KR102539445B1

KR102539445B1 - 미세먼지에 의한 세포 손상 방지 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102539445B1
Application number: KR1020200159849A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 강한아; 황보별
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2023-06-05
Also published as: JP2023552315A; CN116615175A; US20240002439A1; EP4253400A1; WO2022114261A1; KR20220072349A

Abstract

본 출원은 미세먼지에 의한 세포 손상을 방지하는 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

미세먼지에 의한 세포 손상 방지 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptide Having Activity of Protecting Cell Damage From Particulate Matter and Uses Thereof}

미세먼지(particulate matter)는 눈에 보이지 않을 정도로 작은 입자의 먼지를 말한다. 미세먼지는 아황산가스, 질소 산화물, 납, 오존, 일산화탄소 등을 포함하는 대기오염 물질이며, 자동차, 공장, 조리 과정 등에서 발생하여 대기 중 장기간 떠다닌다. 대기 중에 떠다니는 지름이 50μm 이하인 먼지를 총 먼지(TSP, total suspended particle)으로 지칭하는데, 통상적으로 이 TSP 중에서 10μm 보다 작은 먼지를 미세먼지로 정의한다. 미세먼지는 입자의 지름에 따라 10μm 이하의 직경을 갖는 경우 PM10이라고 하고, 입자 직경이 2.5μm 이하인 경우는 PM 2.5라고 하고, 이를 '초미세먼지' 또는 '극미세먼지' 라고도 부른다.

미세먼지는 탄소, 유기탄화수소, 질산염, 황산염, 유해 금속성분을 포함하고 있어, 호흡기질환, 심혈관계 질환, 안구질환, 암, 피부질환, 두통 등을 직접적으로 유발하거나 이들 질환을 더 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 미세먼지는 입자의 크기가 피부의 모공의 5분의 1정도로 작기 때문에 미세먼지가 피부 안으로 침투하면 피부 바깥층의 보호막 기능이 손상되고 자극에 대해 민감해진다.

미세먼지 속에 포함되어 있는 다환방향족 탄화수소(polyaromatic hydrocarbons, PAHs)는 피부 모낭을 통하여 피부 속으로 들어와 멜라닌 세포와 색소반점을 증가시키며, 콜라겐 합성 감소와 분해를 증가시켜 주름 생성 및 탄력을 저하시켜 피부와 노화를 촉진한다. 다환방향족 탄화수소는 세포내로 침투할 수 있는데, 세포내로 침투한 아릴 탄화수소 수용체(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)와 결합하여, 핵내로 이동한다. 핵내로 이동한 AHR은 ARNT(AHR nuclear translocator)와 복합체 AHR/ARNT를 형성하고, 이 복합체 "AHR/ARNT"는 DNA상 AHRE(AHR responsive element), DRE (Dioxin responsive element), XRE (Xenobiotic responsive element) 서열에 결합하여, 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)을 발생시키거나, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 등의 효소를 통해 독성물질을 발생시켜 세포 손상을 유도하고, 다양한 염증 매개 인자, 멜라닌 합성 관련 전사인자인 작은 안구증 연관 전사 요소(Microphthalmiaassociated transcription factor; Mitf), 주름 생성 관련 효소인 메트릭스 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteases; MMPs)의 발현을 증가시켜 피부에서는 피부염, 색소 과형성(기미, 주근깨 등), 주름 등을 일으키게 된다.

대한민국 등록특허 제10-2065171호

본 발명자들은 신체의 세포가 미세먼지와 접촉되는 경우 유발되는 세포의 손상을 방지할 수 있는 활성을 갖는 펩타이드를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들이 개발한 펩타이드가 미세먼지에 의해 유도되는 AHR의 활성화를 억제하고, 동시에 AHR의 활성화에 의해 유도되는 사이토크롬 P450의 활성도 억제함으로써 세포 보호 활성을 가짐을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 미세먼지에 의해 유도되는 세포의 손상을 효과적으로 방지하는 활성을 보유한 펩타이드를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포 손상 방지용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 세포 손상 방지용 화장료 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세먼지와 접촉에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는, 미세먼지에 의한 세포손상 방지 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 세포 손상 방지용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 펩타이드 및 활성

본 발명의 일 양태에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 제공한다.

본 명세서의 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는 변형 없이 사용될 수 있으나, 다른 한편 상기 펩타이드가 가지는 본래의 활성, 예컨대 미세먼지에 의한 세포의 손상을 보호하는 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환, 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 그 활성을 변화시키지 않는 범위내에서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 예컨대, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 의미한다. 또한, 상기 펩타이드에는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열이 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 및/또는 C-말단 변형이 유도된 것일 수 있다. 이러한 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 통해 본 발명의 펩타이드의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 예를 들어, 펩타이드의 생체 내 투여 시 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 용어 펩타이드의 "안정성"은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미이다.

상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합한 것일 수 있다.

상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2), 아자이드(azide, -NHNH2) 등이 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폡타이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 알려진 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phasesynthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 미세먼지에 의해 유발되는 세포 손상을 효과적으로 방지할 수 있다.

미세먼지 속에 포함되어 있는 다환방향족 탄화수소(polyaromatic hydrocarbons, PAHs)는 세포내로 침투할 수 있고, 세포내로 침투한 다환방향족 탄화수소는 아릴 탄화수소 수용체(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)와 결합하여, 핵내로 이동한다. 핵내로 이동한 AHR은 ARNT(AHR nuclear translocator)와 복합체 AHR/ARNT를 형성하고, 이 복합체 "AHR/ARNT"는 DNA상에 존재하는 AHRE(AHR responsive element), DRE (Dioxin responsive element), XRE (Xenobiotic responsive element) 서열에 결합하여, 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)을 발생시키거나, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 등의 효소의 발현 또는 활성을 증가시켜 이를 통해 독성물질을 발생시켜 세포 손상을 유도하며, 다양한 염증 매개 인자의 발현도 증가시킨다.

본 발명의 펩타이드는 미세먼지와의 접촉에 의해 세포내에서 증가하는 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor)의 핵내 이동(nuclear translocation) 및 이에 의해 증가하는 사이토크롬 P450 활성을 현저히 억제함으로써, 미세먼지에 의해 발생되는 세포 손상을 방지할 수 있다.

2. 세포 손상 방지용 조성물

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 세포 손상 방지용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 세포 손상은 피부 세포, 호흡기 세포 또는 각막 세포의 손상일 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor)의 활성화를 억제하는 활성을 가질 수 있다. 상기 펩타이드에 의한 AHR의 활성화의 억제는 AHR의 핵내로의 이동의 억제일 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 사이토크롬(Cytochrome) P450의 활성을 억제하는 활성을 가질 수 있다. 상기 펩타이드에 의한 사이토크롬 P450의 활성의 억제는 사이토크롬 P450의 활성화의 억제 또는 발현(expression)의 억제일 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 미세먼지는 다환방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)를 포함한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상은 예컨대 피부 노화, 피부 주름의 증가, 피부 탄력의 손상, 피부 색의 손상, 색소 과형성, 기미, 주근깨, 피부의 건조, 피부 염증, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 또는 건선을 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부 노화, 피부 주름의 증가, 피부 탄력의 손상, 피부 색의 손상, 색소 과형성, 기미, 주근깨, 피부의 건조, 피부 염증, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 또는 건선의 개선 용도의 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 (i) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (ii) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

상기 용어 "화장품학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 방지 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 이용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로서의 펩타이드와 상기 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 아릴 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor, AHR)의 활성화를 억제하는 활성을 가질 수 있다. 상기 펩타이드에 의한 AHR의 활성화의 억제는 AHR의 핵내로의 이동의 억제일 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 미세먼지는 다환방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)를 포함할 수 있다.

상기 용어 “예방”은 미세먼지에 의해 유발되는 질환으로 인한 증상 또는 이의 합병증으로 인한 증상의 발생의 억제를 의미하며, 상기 용어 “치료”는 이미 발생된 미세먼지에 의해 유발되는 질환 또는 이 질환의 합병증으로 인한 증상의 경감 또는 제거를 의미한다.

상기 미세먼지에 의해 유발되는 질환은 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 여드름, 피부건조증, 건선; 알러지성 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 폐기능 감소, 천식, 기관지 확장증, 특발성폐섬유화증, 만성폐쇄성 폐질환(COPD; chronic obstructive pulmonary disease), 낭포성섬유증, 세기관지염, 급성상기도감염증, 폐렴, 부비강염, 인후염, 편도염, 후두염; 안구건조증, 알러지성 결막염, 녹내장, 백내장, 황반 변성, 망막 출혈, 망막 박리, 망막색소변성증, 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막증; 암, 면역 독성, 말초신경계 손상, 중추신경계 손상, 내분비선 이상, 생식기관 장애, 영아 및 유아의 발달 장애, 빈혈, 부정맥, 심장마비, 협심증, 및 심근경색증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 (i) 상술한 본 발명의 펩타이드의 치료학적 유효량(therapeutically effective amount); 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

상기 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 미세먼지에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10,000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 미세먼지에 의한 세포 손상 방지 활성이 매우 우수하여, 미세먼지로부터 피부 세포, 호흡기 세포 또는 각막 세포의 손상을 보호하기 위한 활성 물질로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 미세먼지에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료제도로 개발될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 아릴 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor, AHR)에 의해 매개되는 신호전달 기전을 보여주는 모식도이다.
도 2은 인간 각질형성세포 HaCaT 에서 미세먼지 처리에 의해 유도된 AHR의 핵내 이동의 증가가, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드의 처리에 의해 뚜렷하게 감소함을 보여주는 웨스턴 블롯 실험의 결과이다.
도 3는 인간 각질형성세포 HaCaT 에서 미세먼지 처리에 의해 유도된 사이토크롬 P450의 활성 증가가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소함을 보여주는 P450 활성 측정 실험의 결과이다.
도 4는 인간 폐포상피세포 A549 에서 미세먼지 처리에 의해 유도된 사이토크롬 P450의 활성 증가가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소함을 보여주는 P450 활성 측정 실험의 결과이다.

이하, 본 출원을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 출원을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 출원의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

실시예

제조예 1: 펩타이드의 제조

자동 펩타이드 합성기(Liberty, CEM Corporation, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(U-3000, Thermo fisher scientific, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 Pursuit XRs C18 (250 * 4.65 mm 100Å, Agilent, 미국)을 이용하였다.

서열번호	펩타이드의 아미노산 서열
1	SSNAEVLALF

실험예 1: AHR의 핵 이동 실험 (nuclear translocation test)

미세먼지에 존재하는 다환방향족 탄화수소(polyaromatic hydrocarbons, PAHs)는 AHR의 리간드(ligand)로 작용하여, PAH가 세포내로 침투하여 AHR에 결합하는 경우 AHR의 핵이동을 촉진한다. 합성한 펩타이드의 미세먼지에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인하기 위해, 세포에 미세먼지를 처리한 후 리간드-AHR 결합시 관찰되는 AHR의 핵 이동(nuclear translocation)을 펩타이드가 저해하는 지를 증명하는 실험을 행하였다.

5 x 10⁵ 세포/웰의 밀도(density)로 6-웰 플레이트에 인간 각질형성세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 접종하였다. 하룻밤 인큐베이션한 후, 무혈청 배지(serum-free media)로 교환하였다. 각질형성세포 HaCaT에 합성한 펩타이드를 농도별(20 μM, 100 μM, 200 μM)로 1시간 동안 전처리하였다. 이어서, 50 μg/cm²의 도시 미세먼지(Urban particulate matter, Sigma, NIST1648A)를 1시간 처리하였다. 각질형성세포를 수집한 후, 세포핵 추출물을 준비하여 웨스턴 블로팅을 행하였다. 웨스턴 블로팅은 항-AHR 항체(Cell Signaling Technology사)를 사용하여 당업계에 공지된 프로토콜에 따라 수행하였다.

실험 결과, 도 2에 도시된 웨스턴 블로팅의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 미세먼지를 처리하지 않은 대조군 세포(Con)에 비해, 미세먼지를 처리한 세포(NC)에서 AHR의 핵 이동이 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열의 펩타이드를 처리한 세포에서, 미세먼지 처리에 의해 증가된 AHR의 핵 이동의 수준이 뚜렷하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 사이토크롬 P450 활성 분석

미세먼지에 존재하는 다환방향족 탄화수소(PAHs)는 세포내로 침투하여 AHR에 결합하는 경우 AHR의 핵이동을 촉진한다. 핵내로 이동한 AHR은 ARNT(AHR nuclear translocator)와 복합체 AHR/ARNT를 형성하고, 이 복합체는 전사 인자(transcription factor)로 작용하여 사이토크롬 P450(CYPs)의 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 합성한 펩타이드의 미세먼지에 의한 세포 손상 억제 효과를 확인하기 위해, 세포에 미세먼지를 처리한 후 사이토크롬 P450의 활성을 펩타이드가 저해하는 지를 확인하는 실험을 행하였다.

먼저, 1 x 10⁴ 세포/웰의 밀도(density)로 96-웰 플레이트에 인간 각질형성세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 접종하였다. 하룻밤 인큐베이션한 후, 무혈청 배지(serum-free media)로 교환하였다. 각질형성세포 HaCaT에 합성한 펩타이드를 농도별(20 μM, 100 μM, 200 μM)로 1시간 전처리하였다. 이어서, 50 μg/cm² 의 도시 미세먼지(Urban particulate matter, Sigma, NIST1648A)를 24시간 처리하였다. 각질형성세포를 수집한 후, P450-Glo^TM Assay kit (Promega)을 이용하여 사이토크롬 P450의 활성을 측정하였다.

실험 결과, 도 3에 도시된 사이토크롬 P450의 활성 측정 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 미세먼지를 처리하지 않은 대조군 세포(Con)에 비해, 미세먼지를 처리한 세포(NC)에서 사이토크롬 P450의 활성이 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열의 펩타이드를 처리한 세포에서, 미세먼지 처리에 의해 증가된 사이토크롬 P450의 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 미세먼지 처리에 의한 사이토크롬 P450 활성의 증가는 펩타이드를 처리한 경우 처리한 펩타이드의 농도에 의존적 방식으로 감소하였다.

또한, 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 펩타이드가 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 인간 폐포상피세포(human alveolar epithelial cell)인 A549 세포에 대해서도 사이토크롬 P450의 활성 측정 실험을 진행하였다.

먼저, 1.2 x 10⁴ 세포/웰의 밀도(density)로 96-웰 플레이트에 인간 폐포 상피세포 A549 세포를 접종하였다. 하룻밤 인큐베이션한 후, 무혈청 배지(serum-free media)로 교환하였다. 폐포상피세포 A549에 합성한 펩타이드를 농도별(20 μM, 100 μM, 200 μM)로 1시간 전처리하였다. 이어서, 50 μg/cm² 의 도시 미세먼지(Urban particulate matter, Sigma, NIST1648A)를 24시간 처리하였다. 처리한 세포를 수집한 후, P450-Glo_TM Assay kit (Promega)을 이용하여 사이토크롬 P450의 활성을 측정하였다.

실험 결과, 도 4에 도시된 사이토크롬 P450의 활성 측정 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 미세먼지를 처리하지 않은 대조군 세포(Con)에 비해, 미세먼지를 처리한 세포(NC)에서 사이토크롬 P450의 활성이 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 펩타이드를 처리한 세포에서, 미세먼지 처리에 의해 증가된 사이토크롬 P450의 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 미세먼지 처리에 의한 사이토크롬 P450 활성의 증가는 펩타이드를 처리한 경우 처리한 펩타이드의 농도에 의존적 방식으로 감소하였다.

상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> CAREGEN CO., LTD <120> Peptide Having Activity of Protecting Cell Damage From Particulate Matter and Uses Thereof <130> 2020-DPA-3921 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 1 Ser Ser Asn Ala Glu Val Leu Ala Leu Phe 1 5 10

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드.
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서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 다환 방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)를 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 방지용 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 조성물은 피부 노화, 피부 주름의 증가, 피부 탄력의 손상, 피부 색의 손상, 색소 과형성, 기미, 주근깨, 피부의 건조, 피부 염증, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 또는 건선의 개선 용도인, 화장료 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 겔, 로션, 에센스, 크림, 파우더, 비누, 샴푸, 린스, 팩마스크, 계면활성제-함유 클렌징, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 오일, 리퀴드 파운데이션, 크림 파운데이션, 및 스프레이로이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 제형을 갖는 것인, 화장료 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 다환 방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)를 포함하는 미세먼지에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로서,
상기 다환방향족 탄화수소를 포함하는 미세먼지에 의해 유발되는 질환은 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 여드름, 피부건조증, 건선; 알러지성 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 폐기능 감소, 천식, 기관지 확장증, 특발성폐섬유화증, 만성폐쇄성 폐질환, 낭포성섬유증, 세기관지염, 급성상기도감염증, 부비강염, 인후염, 편도염, 후두염; 암, 부정맥, 심장마비, 협심증, 및 심근경색증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것인 약학적 조성물.
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청구항 10에 있어서,
상기 펩타이드는 아릴 탄화수소 수용체(Aryl Hydrocarbon Receptor, AHR)의 활성화를 억제하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서,
상기 펩타이드는 사이토크롬(Cytochrome) P450의 활성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
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