JP2018510915A - 汚染から皮膚を保護し、皮膚再生を改善するための化粧的処理方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、汚染から皮膚細胞を保護するための活性剤としての、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせの化粧的使用に関する。本発明はまた、処理すべき皮膚領域に、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを含む組成物を適用することを含む、大気汚染から皮膚表皮細胞を保護するための化粧的処理方法に関する。【選択図】 図１

Description

本発明は化粧品及びスキンケアの分野に属する。本発明は、生理的に許容される媒体中の少なくとも加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせの局所的適用のための使用に関する。
本発明はまた、生理的に許容される媒体中に加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを含有する組成物を皮膚に適用することを含む、汚染から皮膚を保護して皮膚再生及び修復を改善するための化粧的処理（treatment）方法に関する。

長年にわたって、大気汚染が顕著に増加し、ヒトの健康及び幸福にマイナスの影響を有する世界的な環境問題となっている。

有害な汚染物質に最初に直接さらされるのは、皮膚、毛髪、爪及び肺のような最も外側の組織である。従って、皮膚は、揮発性有機化合物、タバコの煙、オゾン、及び粒子状物質等の環境汚染に日常的にさらされている。

大気汚染は、様々なタイプの化学物質、生体異物及び粒子から構成されている。暴露された組織に対して有害な作用をもたらし得る汚染物質の3つの大きなカテゴリーは、気体、重金属及び粒子状成分である。

大気汚染物質は、例えばディーゼルモーター粒子、オゾン、又は重金属による汚染のある屋外、及び特に塗料、接着剤又は壁紙から放出される溶媒、例えばトルエン、スチレン、キシレン、ベンズアルデヒド又はタバコの煙による汚染が生じ得る屋内の双方で見出すことができる。

大気汚染物質の中で、オゾン及び粒子状汚染物質が最も広範な大気汚染物質であり、最も危険なものである。

地表面では、オゾン（O₃）は、酸化窒素等の一次汚染物質、及び揮発性有機化合物、特に自動車の排出ガスへの日光の相互作用によって形成される。

オゾンは小分子であり、極度に反応性の高い酸化剤であるため、最も外側のヒト組織と、著しくは気道及び皮膚と、速やかに反応する。

より具体的には、オゾンは毒物学的な損傷をもたらし（Afaq F. et al. J Invest Dermatol, 2009: 129: 2396-2403）、正常ヒト表皮角化細胞におけるDNA損傷を増加させることが見出されており、これは最終的には正常な細胞機能を損なうであろう（James T. McCarthy et al. Exp Dermatol, 2013, 22, 358-379）。

大気汚染に反復的かつ長期的に暴露すると、UV暴露と相乗的に作用して、皮膚にマイナスの結果をもたらす。これは、刺激、炎症を生じ、光傷害及び皮膚老化を増大させる可能性がある（Carletto, C. et al. Int J Cosmet Sci. 2000 Oct; 22(5):361-70）。

また、フリーラジカルが老化及び光老化のプロセスにおいて、より具体的には酸化され、損傷を受けたタンパク質の形成において重要な役割を果たしていることが周知である（Harman et al. J. Gerontol., 1956, 11(3), 298-300）。

このような大気汚染による皮膚への外部攻撃は、皮膚の全ての層に影響し、経時的老化と共に累積する老化のゆっくりとした進行プロセスをもたらし得る。皮膚の外観は変わり、しわ及び小じわの出現、色素過剰若しくは低色素沈着、しみ、皮膚の乾燥若しくは脱水、表皮の菲薄化、弾性線維症、不完全性、年齢によるしみを観察することができる。これらの全ての変化は、皮膚のみでなく、爪及び毛髪にも影響を及ぼす。これらの変化は、特に、細胞の再生機能、及び、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸等の細胞外マトリクス分子合成の低下による。

近年の研究は、環境ストレス（日光、汚染等）に対抗することができる活性剤を同定することを検討している。これらの研究から、数多くの概ね有効な活性剤が開示されている。一例として、米国特許出願US20070003536号には、酸化種及び皮膚の酸化的損傷に対して皮膚を保護するための方法が開示されている。この方法は、活性酸素及び窒素種の影響に対抗するために選択される10種を超える成分、例えばアスコルビン酸、SOD、グルタチオン、ブドウ成分、緑茶、フラボノイド、ブドウ種子成分、緑茶成分、トコフェノール等の混合物を適用することを含む。

その他、米国特許出願US2002/0192178号には、トウモロコシの水性抽出物を含有する組成物を皮膚に適用することを含む、汚染の影響に対して皮膚を保護する方法が開示されている。フランス特許FR 2915380号及びFR 2915383号には、酸化的ダメージから皮膚を保護することが意図されるコメペプチド抽出物が開示されている。

しかしながら、現在、汚染の悪影響に対して皮膚を保護する化粧的処理に対して高い需要が存在している。従って、大気汚染から皮膚を防止若しくは保護し、皮膚再生を改善することができる新規化合物を同定することが今なお重要である。

本明細書において、大気汚染から皮膚を効果的に保護し、皮膚再生を改善するための組成物、化粧的使用、及び化粧的方法が提供される。

本発明の第一の目的は、局所的適用のための、生理的に許容される媒体中の加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせの化粧的使用に関する。より具体的には、本発明の主題は、大気汚染から皮膚を保護し、皮膚再生及び修復を改善するための、生理的に許容される媒体中の少なくとも加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせの化粧的使用である。

本発明の第二の目的は、生理的に許容される媒体中に加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを含有する組成物を皮膚に適用することを含む、大気汚染から皮膚を保護するための化粧的処理方法に関する。

本発明の第三の目的は、生理的に許容される媒体中に加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを含有する組成物を皮膚に適用することを含む、皮膚の再生及び修復を改善するための化粧的処理方法に関する。

本発明の第四の目的は、生理的に許容される媒体中に加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを含有する組成物を皮膚に適用することを含む、汚染の有害作用による皮膚の老化及び光老化の徴候を予防及び／又は処理するための化粧的処理方法に関する。

従って、汚染から皮膚を保護するための、皮膚再生を改善するための、又は汚染による皮膚の老化及び光老化の徴候を処理するための、本発明の組成物を適用する方法は、本明細書に記載する1種以上の様々な組成物の有効量を局所的に適用することを含む。

DNA修復：1％及び0.5％の実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物（Neovixyl）前処理及び後処理したNHEKにおけるピリミジン類、シクロブタンピリミジン二量体（CPD）の減少％を示す。 DNA修復：実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物（Neovixyl）で前処理及び後処理したNHEKにおけるピリミジン類、シクロブタンピリミジン二量体（CPD）の減少％を示す。CPD減少-用量応答。 0.5％及び1％の実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物（Neovixyl）48時間処理したオルガノタイプスキン（Organotypic skin）の創傷床閉鎖（wound bed closure）の刺激を示す。 オゾン暴露後のDNA損傷を示す。オゾン及び実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物（Neovixyl）で処理したNHEKのコメットスコアを示す。

本発明の目的は、大気汚染から皮膚を効果的に保護するための、皮膚再生を改善するための、及び汚染の有害な影響による皮膚老化及び光老化の徴候を予防及び／又は処理するための化粧的処理方法を開示することである。

開示された方法は、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを生理的に許容される媒体中に含有する組成物を皮膚に局所的に適用することを含む。

本明細書において使用する用語「コメ／ブドウ種子抽出物」は、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを意味する。

一方で、コメ／ブドウ種子抽出物は、イネ種子粉末を植物性酵素で酵素的加水分解した後に得られる加水分解コメ抽出物から構成される。6kDa未満の低分子量タンパク質を得るために、空隙率を低下させた複数のフィルター（decreasing porosity filters）を使用して混合物を精製する。加水分解コメ抽出物は、米国特許第8,541,374号に記載された方法に従って得ることができる。

2009年11月3日に出願されたフランス特許FR0905256号の優先権を主張する米国特許第8,541,374号を、参照により本明細書に組み入れる。

用語「加水分解コメ抽出物」は、主としてペプチド又はオリゴペプチドによって代表される化合物の混合物を意味する。

用語「ペプチド又はオリゴペプチド」は、ペプチド結合によって連結された少なくとも2個のアミノ酸の連結体から構成されるタンパク質断片を意味する。

本発明の加水分解コメ抽出物を製造するために、イネ科（Poaceae）の植物、特にイネ属の植物、より好ましくはコメ（Oryza sativa L.）を使用する。使用する植物材料は、外皮を除去した（dehulled）又は除去していない種子のいずれかであろう。好ましくは、コメは先に発酵したものではない。

第1のステップにおいて、コメを植物用製粉機（plant mill）を用いて製粉する。得られた粉末を、続いて伝統的な有機溶媒（例えばアルコール、ヘキサン又はアセトン）を使用して「脱脂（delipidized）」しても良い。

好ましい実施形態において、植物材料は、コメデンプン製造後に得られるタンパク質に富む粉末状生成物である。コメデンプンを単離するために、コメタンパク質はコメ粉末から除去される。タンパク質に富む粉末状生成物は、湿式粉砕、ふるい、分離、濃縮及び乾燥によって得られる。コメ粉末から抽出されるタンパク質は、次いでアルカリ性溶液中に再懸濁させることができる。

遠心分離及びろ過段階の後、タンパク質、糖質及びおそらくは脂質を含有する可溶性画分を回収する。この粗溶液を、次いで管理された条件下で加水分解して可溶性ペプチドを生成させる。

本発明に従い、加水分解は、タンパク分解酵素を使用して、好ましくは植物起源（パパイン、ブロメライン、フィシン）及び微生物起源（アスペルギルス(Aspergillus)、リゾプス(Rhizopus)、バシラス(Bacillus)等）のエンドプロテアーゼを使用して、実施する。

この段階で得られる加水分解コメ抽出物は、低分子量画分、好ましくは6kDa未満の画分を選択するために更に精製しても良い。精製は、特に加水分解物中のペプチドを増加させるために多孔性を低下させる複数のフィルターを通した連続的な限外ろ過ステップ、各ステップにおけるろ液の回収、及び／又はクロマトグラフィー型の方法によって有利に実施することができる。

次いで、溶媒、例えば水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化若しくはプロポキシル化グリコール、環状ポリオール、又はこれらの溶媒の任意の混合物を用い、ろ液を20g/kg〜40g/kg、好ましくは30g/kgの乾燥物質濃度に希釈する。有利には、溶媒は、水中の30％グリセロール及び0.5％安息香酸ナトリウムの混合物であり得る。

次いで、場合により、希釈された活性成分を滅菌ろ過によって滅菌し、例えば65℃のオーブンで一晩低温殺菌する。

次に、水、又は水を含む任意の混合物での希釈を実施した後、10〜20g/lの範囲のタンパク質含量によって特徴付けられるコメ加水分解抽出物を得るために、限外ろ過によって滅菌する。

本発明に従って得られる加水分解コメ抽出物は、（適切な溶媒の勾配を使用して）0.2〜10kDaの分子量のタンパク質及びペプチドを分析できるサイズ排除分析カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用する高速サイズ排除クロマトグラフィー（SEC HPLC）で定性的及び定量的に特徴付けられる。

HPLC分析から、得られた加水分解コメ抽出物が6kDa未満の分子量を有するペプチドから構成されていることが示される。

他方、コメ／ブドウ種子抽出物は、ブドウ種子抽出物（植物種 Vitis vinifera）から構成される。

ブドウ種子抽出物は、ブドウ種子ケーキ（グレープシードオイル抽出の副産物）のpH4〜7の水中、有利には活性炭の存在下での抽出後に得られる。混合物を次いで、空隙率を低下させた複数のフィルターを使用して精製する。

高純度の抽出物の使用が必要とされる場合、酸で洗浄した活性炭が脱色及び精製のために有利に使用される。

次いで、加水分解コメ抽出物と、ブドウ種子抽出物とを、加水分解コメ抽出物5〜9の範囲、ブドウ種子抽出物5〜1の範囲の比率で混合する。好ましくは、この組合せは、9重量部の加水分解コメ抽出物及び1重量部のブドウ種子抽出物を混合することによって調製する。このようにして、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の比率を9:1（w/w）に調整する。次いで、水で希釈することによって、タンパク質含量を10〜20g/kg、好ましくは15g/kgに調整する。好ましくは、希釈は、グリセロールの最終濃度30％を得るために、水及びグリセロールの混合液で実施する。0.5％安息香酸ナトリウム等の保存剤を添加することができる。最終溶液を、次いで無菌環境下でろ過し、65℃で8時間、低温殺菌する。

好ましい実施形態において、得られた最終生成物は、4.0〜5.0の範囲のpH、20℃で1.06〜1.09 g/cm³の範囲の密度、20℃で1.360〜1.390の範囲の屈折率、及び（Lowryアッセイで測定して）10.0〜20.0 g/kgの範囲のタンパク質含量を有する。保存剤は、0.45〜0.55％の濃度の安息香酸ナトリウムを添加することができる。

いかなる科学的理論に拘束されるものでもないが、本発明者等は今回、コメ／ブドウ種子抽出物が汚染から皮膚を保護し、皮膚再生を改善することができること、更に汚染の有害な影響による皮膚老化及び光老化の徴候を防止及び／又は処理するために有用であることを見出した。

本発明におけるコメ／ブドウ種子抽出物を試験した結果、皮膚の角化細胞及び線維芽細胞に対する生物学的効果が実証された。更に、コメ／ブドウ種子抽出物は、オゾンによって皮膚細胞に引き起こされるDNA損傷に対して保護剤として作用することが実証された。

また、コメ／ブドウ種子抽出物は、ex vivoの創傷治癒モデルにおいて、皮膚再生及び皮膚修復を加速することも実証された。

本発明のコメ／ブドウ種子抽出物の保護能を、オゾン誘発性酸化的ストレスに対して評価した。本発明のコメ／ブドウ種子抽出物は、オゾン暴露中の酸化的応答を劇的に低減し、従ってDNA損傷から皮膚細胞を保護するのに非常に有効なものであることが見出された。

第1の態様において、本発明は、生理的に許容される媒体中の活性剤としてのコメ／ブドウ種子抽出物の、局所的適用のための化粧的使用に関する。

好ましい実施形態において、本発明は、局所的適用のための組成物中の、汚染から皮膚を保護し、皮膚再生を改善するための活性剤としての、生理的に許容される媒体中の少なくともコメ／ブドウ種子抽出物の化粧的使用に関する。

より好ましい実施形態において、本発明は、5〜9の範囲の加水分解コメ抽出物、及び5〜1の範囲のブドウ種子抽出物の比率で加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物が混合された、活性剤としてのコメ／ブドウ種子抽出物の化粧的使用に関する。好ましくは、比率は加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物9:1（w/w）に調整される。

別の好ましい実施形態において、組成物は、0.01〜5％、好ましくは0.5％〜2％のコメ／ブドウ種子抽出物を含有し、加水分解コメ抽出物は低分子量タンパク質（6kDa未満）を得るための植物性酵素による酵素的加水分解の後に得られる。加水分解コメ抽出物は、多孔性を低下させた複数のフィルターを使用して精製される。ブドウ種子抽出物は、ブドウ種子ケーキ（グレープシードオイル抽出の副産物）のpH4〜7の水による抽出後に得られる。混合物は多孔性を低下させた複数のフィルターを使用して精製される。次いで、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物を、5〜9の範囲の加水分解コメ抽出物及び5〜1の範囲のブドウ種子抽出物の比率で混合する。好ましくは、比率は、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物9:1である。コメ／ブドウ種子抽出物は、最終生成物の70％を占める。グリセロール（30％）を添加する。場合によって0.5％の安息香酸ナトリウムを添加しても良い。最終溶液を、次いで無菌環境下でろ過し、低温殺菌によって殺菌する。

「局所的適用」との表現は、皮膚又は粘膜の表面上への上記コメ／ブドウ種子抽出物を含有する組成物の適用または塗布（spreading）であると理解される。

組成物は、0.5％〜2％の上記コメ／ブドウ種子抽出物を含有し、これは組成物の総重量と比較したコメ／ブドウ種子抽出物の重量と理解しなければならない。

0.5％〜2％の範囲は、本明細書に記載する組成物中の活性剤の「有効量」として理解しなければならない。

「有効量」との表現は、本明細書において、大気汚染に対する保護が確実であるような量を意味する。

「汚染から皮膚を保護し、皮膚再生を改善するための活性剤」との表現は、オゾン暴露後のDNA損傷から細胞を保護し、皮膚再生を加速することができるコメ／ブドウ種子抽出物をいうものと理解される。

第2の態様において、本発明は、処理すべき皮膚に化粧用組成物を局所的に適用することを含む、大気汚染から皮膚表皮細胞を保護するための化粧的処理方法に関し、該組成物は、9:1の比率の加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物（コメ／ブドウ種子抽出物）の組み合わせからなる活性成分0.01〜5％、及び生理的に許容される媒体を含有する。

好ましい実施形態において、化粧用組成物は、0.5％〜2％の活性成分コメ／ブドウ種子抽出物を含有する。

別の実施形態において、化粧的処理方法は以下のステップを含む：
a. 植物性酵素での酵素的加水分解によって加水分解コメ抽出物を得て6kDa未満の分子量の低分子量ペプチドを取得し、
b. 空隙率が低下する複数のフィルターを用いて加水分解コメ抽出物を精製し、
c. pH4〜7の水中のブドウ種子ケーキからブドウ種子抽出物を取得し、
d. 空隙率が低下する複数のフィルターを用いてブドウ種子抽出物を精製し、そして
e. ステップb及びdで取得した抽出物を、5〜9の範囲の加水分解コメ抽出物及び5〜1の範囲のブドウ種子抽出物の比率、好ましくは9:1の比率で組み合わせて最終生成物の70％とし、
f. 次いでステップeで取得した生成物中にグリセロールを添加して最終生成物の30％とし、
g. 場合によって0.5％の安息香酸ナトリウムを添加しても良い。次いで最終溶液を無菌環境下でろ過し、低温殺菌によって殺菌する。

好ましい実施形態において、活性成分であるコメ／ブドウ種子抽出物は、10〜20g/kgの範囲のタンパク質含量、より好ましくは15g/kgのタンパク質含量を含む。

好ましい実施形態において、活性成分であるコメ／ブドウ種子抽出物は、6kDa未満の分子量を有するペプチドから構成される加水分解コメ抽出物を含有する。

第3の態様において、本発明は、化粧用組成物を処理すべき皮膚に局所的に適用することを含む、皮膚再生及び修復を改善するための化粧的処理方法に関し、この組成物は、0.01〜5％、より好ましくは0.5％〜2％の活性成分であるコメ／ブドウ種子抽出物を含有する。

第4の態様において、本発明は、化粧用組成物を処理すべき皮膚に局所的に適用することを含む、汚染の有害な影響による皮膚の老化及び光老化の徴候を防止及び／又は処理するための化粧的処理方法に関し、この組成物は、0.01〜5％、より好ましくは0.5％〜2％の活性成分であるコメ／ブドウ種子抽出物を含有する。

本発明における「光老化」との表現は、長期的かつ累積的な太陽への暴露によって引き起こされる早期の皮膚老化を意味する。

「皮膚老化及び光老化の徴候」との表現は、限定するものではないが、老化によって、及びUV照射等の外部ストレスへの急性若しくは慢性的暴露によって引き起こされる皮膚上で目に見える任意の徴候を含む。これは特に、しわ、深く荒いしわ、小じわ、ひび、皮膚組織及び皮下組織のゆるみ（slackening）、皮膚の弾性消失及び弛緩、堅さ及び緊張の消失、及び皮膚の萎縮を意味する。更に、用語「皮膚老化及び光老化の徴候」は、毛穴の拡大、不完全性、変色、年齢によるしみ、角化症、コラーゲンの消失、及び真皮及び表皮における他の変化を意味するが、老化及び光老化による皮膚、爪及び毛髪の外観のあらゆる変化、例えば角質層表面の粗さ、更に、皮膚の菲薄化等の、組織的には外観の変化をもたらさない皮膚内部の変化をも意味する。

別の有利な実施形態に従えば、コメ／ブドウ種子抽出物を、リポソーム又はマイクロカプセル若しくはナノカプセル等の化粧的又は医薬的ベクター中に溶解し、あるいは粉末状有機ポリマー、タルク又はベントナイト等の鉱物性支持体に吸着させ、より一般的には任意の生理的に許容されるベクター中に溶解又はベクター上に固定させる。

本発明の組成物は、任意の適切な方法で、特に経口的又は局所的に適用することができ、また組成物の処方は、当業者によって、特に化粧用又は皮膚科学的組成物のために適応されるであろう。本発明の組成物は、有利には局所的に投与するために設計される。従って、これらの組成物は、生理的に許容される媒体を含有し、すなわち皮膚及び上皮付属器官と適合するものでなければならず、全ての化粧品又は皮膚科学的形態を含む。

「生理的に許容される媒体」との用語は、毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応等のリスクなしに、ヒトの皮膚又は爪若しくは毛髪との接触に適した媒体を意味する。

好ましくは、上記コメ／ブドウ種子抽出物は、最終組成物の総重量に対して約0.01％〜5％の量で、最も好ましくは全組成物重量の0.05％〜2％の量で組成物中に活性成分として存在する。

本発明の組成物は、水性、水-アルコール性又は油性溶液；水中油型エマルション、油中水型エマルション又は多重エマルションの形態であって良く、これらはまた、皮膚、粘膜、唇及び／若しくは上皮付属器官への適用に適したクリーム、懸濁液、又は粉末の形態でさえ存在し得る。これらの組成物はまた、事実上液体であっても良く、クリーム、ローション、ミルク、セラム、ポマード、ゲル、ペースト又はムースの外観を有し得る。これらはまた、スティックのような固型形態で存在することができ、あるいはエアゾールとして皮膚に適用することができる。これらはまた、スキンケア製品及び／又はメークアップ製品として使用することもできる。

更に、本組成物は、本出願の範囲において想定される伝統的に使用される添加剤、並びに製剤化のために必要な添加剤、例えば共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール、ダンパー(damper)）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、抗酸化剤、着色剤、ソーラーフィルター、顔料、増量剤、保存剤、香料、消臭剤、エッセンシャルオイル、少数元素、必須脂肪酸、界面活性剤、皮膜形成性ポリマー、化学的フィルター若しくはミネラル、保湿剤又は温泉水（thermal water）等を含有する。水溶性の、好ましくは天然のポリマー、例えば多糖類又はポリペプチド、メチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルセルロース型のセルロース誘導体、更に合成ポリマー、ポロキサマー、カーボマー、シロキサン、PVA若しくはPVP、及び特にAshland社から販売されているポリマーを例として挙げることができる。

全ての場合において、当業者であれば、これらの助剤並びにその比率が、本発明の組成物の所望の有利な特性に有害な影響を有さないような選択を確実にするであろう。これらの助剤は、例えば全組成物重量の0.01％〜20％の濃度で存在し得る。本発明の組成物がエマルションである場合、脂質相（fatty phase）は全組成物重量に対して5重量％〜80重量％、好ましくは5重量％〜50重量％を示し得る。本組成物中で使用する乳化剤及び共乳化剤（co-emulsifier）は、意図される分野において伝統的に使用されているものから選択されるであろう。一例として、これらは全組成物重量に対して0.3重量％〜30重量％の比率で使用され得る。

特定の実施形態において、本発明の組成物は更に、上記コメ／ブドウ種子抽出物の作用を促進する少なくとも1種の他の活性成分を含有する。他の活性成分として、以下のタイプの成分を非限定的に挙げることができる：他のペプチド活性剤、植物抽出物、治癒剤（healing agent）、抗老化剤、抗しわ剤、緩和剤（soothing agent）、抗フリーラジカル剤、抗紫外線放射剤、皮膚の高分子合成若しくはエネルギー代謝を刺激する薬剤、保湿剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤、皮膚の分化、皮膚の色素沈着若しくは脱色を調節する薬剤、及び爪及び毛髪の成長を刺激する薬剤。

抗フリーラジカル剤若しくは抗酸化剤、又は皮膚の高分子合成若しくはエネルギー代謝の刺激剤を使用することが好ましい。

より具体的な実施形態において、本発明の組成物は、本発明のコメ／ブドウ種子抽出物に加えて、以下の成分を含むであろう：
−サンスクリーン剤、紫外線及び赤外線スクリーン剤、
−抗フリーラジカル剤、
−DHEA（デヒドロエピアンドロステロン）、

−少なくとも1種のシトクロムc-活性化化合物、及び／又は
−少なくとも1種のアクアポリン-活性化化合物、及び／又は
−少なくとも1種のサーチュイン-活性化化合物、及び／又は
−細胞接着を増大させる少なくとも1種の化合物、及び／又は
−コラーゲン又はラミニン型のマトリクスタンパク質等の生成を増大させる少なくとも1種の化合物、

−少なくとも1種のHSPタンパク質調節化合物、
−細胞エネルギーを増大させる少なくとも1種の化合物、
−少なくとも1種の色素沈着調節化合物、例えば酵母、アマランス、リンシード（linseed）、豆（bean）、カカオ、トウモロコシ、大豆、ヒマワリ、ナタネ、又は豆（pea）ペプチド抽出物、
−皮膚バリア機能を改善する少なくとも1種の化合物、
−少なくとも1種のミトコンドリア保護化合物、

−ビタミンA及び特にレチノイン酸、レチノール、プロピオン酸レチノール、パルミチン酸レチノール、
−ビタミンB3及び特にナイアシンアミド、トコフェノールのニコチン酸塩（niconitate）、
−ビタミンB5、ビタミンB6、ビタミンB12、パンテノール、
−ビタミンC、及び特にアスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、テトラパルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルマグネシウム及びナトリウム、
−ビタミンE、F、H、K、PP、及びコエンザイムQ10、

−メタロプロテイナーゼ阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害物質（TIMP）、
−アミノ酸及び特にアルギニン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシプロリンジパルミテート、パルミトイルグリシン、ヒドロキシリシン、メチオニン及びその誘導体、N-アシル化アミノ酸、
−ジ、トリ、テトラ、ペンタ及びヘキサペプチドを含む天然若しくは合成ペプチド、及びこれらの親油性誘導体、異性体及び他の分子、例えば金属イオン（すなわち銅、亜鉛、マンガン、マグネシウム等）との複合体、商品名MATRIXYL（登録商標）、ARGIRELINE（登録商標）、COLLAXYL^TM、PEPTIDE VINCI 02^TM、CHRONOGEN^TM、LAMINIXYL IS^TM、PEPTIDE Q10^TMで販売されているペプチド、
−加水分解若しくは他の任意の方法で得られるペプチド性植物抽出物、例えば大豆抽出物、ヒトツブコムギ抽出物、ナタネ抽出物、アマニ抽出物、トウモロコシ抽出物、又はマメ（pea）抽出物、イナゴマメ抽出物、マメ（bean）抽出物、ソラマメ（fava）抽出物、
−酵母抽出物、アルテミア・サリーナ（artemia salina）抽出物、

−デヒドロ酢酸（DHA）、
−天然若しくは合成フィトステロール、
−α-及びβ-ヒドロキシ酸、シラノール、
−糖アミン（sugar amine）、グルコサミン、D-グルコサミン、N-アセチル-グルコサミン、N-アセチル-D-グルコサミン、マンノサミン、N-アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、
−ポリフェノール、イソフラボン、フラボノイド、例えばブドウ（grap）抽出物、松抽出物、オリーブ抽出物、

−脂質、例えばセラミド又はリン脂質、
−動物性油、例えばスクアレン又はスクアラン、
−植物性油、例えばアーモンド油、ヤシ油、ヒマシ油、ホホバ油、オリーブ油、ナタネ油、ピーナッツ油、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、トウモロコシ胚芽油、大豆油、綿実油、アルファルファ油、ケシ油、パンプキン種子油、月見草油、雑穀（millet）油、オオムギ油、ライムギ油、サフラワー油、パッションフルーツ油（passion oil）、ヘーゼルナッツ油、パーム油、アプリコットカーネル油、アボカド油、カレンデュラ油、エトキシル化植物油、又はシアバター。
上記の化合物は、植物のペプチド加水分解物のような天然のものであっても良く、またペプチド化合物のような合成のものであっても良い。

以下の実施例は、本発明に従って記載したコメ／ブドウ種子抽出物の効果を記載し、実証するものであるが、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。

［実施例１：コメ／ブドウ種子抽出物の調製］
A. 加水分解コメ抽出物（Oryza sativa L種）の調製
第1のステップにおいて、タンパク質量が80％に高められた42gのコメ粉末（コメデンプン製造澱粉生成後に得られたもの）を1kgの水中に撹拌しながら懸濁する。次いで、0.04重量％のAlcalase（登録商標）及び0.04重量％のブロメラインのプロテアーゼを55℃で2時間添加し、pHをpH7.0〜7.5の範囲に調整する。
次いで酵素を80℃で2時間不活化させる。次いでpHを4.3〜4.7の範囲の値に調整する。

4000rpmで10分間の遠心分離によって抽出物を清澄化し、次いで上清を清澄化のための500μmから滅菌のための0.2μmまで空隙率が下がる複数のメンブレンを通して連続的にろ過する。
加水分解したコメ抽出物を次いでMillipore Heliconろ過カートリッジ（カットオフ値6kDa）上で限外ろ過に供する。濃縮液（retentate）中に含まれる高分子量の化合物を除去し、ろ液を回収する。このろ液は、いわゆる加水分解コメ抽出物の原料の形態（raw form）を示す。特にHPLCによる分析後、抽出物が6kDa未満の分子量を有するペプチドを約80％含有することが観察される。

この段階で、以下：
−タンパク質及び低分子量ペプチド：77％
−炭水化物：13％
−アミノ酸：6.3％
−ポリフェノール：1.6％
−灰分（ash）：2.1％
を含有する約700gの抽出物が得られる。

後の使用のために保存する場合、加水分解コメ抽出物に30％グリセロール及び0.5重量％安息香酸ナトリウムを添加する。
抽出物を次いで0.22μmのろ過で滅菌し、最後に65℃で一晩、オーブン中で殺菌する。
この段階で、加水分解コメ抽出物は、32g/lの乾燥抽出物を含有するわずかに黄色の溶液の形態であり、Lowry法で測定したペプチド化合物の濃度は17g/lである。

B. ブドウ種子抽出物（Vitis vinifera種）の調製
10％ w/wのブドウ種子ケーキ粉末（grape seed cake flour）を、5g/kgの活性炭（Norit SX plus(登録商標)）の存在下で水に懸濁し、50℃で1時間放置する。
次いで、ろ過収率を改善するために、10g/kgの珪藻土（ろ過助剤）を添加する。

次いでデプスフィルター媒体を使用して抽出物をろ過する。生成物を精製するために、清澄化（500μm）から滅菌（0.2μm）まで連続的なろ過を実施する。
後の使用のために保存する場合、ブドウ種子抽出物を次いで30％グリセロール及び0.5％安息香酸ナトリウムの添加によって希釈する。次いで得られた抽出物を、95％の糖、4.5％のタンパク質及び0.5％のポリフェノールから構成される乾燥物質0.5％に構成する。

C. 加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせの調製
抽出物を、ステップＡで得られた加水分解コメ抽出物9部（重量）と、ステップＢで得られたブドウ種子抽出物1部（重量）の比率で混合する。次いで、混合物を、15g/kg濃度のタンパク質（低分子量ペプチド）、0.5％濃度の安息香酸ナトリウム、及び30％グリセロールに標準化するために、水及びグリセロールで希釈する。

最後のろ過は0.22μmのポリエーテルスルホンメンブレンで行う。次いで生成物を65℃で一晩低温殺菌する。
得られた最終生成物は、pH 4.5、20℃での密度1.07g/cm³、20℃での屈折率1.370、そしてタンパク質含量15g/kg（Lowryアッセイで測定）を有する。保存剤は0.5％濃度の安息香酸ナトリウムである。

［実施例２：実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物で前処理及び後処理したNHEKにおけるピリミジン、シクロブタンピリミジン二量体（CPD）の減少］
NHEK細胞にUVBを照射し、照射後18時間インキュベートして細胞がDNAの光傷害を修復できるようにした。細胞内DNAは約260nmのUV光を効率的に吸収し、隣接するピリミジン間の二量体性光傷害（dimeric photolesion）、シクロブタンピリミジン二量体（CPD）の形成に到る。
NHEKを100J/m2のUVB照射前に実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物で24時間前処理した。対応する濃度の活性剤による処理を照射後に延長した。照射18時間後に細胞を回収し、DNAを単離し、ElisaによってCPDを検出した。

材料：
DNeasy Tissue Kit−Qiagen, cat# 69504
NHEK, p3
EpiLife−Cascade, cat#M-EPI-500-CA,
ヒト角化細胞増殖用添加剤（Human Keratinocyte Growth Supplement）, cat# S-001-5
トリプシン/EDTA溶液−Cascade, cat#R-001-100,
エタノール−EM Science, cat# AX0441-3,
RNase A−Qiagen, cat# R6513,
Lambda DNA−New England BioLabs, cat# N3011L (標準として)
抗-CPD Cosmos USA Ab−TDM-2cat#D194 ;
抗-マウス Termo scientific cat#31432 (0.4mg/mlのストック)
ELISA 10 x 洗浄バッファー; ImmunoChemistry cat#652
ELISA 5x コーティングバッファーImmunoChemistry cat#646
Qiagen Blod and tissue kit cat#69506
Quanta Blue 蛍光性基質 15169 Lot#IG113044

方法：
NHEKをT75プレートp-2で60-70％のコンフルエンスになるまで増殖させる。
細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理する。
細胞を計数し、p50あたり1×10⁵個でまく。
以下の最終希釈：培地中1、2、1、0.5、0.1及び0.01％ v/vの実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物（Neovixylともいう）で処理する。
処理（24時間）後、プレートをすすぎ、5ml PBSを添加する。
UV照射チャンバーでサンプルを0.01J/cm²で照射する。
PBSを対応する活性成分を含有する培地と置き換え、インキュベーターに戻して20時間置く。PBS中で細胞をかき取り、遠心分離して、ペレットを凍結する。

Qiagen社のDNeasy kitを使用したサンプルからのDNAの単離は製造業者の説明書に従った。サンプルを適切な濃度のDNAse不含RNAseで処理した（細胞懸濁液に4μlのRNAse A(100μg/μl)を添加して室温で5分間インキュベート）。DNAの最終濃度を測定して計算した。50 ng/ウェルのDNAを使用して再現性のある結果が得られた。4個のウェルのために適切なDNA量を計算し、シリコンチューブ中のTEバッファー（最終体積200μl）中に再懸濁した。
煮沸耐性チューブ（boiling secured tube）で10〜15分間DNAを変性させ、次いでチューブを氷浴中に移して少なくとも15〜30分間急速冷却した。

200μlの2×コーティングバッファーを添加し、チューブを逆さにしてサンプルを混合した。
100μlのコーティング混合物をElisaウェルにトリプリケートでアプライした。
プレートを37℃で一晩乾燥させた（プレートを覆わない）。

CPDの検出のためのプレートの調製（以降のインキュベーションは全て室温でオービタルシェーカーで実施する）
プレートをElisa 1×洗浄バッファーで2×10分間洗浄した。
150μlのNeptuneブロッキングバッファーを用い、室温で1時間ブロックした。

一次抗体希釈液の調製
1×洗浄バッファーで抗CPD抗体（TDM-2）を最終濃度1:12000に希釈した。
一次抗体100μlをアプライし、室温で60分間プレートをインキュベートした。
それぞれ180μlの洗浄バッファーで3×10分間洗浄した。

二次抗体及び基質の調製
洗浄後、100μlの希釈二次抗体を添加し、（1:10000の最終希釈物を得るために1×洗浄バッファー中で）室温で1時間インキュベートした。
180μlの洗浄バッファーで3×5分間洗浄した。
PBSで1×3分間洗浄した。
ウェルに100μlの基質をアプライした（基質−9:1を達成するために45mlのパート1及び5mlのパート2）。
直後、及び10分毎に1時間まで、320/405をElisaリーダーで読み取った。

結果：
表１及び２において、実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物をNeovixylと記載する。

NHEKにおけるCPD修復の評価に関して2つの実験を行った。最初の実験では、NHEKを実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物で処理して、CPD修復の増大が実証された（図１）。CPDの減少は12〜14％であった。第2の実験では、実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物の有効投与量が0.01〜2％の範囲であると評価され、最大のCPDの減少は実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物1％で処理したNHEKで観察された（図２）。
図１及び２において、実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物をNeovixyl（NEOVIXYL^TM）と記載する。

［実施例３：0.5及び1％の実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物で48時間処理したオルガノタイプスキンの創傷床閉鎖の刺激］
創傷治癒試験方法
細胞の移動は、細胞外マトリクス、可溶性因子、並びに細胞間相互作用によって調節される。これらの因子の影響を、創傷治癒方法を使用して研究することができる。オルガノタイプスキンを、ハンドヘルドスカルパーを使用して、真皮区画を乱すことなく約2mmの幅に剥いで傷つけた。創傷部位にPBSで希釈した実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物のアリコートを添加し、48時間インキュベートした。対応する濃度の実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物を下部のインキュベーション培地に同様に添加した。オルガノタイプスキンを緩衝ホルマリン中で固定し、McClain研究所で標準的な組織学的手順によって処理した。オルガノタイプスキンの創傷床の画像を、NikonデジタルカメラDS-R1を備えた40倍及び100倍のOlympus顕微鏡を使用して取得した。創傷底部から移動する角化細胞の先端までの長さを、Nikon Elements BR-3-10プログラムを使用して測定した。両側の創傷の端（edge）からの距離を合わせ、データを長さ（μm）及び未処理の創傷と比較した増加％で表した。

結果
表３において、実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物をNeovixylと記載する。
結果を図３に示す。実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物をNeovixyl（NEOVIXYL^TM）と記載する。

［実施例４：実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物処理後のオゾン誘導性DNA断片化のコメットアッセイによる評価］
プロトコル
組織培養
正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）を60mmのペトリ皿上でおよそ50％のコンフルエンシーに達するまで継代培養（sub-cultivate）した。実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物を以下の濃度：0.1％、0.5％及び1％でNHEK媒体中に調製した。次いでNHEKを新しい培地、又は実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物を含む培地のいずれかで処理して一晩インキュベートした。

オゾン処理
オゾン暴露の前に、細胞培養培地を除去し、2mlのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に置き換えた。プレートを、450アングルに設定した回転ステージを備えたオゾンチャンバー中に置いた。次いで細胞を0.4ppmのオゾンに20分間暴露し、続いてそれぞれの培地を用いて再度2時間インキュベートし、トリプシンで処理して回収した。最後に、細胞を計数し、1×10⁴個の細胞をコメットアッセイに用いた。

コメットアッセイ
NHEKをトリプシン処理し、PBSで洗浄し、1×10⁵細胞/mLでPBS中に懸濁した。細胞を次いで37℃で融解アガロース（Trevigen, cat#4250-050-02）中に1:10の比率で分散させた。細胞/アガロース混合物75μlをコメットスライド（Trevigen, cat#4250-050-03）の各スポット上に均一にピぺッティングし、次いで4℃で10分間インキュベートした。スライドを氷上の冷溶解液（Trevigen, cat#4250-050-01）に3時間浸漬した。溶解液からスライドを取り出し、アルカリ溶液（300mM NaOH, 1mM EDTA, pH>13）中に室温で30分間置いた。次いでスライドを氷で冷やした電気泳動装置内に電極から等距離になるように置いた。冷やしたアルカリ性電気泳動液（300mM NaOH, 1mM EDTA, pH>13）を装置中に注ぎ、スライドを覆う程度にした。電気泳動は23Vで30分間実施した。電気泳動の後、スライドをH₂Oですすぎ、70％EtOHに5分間浸漬した。スライドをEtOH溶液から取り出し、タオルの上に置いて一晩風乾した。SYBRグリーン（Trevigen, cat#4250-050-05）をTEバッファー（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5）で1:10000に希釈した。希釈したSYBRグリーン50μlを各スポット上にピペッティングした。スライドを4℃で5分間インキュベートした。次いで、スライドから過剰量のSYBRグリーンを除いた後にスライドを再び乾燥させた。20倍の対物レンズとFITCフィルターとを備えたOlympus BX51顕微鏡でスライドを観察した。画像はNikon Elementsソフトウェアを使用して取得した。Tri Tek社のComet Scoreソフトウェアを使用してテールモーメントを決定した。

結果
図４は、オゾン暴露後のDNAの損傷を示す。オゾン及び実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物で処理したNHEKのコメットスコアを示す。実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物をNeovixyl（NEOVIXYL^TM）と記載する。

結論
実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物は、オゾンによって誘発されるDNA断片化の増大に対抗することができた。実施例１のコメ／ブドウ種子抽出物による処理は、オゾンの影響から細胞を保護する。

Claims (8)

1. 化粧用組成物を皮膚に局所的に適用することを含む、大気汚染から皮膚表皮細胞を保護するための化粧的処理方法であって、該組成物が、5〜9の範囲の加水分解コメ抽出物及び5〜1の範囲のブドウ種子抽出物の比率の加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせからなる0.01〜5％の活性成分、及び生理的に許容される媒体を含有する、上記方法。
2. 上記比率が加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物で9:1（w/w）に調節されている、請求項1記載の化粧的処理方法。
3. 上記化粧用組成物が、加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせを0.5〜2％含有する、請求項1記載の化粧的処理方法。
4. 上記方法が：
   a. 植物性酵素での酵素的加水分解によって加水分解コメ抽出物を得て6kDa未満の分子量の低分子量ペプチドを取得し、
   b. 空隙率が低下する複数のフィルター（decreasing porosity filters）を用いて加水分解コメ抽出物を精製し、
   c. pH4〜7の水中のブドウ種子ケーキからブドウ種子抽出物を取得し、
   d. 空隙率が低下する複数のフィルターを用いてブドウ種子抽出物を精製し、そして
   e. ステップb及びdで取得した抽出物を9:1の比率で組み合わせて最終生成物の70％とし、
   f. ステップeで取得した生成物中にグリセロールを添加して最終生成物の30％とする
   を含む、請求項1記載の化粧的処理方法。
5. 加水分解コメ抽出物及びブドウ種子抽出物の組み合わせが、10〜20g/kgの範囲のタンパク質含量、より好ましくは15g/kgのタンパク質含量を含む、請求項1記載の化粧的処理方法。
6. 加水分解コメ抽出物が6kDa未満の分子量を有するペプチドから構成される、請求項1記載の化粧的処理方法。
7. 皮膚再生及び修復を改善するために使用される、請求項1記載の化粧的処理方法。
8. 汚染の有害な影響による皮膚老化及び光老化の徴候を防止及び／又は処理するために使用される、請求項1記載の化粧的処理方法。