는 포유류, 또는 사람을 포함하는 포유류로부터 분리된 세포 및/또는 조직일 수 있다. 또한, 상기 대상은 인간이 아닌 동물일 수 있으며, "인간이 아닌 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예컨대, 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유동물 및 비(非) 포유동물을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물의 치료적 유효량 및 투여 경로는 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 환자의 상태, 원하는 효과 등을 고려하여 적절히 조절될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 조성물은 주사제 형태로 제공될 수 있으며, 예를 들면, 신경주사, 피하주사, 근육 내 주사, 또는 유전자 총 주사(gene gun injection) 등을 포함할 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 단지 예시적으로 제공하는 것일 뿐, 본 발명의 보호 범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
<실시예 1> 재조합 아데노 부속 바이러스의 제조 및 특성 분석
본 발명에 필요한 아데노 부속 바이러스는 AAV 헬퍼-프리(helper-free) 시스템(Agilent, USA)을 기반으로 하여 제작 및 생산하였다.
A. pAAV-hGAD65의 제작
도 1의 pAAV-hGAD65를 제작하기 위하여, pJDK-rGAD65[Lee B et al., Gene Ther, 12: 1215-1222 (2005)]의 CMV 프로모터 부위를 PCR로 증폭한 후 pGEM-T(Promega, USA)에 도입하여 pGEM-T-CMV를 제작하였다. CMV 프로모터 증폭에 사용한 primer 서열은 다음과 같다.
F-JDK(서열번호 16): 5'-TTCGGCCGTCGAGGAGCTTGGCCCATTG-3'
R-JDK(서열번호 17): 5'-GACGTCGACCTAGCTAGCGAATTCGGGGCCGCGGAG-3'
GAD65 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인체 GAD65 시퀀스(NCBI NM_000818)를 바탕으로 사람에 맞게 코돈 최적화하여 서열번호 3의 염기 서열로 유전자를 합성하였다(바이오니아, 한국). pGEM-T에 도입된 hGAD65 유전자는 NheI과 SalI을 처리하여 1.7 Kb의 DNA 절편으로 확보하고, pGEM-T-CMV를 NheI과 SalI으로 처리하여 얻은 3.7 Kb의 DNA 절편과 ligation하여 pGEM-T-CMV-hGAD65를 완성하였다.
SV40pA는 pCI(Invitrogen, USA)를 주형으로 PCR을 수행하여 유전자를 증폭한 후 ClaI과 SalI을 처리하여 222 bp의 DNA 절편으로 확보하였다. 이를 pGEM-T-CMV-hGAD65를 ClaI과 SalI으로 잘라 준비한 5.4 Kb DNA 절편과 함께 ligation하여 최종적으로 pGEM-T-CMV-hGAD65-SV40pA를 제작하였다. SV40pA 증폭에 사용한 primer 서열은 다음과 같다.
F-SV40pA(서열번호 18): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'
R-SV40pA(서열번호 19): 5'-GACGTCGACGCGGCCGCTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG -3'
아데노 부속 바이러스 벡터 제작을 위해 pAAV-MCS(Agilent, USA) 내의 암피실린 저항 유전자를 카나마이신 저항 유전자로 교체하였다. 카나마이신 저항 유전자는 pET-28(a)(Novagen, USA)를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였고, 증폭된 816 bp의 카나마이신 저항 유전자를 pGEM-T와 ligation하여 pGEM-T-Kanr를 제작하였다. 카나마이신 저항 유전자 증폭에 사용한 primer 서열은 다음과 같다.
F-Kan(서열번호 20): 5'-AGGCGCCATGAGCCATATTCAACGGGAA-3',
R-Kan(서열번호 21): 5'-TTCATGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3'
카나마이신 저항 유전자의 도입을 위하여 pAAV-MCS 내 암피실린 저항 유전자 앞뒤에 mutagenesis를 통해 각각 SpeI과 EcoRV 사이트를 생성한 후 이를 다시 SpeI과 EcoRV로 처리하고, 앞서 제작한 pGEM-T-Kanr를 NheI과 EcoRV로 잘라 얻은 DNA 절편과 ligation하여 pAAV-MCS-Kanr를 제작하였다.
제작된 pAAV-MCS-Kanr를 NotI과 BamHI으로 처리한 후 pGEM-T-CMV-hGAD65-SV40pA를 EagI과 PvuI으로 잘라 얻은 2.7 Kb의 DNA 절편과 함께 ligation하여 pssAAV-GAD65를 제작하였다.
pVAX1(Invitrogen, USA)에 GAD65 발현 카세트를 도입하기 위해 bGHpA 뒤쪽에 mutagenesis를 통해 BamHI 사이트를 생성한 후, 이를 MluI과 NheI으로 잘라 DNA 절편을 준비하였다, pssAAV-GAD65를 주형으로 LITR과 CMV 프로모터 부위를 PCR로 증폭하여 pGEM-T easy(Promega, USA)에 클로닝하고, 이를 AscI과 NheI으로 잘라 앞서 준비한 pVAX1 벡터와 ligation하여 pVAX1-LITR-CMV를 제작하였다. LITR과 CMV 프로모터 부위 증폭에 이용한 primer 서열은 다음과 같다.
F-ITR(서열번호 22): 5'-ATGGCGCGCCCCTGGCCTTTTGCTGGCC-3',
R-JDK(서열번호 17): 5'-GACGTCGACCTAGCTAGCGAATTCGGGGCCGCGGAG-3'
pVAX1-LITR-CMV를 다시 NotI과 NheI으로 잘라 DNA 절편으로 준비하고, pssAAV-GAD65를 EagI과 NheI으로 잘라 준비한 DNA 절편과 함께 ligation하여 pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA를 제작하였다. pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA를 HpaI과 BamHI으로 자른 후, pssAAV-GAD65를 주형으로 PCR 로 증폭하여 pGEM-T easy에 클로닝한 pGEM-T easy-SV40pA-RITR을 HpaI과 BamHI을 처리하여 얻은 DNA 절편과 ligation함으로써 pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA-RITR(이하"pAAV-GAD65"로 약칭함)를 완성하였다. SV40pA와 RITR 부위 증폭에 이용한 primer 서열은 다음과 같다.
F-SV40pA(서열번호 18): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'
R-ITR(서열번호 23): 5'-ATGGATCCGCTAGTAAATACCGCATCAG-3'
pAAV-hGAD65의 개열 지도를 도 1에 나타냈다.
B. pAAV-rIL-10의 제작
pAAV-rIL-10은 pAAV-hGAD65과 유사한 방법으로 제작되었다. Rat IL-10 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 래트 유래의 염기 서열(NCBI NM_012854)을 바탕으로 래트에 맞게 코돈 최적화하여 서열번호 8의 염기 서열을 갖는 유전자를 합성하였다(바이오니아, 한국). pGEM-T easy에 도입된 rat IL-10 유전자를 주형으로 PCR을 수행하여 rIL-10 유전자를 증폭한 후 NheI과 SalI으로 처리하여 0.5 Kb의 DNA 절편을 얻고 pGEM-T-CMV를 NheI과 SalI으로 잘라 얻은 3.7 Kb의 DNA 절편과 ligation하여 pGEM-T-CMV-rIL-10을 제작하였다.rIL10 증폭에 이용한 primer 서열은 다음과 같다.
F-rIL-10(서열번호 24): 5'-CCGCTAGCGCCACCATGCCT-3'
R-rIL-10(서열번호 25): 5'-GACGTCGACGCCATCGATGGCTTAATTAATCAATTCTTC-3'
SV40pA는 pCI를 주형으로 PCR을 수행하여 유전자를 증폭한 후 NotI과 SalI을 처리하여 222 bp의 DNA 절편으로 확보하였다. 이를 앞서 제작한 pGEM-T-CMV-rIL-10에 ClaI과 SalI을 처리하여 준비한 4.2 Kb DNA 절편과 함께 ligation하여 pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA를 제작하였다. SV40pA 증폭에 이용한 primer 서열은 다음과 같다.
F-SV40pA(서열번호 18): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'
R-SV40pA(서열번호 19): 5'-GACGTCGACGCGGCCGCTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG-3'
pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA를 EagI으로 처리하여 1.6 Kb의 DNA 절편을 얻고 이를 pAAV-MCS-Kanr에 NotI과 BamHI을 처리하여 준비한 DNA 절편과 함께 ligation하여 pssAAV-CMV-rIL-10-SV40pA(이하 "pAAV-rIL-10"으로 약칭함)을 제작하였다. pAAV-rIL-10 의 개열 지도를 도 2에 나타냈다.
C. pAAV-rIL-4의 제작
RatIL-4 유전자는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 래트 유래의 염기 서열(NCBI NM_201270)을 바탕으로 래트에 맞게 코돈 최적화 하여 서열번호 13의 염기 서열을 갖는 유전자를 합성하였다(바이오니아, 한국). pGEM-B1(바이오니아, 한국)에 도입된 rIL-4 유전자는 NheI과 NotI으로 처리하여 0.5 Kb의 DNA 절편으로 확보하였다. 이를 pAAV-hGAD65에 NheI과 NotI을 처리하여 준비한 3 Kb의 DNA 절편과 ligation하여 pssAAV-CMV-rIL-4-SV40pA(이하"pAAV-rIL-4"로 약칭함)를 제작하였다. pAAV-rIL-4의 개열 지도를 도 3에 나타냈다.
D. 재조합 아데노 부속 바이러스의 특성 분석
상기 제작한 3종의 플라스미드(pAAV-hGAD65, pAAV-rIL-10, pAAV-rIL-4) 각각을 pHelper, pRC와 함께 PEI(Polysciences, USA)를 이용하여 인체 배아 신장 세포주인 293T 세포에 transfection 하였다. 이 때 hGAD65의 경우 AAV serotype 5의 캡시드 유전자가 도입된 pRC5를, rIL-10과 rIL-4의 경우 AAV serotype 1의 캡시드 유전자가 도입된 pRC1을 이용하였다. Transfection한 세포는 37℃ 배양기에서 배양하고 48시간 후 세포를 회수하여 freezing과 thawing을 3회 반복함으로써 각각의 crude 바이러스를 확보하였다.
세포로 전달된 재조합 아데노 부속 바이러스의 단백질 발현을 확인하기 위하여 AAV5-hGAD65, AAV1-rIL-10 또는 AAV1-rIL-4 각각의 crude 바이러스를 인체 배아 신장 세포주인 293T 세포에 처리하고 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 구체적으로, T25 flask에 8x105개의 293T 세포를 분주하고, 다음날 flask당 700 μL의 crude 바이러스를 각각 처리한 후 37℃ 배양기에서 배양하였다. 48시간 후 세포와 배양 배지를 각각 수확하여 세포는 용해제로 용해하고, 배양 배지는 amicon(Merck Millipore, Germany)으로 농축하였다. 준비된 샘플에 GAD65(Cell signaling, USA), IL-10(Santa Cruz, USA), IL-4(Santa Cruz, USA)에 대한 항체를 각각 처리하여 웨스턴 블랏을 진행하였으며 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4는 AAV5-hGAD65, AAV1-rIL-10 또는 AAV1-rIL-4가 처리된 인체 배아신장 세포주인 293T 세포주의 세포 용해물을 웨스턴 블랏으로 분석하여 각 단백질의 발현을 확인한 도면이다. 모두에서 목적 단백질이 발현됨을 확인함으로써 실험에 이용한 재조합 아데노 부속 바이러스의 구조 및 특성에 이상이 없음을 알 수 있었다.
AAV5-hGAD65에 의해 GABA가 생산됨을 확인하고자, 웨스턴 블랏을 위해 샘플을 준비한 것과 동일한 조건으로 AAV5-GAD65를 처리한 세포의 배양 배지를 회수하여 GABA ELISA(LDN, Netherland) 분석을 진행하고 그 결과를 도 5에 나타냈다. 각 실험군별로 동일한 두 개의 샘플을 따로 제작하여 분석을 진행하였으며 막대그래프는 각각의 샘플에 대한 값을 나타낸다. 그 결과 AAV5-hGAD65 바이러스에 의해 세포 내로 도입된 GAD65에 의해 GABA가 배양 배지로 분비됨을 확인할 수 있었다.
E. 재조합 아데노 부속 바이러스의 제조
동물 효능 실험을 위하여 KRcrogen사(한국)에서 재조합 아데노 부속 바이러스를 생산 및 정제하였으며 생산 방법은 다음과 같다.
상기 제작한 3종의 플라스미드(pAAV-hGAD65, pAAV-rIL-10, pAAV-rIL-4) 각각을 pHelper, pRC와 함께 인산칼슘법을 이용하여 인체 배아 신장 세포주인 293T 세포에 transfection 하였다. 이 때 hGAD65의 경우 AAV serotype 5의 캡시드 유전자가 도입된 pRC5를, rIL-10과 rIL-4의 경우 AAV serotype 1의 캡시드 유전자가 도입된 pRC1을 이용하였다. Transfection한 세포는 37℃ 배양기에서 배양하였고 48시간 후 세포를 회수하였다.
이후 세슘 농도 구배에 따른 초고속 원심분리법을 통해 바이러스가 포함된 밴드만을 분리 정제하여 AAV5-hGAD65, AAV1-rIL-10, AAV1-rIL-4를 확보하였다. 생산된 바이러스의 역가는 업체에서 확립한 qPCR 방법을 이용하여 측정하였다.
<실시예 2> AAV-IL-10 및 AAV-GAD65의 진통 효능 시험
A. 투여 시료 제조
동물 투여 30분 전에 -80℃에 보관 중인 재조합 아데노 부속 바이러스를 상온에서 1분 이내에 해동시킨 후 vortexer 로 잘 섞었다. 그리고, Coomassie blue dye 용액을 준비하였다. Coomassie blue dye 용액은 1 mL PBS에 Coomassie blue 10 mg 을 잘 섞은 다음 syringe filter로 걸러서 준비하였다. AAV-GAD65 5.4 x 105 VG/μL, AAV-IL-10 1.8 x 107 VG/μL 및 0.1% Coomassie blue dye 를 각 1μL씩 섞어 개체 당 투여량이 총 3μL 가 되도록 계산하였다. 시료는 필요한 용량의 2배를 제작해 개체 당 3μL씩 투여하였다.
대조군으로서, 투여 1시간 전에 Gabapentin을 동물의 식수에 혼합하여 10 mg/mL 의 농도가 되도록 제조하였다.
B. 신경병증성 통증 동물 모델의 제작 및 시료 투여
180-200g SD-rat 수컷을 흡입 마취한 후 종아리 위쪽을 절개하고 common peroneal nerve와 tibial nerve의 양쪽 끝부분을 7-0 봉합사로 0.5 ∼ 1 cm 간격을 두고 매듭을 만들어 묶었다. 매듭이 있는 2개의 신경 다발 사이를 가위로 자르고 절개 부위를 봉합하였다.다. 2주 뒤 von Frey filament test를 실시하여 통증 유발을 확인한 다음 시험물질을 투여하였다(C.J. Woolf, Pain 87, 2000).
시험물질은 dorsal root ganglion(DRG)으로 투여하였다. 통증 동물 모델을 흡입 마취한 후, 래트의 요추 L3에서 L5 부위까지 등을 일자로 절개하여 등뼈를 노출시켜, 노출된 측면에 등뼈의 돌기 중 하나인 transverse process가 보이게 하고, Stereo zoom microscope을 보면서 고정된 상태에서 DRG 위를 덮고 있는 L4의 process를 DRG가 손상되지 않도록 신중하게 rongeur로 분리하였다. 사선으로 뻗은 DRG가 쌀알 모양처럼 드러나도록 주변을 정리하였다.
Polyethylene catheter에 Hamilton syringe를 연결하여 정확하게 3μL 시험물질을 채취하고, 투여시에는 1mL 주사기로 교체하여 투여하였다. 래트를 small animal stereotaxic instrument에 올려 놓고 surgioscope로 보면서 micro-needle이 L4 DRG를 정확하게 찌른 것을 확인하고 시료를 주입 하였다. 이때 dye가 섞인 시료가 DRG 밖으로 누출되지 않고 DRG 내부로 잘 전달되고 있는지 확인하였다. 시료가 DRG로 모두 전달된 것을 확인한 다음 주사기를 DRG에서 분리시키고 봉합한 후 동물을 회복시켰다.
Gabapentin은 경구로 3 mg/kg이 되도록 투여하였다.
C. von Frey filament test를 이용한 진통 효능 관찰
1992년 Dixon이 확립한 50% up & down threshold 법이 일반적으로 많이 알려져 있어 이 방법을 사용하였다. N 값이 각각 0.4, 0.6, 1,2, 4, 6, 8, 15 g 인 총 8개의 filament로 통증 반응의 정해진 패턴에 따라서 threshold 값을 계산해 내는 방법으로, 통증이 발생한 발바닥의 맨 바깥쪽 발가락이 시작되는 부위에서 발 뒤꿈치까지 위치를 바꿔가면서 통증이 발생하는 부위를 찾았다. 통증이 발생하면 래트는 발바닥을 급작스레 떼고 움츠러들거나 발바닥을 입으로 핥으므로, 통증 발생 부위를 찾으면 다음 단계의 filament로 주변 부위를 5회 찔러서 3회 이상의 반응이 있으면 통증 반응으로 간주하고, 그 다음 단계의 filament로 관찰하였다. 이렇게 넘어갈 때마다 패턴을 기록하였다. 통증 패턴은 S.R. Chaplan(Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods, 1994)이 확립한 패턴 표를 근거해서 기록하고 이를 이용하여 threshold값을 계산하였다. 행동 분석은 4∼6주 동안 동물 그룹을 blind로 처리하여 최소 3명이 관찰하고 기록된 패턴의 결과를 통계처리 하여 통증의 경향을 분석한다.
상기 통증 동물 모델에 시료를 투여하고, von Frey filament test를 이용한 통증 관찰한 결과를 도 6에 나타냈다. 도 6은 AAV-GAD65 및 AAV-IL-10 병용 투여와 Gabapentin 간 효능을 비교 분석한 결과이다 GAD65 및 IL-10을 병용 투여하였을 때 무처리 대조군(negative control) 대비 통계적으로 유의하게 통증 완화 효과가 나타났으며, Gabapentin 보다도 높은 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
<실시예 3> AAV-IL-10 및 AAV-GAD65의 진통 효능 시험
A. 투여 시료의 제조
투여 시료의 제조를 위해, 실시예 1에서 제조하여 동결 보관 중인 rAAV5-GAD65 및 rAAV1-rIL-10를 해동하여 실시예 2의 투여 시료 제조 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 시료를 제조하였다. 구체적으로 단독 투여 물질 AAV-GAD65 또는 AAV-rIL-10 과, 병용 투여 물질 AAV-GAD65 및 AAV-rIL-10을 표 1에 명시된 바이러스 역가 기준의 혼합비 1:1, 1:5, 또는 1:30으로 PBS에 희석하고, 각각 0.1% Coomassie blue dye 1μL를 첨가하여 개체 당 3μL가 되도록 계산하였다. 시료는 총 개체 수에 필요한 용량의 2배를 제작해 개체 당 3μL씩 투여하였다.
Figure 112018018577719-pct00001
B. von Frey filament test를 이용한 진통 효능 관찰
실시예 2에서 실험한 방법과 동일한 방법으로 제작한 통증 동물 모델에 시료를 투여하고, von Frey filament test를 이용하여 통증을 관찰하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7은 AAV-GAD65 와 AAV-IL-10의 조성비에 따른 효능 확인으로서, 통증 효과가 없는 미량의 AAV-GAD65 와 AAV-rIL-10에 비해서, AAV-GAD 대비 AAV-rIL-10의 혼합 조성비를 1:1 (실험예 1), 1:5 (실험예 2), 1:30 (실험예 3)으로 하여 동물 행동 분석에서 상승적 효과가 나타나는 조성비를 확인하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 AAV-GAD65 와 AAV-rIL-10의 병용 투여 조성물은 AAV-GAD 대비 AAV-rIL-10의 혼합 조성비가 증가할수록 통증 치료 효과가 증가하는 패턴을 나타냈다.
<실시예 4> Transforaminal epidural injection 을 이용한 AAV-IL-10 및 AAV-GAD65의 진통 효능 시험
A. 투여 시료 제조
동물 투여 실험 30분 전에 -80℃에 보관 중인 시약을 상온에서 1분 이내에 해동시킨 후 vortexer 로 잘 섞어 준비하였다. AAV-GAD65, AAV-IL-10을 표2 에 명시된 바이러스 역가가 되도록 PBS에 희석하였다. 동물 개체당 5μL 를 투여하는 것으로 하고, 필요한 부피의 1.5 배가 되도록 두 바이러스 희석액을 반반씩 섞었다. 이후 동물 개체 당 5μL씩 시료를 투여하였다.
Figure 112018018577719-pct00002
B. 신경병증성 통증 동물 모델의 제작 및 시료 투여
신경병증성 통증 동물모델은 실시예 2에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 제작한 다음 시험물질을 투여하였다. 시험 물질은 dorsal root ganglion(DRG)에 인접한 위치에 transforaminal epidural injection 방법으로 투여하였다. 통증 동물 모델을 흡입 마취한 후, 래트 요추의 L3에서 L5 부위까지 등을 일자로 절개하여 척추뼈를 노출시킨 후, 노출된 측면에 등뼈의 돌기 중 하나인 L4 transverse process가 보이게 한다. 래트의 측면이 위쪽에서 볼 수 있도록 옆으로 눕혀 L4의 추간공이 보이도록 한다.
Catheter에 부착된 micro needle을 제조된 시료에 넣고, Hamilton syringe 를 반대편 catheter 끝에 연결하여 눈금이 5μL 이 되도록 잡아당겨 시료를 catheter 내부로 주입하였다. Hamilton syringe를 catheter 에서 분리한 다음 Halsted-Mosquito 로 needle 끝 부분에서 1 cm 떨어진 곳을 쥔다. Forceps 으로 L4 등뼈를 쥐고 위로 당기면서 반대편 손으로 Halsted-Mosquito Straight로 고정 된 needle 끝 부분을 L4 추간공 주변으로 가져간다. 공간이 확보된 추간공으로 needle 끝을 삽입하여 needle이 꺾어진 부분까지 추간공 내부로 들어가게 만들고 쥐고 있던 needle을 풀어 둔다. needle이 고정된 것을 확인한 다음 needle 반대편에 연결된 polyethylene catheter에 1 mL syringe를 연결한다. 피스톤을 살짝 눌러서 희석 된 투여 물질이 천천히 래트 DRG 주변으로 투여되는 것을 확인하고 봉합하여 투여를 마무리하였다. 그리고 실시예 2에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 물질 투여 후 4주차에 von Frey filament test를 이용한 통증 결과를 관찰하였으며, 그 결과를 도 8에 나타냈다.
도 8은 AAV-GAD65 와 AAV-IL-10의 혼합물이 transforaminal epidural injection 방식으로 투여되어도 효능이 나타나는 것을 보여준다. 또한 AAV-GAD65 와 AAV-IL-10의 혼합 조성비를 1:10 (실험예 1), 1:30 (실험예 2)으로 하여 동물 행동 분석에서 상승적 효과가 나타나는 점을 확인 할 수 있다.
<실시예 5> AAV-GAD65 및 AAV-IL-10과, AAV-GAD65 및 AAV-IL-4 의 효능 비교
실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 통증 동물 모델을 제작하였으며, 투여 시료의 제조과정도 동일하다. 실시예 1에서 기술한 AAV1-rIL-4를 해동하여 동물 실험에 사용할 수 있도록 다음과 같이 준비하였다.
동물 DRG 투여 실험 30분 전에 -80℃에 보관 중인 시약을 상온에서 1분 이내에 해동시킨 후 vortexer 로 잘 섞어 두고, 1mL PBS에 Coomassie blue 10 mg 을 잘 섞은 다음 syringe filter로 걸러져 나온 dye를 준비하였다. AAV-GAD65 및 AAV-rIL-4 를 표 3에 명시된 바이러스 역가 기준 혼합비로 PBS에 희석하고, 각각 0.1% Coomassie blue dye 1μL를 첨가하여 개체 당 3μL가 되도록 계산하였다. 시료는 총 개체 수에 필요한 용량의 2배를 제작해 개체 당 3μL씩 투여하였다.
Figure 112018018577719-pct00003
상기 von Frey filament test를 이용한 통증 결과를 관찰하였으며, 그 결과를 도 9에 나타냈다. 도 9 는 AAV-GAD65 및 AAV-rIL-10, AAV-GAD65 및 AAV-rIL-4의 효능을 비교한 결과로서, 항염증 효과를 가지고 있는 사이토카인인 IL-10과 IL-4를 각각 GAD65와의 병용 사용하였을 때 동물 행동 분석에서 나타나는 상승적 효과를 비교 확인한 그림이다. 도9 에 나타낸 바와 같이, GAD65, IL-10 또는 IL-4 를 단독 투여 시에는 통증 치료 효과가 미미하거나 없었으며, GAD65와 IL-4를 병용 투여한 경우에도 각각 단독으로 투여한 것 대비하여 두드러진 진통효과를 나타내지 않았다. 반면 GAD65와 IL-10을 병용 투여한 경우는, 나머지 비교예 보다 통계적으로 유의하게 높은 진통 효능이 있는 것이 확인 되었다. 특히, GAD65와 IL-4의 병용투여에서는 볼 수 없었던 상승적(synergistic) 통증완화 효과가 나타나는 것으로 나타났다.
<110> KOLON LIFE SCIENCE, INC. <120> Composition for treating pain <130> OPP20162511KR <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly 1 5 10 15 Ser Gly Asp Ser Glu Asn Pro Gly Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val 20 25 30 Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu 35 40 45 Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly Ser Gln Pro Pro 50 55 60 Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Ala Cys Ala Cys Asp Gln Lys Pro Cys 65 70 75 80 Ser Cys Ser Lys Val Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp 85 90 95 Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln 100 105 110 Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg 115 120 125 Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu 130 135 140 Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu 145 150 155 160 Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro 165 170 175 Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala 180 185 190 Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu 195 200 205 Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met 210 215 220 Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser 225 230 235 240 Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe 245 250 255 Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg 260 265 270 Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly 275 280 285 Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys 290 295 300 Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu 305 310 315 320 Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala 325 330 335 Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp 340 345 350 Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly 355 360 365 Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val 370 375 380 Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val 385 390 395 400 Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln 405 410 415 Asn Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His 420 425 430 Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg 435 440 445 His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr 450 455 460 Thr Gly Phe Glu Ala His Val Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr 465 470 475 480 Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp 485 490 495 Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Pro Ser 500 505 510 Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys 515 520 525 Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met 530 535 540 Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val 545 550 555 560 Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu 565 570 575 Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu 580 585 <210> 2 <211> 2824 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcggccgccc gcacttcccg cctctggctc gcccgaggac gcgctggcac gcctcccacc 60 ccctcactct gactccagct ggcgtgcatg gtctgcctcg catcctcacg actcagctcc 120 ctccctctct cgtgtttttt tcctccgccg ccccctcatt catccccact gggctccctt 180 tccctcaaat gctctggggc tctccgcgct ttcctgagtc cgggctccga ggacccttag 240 gtagtcccgg tctcttttaa agctccccgg cttccaaagg gttgccacgt ccctaaaccc 300 tgtctccagc tcgcatacac acacgcacag acacgcacgt tttctgttcc tgcgtgacac 360 ccgccctcgc cgctcggccc cgccggtccc cgcgcggtgc cctcctcccg ccacacgggc 420 acgcacgcgc gcgcagggcc aagcccgagg cagctcgccc gcagctcgca ctcgcaggcg 480 acctgctcca gtctccaaag ccgatggcat ctccgggctc tggcttttgg tctttcgggt 540 cggaagatgg ctctggggat tccgagaatc ccggcacagc gcgagcctgg tgccaagtgg 600 ctcagaagtt cacgggcggc atcggaaaca aactgtgcgc cctgctctac ggagacgccg 660 agaagccggc ggagagcggc gggagccaac ccccgcgggc cgccgcccgg aaggccgcct 720 gcgcctgcga ccagaagccc tgcagctgct ccaaagtgga tgtcaactac gcgtttctcc 780 atgcaacaga cctgctgccg gcgtgtgatg gagaaaggcc cactttggcg tttctgcaag 840 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Arg Thr Glu Thr Asp Phe Ser 85 90 95 Asn Leu Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Ala Lys Asn Gly Glu Glu Gln 100 105 110 Thr Val Gln Phe Leu Leu Glu Val Val Asp Ile Leu Leu Asn Tyr Val 115 120 125 Arg Lys Thr Phe Asp Arg Ser Thr Lys Val Leu Asp Phe His His Pro 130 135 140 His Gln Leu Leu Glu Gly Met Glu Gly Phe Asn Leu Glu Leu Ser Asp 145 150 155 160 His Pro Glu Ser Leu Glu Gln Ile Leu Val Asp Cys Arg Asp Thr Leu 165 170 175 Lys Tyr Gly Val Arg Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gln Leu Ser 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ile Ile Gly Leu Ala Gly Glu Trp Leu Thr Ser Thr 195 200 205 Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu 210 215 220 Met Glu Gln Ile Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Val Gly Trp Ser 225 230 235 240 Ser Lys Asp Gly Asp Gly Ile Phe Ser Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn 245 250 255 Met Tyr Ser Ile Met Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Phe Pro Glu Val Lys 260 265 270 Thr Lys Gly Met Ala Ala Val Pro Lys Leu Val Leu Phe Thr Ser Glu 275 280 285 Gln Ser His Tyr Ser Ile Lys Lys Ala Gly Ala Ala Leu Gly Phe Gly 290 295 300 Thr Asp Asn Val Ile Leu Ile Lys Cys Asn Glu Arg Gly Lys Ile Ile 305 310 315 320 Pro Ala Asp Phe Glu Ala Lys Ile Leu Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr 325 330 335 Val Pro Phe Tyr Val Asn Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala 340 345 350 Phe Asp Pro Ile Gln Glu Ile Ala Asp Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Leu 355 360 365 Trp Leu His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg 370 375 380 Lys His Arg His Lys Leu Asn Gly Ile Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr 385 390 395 400 Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val Leu Leu Gln Cys Ser Ala Ile 405 410 415 Leu Val Lys Glu Lys Gly Ile Leu Gln Gly Cys Asn Gln Met Cys Ala 420 425 430 Gly Tyr Leu Phe Gln Pro Asp Lys Gln Tyr Asp Val Ser Tyr Asp Thr 435 440 445 Gly Asp Lys Ala Ile Gln Cys Gly Arg His Val Asp Ile Phe Lys Phe 450 455 460 Trp Leu Met Trp Lys Ala Lys Gly Thr Val Gly Phe Glu Asn Gln Ile 465 470 475 480 Asn Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Tyr Ala Lys Ile Lys Asn 485 490 495 Arg Glu Glu Phe Glu Met Val Phe Asn Gly Glu 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Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Lys Phe Tyr Leu Val Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn His Gly Pro Glu Ile Lys Glu His Leu Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu Trp Ile Gln Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Asp Phe Asn Lys Leu Gln Asp Lys Gly Val Tyr Lys Ala Met Asn Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Cys Ile Glu Ala Tyr Val Thr Leu Lys Met 165 170 175 Lys Asn <210> 7 <211> 682 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 7 catgcctggc tcagcactgc tatgttgcct gctcttactg gctggagtga agaccagcaa 60 aggccattcc atccggggtg acaataactg cacccacttc ccagtcagcc agacccacat 120 gctccgagag ctgagggctg ccttcagtca agtgaagact ttctttcaaa agaaggacca 180 gctggacaac atactgctga cagattcctt actgcaggac tttaagggtt acttgggttg 240 ccaagccttg tcagaaatga tcaagtttta cctggtagaa gtgatgcccc aggcagagaa 300 ccatggccca gaaatcaagg agcatttgaa ttccctggga gagaagctga agaccctctg 360 gatacagctg cgacgctgtc atcgatttct 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sapiens <400> 10 aaaccacaag acagacttgc aaaagaaggc atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg 60 gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca ggccagggca cccagtctga gaacagctgc 120 acccacttcc caggcaacct gcctaacatg cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga 180 gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg 240 ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc caagccttgt ctgagatgat ccagttttac 300 ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac 360 tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt 420 ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa 480 gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag tttgacatct tcatcaacta catagaagcc 540 tacatgacaa tgaagatacg aaactgagac atcagggtgg cgactctata gactctagga 600 cataaattag aggtctccaa aatcggatct ggggctctgg gatagctgac ccagcccctt 660 gagaaacctt attgtacctc tcttatagaa tatttattac ctctgatacc tcaaccccca 720 tttctattta tttactgagc ttctctgtga acgatttaga aagaagccca atattataat 780 ttttttcaat atttattatt ttcacctgtt tttaagctgt ttccataggg tgacacacta 840 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Leu Phe Cys Phe Leu Ile 1 5 10 15 Cys Thr Gly Asn Gly Ile His Gly Cys Asn Asp Ser Pro Leu Arg Glu 20 25 30 Ile Ile Asn Thr Leu Asn Gln Val Thr Glu Lys Gly Thr Pro Cys Thr 35 40 45 Glu Met Phe Val Pro Asp Val Leu Thr Ala Thr Arg Asn Thr Thr Glu 50 55 60 Asn Glu Leu Ile Cys Arg Ala Ser Arg Val Leu Arg Lys Phe Tyr Phe 65 70 75 80 Pro Arg Asp Val Pro Pro Cys Leu Lys Asn Lys Ser Gly Val Leu Gly 85 90 95 Glu Leu Arg Lys Leu Cys Arg Gly Val Ser Gly Leu Asn Ser Leu Arg 100 105 110 Ser Cys Thr Val Asn Glu Ser Thr Leu Thr Thr Leu Lys Asp Phe Leu 115 120 125 Glu Ser Leu Lys Ser Ile Leu Arg Gly Lys Tyr Leu Gln Ser Cys Thr 130 135 140 Ser Met Ser 145 <210> 12 <211> 475 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 12 tctcacgtca ctgactgtag agagctattg atgggtctca gcccccacct tgctgtcacc 60 ctgttctgct ttctcatatg taccgggaac ggtatccacg gatgtaacga cagccctctg 120 agagagatca tcaacacttt gaaccaggtc acagaaaaag ggactccatg caccgagatg 180 tttgtaccag acgtccttac ggcaacaagg aacaccacgg agaacgagct catctgcagg 240 gcttccaggg 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cacaactgag aaggaaacct tctgcagggc tgcgactgtg ctccggcagt 300 tctacagcca ccatgagaag gacactcgct gcctgggtgc gactgcacag cagttccaca 360 ggcacaagca gctgatccga ttcctgaaac ggctcgacag gaacctctgg ggcctggcgg 420 gcttgaattc ctgtcctgtg aaggaagcca accagagtac gttggaaaac ttcttggaaa 480 ggctaaagac gatcatgaga gagaaatatt caaagtgttc gagctgaata ttttaattta 540 tgagtttttg atagctttat tttttaagta tttatatatt tataactcat cataaaataa 600 agtatatata gaatctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 642 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying CMV promoter <400> 16 ttcggccgtc gaggagcttg gcccattg 28 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying CMV promoter <400> 17 gacgtcgacc tagctagcga attcggggcc gcggag 36 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying SV40pA <400> 18 ccatcgatca gacatgataa gatacattga tgag 34 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying SV40pA <400> 19 gacgtcgacg cggccgctac cacatttgta gaggttttac ttg 43 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying Kanamycin resistant gene <400> 20 aggcgccatgagccatattcaacgggaa 28 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying Kanamycin resistant gene <400> 21 ttcatgatta gaaaaactca tcgagcatc 29 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying LITR and CMV <400> 22 atggcgcgcc cctggccttt tgctggcc 28 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying SV40pA and RITR <400> 23 atggatccgc tagtaaatac cgcatcag 28 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying rIL-10 <400> 24 ccgctagcgc caccatgcct 20 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying rIL-10 <400> 25 gacgtcgacg ccatcgatgg cttaattaat caattcttc 39

Claims (16)

  1. 글루타메이트 디카르복실라제 (GAD)를 암호화하는 유전자 및 인터루킨-10 (IL-10)을 암호화하는 유전자를 포함하는 통증의 완화 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 GAD를 암호화하는 유전자가 작동 가능하도록 포함된 제1벡터 및 IL-10을 암호화하는 유전자가 작동 가능하도록 포함된 제2벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 GAD를 암호화하는 유전자를 포함하는 제1벡터 및 IL-10을 암호화하는 유전자를 포함하는 제2벡터를 단위 부피당 바이러스 역가 기준 혼합비 1:1 내지 1:50으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스 및 폭스바이러스로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 GAD는 GAD65 및 GAD67로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 GAD는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 GAD 암호화 유전자는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-10은 서열번호 6 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-10 암호화 유전자는 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 통증은 통각 통증(nociceptive pain), 심인성 통증(psychogenic pain), 염증성 통증(inflammatory pain), 또는 병적 통증(pathological pain)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 통증은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 수술 후 통증(postoperative pain), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain), 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 또는 편두통(migraine)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 주사제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 인간이 아닌 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 통증의 완화 또는 치료 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 통증은 통각 통증(nociceptive pain), 심인성 통증(psychogenic pain), 염증성 통증(inflammatory pain), 또는 병적 통증(pathological pain)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 통증은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 수술 후 통증(postoperative pain), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain), 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 또는 편두통(migraine)인 것을 특징으로 하는, 방법.
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