KR102036532B1

KR102036532B1 - 오염으로부터 피부를 보호하고 피부 재생을 개선하기 위한 화장품 트리트먼트 방법

Info

Publication number: KR102036532B1
Application number: KR1020177027632A
Authority: KR
Inventors: 프레데리끄 뽀르똘랑; 장-마리 부뚜; 조엘 망틀랑; 이사벨 엥베르트; 누아 동로제; 다니엘 비. 야로쉬; 네베나 주로코브스카-카라만; 나딘 페르노데; 켈리 덩; 에드워드 펠레
Original assignee: 아이에스피 인베스트먼츠 엘엘씨; 이엘씨 매니지먼트 엘엘씨
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2019-10-25
Also published as: US20180104178A1; US10478393B2; CN107427457A; EP3280390A4; JP2018510915A; EP3280390A1; WO2016164216A1; JP6782762B2; KR20170122811A; EP3280390B1

Abstract

본 발명은 오염으로부터 피부 세포를 보호하기 위한 활성제로서 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합의 화장 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합을 포함하는 조성물을 처리될 피부 영역 위에 도포하는 것을 포함하는, 대기 오염으로부터 피부 표피 세포를 보호하기 위한 화장품 트리트먼트 방법에 관한 것이다.

Description

오염으로부터 피부를 보호하고 피부 재생을 개선하기 위한 화장품 트리트먼트 방법

본 발명은 화장품 및 피부 케어의 분야이다. 본 발명은 국소 도포를 위한, 생리적으로 허용가능한 매질에서 적어도 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 생리적으로 허용가능한 매질에 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합을 포함하는 조성물을 피부에 도포하는 것을 포함하는, 오염으로부터 피부를 보호하고 피부 재생 및 복구를 개선하기 위한 화장품 트리트먼트 방법에 관한 것이다.

수년 동안, 대기 오염은 상당히 증가했고, 인간의 건강 및 복지에 부정적인 영향을 미치는 전세계적 환경 문제가 되었다.

해로운 오염물질에 처음에 및 직접적으로 노출되는 것은 피부, 모발, 손톱 및 폐와 같은 가장 바깥 조직이다. 따라서, 피부는 휘발성 유기 화합물, 담배 연기, 오존 및 미립자 물질과 같은 환경 오염에 매일 노출된다.

대기 오염은 다양한 유형의 화학물질, 생체이물 제품 및 입자로 구성된다. 노출된 조직에 해로운 영향을 미칠 수 있는 오염물질의 3 개의 주요 카테고리는 가스, 중금속 및 미립자 요소이다.

대기 오염물질은, 예를 들어 디젤 모터 입자, 오존 또는 중금속으로 인해 외부에서, 및 오염이 특히 톨루엔, 스티렌, 크실렌, 벤즈알데히드 또는 담배 연기와 같이 페인트, 글루 또는 벽지에 의해 방출된 용매 때문일 수 있는 집에서 모두 확인될 수 있다.

공기 오염물질 중에, 오존 및 입자 오염이 가장 널리 퍼진 공기 오염물질이고 그 중에서 가장 위험하다.

지면에서, 오존 (O₃)이 질소 산화물 및 휘발성 유기 화합물, 특히 자동차 배기 배출과 같은 1차 오염물질에 대한 햇빛의 상호작용에 의해 형성된다.

오존이 작은 분자이고 극도의 반응성 산화제이기 때문에, 이것은 가장 바깥 인간 조직과, 특히 기도 및 피부와 빠르게 반응한다.

보다 특히, 오존은 독성학적 손상을 야기하고 (문헌 [Afaq F. et al. J Invest Dermatol, 2009: 129: 2396-2403]) 정상 인간 표피 각질세포에서 DNA 손상을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 궁극적으로 정상 세포 기능을 손상시킬 것이다 (문헌 [James T. McCarthy et al. Exp Dermatol, 2013, 22, 358-379]).

대기 오염에의 반복적 및 지속적 노출은 UV 노출과 상승작용적으로 작용하여 피부에 부정적 결과를 초래한다. 이것은 잠재적으로 자극, 염증, 및 광손상 및 피부 노화를 증가시키는 것을 야기할 수 있다 (문헌 [Carletto, C. et al. Int J Cosmet Sci. 2000 Oct; 22(5):361-70]).

다른 면에서, 유리 라디칼이 노화 및 광-노화 과정에서, 및 보다 특히 산화된, 손상된 단백질의 형성에서 중요한 역할을 한다는 것이 잘 알려져 있다 (문헌 [Harman et al. J. Gerontol., 1956, 11(3), 298-300]).

대기 오염에 의한 피부의 이러한 외부 공격은 피부의 모든 피부 층에 영향을 미치고 연대기적 노화와 누적되는 노화의 느린, 진행성 과정을 야기할 수 있다. 피부의 외관은 변형되고 주름 및 잔주름, 과다 또는 과소-색소침착 블레미쉬, 건조 또는 심지어 피부의 탈수, 표피의 박막화, 탄력섬유증, 결함, 노인성 반점의 출현을 관찰할 수 있다. 이들 변화 모두가 피부 뿐만 아니라 손톱 및 모발에 영향을 미친다. 이들 변형은 특히 세포 재생 및 콜라겐, 엘라스틴 및 히알루론산과 같은 세포외 기질 분자 합성의 기능에서의 감소 때문이다.

연구의 최근 방법은 환경 스트레스 (태양, 오염 등)와 싸울 수 있는 활성제를 확인하도록 모색되었다. 이들 연구는 수많은 다소 효과적인 활성제의 개시를 이끌었다. 예로서, 특허 출원 US20070003536은 피부의 산화적 손상 및 산화 종으로부터 피부를 보호하기 위한 방법을 개시했다. 방법은 아스코르브산, SOD, 글루타티온, 포도 성분, 녹차, 플라보노이드, 포도씨 성분, 녹차 성분, 토코페롤 등과 같은, 반응성 산소 및 질소 종의 영향을 억제하도록 선택된 10 개 초과의 성분의 부가혼합물을 도포하는 것을 포함한다.

다른 면에서, 특허 출원 US2002/0192178은 옥수수의 수성 추출물을 포함하는 조성물을 피부에 도포하는 것을 포함하는, 오염의 영향으로부터 피부를 보호하기 위한 방법을 개시했다. 특허 FR 2915380 및 FR 2915383은 산화적 손상으로부터 피부를 보호하도록 의도된 벼 펩티드 추출물을 개시했다.

그러나 오염의 유해한 영향으로부터 피부를 보호하는 화장품 트리트먼트를 위한 높은 수요가 현재 존재한다. 따라서, 대기 오염으로부터 피부를 보호하거나 예방하고 피부 재생을 개선할 수 있는 새로운 화합물을 확인하는 것이 중요하게 남아있다.

본원에 대기 오염으로부터 피부를 효율적으로 보호하고 피부 재생을 개선하기 위한 조성물, 화장 용도 및 화장 방법이 제공된다.

본 발명의 첫 번째 목적은 국소 도포를 위한, 생리적으로 허용가능한 매질에서의 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합의 화장 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 주제는 대기 오염으로부터 피부를 보호하고 피부 재생 및 복구를 개선하기 위한, 생리적으로 허용가능한 매질에서 적어도 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합의 화장 용도에 관한 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 생리적으로 허용가능한 매질에 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합을 포함하는 조성물을 피부에 도포하는 것을 포함하는, 대기 오염으로부터 피부를 보호하기 위한 화장품 트리트먼트 방법에 관한 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 생리적으로 허용가능한 매질에 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합을 포함하는 조성물을 피부에 도포하는 것을 포함하는, 피부 재생 및 복구를 개선하기 위한 화장품 트리트먼트 방법에 관한 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 생리적으로 허용가능한 매질에 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합을 포함하는 조성물을 피부에 도포하는 것을 포함하는, 오염의 해로운 영향으로 인한 피부 노화 및 광-노화의 징후를 예방하고/거나 치료하기 위한 화장품 트리트먼트 방법에 관한 것이다.

따라서, 오염으로부터 피부를 보호하거나, 피부 재생을 개선하거나 오염으로 인한 피부 노화 및 광-노화의 징후를 치료하기 위한, 본 발명의 조성물을 도포하는 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 다양한 조성물의 유효량을 국소 도포하는 것을 포함한다.

도 1은 DNA 복구: 1 % 및 0.5 %에서 실시예 1의 벼/포도씨 추출물 (네오빅실(Neovixyl))로 전처리 및 후처리된 NHEK에서의 피리미딘, 시클로부탄 피리미딘 이량체 (CPD)의 감소 %를 나타낸다.
도 2는 DNA 복구: 실시예 1의 벼/포도씨 추출물 (네오빅실)로 전처리 및 후처리된 NHEK에서의 피리미딘, 시클로부탄 피리미딘 이량체 (CPD)의 감소 %을 나타낸다. CPD 감소-용량 반응.
도 3은 0.5 및 1 %에서 실시예 1의 벼/포도씨 추출물 (네오빅실)로 48 시간 동안 처리된 기관형(Organotypic) 피부의 상처 베드 봉합의 자극을 나타낸다.
도 4는 오존 노출 후 DNA 손상을 나타낸다. 오존 및 실시예 1의 벼/포도씨 추출물 (네오빅실)로 처리된 NHEK의 코멧(Comet) 스코어.

본 발명의 목적은 대기 오염으로부터 피부를 효율적으로 보호하고, 피부 재생을 개선하고 오염의 해로운 영향으로 인한 피부 노화 및 광-노화의 징후를 예방하고/거나 치료하기 위한 화장품 트리트먼트 방법을 개시하는 것이다.

개시된 방법은 생리적으로 허용가능한 매질에 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합을 포함하는 조성물을 피부에 국소 도포하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "벼/포도씨 추출물"은 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합을 의미한다.

한편으로 벼/포도씨 추출물은 식물 효소로의 벼 씨 곡분의 효소 가수분해 후 얻어진 가수분해된 벼 추출물로 구성된다. 6 kDa 미만의 저분자량 단백질을 얻기 위해, 혼합물은 감소하는 다공성 필터를 사용하여 정제된다. 가수분해된 벼 추출물은 US 특허 8,541,374에 기재된 공정에 따라 얻어질 수 있다.

2009 년 11 월 3 일 출원된 프랑스 특허 FR0905256의 우선권을 주장하는 US 특허 8,541,374는 참고문헌으로 본원에 도입된다.

용어 "가수분해된 벼 추출물"은 펩티드 또는 올리고펩티드에 의해 주로 표현되는 화합물의 혼합물을 의미한다.

용어 "펩티드 또는 올리고펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 적어도 2 개의 아미노산의 연쇄로 구성된 단백질 단편을 의미한다.

벼과 포아세아에(Poaceae)로부터의 식물, 특히 오리자(Oryza) 속 및 보다 바람직하게는 종 오리자 사티바 엘.(Oryza sativa L.)로부터의 그것이 본 발명의 가수분해된 벼 추출물을 제조하기 위해 사용된다. 사용된 식물 재료는 거피된(dehulled) 또는 거피되지 않은 씨일 것이다. 바람직하게는, 벼는 사전 발효를 겪지 않는다.

첫 번째 단계에서, 벼는 식물 밀(mill)을 사용하여 밀링된다. 얻어진 분말은 이어서 통상적인 유기 용매 (예를 들어 알콜, 헥산 또는 아세톤)를 사용하여 "지방이 제거(delipidize)"될 수 있다.

바람직한 실시양태에서 식물 재료는 벼 전분 생산 후 얻어진 풍부 단백질 곡분 생성물이다. 벼 전분을 단리시키기 위해, 벼 단백질이 벼 곡분으로부터 제거된다. 풍부 단백질 곡분 생성물이 습윤 밀링, 체질, 분리, 농축 및 건조에 의해 얻어진다. 그 다음 벼 곡분으로부터 추출된 단백질은 알칼리성 용액에 재현탁될 수 있다.

단백질, 글루시드 및 가능하게는 지방을 함유하는 가용성 분획은 원심분리 및 여과 단계 후 회수된다. 그 다음 조용액이 관리된 조건 하에 가수분해되어 가용성 펩티드를 생성한다.

본 발명에 따라, 가수분해는 단백질분해성 효소를 사용하여 및 바람직하게는 식물 기원 (파파인, 브로멜라인, 피신) 및 미생물 (아스페르길루스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus), 바실루스(Bacillus) 등)로부터의 엔도프로테아제를 사용하여 수행된다.

이 단계에서 얻어진 가수분해된 벼 추출물은, 바람직하게는 6 kDa 미만의 저분자량 분획을 선택하기 위해 더 정제될 수 있다. 정제는 유리하게는 각 단계에서 여과물을 수집하는, 다공성이 감소하는 필터를 통한 연속적 한외여과 단계에 의해 및/또는 특히 펩티드 내 가수분해물을 풍부하게 하기 위해 크로마토그래피 유형의 방법에 의해 수행될 수 있다.

그 다음 여과물은 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화된 또는 프로폭실화된 글리콜, 시클릭 폴리올 또는 이들 용매의 임의의 혼합물과 같은 용매로 건조 물질의 20 g/Kg 내지 40 g/Kg, 바람직하게는 30 g/Kg의 농도에서 희석된다. 유리하게는, 용매가 물 내 30 % 글리세롤 및 0.5 % 나트륨 벤조에이트의 혼합물일 수 있다.

그 다음, 임의로, 희석된 활성제가 멸균 여과에 의해 멸균되고 예를 들어 65 ℃에서 오븐에서 하룻밤 동안 살균된다.

다음, 물에서의 또는 물을 함유하는 임의의 혼합물에서의 희석이 수행된 후, 10 내지 20 g/l 범위의 단백질 함량을 특징으로 하는 벼 가수분해된 추출물을 얻기 위해 한외여과에 의한 멸균이 뒤따른다.

본 발명에 따라 얻어진 가수분해된 벼 추출물은 분자량이 0.2 내지 10 kDa인 단백질 및 펩티드를 분석할 수 있는 (적절한 용매 구배를 사용하여) 크기 배제 분석 컬럼이 장착된 고압력 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (SEC HPLC)에 의해 질적으로 및 양적으로 특성화된다.

HPLC 분석은 얻어진 가수분해된 벼 추출물이 분자량이 6 kDa 미만인 펩티드로 구성된다는 것을 보여준다.

다른 한편으로 벼/포도씨 추출물은 포도씨 추출물 (식물 종 비티스 비니페 라(Vitis vinifera))로 구성된다.

포도씨 추출물은 유리하게는 활성 목탄의 존재 하에 4 내지 7의 pH에서, 물에서 포도씨 케이크 (포도씨유 추출 부생성물)의 추출 후 얻어진다. 그 다음 혼합물은 감소하는 다공성 필터를 사용하여 정제된다.

산 세척된 활성 탄소는 유리하게는 고순도 추출물의 사용이 요구되는 탈색 및 정제를 위해 사용된다.

그 다음 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물은 5:5 내지 9:1 범위의 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 비로 혼합된다. 바람직하게는, 조합이 9 중량부의 가수분해된 벼 추출물 및 1 중량부의 포도씨 추출물을 혼합함으로써 제조된다. 이 방식으로, 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 비가 각각 9:1 (w/w)로 조정된다. 그 다음 단백질 함량이 물에서의 희석에 의해 10 내지 20 g/Kg, 바람직하게는 15 g/Kg로 조정된다. 바람직하게는, 희석액은 최종 농도가 30 %인 글리세롤을 얻기 위해 물 및 글리세롤의 혼합물에서 제조된다. 0.5 %에서의 나트륨 벤조에이트와 같은 방부제가 첨가될 수 있다. 그 다음 최종 용액은 멸균 대기 하에 여과되고 65 ℃에서 8 시간 저온에서 살균된다.

바람직한 실시양태에서; 얻어진 최종 생성물은 pH가 4.0 내지 5.0 범위이고, 20 ℃에서의 밀도가 1.06 내지 1.09 g/cm³ 범위이고, 20 ℃에서의 굴절률이 1.360 내지 1.390 범위이고, 단백질 함량이 10.0 내지 20.0 g/kg 범위이다 (로우리(Lowry) 분석법에 의해 측정된 바와 같음). 0.45 내지 0.55 % 농도에서의 나트륨 벤조에이트인 방부제가 첨가될 수 있다.

과학적 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 본 발명에 이르러 벼/포도씨 추출물이 오염으로부터 피부를 보호하고 피부 재생을 개선할 수 있고, 또한 오염의 해로운 영향으로 인한 피부 노화 및 광-노화의 징후를 예방하고/거나 치료하는데 유용하다는 것을 발견했다.

본 발명에 따른 벼/포도씨 추출물이 테스트되었고 이것은 피부의 각질세포 및 섬유아세포에 대한 생물학적 효과를 입증했다. 또한 벼/포도씨 추출물이 오존에 의해 피부 세포에 유발된 DNA 손상에 대한 보호제로서 작용했다는 것이 입증되었다.

또한 벼/포도씨 추출물이 생체 외 상처 치유 모델에서 피부 재생 및 피부 복구를 가속화시킨 것이 입증되었다.

본 발명의 벼/포도씨 추출물의 보호 잠재성이 오존-유도 산화 스트레스에 대해 평가되었다. 본 발명의 벼/포도씨 추출물은 오존 노출 동안 산화 반응을 극적으로 감소시켰고 따라서 DNA 손상으로부터 피부 세포를 보호하기에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 국소 도포를 위한 생리적으로 허용가능한 매질에서 활성제로서의 벼/포도씨 추출물의 화장 용도에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 국소 도포를 위한 조성물에서 오염으로부터 피부를 보호하고 피부 재생을 개선하기 위한 활성제로서의, 생리적으로 허용가능한 매질에서 적어도 벼/포도씨 추출물의 화장 용도에 관한 것이다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 활성제로서의 벼/포도씨 추출물의 화장 용도에 관한 것이며, 여기서 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물이 5:5 내지 9:1 범위의 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 비로 혼합된다. 바람직하게는, 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 비가 각각 9:1 (w/w)로 조정된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물은 0.01 내지 5 %, 및 바람직하게는 0.5 % 내지 2 %의 벼/포도씨 추출물을 포함하며, 여기서 가수분해된 벼 추출물은 저분자량 단백질 (6 kDa 미만)을 얻도록 식물 효소로 효소 가수분해 후 얻어진다. 가수분해된 벼 추출물은 감소하는 다공성 필터를 이용하여 정제된다. 포도씨 추출물은 4 내지 7의 pH에서 물에서 포도씨 케이크 (포도씨유 추출 부생성물)의 추출 후 얻어진다. 혼합물은 감소하는 다공성 필터를 이용하여 정제된다. 그 다음 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물이 5:5 내지 9:1 범위의 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 비로 혼합된다. 바람직하게는 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 비가 각각 9:1이다. 벼/포도씨 추출물이 최종 생성물의 70 %을 나타낸다. 글리세롤 (30 %)이 첨가된다. 임의로 0.5 %에서의 나트륨 벤조에이트가 첨가될 수 있다. 그 다음 최종 용액은 멸균 대기 하에 여과되고 저온 살균에 의해 멸균된다.

표현 "국소 도포"는 피부의 표면 또는 점막 위에 상기 벼/포도씨 추출물을 함유하는 조성물의 도포 또는 스프레딩인 것으로 이해된다.

조성물이 0.5 % 내지 2 %의 상기 벼/포도씨 추출물을 포함하는 것은 조성물의 전체 중량과 비교하여 벼/포도씨 추출물의 중량으로서 이해되어야 한다.

0.5 % 내지 2 %의 범위는 본원에 기재된 조성물 내 활성제의 "유효량"으로서 이해되어야 한다.

표현 "유효량"은 본원에서 대기 오염에 대한 보호가 보장되는 것과 같은 양을 의미한다.

표현 "오염으로부터 피부를 보호하고 피부 재생을 개선하기 위한 활성제"는 오존 노출 후 DNA 손상으로부터 세포를 보호하고 피부 재생을 가속화할 수 있는 임의의 벼/포도씨 추출물을 지칭하는 것으로 이해된다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 9:1의 비인 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물 (벼/포도씨 추출물)의 조합으로 구성된 0.01 내지 5 %의 활성 성분 및 생리적으로 허용가능한 매질을 포함하는 화장품 조성물을 처리될 피부에 국소 도포하는 것을 포함하는, 대기 오염으로부터 피부 표피 세포를 보호하기 위한 화장품 트리트먼트 방법에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 화장품 조성물은 0.5 % 내지 2 %의 활성 성분 벼/포도씨 추출물을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 화장품 트리트먼트 방법은 다음 단계를 포함한다:

a. 분자량이 6 kDa 미만인 저분자량 펩티드를 얻도록 식물 효소로의 효소 가수분해에 의해 가수분해된 벼 추출물을 얻는 것,

b. 감소하는 다공성 필터를 이용하여 가수분해된 벼 추출물을 정제하는 것,

c. 4 내지 7의 pH에서 물에서 포도씨 케이크로부터 포도씨 추출물을 얻는 것,

d. 감소하는 다공성 필터를 이용하여 포도씨 추출물을 정제하는 것; 및

e. 최종 생성물의 70 %를 나타내도록 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 5:5 내지 9:1 범위의 비로, 바람직하게는 9:1의 비로 단계 b 및 d에서 얻어진 추출물을 조합하는 것,

f. 그 다음 글리세롤이 최종 생성물의 30 %를 나타내도록 단계 e에서 얻어진 생성물에 첨가되는 것,

g. 임의로 0.5 %에서의 나트륨 벤조에이트가 첨가될 수 있다. 그 다음 최종 용액이 멸균 대기 하에 여과되고 저온 살균에 의해 멸균된다.

바람직한 실시양태에서, 활성 성분 벼/포도씨 추출물은 10 내지 20 g/Kg 범위의 단백질 함량, 및 보다 바람직하게는 15 g/Kg의 단백질 함량을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 활성 성분 벼/포도씨 추출물은 분자량이 6 kDa 미만인 펩티드로 구성된 가수분해된 벼 추출물을 포함한다.

세 번째 측면에서, 본 발명은 0.01 내지 5 % 및 보다 바람직하게는 0.5 % 내지 2 %의 활성 성분 벼/포도씨 추출물을 포함하는 화장품 조성물을 처리될 피부에 국소 도포하는 것을 포함하는, 피부 재생 및 복구를 개선하기 위한 화장품 트리트먼트 방법에 관한 것이다.

네 번째 측면에서, 본 발명은 0.01 내지 5 % 및 보다 바람직하게는 0.5 % 내지 2 %의 활성 성분 벼/포도씨 추출물을 포함하는 화장품 조성물을 처리될 피부에 국소 도포하는 것을 포함하는, 오염의 해로운 영향으로 인한 피부 노화 및 광-노화의 징후를 예방하고/거나 치료하기 위한 화장품 트리트먼트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 표현 "광-노화"는 태양에의 지속적 및 누적적 노출에 의해 유발된 조기 피부 노화를 나타낸다.

표현 "피부 노화 및 광-노화의 징후"는 노화에 의해 및 자외선과 같은 외부 스트레스에의 급성 또는 만성 노출에 의해 유발된 피부 위에 가시적인 임의의 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이것은 특히 피부 및 피하 조직의 주름, 깊고 거친 주름, 잔주름, 균열, 느슨해짐, 피부 탄력 및 이완의 손실, 견고함 및 긴장의 손실 및 피부 위축을 의미한다. 또한, 용어 "피부 노화 및 광-노화의 징후"는 확대된 기공, 결함, 변색, 노인성 반점, 각화증, 콜라겐의 손실 및 진피 및 표피에서의 기타 변화 뿐만 아니라 예를 들어 각질층의 표면 거칠기와 같은, 노화 및 광-노화로 인한 피부, 손톱 및 모발의 외부 외관에의 임의의 변형, 또한 전신적으로 피부의 박막화와 같은 변형된 외부 외관을 초래하지 않는 피부에의 임의의 내부 변형을 의미한다.

또 다른 유리한 실시양태에 따라, 벼/포도씨 추출물은 리포좀 또는 마이크로캡슐 또는 나노캡슐과 같은 화장품 또는 약학적 벡터에 용해되거나 분말 유기 중합체, 탈크 또는 벤토나이트와 같은 광물 지지체 위에 흡착되고, 보다 일반적으로 임의의 생리적으로 허용가능한 벡터 내에 용해되거나 그 위에 고정된다.

본 발명의 조성물은 임의의 적절한 방식으로, 특히 경구로 또는 국소로 도포될 수 있고, 조성물의 제제는 특히 화장품 또는 피부과 조성물을 위해 당업자에 의해 채택될 것이다. 본 발명의 조성물은 유리하게는 국소 투여되도록 설계된다. 따라서 이들 조성물은 생리적으로 허용가능한, 즉 피부 및 상피 부속물과 상용성인 매질을 함유하고, 모든 화장품 또는 피부과 형태를 포함해야 한다.

용어 "생리적으로 허용가능한 매질"은 독성, 비상용성, 불안정성, 알러지성 반응 또는 기타의 위험 없이, 인간 피부 또는 손톱 또는 모발과 접촉하기에 적합한 매질을 의미한다.

바람직하게는, 상기 벼/포도씨 추출물은 최종 조성물의 전체 중량에 대해 약 0.01 % 및 5 %를 나타내는 양으로 및 가장 바람직하게는 전체 조성물 중량의 0.05 % 내지 2 %를 나타내는 양으로 활성 성분으로서 조성물에 존재한다.

본 발명의 조성물은 수성, 히드로알콜성 또는 오일성 용액의 형태; 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼 또는 다중 에멀젼일 수 있다; 이들은 또한 피부, 점막, 입술 및/또는 상피 부속물 위의 도포를 위해 채택된 크림, 현탁액 또는 심지어 분말의 형태로 존재할 수 있다. 또한 이들 조성물은 다소 유동적이고 크림, 로션, 밀크, 세럼, 포마드, 겔, 페이스트 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 또한 그들은 스틱으로서 고체 형태로 존재할 수 있거나, 에어로졸로서 피부에 도포될 수 있다. 또한 그들은 피부케어 제품으로서 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수 있다.

또한, 조성물은 적용의 범위에서 고안된 임의의 통상적으로 사용되는 첨가제 뿐만 아니라 보조용매 (에탄올, 글리세롤, 벤질 알콜, 댐퍼(damper) 등), 증점제, 시너, 유화제, 항산화제, 착색제, 태양 필터, 색소, 충전제, 방부제, 향료, 냄새 흡수제, 정유, 올리고엘리먼트(oligoelement), 필수 지방산, 계면활성제, 필름-형성 중합체, 화학 필터 또는 광물, 보습제 또는 열수 등과 같은 그들의 제제를 위해 필요한 첨가제를 포함한다. 수용성, 바람직하게는 다당류 또는 폴리펩티드, 메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필셀룰로스 유형의 셀룰로스 유도체와 같은 천연 중합체, 또는 심지어 합성 중합체, 폴록사머, 카르보머, 실록산, PVA 또는 PVP, 및 특히 회사 애쉬랜드(Ashland)에 의해 판매되는 중합체가 예를 들어 인용될 수 있다.

모든 경우에, 당업자가 이들 아쥬반트 뿐만 아니라 그들의 비율이 그들이 본 발명의 조성물의 원하는 유리한 성질에 유해한 영향을 미치지 않도록 선택될 수 있게 할 것이다. 예를 들어, 이들 아쥬반트가 전체 조성물 중량의 0.01 % 내지 20 %의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명의 조성물이 에멀젼일 때, 지방 상은 전체 조성물 중량에 대해 5 중량% 내지 80 중량%, 바람직하게는 5 중량% 내지 50 중량%를 나타낼 수 있다. 조성물에 사용된 유화제 및 보조유화제가 고려 하의 분야에서 통상적으로 사용되는 그것으로부터 선택될 것이다. 예로서, 그들은 전체 조성물 중량에 대해 0.3 중량% 내지 30 중량%의 비율로 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 상기 벼/포도씨 추출물의 작용을 촉진하는 적어도 하나의 다른 활성 원리를 더 함유한다. 다른 활성 원리로서, 다음의 유형의 성분이 비제한적 방식으로 인용될 수 있다: 기타 펩티드 활성제, 식물성 추출물, 치유제, 노화방지제, 주름방지제, 진정제, 항-유리 라디칼, 항-자외선 작용제, 피부 거대분자 합성 또는 에너지 대사를 자극하기 위한 작용제, 보습제, 항균제, 항진균제, 소염제, 마취제, 피부 분화, 피부 색소침착 또는 색소탈실을 조절하는 작용제, 및 손톱 및 모발 성장을 자극하기 위한 작용제.

항-유리 라디칼 또는 항산화제 또는 피부 거대분자 합성 또는 에너지 대사를 자극하는 작용제가 사용되는 것이 바람직하다.

보다 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 벼/포도씨 추출물에 추가로, 다음을 포함할 것이다:

- 태양광차단제, 자외선 및 적외선 차단제

- 항-유리 라디칼 작용제,

- DHEA (데히드로에피안드로스테론),

- 적어도 하나의 시토크롬 c-활성화 화합물, 및/또는;

- 적어도 하나의 아쿠아포린-활성화 화합물 및/또는;

- 적어도 하나의 시르투인-활성화 화합물 및/또는;

- 세포 접착성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물 및/또는;

- 콜라겐 또는 라미닌 유형 등의 기질 단백질의 생산을 증가시키는 적어도 하나의 화합물;

- 적어도 하나의 HSP 단백질-조절 화합물;

- 세포 에너지를 증가시키는 적어도 하나의 화합물;

- 효모, 아마란스, 아마씨, 콩, 카카오, 옥수수, 대두, 해바라기, 평지씨 또는 완두콩 펩티드 추출물과 같은 적어도 하나의 색소침착-조절 화합물;

- 피부 장벽 기능을 개선하는 적어도 하나의 화합물;

- 적어도 하나의 미토콘드리아-보호 화합물,

- 비타민 A 및 특히 레티노산, 레티놀, 레티놀 프로피오네이트, 레티놀 팔미테이트,

- 비타민 B3 및 특히 니아신아미드, 토코페롤의 니코니테이트,

- 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 판테놀,

- 비타민 C 및 특히 아스코르브산, 아스코르빌 글루코시드, 아스코르빌 테트라팔미테이트, 마그네슘 및 나트륨 아스코르빌 포스페이트,

- 비타민 E, F, H, K, PP 및 조효소 Q10,

- 메탈로프로테이나제 억제제, 조직 억제제 메탈로프로테이나제 (TIMP)의 활성자,

- 아미노산 및 특히 아르기닌, 오르니틴, 히드록시프롤린, 히드록시프롤린 디팔미테이트, 팔미토일글리신, 히드록시리신, 메티오닌 및 이것의 유도체, N-아실화된 아미노산,

- 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사펩티드를 포함하는 천연 또는 합성 펩티드 및 그들의 친유성 유도체, 이성질체 및 금속 이온 (즉 구리, 아연, 망가니즈, 마그네슘 및 기타)과 같은 다른 분자와의 착체, 상업 명칭 매트릭실(MATRIXYL)®, 아르기렐린(ARGIRELINE)®, 콜락실(COLLAXYL)™, 펩티드 빈치 02(PEPTIDE VINCI 02)™, 크로노겐(CHRONOGEN)™, 라미닉실 IS(LAMINIXYL IS)™, 펩티드 Q10(PEPTIDE Q10)™ 하에 판매되는 펩티드,

- 대두 추출물, 외알밀(einkorn) 추출물, 평지씨 추출물, 아마씨 추출물, 옥수수 추출물, 또는 완두콩 추출물, 캐롭(carob) 추출물, 콩 추출물, 파바(fava) 추출물과 같은, 가수분해 또는 임의의 다른 방법에 의해 얻어진 펩티드성 식물 추출물,

- 효모 추출물, 아르테미아 살리나(artemia salina) 추출물,

- 데히드로아세트산 (DHA),

- 천연 또는 합성 피스토스테롤,

- 알파- 및 베타-히드록시산, 실라놀,

- 당 아민, 글루코사민, D-글루코사민, N-아세틸-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민, 만노사민, N-아세틸 만노사민, 갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민,

- 포도 추출물, 소나무 추출물, 올리브 추출물과 같은 플라보노이드, 이소플라본, 폴리페놀,

- 세라미드 또는 인지질과 같은 지질,

- 스쿠알렌 또는 스쿠알란과 같은 동물성유,

- 알몬드유, 코코넛유, 피마자유, 호호바유, 올리브유, 평지씨유, 땅콩유, 해바라기유, 밀 배아 유, 옥수수 배아 유, 대두유, 목화유, 알팔파(alfalfa)유, 양귀비유, 호박씨유, 월견초(evening primrose)유, 기장유, 보리유, 호밀유, 잇꽃유, 패션(passion)유, 헤이즐넛유, 팜유, 살구 커넬유, 아보카도유, 금잔화유, 에톡실화된 식물성유 또는 시어 버터와 같은 식물유. 상기 언급된 화합물은 식물의 펩티드 가수분해물과 같은 천연, 또는 또한 펩티드 화합물과 같은 합성일 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명에 따라 기재된 벼/포도씨 추출물의 효율성을 기재하고 입증하지만 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1: 벼/포도씨 추출물의 제조

A- 가수분해된 벼 추출물 (종 오리자 사티바 엘 )의 제조:

첫 번째 단계에서, 단백질 내 80 %로 풍부한 42 g의 벼 곡분 (벼 전분 생산 후 얻어짐)은 교반 하에 유지되는 1 kg의 물에 현탁된다. 그 다음 0.04 % w/w에서의 프로테아제 알칼라세(Alcalase)® 및 0.04 % w/w에서의 브로멜라인이 55 ℃에서 2 시간 동안 첨가되었고, pH가 7.0 내지 7.5의 범위로 조정된다.

그 다음 효소는 80 ℃에서 2 시간 탈활성화된다. 그 다음 pH는 4.3 내지 4.7 범위의 값에서 조정된다.

추출물은 10 분, 4000 rpm에서 원심분리에 의해 청정화된 다음, 상등액은 다공성이 청정화를 위한 500 μm에서 멸균을 위한 0.2 μm으로 감소하는 막을 통해 연속적으로 여과된다.

그 다음 가수분해된 벼 추출물은 밀리포어 헬리콘(Millipore Helicon) 여과 카트리지 (컷오프 6 kDa) 상에서 한외여과된다. 잔류물(retentate)에 함유된 고분자량 화합물은 제거되고 여과물이 수집된다. 이 여과물은 소위 가수분해된 벼 추출물의 원시 형태를 나타낸다. 특히 HPLC에 의한 분석 후, 추출물이 분자량이 6 kDa 미만인 약 80 %의 펩티드를 함유하는 것이 관찰된다.

이 단계에서, 다음을 함유하는 약 700 그램의 추출물이 얻어진다:

- 단백질 및 저분자량 펩티드: 77 %

- 탄수화물: 13 %

- 아미노산: 6.3 %

- 폴리페놀: 1.6 %

- 회분: 2.1 %.

나중에 사용되도록 저장되기 위해, 가수분해된 벼 추출물에 30 % 글리세롤 및 0.5 % w/w 나트륨 벤조에이트가 첨가된다.

그 다음 추출물은 0.22 μm 여과에 의해 멸균되고 최종적으로 65 ℃에서 밤새 오븐에서 살균된다.

이 단계에서, 가수분해된 벼 추출물은 32 g/l의 건조 추출물로부터 함유하는 옅은 노란색 용액의 형태 하이고 로우리 방법에 의해 결정된 펩티드 화합물의 농도는 17 g/l이다.

B-포도씨 추출물 (종 비티스 비니페라 )의 제조:

10 % w/w에서의 포도씨 케이크 곡분은 5 g/kg에서의 활성 목탄 (노리트 SX 플러스(Norit SX plus)®) 의 존재 하에 물에서 현탁되고 50 ℃에서 1 시간 방치된다.

그 다음 10 g/Kg의 규조토 (여과제)가 여과 수율을 개선하기 위해 첨가된다.

그 다음 추출물은 깊이 필터 매질을 사용하여 여과된다. 연속적 여과가 청정화 (500 μm)부터 멸균 (0.2 μm)까지 생성물을 정제하기 위해 수행된다.

그 다음 나중에 사용되도록 저장되기 위해, 포도씨 추출물이 30 % 글리세롤 및 0.5 % 나트륨 벤조에이트의 첨가에 의해 희석된다. 그 다음 얻어진 추출물은 95 % 당, 4.5 % 단백질 및 0.5 % 폴리페놀로 구성된 0.5 % 건조 물질로 구성된다.

C-가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합의 제조.

추출물은 단계 A에서 얻어진 9 중량부의 벼 가수분해된 추출물 및 단계 B에서 얻어진 1 중량부의 포도씨 추출물의 비로 혼합된다. 그 다음 믹스는 15 g/Kg의 단백질 (저분자량 펩티드)의 농도 및 0.5 % 나트륨 벤조에이트 및 30 % 글리세롤의 농도로 표준화되기 위해 물 및 글리세롤에서 희석된다.

최종 여과는 0.22 μm 폴리에테르술폰 막 상에서 수행된다. 그 다음 생성물은 65 ℃에서 밤새 저온에 의해 살균된다.

얻어진 최종 생성물은 pH가 4.5이고, 20 ℃에서의 밀도가 1.07 g/cm³이고, 20 ℃에서의 굴절률이 1.370이고, 단백질 함량이 15 g/kg이다 (로우리 분석법에 의해 측정된 바와 같음). 방부제는 0.5 %의 농도에서의 나트륨 벤조에이트이다.

실시예 2: 실시예 1의 벼/포도씨 추출물로 전처리 및 후처리된 NHEK에서의 피리미딘, 시클로부탄 피리미딘 이량체 (CPD)의 감소

세포 NHEK는 UVB로 조사되고 조사 후 18 시간 동안 인큐베이션되어 세포가 DNA 광손상을 복구할 수 있게 했다. 세포 DNA가 약 260 nm UV 광을 효율적으로 흡수하여, 인접한 피리미딘 간의 이량체성 광손상, 시클로부탄 피리미딘 이량체 (CPD)의 형성을 초래한다.

NHEK는 100 J/m²에서의 UVB 조사 전 24 시간 동안 실시예 1의 벼/포도씨 추출물로 전처리되었다. 활성의 상응하는 농도로의 처리가 조사 후 연장되었다. 세포는 조사 후 18 시간 수집되었고, DNA가 단리되고, CPD가 엘리사(Elisa)에 의해 검출되었다.

재료:

디엔이지(DNeasy) 조직 키트―퀴아젠(Qiagen) cat# 69504

NHEK, p3

에피라이프(EpiLife) -- 캐스케이드(Cascade), cat#M-EPI-500-CA,

인간 각질세포 성장 공급물, cat# S-001-5

트립신/EDTA 용액―캐스케이드, cat#R-001-100,

에탄올―EM 사이언스(EM Science), cat# AX0441-3,

리보뉴클레아제(RNase) A―퀴아젠, cat# R6513,

람다 DNA―뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), cat# N3011L (표준을 위함)

항-CPD 코스모스(Cosmos) USA Ab―TDM-2cat#D194;

항-마우스 터모 사이언티픽(Termo scientific) cat#31432 (0.4 mg/ml에서의 스톡)

엘리사 10x 세척 완충액; 이뮤노케미스트리(ImmunoChemistry) cat#652

엘리사 5x 코팅 완충액 이뮤노케미스트리 cat#646

퀴아젠 혈액 및 조직 키트 cat#69506

콴타 블루(Quanta Blue) 형광 기질 15169 Lot#IG113044

절차:

T75 플레이트 p-2에서 60-70 % 전면성장으로 NHEK를 성장시킨다.

PBS로 세포를 세척하고 세포를 트립신 처리한다.

세포를 계수하고 p50 당 1x10⁵ 개를 플레이팅한다.

다음의 최종 희석액에서 배지 내 1; 2; 1; 0.5; 0.1 및 0.01 % v/v에서의 실시예 1의 벼/포도씨 추출물 (또한 네오빅실로 지칭됨)로 처리한다.

처리 후 (24 시간) 플레이트를 헹구고 5 ml PBS를 첨가한다.

0.01 J/cm²에서 UV 조사 챔버로 샘플을 조사한다.

상응하는 활성이 있는 배지로 PBS를 대체하고 20 시간 동안 인큐베이터 내로 복귀시킨다. PBS에서 세포를 긁어내고 펠렛을 스핀 다운시키고 냉동시킨다.

퀴아젠으로부터의 디엔이지 키트를 사용함으로써 샘플로부터의 DNA의 단리는 제조사의 지침서를 따른다. 샘플은 적절한 농도의 데옥시리보뉴클레아제(DNase)가 없는 리보뉴클레아제로 처리되었다 (세포 현탁액에 4 μl 리보뉴클레아제 A (100 μg/μl)를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션함). DNA의 최종 농도를 측정하고 계산한다. 50 ng/웰 사이 범위의 DNA를 사용하여 재현가능한 결과가 얻어졌다. 4 개의 웰에 충분한 적절한 DNA를 계산하고 실리콘 튜브에서 TE 완충액에 재현탁시킨다 (최종 부피 200 μl).

10-15 분 동안 고정된 튜브를 끓임으로써 DNA를 변성시키고, 그 다음 적어도 15-30 분 동안 아이스 배스에서 튜브를 이동시킴으로써 빠르게 냉각시킨다.

200 μl의 2x 코팅 완충액을 첨가하고 튜브를 반전시킴으로써 샘플을 혼합한다.

3 회 반복하여 엘리사 웰에 100 μl의 코팅 혼합물을 도포한다.

37 ℃에서 밤새 플레이트를 건조시킨다 (플레이트를 덮지 않을 것).

CPD의 검출을 위한 플레이트의 제조 (모든 후속 인큐베이션이 RT에서 궤도 진탕기 상에서 수행됨)

엘리사 1x 세척 완충액으로 2x10 분 플레이트를 세척한다.

RT에서 1 시간 동안 150 μl 넵튠(Neptune) 차단 완충액으로 차단한다.

1차 항체 희석액의 제조

1:12000의 최종 농도를 위해 1x 세척 완충액에서 항 CPD 항체 (TDM-2)를 희석한다.

100 μl의 1차 항체를 도포하고 60 분 동안 RT에서 플레이트를 인큐베이션한다.

각 180 μl의 세척 완충액으로 3x10 분 세척한다.

2차 항체 및 기질의 제조

세척 후 100 μl의 희석된 2차 항체를 첨가하고 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션한다 (1x 세척 완충액에서 1:10000의 최종 희석액을 달성하기 위함).

180 μl의 세척 완충액으로 3x5 분 세척한다.

PBS로 1x3 분 세척한다.

웰 내로 100 μl의 기질을 도포한다 (기질 - 45 ml의 파트 1 및 5 ml의 파트 2; 9:1을 달성하기 위함).

최대 1 시간 동안 10 분마다 및 즉시 엘리사 리더 320/405 상에서 판독한다.

결과:

표 1 및 2에서, 실시예 1의 벼/포도씨 추출물은 네오빅실로 불린다.

2 개의 실험이 NHEK에서 CPD 복구의 평가에 관하여 수행되었다. 첫 번째에서, 실시예 1의 벼/포도씨 추출물로의 NHEK의 처리가 CPD 복구의 증가를 입증한다 (도 1). CPD의 감소는 12-14 %였다. 두 번째 실험에서, 실시예 1의 벼/포도씨 추출물의 유효 용량이 0.01-2 %의 범위에서 평가되었고 다시 최대 CPD 감소가 실시예 1의 1 % 벼/포도씨 추출물로 처리된 NHEK에서 보였다 (도 2).

도 1 및 2에서, 실시예 1의 벼/포도씨 추출물은 네오빅실 (NEOVIXYL^TM)로 불린다.

실시예 3: 0.5 및 1 %에서 실시예 1의 벼/포도씨 추출물로 48 시간 동안 처리된 기관형 피부의 상처 베드 봉합의 자극

상처 치유 테스트의 절차

세포의 이동이 세포외 기질, 가용성 인자 뿐만 아니라 세포간 상호작용에 의해 조절된다. 이들 인자의 영향은 상처 치유 방법을 사용함으로써 연구될 수 있다. 기관형 피부는 피부 구획의 방해 없이, 약 2 mm 와이드 스트립에서 손에 들고 쓰는 스캘퍼(hand held scalper)를 사용하여 상처를 내었다. PBS에서 희석된 실시예 1의 벼/포도씨 추출물의 분취액이 상처 부위에 첨가되고 그 다음 48 시간 동안 인큐베이션되었다. 상응하는 농도의 실시예 1의 벼/포도씨 추출물이 마찬가지로 인큐베이션 배지 아래에 첨가되었다. 기관형 피부가 완충 포르말린에 고정되고 맥클레인(McClain) 실험실에 의한 표준 조직학 절차에 의해 처리되었다. 기관형 피부 상처 베드의 이미지가 니콘 디지털 카메라 DS-R1으로 40 및 100 X에서 올림푸스 현미경을 사용하여 찍혔다. 상처 기저부부터 이동하는 각질세포의 끝까지의 길이는 니콘 엘리먼츠(Nikon Elements) BR-3-10 프로그램을 사용하여 측정되었다. 상처 가장자리의 양쪽으로부터의 거리가 첨가되었고 데이터는 길이 (μm) 및 처리되지 않은 상처와 비교한 증가 %로 나타냈다.

결과

표 3에서, 실시예 1의 벼/포도씨 추출물은 네오빅실로 불린다.

결과는 도 3에 도시되었으며, 여기서 실시예 1의 벼/포도씨 추출물은 네오빅실 (NEOVIXYL^TM)로 불린다.

실시예 4: 실시예 1의 벼/포도씨 추출물로 처리 후 코멧 분석법에 의한 오존 유도 DNA 단편형성의 평가

프로토콜

조직 배양

정상 인간 표피 각질세포 (NHEK)가 약 50 % 전면성장에 도달할 때까지 60 mm 페트리 디쉬 상에서 하위-배양되었다. 실시예 1의 벼/포도씨 추출물은 다음의 농도에서 NHEK 배지에서 제조되었다: 0.1 %, 0.5 % 및 1 %. 그 다음 NHEK는 새로운 배지 또는 실시예 1의 벼/포도씨 추출물을 함유하는 배지로 처리되고 밤새 인큐베이션되었다.

오존 처리

오존 노출 전에, 세포 배양 배지가 제거되고 2 ml의 둘베코의 포스페이트 완충 염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 대체되었다. 플레이트는 450 도에서 회전하는 스테이지 세트가 있는 오존 챔버에 배치되었다. 그 다음 세포는 20 분 동안 0.4 ppm 오존에 노출된 후, 2 시간 동안 그들 각각의 배지와 재인큐베이션되었고, 트립신으로의 처리에 의해 수거되었다. 마지막으로, 세포가 계수되었고 1x10⁴ 개의 세포가 코멧 분석법을 위해 사용되었다.

코멧 분석법

NHEK는 트립신 처리되고, PBS로 세척되고 1x10⁵ 세포/mL에서 PBS에 현탁되었다. 그 다음 세포는 1:10 비로 37 ℃에서 용융 아가로스 (트레비젠(Trevigen), cat#4250-050-02)에 분산되었다. 75 μl의 세포/아가로스 혼합물이 코멧 슬라이드 (트레비젠, cat#4250-050-03)의 각 지점 상에 고르게 피펫팅되었고 그 다음 10 분 동안 4 ℃에서 인큐베이션되었다. 슬라이드는 3 시간 동안 얼음 상에서 냉각 용균 용액 (트레비젠, cat#4250-050-01)에 담겼다. 슬라이드는 용균 용액으로부터 제거되고 30 분 동안 실온에서 알칼리성 용액 (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>13) 내로 배치되었다. 그 다음 슬라이드는 그들이 전극으로부터 등거리에 있도록 얼음에 냉각된 전기영동 장치에 배치되었다. 냉각 알칼리성 전기영동 용액 (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>13)이 이것이 단지 슬라이드를 덮을 정도로 장치 내로 부어졌다. 전기영동은 23 V에서 30 분 동안 실행되었다. 전기영동 후 슬라이드가 H2O에서 헹궈지고 5 분 동안 70 % EtOH에 담겼다. 슬라이드는 EtOH 용액으로부터 제거되고 타월 상에 배치되어 밤새 공기 건조시켰다. SYBR 그린 (트레비젠, cat#4250-050-05)이 1:10000로 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 희석되었다. 50 μl의 희석된 SYBR 그린이 각 지점 상에 피펫팅되었다. 슬라이드는 5 분 동안 4 ℃에서 인큐베이션되었다. 그 다음 슬라이드는 슬라이드로부터 과량의 SYBR 그린을 제거한 후 다시 건조될 수 있게 했다. 20x 대물을 갖는 FITC 필터로 올림푸스 BX 51 현미경 하에 슬라이드를 보았다. 이미지는 니콘 엘리먼츠 소프트웨어를 사용하여 포착되었다. 테일 모멘트(tail moment)가 트리텍(Tritek)으로부터의 코멧 스코어 소프트웨어로 결정되었다.

결과

도 4는 오존 노출 후 DNA 손상을 나타낸다. 오존 및 실시예 1의 벼/포도씨 추출물로 처리된 NHEK의 코멧 스코어, 여기서 실시예 1의 벼/포도씨 추출물은 네오빅실 (NEOVIXYL^TM)로 불린다.

결론

실시예 1의 벼/포도씨 추출물은 오존 유도 DNA 단편형성의 증가를 방해할 수 있었다. 실시예 1의 벼/포도씨 추출물로의 처리가 오존의 영향으로부터 세포를 보호한다.

Claims

가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 중량비(w/w)가 9:1인, 0.01 내지 5 중량%의 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합으로 구성된 활성 성분 및 생리적으로 허용가능한 매질을 포함하고, 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합은 하기 a. 내지 f.를 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 대기 오염으로부터 피부 표피 세포를 보호하기 위해 피부에 국소 도포하기 위한 화장품 조성물:
a. 분자량이 6 kDa 미만인 저분자량 펩티드를 얻도록 식물 효소로의 효소 가수분해에 의해 가수분해된 벼 추출물을 얻는 것;
b. 공극률이 저하되는 복수의 필터를 이용하여 가수분해된 벼 추출물을 정제하는 것;
c. 4 내지 7의 pH에서 물에서 포도씨 케이크로부터 포도씨 추출물을 얻는 것;
d. 공극률이 저하되는 복수의 필터를 이용하여 포도씨 추출물을 정제하는 것;
e. 최종 생성물의 70 중량%를 나타내도록 9:1의 중량비(w/w)로 단계 b 및 d에서 얻어진 추출물을 조합하는 것; 및
f. 글리세롤이 최종 생성물의 30 중량%를 나타내도록 단계 e에서 얻어진 생성물에 첨가되는 것.
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제1항에 있어서, 0.5 내지 2 중량%의 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 상기 조합을 포함하는 화장품 조성물.
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제1항에 있어서, 가수분해된 벼 추출물 및 포도씨 추출물의 조합이 10 내지 20 g/Kg 범위의 단백질 함량, 또는 15 g/Kg의 단백질 함량을 포함하는 화장품 조성물.
제1항에 있어서, 가수분해된 벼 추출물이 분자량이 6 kDa 미만인 펩티드로 구성된 것인 화장품 조성물.
제1항에 있어서, 피부 재생 및 복구를 개선하기 위한, 화장품 조성물.
제1항에 있어서, 오존 노출 동안 산화 반응을 감소시키기 위한, 화장품 조성물.