KR102021107B1 - 다발성 경화증 진단 및 치료를 위한 수단 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 가지는 환자의 시료에 포함된 항-KIR4,1 항체와 결합하는, 서열번호 3의 서열로 이루어지지 않으나, 서열번호 3에서 적어도 8개의 연이은 아미노산 잔기로 이루어지거나 이를 포함하며, 바람직하게는 (i) 상기 연이은 적어도 8개의 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2로 이루어지는 KIR4.1의 세포 외 도메인 이후에 존재하고; 또는 (ii) 상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하거나 이루어졌다. 본 발명은 더욱이 시료에 항-KIR4.1 항체가 존재하는 것이 다발성 경화증 또는 다발성 경화증에 대한 소인을 나타내는 것을 특징으로 하는, 개체 유래 시료에서 항-KIR4.1 항체의 존재를 측정하는 것을 포함하는 개체에서 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 다발성 경화증에 대한 소인(predisposition)을 진단하는 방법이다. 또한 다발성 경화증을 치료하기 위한 새로운 수단 및 방법을 제공한다.

Description

다발성 경화증 진단 및 치료를 위한 수단 및 방법{Means and methods for diagnosing and treating multiple sclerosis}
본 발명은　서열번호　3에 있는 적어도　8개의 아미노산을 포함하거나 이루어진 펩티드 또는 대응하는 펩티도미메틱(peptidomimetic)에 관한 것으로, 상기 펩티드는　서열번호 3의 서열로 이루어지지 않을 수 있고, 또는 환자 유래 시료를 포함하는 항-KIR4.1 항체와 결합하는 상기 펩티드 또는 펩티도미메틱이고, 상기 환자는 다발성 경화증 또는 이의 소인을 가지며, 이때,　(i) 상기 연이은 적어도 8개의 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2로 이루어지는 KIR4.1의 세포 외 도메인 이후에 존재하고; 또는 (ii) 상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하거나 이루어진다. 본 발명은 개체에서 다발성 경화증 또는 다발성 경화증에 대한 소인을 진단하는 방법과 더욱 관련이 있고, 상기 개체에서 유래한 시료에서 항 KIR4.1 항체의 존재를 측정하는 것을 포함하는 방법이며, 상기 시료에서 항 KIR4.1 항체의 존재는 다발성 경화증 또는 다발성 경화증에 대한 소인을 표시하는 것이다.
본 명세서에서, 특허 출원 및 제조사의 매뉴얼을 포함하는 많은 수의 문헌들을 인용했다.　본 발명의 특허성과 관련성 없다고 여겨지는 문헌들의 개시는 이를 인용함으로써 그 전체로 포함시켰다. 더욱 구체적으로, 모든 참고 문헌들은 개개의 문헌이 참고문헌으로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것처럼 참고 문헌으로 포함된다.
다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)은 다수의 감염환자들에게 장애를 일으키는 가장 흔한 중추신경계 만성염증질환이다(1).　다발성 경화증의 원인은 잘 알려져 있지 않으나 역학적 증거는 유전과 환경적인 요인의 복잡한 상호작용하는 것으로 알려져 있다(2-4).　개개인의 환자마다 나타나는 임상적인 이질성과 예측불가능성으로 병리학적 메커니즘이 밝혀지지 않아 질환의 복잡성을 가중시키고 있다(5).
MS　병원성에 대한 현재 논의되고 있는 가설은　T-cell의 자가면역 반응이 주요역할을 한다는 점이다(6).　그러나 조직병리학적　(histopathological)　연구들은　MS　환자들 일부만이　이뮤노글루빈(immunoglobin)이 현저히 침적되고 급성탈수병변에서　보체 활성이 나타났다(7,8).　이들 환자들은 특히 혈장교환술(therapautic plasma exchange)에 잘 반응하였다(9).　게다가 단일클론항체생성에 의한 B 세포의 침적은　MS의 염증반응에 중대한 작용을 하였다(10).　이러한 발견들은 적어도　MS 환자들의 일부는　B 세포와 항체들이 상당히 이병의 발병과 진행에 영향을 미친다는 것을 의미한다(11,12).　이러한 정황들에도 불구하고, MS의 체액반응에 관여하는 구체적인 분자 타켓이 밝혀지지 않았기 때문에,　여전히　MS 항체와 임상적으로 관련이 있는 직접적인 증거를 밝히지 못하고 있다.
기술적인 문제는 대체되거나 향상된 진단방법과 다발경화성 치료법에서 찾을 수 있다.
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도 1은 CNS 세포막 항원으로써 MS 혈청 IgG 반응성을 나타낸다.
(a)는 MS 또는 OND 환자로부터 혈청 IgG로 쥐 소뇌 (윗쪽의 패널) 및 인간 뇌 섹션 (아래쪽의 패널) 면역형광 표지의 대표 현미경사진을 나타낸다. 기준자 100 ㎛ (위쪽의 패널) 및 20 ㎛ (아래쪽의 패널)을 나타낸다.
(b)는 쥐 뇌 조직으로부터 준비된 막 단백질 분획의 ELISA 분석 캡쳐. MS 및 OND 환자에서 혈청 반응성을 나타낸다(OD, 광학 밀도).
도 2는 MS에서 혈청 IgG의 타겟으로써 KIR4.1 식별을 나타낸다.
(a)는 인간 뇌 용해물의 1차원 SDS 겔 전기영동 (왼쪽)은 OND 또는 MS 환자로부터 혼주(pooled) IgG로 침전되었다. 특별한 밴드(세 번째 라임) 상하로 IgG 중쇄 밴드(화살표)는 MS 환자로부터 정제된 혼주 혈청 IgG로 면역형광법 후에 획득하였다. 뇌 항원의 2차원 전기영동 (오른쪽)은 MS 환자로부터 혈청 IgG로 면역형광법 후에 획득하였다. MALDI-MS/MS 분석에 의해 식별된 KIR4.1 단백질을 포함하는 스팟은 프레임으로 표시하였다. 화살표는 IgG 중쇄 스팟으로 표시하였다.
(b)는 웨스턴 블랏 분석에 의한 KIR4.1 검출은 나타나 있는 것처럼 다양하게 면역침강반응을 하였다. 면역침강법은 랫트 신장 및 인간 뇌 용해물 각각의 풍부한 세포 막 단백질 분획에서 OND 및 MS 환자에서 유래한 혈청 IgG로 확인하였다.
(c)는 인비트로로 번역된 KIR4.1의 면역침전물에서 KIR4.1와 OND 또는 MS 환자에서 유래한 IgG로 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다.
도 3은 MS에서 혈청 IgG의 타겟으로써 KIR4.1의 동정을 나타낸다.
(a)는 이중 면역형광 표지는 쥐 소뇌 섹션에서 단일 클론 항-KIR4.1로 MS 환자로부터 유래한 혈청 IgG의 동일 위치를 나타냄. OND 환자의 혈청 염색은 대조군으로 나타낸다. 기준자는 200 ㎛를 나타낸다.
(b)는 MS 환자에서 유래한 정제 혈청 IgG으로 야생형 소뇌 부분 (외쪽 패널) 및 Kir4.1-/- 쥐 (오른쪽 패널) 면역 형광 표지를 나타낸다. 기준자는 100 ㎛ (위쪽 패널) and 알제리50 ㎛ (아래쪽 패널) 나타낸다.
(c)는 쥐 첫 번째 별아교세포 배양의 이중 면역 형광 염색을 나태낸다. OND 혈청 IgG (위쪽 패널) 및 MS 혈청 IgG (아래쪽 패널)의 염색은 녹색 채널로 검출하였다. 추가적으로 GFAP 염색은 (오른쪽 패널) 빨간색 채널로 검출하였다.
(d)는 MS 및 OND 환자에서 유래한 쥐 성상세포와 MS 및 OND 환자의 혈청과의 염색 및 유동 혈구 계산 분석을 나타낸다.
도 4는 MS 환자의 부분집합에서 KIR4.1에 대한 고농도 혈청 반응성을 나타낸다.
(a)는 스크리닝에 기반을 둔 단백질은 항-KIR4.1 혈청 반응성을 위해 접근하였다. HEK293 세포에서 정제한 재조합 KIR4.1 은 ELISA 플레이트의 고체상에서 공유겹합 하였다. KIR4.1에 결합하는 혈청 항체는 HD, OND 및 MS 환자에 알아내었다. 항체 양성 및 항체 음성 혈청의 빈도는 HD (n=14), OND (n=71) 및 MS (n=122) 환자들 사이에서 클루스컬-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test)으로 비교하였다. 항-KIR4.1 항체 양성 (절단값 OD 0.866, 환자의 중간값보다 위에 5명 SD)의 한계점은 수평 점선으로 표시하였다.
(b)는 ROC 커브는 두개의 독립적인 MS 및 OND 환자 그룹에서 항-KIR4.1 항체 ELISA 분석의 진단 수행도를 나타낸다. 실험 집단(실선)은 (a)에 나타난 집단과 일치한다. 132명 OND 및 147명 MS 환자로 이루어진 유효 집단(파선). 아래 영역은 ROC 커브 (AUC), 실험 집단: 0.76 (95% CI: 0.69-0.81), 유효 집단: 0.82 (95% CI: 0.76-0.87).
(c)는 2 차원 uniprot database (http://www.uniprot.org/uniprot/P78508)로 부터 서열 어노테이션(annotation)을 기초로한 KIR4.1 단백질의 2차원 그래픽 도면. 크고 작은 세포 외 루프는 각각 빨강 및 노랑으로 강조한다.
(d)는 KIR4.1의 첫 번째 세포 외 루프를 포함하는 펩타이드 KIR4.183-120가 결합된 플레이트로 ELISA 분석을 나타낸다. KIR4.183-120에 대항하는 혈청 반응성은 실험 집단의 HD, OND 환자, 및 MS 환자에서 밝혔다((a) 참조). 항체 양성 및 음성 혈청은 클루스컬-왈리스 검정으로 HD, OND, 및 MS 환자를 사이에서 비교한다. 항-KIR4.1 항체 양성 (절단값 OD 0.7558, 환자의 중간값보다 위에 5명 SD)의 한계점은 수평 파선으로 표시한다.
도 5는 KIR4.1-특이적 MS 혈청 IgG 항체는 세포 외 루프 또는 KIR4.1 (KIR4.183-120)에 특이적이다.
(a)는 His-태그된 재조합 KIR4.1 정제된 전체 길이에 대비하여 KIR4.183-120 (첫 번째 세포 외 루프) 또는 KIR4.1356-375 (c-터미널 도메인)에 의해 항-KIR4.1 혈청 IgG 친화성 정제의 경합 결합을 나타낸다. 항-KIR4.1 혈청 IgG는 ELISA 플레이트에서 고정 시킨 다음 His-태그된 재조합 KIR4.1 단백질의 고정 농도 (150 nM)에 있어서 펩타이드 (농도 범위 0.045-150 nM)의 농도 증가를 위해 배양하였다. KIR4.1 단백질의 결합은 항-His 검출 항체로 확인하였다.
(b)는 MS 환자 (n = 122)의 시료에서 항-KIR4.1 혈청 반응성의 정량하기 위하여 KIR4.1 단백질 또는 KIR4.183-120 펩타이드를 기반으로 하여 ELISA분석 상관관계를 나타낸다.
(c)는 세포의 경합결합측정법에 기반하였다. KIR4.1 발현한 HEK293 세포는 대조군 부재(왼쪽)이거나 KIR4.183-120 (중간) 또는 KIR4.1356-375 (오른쪽)가 존재하는 MS 혈청 IgG로 면역 표지하였다. 대표 현미경 사진을 나타낸다.
도 6의 (a)는 면역 형광법 표지는 P10 마우스 소뇌 섹tus을 나타낸다. MS 혈청 IgG (왼쪽 패널) 및 항-GFAP 항체(오른쪽 패널)로 염색하였다. 기준자는 50 ㎛을 나타낸다..
(b)는 혈관 주위의 염색 패턴은 인간 피층의 섹션에서 MS 혈청 IgG (왼쪽 패널) 및 항-GFAP 항체 면역 표지 (오른쪽 패널)로써 얻었다. 프레임은 더 낮은 패널에서 나타낸 고배율 부분을 나타낸다. 기준자는 100 ㎛ (위쪽 패널) 및 20 ㎛ (아래쪽 패널)을 나타낸다.
도 7은 KIR4.1-특이적 MS 혈청 IgG 항체는 생체 내에서 KIR4.1 발현 손실, GFAP 필라멘트(filament) 구조 파괴 및 보체 활성화 유도한다.
PBS (첫 번째 줄), KIR4.1-특이적 항체 반응성이 감소된 MS 환자 혈청 IgG(두 번째 줄), 또는 항-KIR4.1 활성화 (세 번째 및 네 번째 줄) 가 보존된 혈청 IgG는 인간 보체와 함께 C57BL/6 쥐의 큰수조(cisterna magna)에 주입하였다. 주입 한지 24가 후에 쥐는 죽이고 뇌 조직은 면역조직화학법에 의해 GFAP (왼쪽), KIR4.1 (가운데) 및 C9neo 반응성 (오른쪽)을 확인하였다. 기준자는 50 ㎛ 및 20 ㎛ (아래 패널)을 나타낸다.
도 8의 (a)는 KIR4.1 발현 컨스트럭트 [PcDNA3.1(+)/KIR4.1]가 감염된 HEK293 세포로부터 유래한 His-태그된 KIR4.1 단백질의 정제를 나타낸다. 라인 1: HEK293 용해물; 라인 2: 통과액; 라인 3-5: 세척 분획물; 라인 6-8: 용출 분획물.
(b)는 환자의 혈청 IgG로부터 항-KIR4.1 반응성의 감소를 나타낸다. 라인 1: HEK293 세포 용해물이 거짓으로 감염되어 믹스된 비드 및 라인 2: HEK293 세포 용해물이 감염된 PcDNA3.1 (+)/KIR4.1로 믹스된 비드. 이 비드들은 목(mock) 전흡수(preabsorption) 및 전흡수 컬럼으로 만드는데 각각 사용하였다. 오른쪽에 면역 블랏은 비드-결합 KIR4.1에 기반한 전흡수 컬럼으로 포획한 혈청 IgG를 보여주었다.
(c) 목(mock) 전흡수(preabsorption) 및 전흡수 컬럼을 통과한 비-농축물은 정제된 재조합 KIR4.1 ELISA로 KIR4.1 반응성을 조사하였다.
본 발명의 첫 번째 측면에서 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 그에 대한 소인(predisposition)을 가지는 환자의 시료에 포함된 항-KIR4,1 항체와 결합하는, 서열번호 3의 서열로 이루어지지 않으나, 서열번호 3에서 적어도 8개의 연이은 아미노산 잔기로 이루어지거나 이를 포함하며, 바람직하게는 (i) 상기 연이은 적어도 8개의 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2로 이루어지는 KIR4.1의 세포 외 도메인 이후에 존재하고; 또는 (ii) 상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하거나 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 이의 펩티도미메틱(peptidomimetic)을 제공한다. 따라서, (i)과　(ii)에 따른 펩티드에 대응하는　펩티도미메틱이 바람직하다.　또한 상기 펩티드는　서열번호 3의 서열을 포함하지 않는 펩타이드가 바람직하다.
“KIR 4.1”은 세포 내 미세한 칼슘 채널의 속칭이다. 바람직하게, KIR 4.1는 인간 유래이다. KIR 4.1의 서열은 서열번호 3으로 제공한다. "인간 KIR4.1 단백질의 서열" 및 "서열번호 3의 서열" 용어는 일맥상통한다.
나열된 항-KIR.4.1 항체는 또한 "자가면역항체"로 불린다. 상기 자가면역항체는 자연적으로 생겨난 항체로 lgG 항체로도 불린다. 특히, 다발성 경화증 환자에게서 생겨나는 항-KIR4.1 항체 같은 자가면역항체는 개체에서 발견되지 않는 MS 환자나 항-KIR 4.1 항체뿐만 아니라 치료목적으로 사용되는 다른 항체들과는 다르게 다발성 경화증을 진전시키는 경향을 보인다. 뒤에 언급된 항-KIR 4.1 항체의 경우 자연적으로 발생하거나 병을 발전시키진 않는다. 자가면역항체는 특히 KIR 4.1의 세포 외 도메인에 결합하며, 서열번호 1 또는 2의 서열로 이루어진 세포 외 영역에 결합한다. 바람직하게는 상기 자가면역항체는 서열번호 1의 서열로 이루어진 세포 외 영역에 결합한다.
바람직한 서열번호 1 및 2의 서열들의 부분서열은 각각 서열번호 4와 서열번호 5이다. 서열번호 4 및 서열번호 5은 단백질 세포 외에 있는 것으로 예측하였다. 그러므로 이는 서열번호 4 및 서열번호 5의 서열을 포함하거나 이루어진 펩티드가 바람직하다. 펩티도미메틱과 대응하는 펩티드 말단은 임의적으로 예상하였다.
서열번호 1, 2, 4 또는 5번 중의 어느 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 서열을 갖는 펩티드가 바람직하며, 더 나아가 펩티드 서열을 예상하였고, 상기 펩티드 서열은 서열번호 1, 2, 4 및 5의 어느 하나의 서열을 가지는 단지 부분 또는 전체적으로 겹치지 않는 것일 수 있다. 좀더 설명하면, 통상의 기술분야에서 알려진, T-세포와 B-세포는 주어진 항원 내에 서로 다른 항원결정부(epitope)를 가질 수 있다.
상기 용어 "펩티드"는 아미노산의 중축합체(polycondensate)이다. 바람직하게, 자연적으로 발생하는 20가지의 아미노산에서 만들어진다. 본 발명에 따른 펩티드는 적어도 8개의 아미노산의 잔기의 길이를 가진다. 바람직한 펩티드 길이의 상한선은 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10 또는 9개의 아미노산 잔기 및, 뭉쳐있는 형태이고, 폭의 경우 특별히 아미노산의 길이나 상한선이 없다. 바람직하게, 상기 펩티드의 길이가 정해진다는 건 특별한 것이다. 하기 자세한 설명에서, 특정 길이의 펩티드는 MHC 분자에 붙을 수 있는 능력을 가지고 있다. 특히, MHC Ⅰ 분자는 일반적으로 거기에 붙을 수 있는 펩티드의 크기가 제한적이라는 것으로 알려져 있다. 바람직한 길이나 길이 범위는 8~12, 8~10 또는 가장 많이는 9개의 아미노산이 붙은 것이 바람직하다. MHC Ⅱ 분자는 반면에 일반적으로 긴 길이의 펩티드에 붙을 수 있는 능력을 가지고 있어 펩티드의 길이에 상한선은 없다.
상기 용어 "펩티도미메틱"는 통상의 기술로 잘 알려져 있다. 상기 펩티드의 파생물로써 다음에서 기술한 바와 같이 구조적 용어로 정의한다. "대응하는 펩티도미메틱"이란 상기 항체에 붙은 펩티도미메틱을 일컫는다. 이러한 결합(binding)은 항체에 붙은 모(parent) 펩티드나 파생된 펩티드의 각각의 연속적인 아미노산의 구조적인 특성에 따라 달라진다. 바람직한 실시태양에서, 상기 적어도 8개의 아미노산 잔기들 각각의 곁 사슬(side chain)들은 상기 대응하는 펩티도미메틱이 변형되거나 비변형된 형태를 보유한다. 곁 사슬 변형은 하나 또는 하나 이상의 수소원자와 할로겐 원자, 특히 F 원자와 대체되는 것을 포함한다. 또 다른 곁 사슬 변형은 고리화 반응(cyclisations)이다. 고리화 반응은 하나 또는 하나 이상의 펩티드 결합이 아이서스테릭(isosteric)한 기능기(fuctional group)로 대체되는 것을 말한다. 바람직하게, 펩타이드 결합 -CO-NH-는 -NH-CO-, -CH-(OH)-CH2-, -CO-CH2-, -CH2-NH-, -CH2-O-, -CH2-CH2-, -CH=CH-, -CO-N(CH3)- 중의 하나로 대체되며, PO2-X-의 경우 X 는 NH, O 및 CH2 중에서 선택되어 지는 것이 바람직하다. 예를 들어 대응하는 펩티도미메틱의 경우, 모(parent) 펩티드의 모든 펩티드 결합은 레트로-인벌소(retro-inverso) 결합 (-NH-CO-)으로 대체될 수 있다.
모(parent) 펩티드에서 실질적으로 변하지 않는 속성은 본 발명의 펩티도미메틱에 내제되어 있다. 특히, 대응하는 펩티도미메틱은 다발성 경화증 환자의 시료에 포함된 항-KIR4.1 항체와 결합한다. 이러한 결합은 하기에 기술한 수단 및 방법을 통해 알아낼 수 있다.
본 발명의 첫 번째 측면은 하나의 펩티드, 바꾸어 말하면 펩티도미메틱이다. 펩티드를 정의에 의해 서열번호 3의 서열로 이루어진 아미노산 서열을 청구하지 않았다. 다시 말하면, 첫 번째 측면에서는 (a)　서열번호 3의 서열에 있는 적어도　8개의 아미노산으로 이루어지거나 이를 포함하며, 또는 (b)대응하는 펩티도미메틱, 상기 펩티드 또는 펩티도미메틱는 환자의 시료에 포함된 항-KIR4.1과 결합하며, 상기 환자는 다발성 경화증 또는 이의 소인을 가지고, 상기 바람직하게, (i) 상기 연이은 적어도 8개의 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2의 서열로 이루어진 KIR4.1의 세포 외 도메인 이후에 존재하고; 또는 (ii) 상기 펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하거나 이루어진다.
상기 펩티드 또는 펩티도미메틱은 다발성 경화증 환자나 MS가 진행되는 개체의 시료에 포함된 항-KIR4.1 항체에 결합한다. 하기에 자세히 기술한 바대로, 본 발명은 MS 환자들이 항-KIR4.1 자가 항체를 가지고 있는지의 여부뿐만 아니라 MS 환자들에게서 항체를 분리하는 다양한 수단 및 방법들을 제공한다. 상기 수단은 일반적으로 "수용체" 같은 제제들을 포함한다. 자가면역항체를 분리동정하는 방법은 항-KIR4.1 항체를 가진 개체에서 채취한 시료에 있는 수용체에 결합하는 일련의 과정들을 포함한다. MS 환자에게서 얻은 항-KIR4.1 항체를 이용하는 것은 통상의 기술자이라면 별다른 어려움 없이 펩티드가 KIR 4.1의 적어도 8개의 연속적인 아미노산을 포함하거나 이루어져 있는지의 여부 또는, 항체에 결합을 수 있는 펩티도미메틱 인지 아닌지 여부를 알 수 있다. 바람직한 방법은 능숙한 사람이 ELISA 검정법을 이용하는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 주요한 실시태양에 따른 펩티드나 펩티도미메틱가 담체에 고정화하고, MS 환자나 MS 소인을 보이는 개체으로부터 자가면역 항체에게서 얻은 자가면역항체는 펩티드 또는 펩티도미메틱에 결합하는 능력을 가진다. 그리고 이러한 결합은 효소와 연결된 2차 항체를 통해 확인할 수 있다. 상기 2차 항체는 예를 들어 Fc 단편 및 자가면역항체의 Fc 부분에 결합할 수 있는 성질을 가진 항체를 말한다.
상기와 관련하여, 본 발명은 나아가 다발성 경화증 환자나 MS의 진행을 보이는 소인을 가진 개체에서 얻은 항-KIR4.1 항체를 제공한다. 이것은 상기에서 정의한 자가면역항체이다.
상기의 실시예의 좀 더 구체적인 설명으로써, KIR 4.1 세포에는 적어도 두 개의 세포 외 도메인 영역이 존재한다. 이 두 세포 외 도메인은 각각 큰 세포 외 도메인 및 작은 세포 외 도메인으로 불린다. 다발성 경화증을 나타내는 항-KIR4.1 항체는 특히 큰 세포 외 도메인에 잘 결합하나, 작은 세포 외 도메인이나 둘 다 결합하기도 한다. KIR4.1의 두 세포 외 도메인의 서열은 각각 서열번호 1 및 2로 제공된다. 그 외 세포 외 도메인은 각각 서열번호 4 및 5이다.
"다발성 경화증"이란 신경게에 영향을 미치는 염증질환을 말하며; 앞의 개요부분에서 이미 인용 문헌을 인용한 것을 통해 알 수 있다. 개체 또는 환자가 다발성 경화증을 보이는지 여부는 본 발명에 따른 진단법을 통해 알아낼 수 있으며, 본 발명의 두 번째 측면에서 좀더 상세히 기술하였다. 대안적으로 또는 더 나아가 다발성 경화증의 진단은 전문가들에 의해 이미 확립된 임상증상을 통해서도 알아낼 수 있다. 다발성 경화증의 임상학적 증상은 시력장애, 어지러움, 현기증, 감각기능장애, 체력저하, 설사, 어지러움(현기증), 조정(마음대로 자기 몸을 가눌 수 있는 능력)과 관련한 문제, 균형 손실, 피로, 고통, 신경인지적 결함, 정신적 결함, 방광기능 장애, 장기능 장애, 성기능 장애와 열 민감성 등을 포함한다.
환자 또는 개체에게서 수득한 시료에서의 항-KIR4.1 자가항체의 검출이 다발성 경화증 또는 이의 소인을 나타내나, 다발성 경화증 또는 이의 소인이 꼭 상기 자가 항체가 상기 개체 또는 환자 또는 이로부터 수득한 시료에 존재하는 것으로 특징지어진다고는 할 수 없음이 이해되어야 할 것이다.
따라서, 항-KIR4.1 항체의 존재는 MS 가 발병중인 환자들의 일부 그룹에 한해서라고 볼 수 있다. 유사하게, MS 환자들의 일부 그룹이 이와 같이 자가면역항체를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 다르게 말하면, 자가면역항체의 존재는 다발성 경화증 표시의 보조적-표지라고 볼 수 있다. 다발성 경화증의 보조적 표지로 알 수 있는 환자들의 경우, 자가면역항체를 가지지 않는 MS 환자들과 비교하여 치료에 다른 반응을 보인다. 자가면역항체를 가진 환자들이 갖는 위험부담 프로파일과 자가면역항체를 가지지 않은 환자들의 위험부담 측면은 차이가 있다. 결과적으로, 예방적 치료법 뿐만 아니라 치료법의 차이도 환자가 자가면역항체를 가지고 있는지의 여부에 따라 달라지고, 각각의 개체 내 MS 진행 위험도에 따라서도 차이 나게 된다.
상기 용어 "서브 서열" 은 긴 서열에서 떨어져 나온 연속적인 아미노산 잔기들의 가닥을 말한다. 다시 말하면, 전체 서열이 n개의 잔기들로 이루어져있다면, 서브 서열의 최대 길이는 n-1개의 잔기들로 이루어진 길이까지일 수 있다.
본 발명은 더 나아가 상기에서 정의된 본 발명에 따른 펩티드의 코딩된 핵산까지 정보를 제공한다. 핵산은 아마도 cDNA같은 DNA이거나 게놈 DNA 혹은 RNA일 수 있다. 추가적으로 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 게다가 본 발명은 본 발명에 따른 벡터 및/또는 핵산과 벡터를 포함하는 숙주 세포와 관련 있다. 숙주 세포는 인의의 유래일 수 있고, 특히 분리 또는 배양과 같은 인비트로인 것이 바람직하다. 당업자의 처리에 의해 인간배아줄기세포 라인에서 얻어질 수 있다고 알려져 있으나, 인간배아를 파괴하거나 이용해서는 얻어질 수 없다. 또한 더 바람직하게는 숙주 세포는 인간 유래가 아닌 배아 세포 또는 배아 줄기 세포인 것이 바람직하다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 개체에서 다발성 경화증 또는 다발성 경화증 소인을 진단하는 방법을 제공하고, 상기 개체에서 획득한 시료에서 항 KIR4.1 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법이며, 상기 시료에서 항 KIR4.1 항체의 존재는 다발성 경화증이 발병했거나 다발성 경화증에 대한 소인을 보임을 나타내는 것이다.
상기 방법은 다발성 경화증을 진단할 수 있도록 해주거나 개체에서 명확하진 않지만 그 이의 소인을 진단할 수 있도록 해준다. "소인"이란 당업계에서 성립한 의미를 갖고 및 병 진행되기 쉬운 것이 바람직하다. 특히, 상기 진행되기 쉬운 것은 정상 대조군 개체에서 보다 더 높다. 상기 진행되기 쉬운 것은 정상 대조군 개체에서 무작위로 선택된 랜덤 시료에서의 평균 수치로 나타낼 수 있다.
항-KIR4.1 항체의 존재를 알아내기 위한 적당한 제제는 하기에 서술하였고, 특히 진단 조성물 및 진단 용도를 밝히기 위한 관련된 활성제일 수 있다.
상기 소인의 실험하기 위한 각각의 바람직한 그룹은 MS가 발병된 가족력이 있는 참가자들이다.
본 발명자는 다발성 경화증에 자가면역반응을 보이는 분자 타겟을 동정한 최초의 발명이다. MS 내 자가면역항체들을 밝혀내는 기존의 방식들은 대다수가 면역글로불린의 혈청학적 스크리닝에 중점을 두었는데, 이는 수초 생물학이나 동물모델에서 뇌염 유발성을 가진 기능에 초점을 두고 미리 타겟 분자 후보를 선발하는 방식이었다(13). 또한 E.coli 발현에서, 파지 디스플레이(phage display) 및 펩티드 라라이브러리(libraries)는 MS 특정 항체의 선형 타켓을 동정하기 위해 스크리닝 되어졌다.(14-17). MS-특이적이거나 예측할 수 있는 어느 잠재적 타겟으로 확인할 수 있는 전략은 아니다(18-19).
본 발명자는 2가지 독립적인 실험을 통해 환자 혈청의 50.8%에서 항-KIR 4.1 항체의 최대치로 감지해냈다. 따라서, 본 발명의 수단 및 방법이 MS를 진단하거나MS 사례 중 절반 이상에서 MS 소인을 알아내는 게 가능할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 MS 또는 이에 대한 소인의 진단 또는 불확실한 진단의 확인을 가능하게 한다. 항체 시험은 (뇌척수액(cerebrospinal fluid) 분석과 같은) 침습적 처치(invasive procedures) 없이 CIS 또는 MS를 진단할 수 있도록 하며, MS, CIS 또는 MS의 소인을 통상의 기술분야의 진단 방법보다 더 빠르게 진단할 수 있도록 한다. "CIS"는 "임상적 분리 증후군(clinically isolated syndrome)"을 말하며, 이에 대하여는 하기에서 더 논의된다. 질병 과정 동안 가능한 빨리 치료가 시작되었을 때 가장 잘 작용하는 것이 자명하다. 따라서, 빠른 진단은 CIS, MS 또는 상기 질병들의 발달 위험이 있는 환자의 빠른 치료를 가능하게 해준다. 일부 개인에서의 위험 관리(risk treatment)는 질병의 발달 (또한)을 방지할 수도 있다.
본 발명의 예시에서 나타난 것처럼, 자가면역항체는 항체 의존성 세포-매개성세포독성 (ADCC)나 보체 활성을 통해 신경교세포를 발현하는 KIR 4.1을 대폭 고갈시킨다(도 6). 게다가 이 항체는 칼륨 채널의 기능을 방해하여 이온 완충역할과 신경전달 물질의 항상성에 기능적인 손상을 유발한다(20,21,22). 이것은 조직 상처 또는 재수초(remyelination) 손상이 있는 결과일 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시태양에서, 항-KIR4.1 항체는 시료에서 발견되는 경우 (i) 적어도 하나의 다발성 경화증 증상이 있거나 이의 소인을 보이거나, (ii) 다발성 경화증의 임상학적 증상은 없지만 상기 발병 소인이 발견된 경우라고 볼 수 있다.
상기에서 기술한 바처럼, 본 발명은 다발성 경화증을 진단할 뿐만 아니라 이의 소인까지 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 병의 진단과 소인을 진단하는 추가적인 정보를 제공하고 있다. 특히, 상기 추가적인 정보는 다발성 경화증의 적어도 하나의 임상학적 증상을 포함하거나 이루어진다. 다발성 경화증은 특이적인 임상학적 증상으로 잘 알려진 병이다. 임상학적 증상을 잘 아는 당업자라면 다발성 경화증의 특징이나 징후(하기 내용 참조) 등을 추가적인 방법 없이도 알아낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따르면 다발성 경화증의 임상학적 증상의 부재는 항-KIR4.1 항체가 존재와 수반되어 일어나며 다발성 경화증의 발병 소인을 나타낸다. 다시 말하면, 기존의 진단법이나 예후가 실패 한데 반해, 본 발명은 앞으로 미래에 다발성 경화증의 증상과 고위험군을 알아내게 가능해질 것으로 판단된다.
반면에, 적어도 하나 이상의 임상학적 증상이 나타날 때, 항-KIR4.1 항체 측정은 다발성 경화증 진단을 임상학적 지표들은 명확한 진단법은 아니지만 본 발명은 입증할 수 있는 진단법이라고 볼 수 있다. 이는 다발성 경화증의 초기에도 응용할 수 있다. 통상적 기술에 따라서, 초기 단계에서 보통 치료하는 것이 낫다면 다발성 경화증의 초기의 증상을 진단하는 것은 매우 바람직하다.
더 바람직한 실시태양에 따르면, 다발성 경화증의 임상학적 증상은 시력장애, 어지러움, 현기증, 감각기능장애, 체력저하, 설사, 어지러움(현기증), 조정(마음대로 자기 몸을 가눌 수 있는 능력)과 관련한 문제, 균형 손실, 피로, 고통, 신경인지적 결함, 정신적 결함, 방광기능 장애, 장기능 장애, 성기능 장애와 열 민감성, 뇌척수액(CSF)에서 염증표지, 뇌/척수에 병변 등 중에 하나 이상을 포함한다. 병변(lesion)의 경우 MRT 촬영을 통해 감지할 수 있다. 전형적으로 뇌의 뇌실, 피질, 척막 부분에 병변이 나타난다. MS의 염증 표지는 이미 잘 알려져 있으며, 특히 다구증 (pleocytosis)(CEF에서 비정상적으로 세포의 수가 증가하는 것으로 증가된 세포수가 ㎕ 당 5 ~ 50 세포 또는 그 이상 증가한 경우를 말함), 척추 강 내의 lgG 합성과 CSF에 올리고클론(oligoclonal) IgG 밴드가 발생할 때 나타나게 된다.
추가적인 바람직한 실시태양에 따르면, 상기 개체는 임상적 분리 증후군(clinically isolated syndrome)을 가지거나, 상기 임상적 증상 중 적어도 하나가 CIS이다. CIS는 통상의 기술분야에서 일반적으로 MS의 초기 단계로 인지된다. 상기에서 후자의 특징인 임상 매개변수(clinical parameters)는 아직 완전히 개발되지 않았다. CIS의 논의를 위하여, 예를 들어, Thrower, Neurology 68, S12-S15 (2007)를 참조하라. 본 발명에 따른 수단 및 방법은 CIS를 가진 환자들에 대한 추가적인 단서를 수집하는데 유용하다.
추가적인 바람직한 실시태양에 따르면, 상기 항-KIR4.1 항체, 즉, MS 발달 위험이 있는 개체와 같은 MIS 환자에서 존재할 수 있는 항-KIR4.1 항체는 KIR4.1 (서열번호 3) 또는 서열번호 1, 2, 4 또는 5 중 어느 하나의 서열을 포함하는 KIR4.1의 세포 외 도메인에 결합한다. KIR4.1의 구조는 본 명세서에 기재된 실시예에서 더 기술된다. 특히, KIR4.1은 막전위 스패닝 부위(transmembrane spanning segment)로 분리되었음직한 (적어도) 두 세포 외 도메인을 포함한다; 도 4c 참조. 또한, 여기에서 두 세포 외 도메인은 큰 세포 외 도메인 및 작은 세포 외 도메인을 나타내며, 이들은 서열번호 1 및 2이다. 도 4c에 나타낸 잔기 범위는 각각 서열번호 4 및 5이다.
추가적인 실시예에서, 상기 시료에서의 항-KIR4.1 항체의 검출은 ELISA, 면역침강법(immunoprecipitation), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역형광법(immunofluorescence), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 유세포분석법(flow cytometry), (GLORIA와 같은) 금속면역분석법(metalloimmunoassay), 형광 공명 에너지 변화(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석법 및 질량분석법(mass spectroscopy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 가능하다. 상기 방법들은 기초가 확실하며 통상의 기술자들에게 자명하다. 예를 들어, ELISA 분석에서, 항-KIR4.1 항체에 결합된 항체가 사용될 수 있다. 유사한 고려 사항이 면역침강법, 웨스턴 블로팅, 면역형광법 및 면역조직화학법에 적용될 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 표지가 제공될 때, 통상의 기술자는 항-KIR4.1 항체를 지체 없이 분리하고 특정(characterization)할 수 있다. 이러한 동정은 질량 분석법을 이용하는 것이 바람직하다. 동정이 되면, 질량 분석법은 주어진 시료에서 항-KIR4.1 항체의 유무를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, FRET 분석이 결합 분석(binding assay)에 사용될 수 있으며, 상기 결합 분석은 하기에서 정의된 수용체를 활용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 FRET 분석은 마치 FRET의 공여자 및 수여자 쌍 사이의 검출 가능한 이동(transfer) 이 수용체 및 항-KIR4.1 항체가 근접한 경우에만 발생하는 것과 같이 설계될 수 있으며, 상기 근접은 항-KIR4.1 항체의 존재를 나타낸다.
추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 항-KIR4.1 항체의 존재는 (a) 시료와 상기 항-KIR4.1 항체와 결합하는 수용체의 접촉; 및 (b) 수용체-항-KIR4.1 항체 복합체의 형성에 의해 검출되며, 상기 수용체는 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩티도미메틱, KIR4.1 단백질 (서열번호 3) 및 상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 하기에서 추가로 기재된 바와 같이, (항체를 포함한) 항원에 대한 항체를 제조하는 수단 및 방법은 통상의 기술자에게 자명한다.
종래의 바람직한 실시태양이 다양한 해독 방식을 제공하는 것에 반해, 본 발명의 바람직한 실시태양은 항-KIR4.1 항체의 검출에 효과적인 구조적인 용어로 규정된 구체적인 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명에 기재된 다른 실시태양들처럼 이런 바람직한 실시태양은 별도의 기재가 없는 한 본 발명에 따른 추가적인 실시태양의 대상인 조합일 수 있다. 바람직한 분석에서, KIR4.1 단백질은 세포에서 발현되며, 상기 세포는 혈청과 함께 배양되고, 자가항체와 KIR4.1 단백질의 결합은 유세포분석법 또는 이차 항체를 이용한 면역조직화학법에 의해 검출된다. 상술한 바와 같이, 상기 이차 항체는 상기 자가 항체에, 예를 들어, 이의 FC 부분에 결합하여 결합하는 것이 바람직하다. 추가적인 바람직한 분석법들은 별첨된 실시예에 기재하였다.
상기 기재된 수용체의 바람직한 실시태양은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩티도미메틱 및 상기 항-KIR4.1 항체와 결합하는 항체이다. 각 경우에, 상기 수용체는 상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 것이 더욱 바람직하다. 특이성은 비교 또는 대조검정을 통해 확인할 수 있고, 상기 항-KIR4.1 항체의 수용체의 결합은 다른 단백질이 단백질이나 항체와의 결합을 통해서 확인할 수 있다. 바람직하게, 자가면역항체 수용체의 결합 상수(Kd)는 적어도 규모의 하나의 정도, 보다 바람직하게는 다른 단백질로 실험한 더 낮은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6까지의 범위이다. 어느 수치에서 10배까지의 범위이다.
본 발명에 기재된 치료 또는 진단용 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있다. 또한, 본 발명에 기재된 바와 같이 진단 및 치료용 항체의 맥락에서, 상기 용어 "항체"는 이의 화학적으로 변형된 유도체뿐만 아니라 이중특이성 항체(bispecific antibodies), 합성된 항체(synthetic antibodies), Fab, F(ab2)' Fv 및 scFv 단편과 같은 항체 단편(antibody fragments) 처럼 각자의 표적에 특이적으로 결합하는 단쇄 항체(single chain antibodies) 또는 이의 단편 등등을 포함한다.
단일클론 항체가 변형된 기술, 예를 들어, koeler and Milstein, Nature 256 (1975), 495 및 Galfre Meth. Enzymol. 73 (1981), 3에 기재된 것과 같은 마우스 미엘로마 세포와 면역화된 포유동물로부터 유래한 췌장 세포의 융합을 포함하는 기술로 제조될 수 있다. 또한, 전술한 펩타이드에 대한 항체 또는 이의 단편이 예를 들어, Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988에 기재된 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 상기 항체들의 유도체가 파지 디스플레이 기술에 의해 얻어졌을 때, BIAcore 시스템에서 사용된 것과 같이 표면 플라스몬 공명이 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩티드의 에피톱에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다 (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 키메릭 항체의 생산은 예를 들어, WO89/09622에 기재된다. 본 발명에 따라 사용되는 항체의 추가적인 원천은 소위 외인성 항체이다. 인간 항체를 마우스에서 생산하는 것과 같은 외인성 항체를 생산하기 위한 일반적인 원리는 예를 들어, WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 및 WO 96/33735에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 항체 또는 이의 면역글로불린 체인(들)(chain(s))은 통상의 기술분야에 자명한 종래의 기술을 이용하여, 예를 들어, 아미노산 결실, 삽입, 치환, 첨가에 의해 추가적으로 변형, 및/또는 재조합 및/또는 통상의 기술분야에 자명한 다른 변형 단독으로 또는 조합으로 변형될 수 있다. 면역 글로불린 체인의 아미노산 서열의 원천인 DNA 서열에 이와 같은 변형을 도입하기 위한 방법은 통상의 기술분야의 기술자들에게 자명하다; 예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조.
또한, 상기 용어 "단일클론" 또는 "다중클론 항체" (Harlow and Lane, (1988), loc. cit. 참조)는 상기 항체의 결합 특이성을 유지하거나 필수적으로 유지하는 상기 항체의 유도체를 나타낸다. 상기 유도체의 특정 바람직한 실시태양이 하기에 더 명시된 반면, 항체와 같은 다른 바람직한 유도체들은 예를 들어, 마우스 또는 래트 가변영역(variable region) 및 인간 불변영역(constant region)을 포함하는 키메릭 항체(chimeric antibodies)이다.
상기 용어 "scFv단편" (단쇄 Fv 단편)은 통상의 기술분야에 자명하며 이의 작은 사이즈 및 단편 재조합 생산가능성 때문에 선호된다.
본 발명의 방법의 구체적인 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 항체 결합 부위는 인간 항체 또는 인간화 항체(humanized antibody)로부터 유래된다. 본 발명에 따른 상기 용어 "인간화 항체"는 CDR3 및 바람직하게는 모든 6CDRs와 같은 가변영역 내의 적어도 하나의 상보성 결정지역(complementarity determining region, CDR)이 원하는 특이성을 가지는 인간 유래 항체의 CDRs로 교체된 비-인간 항체를 의미한다. 선택적으로, 비-인간 항체의 불변 영역(들)은 인간 항체의 불변영역(들)과 교체된다. 인간화된 항체의 생산 방법은 예를 들어 EP-A1 0 239 400 및 WO90/07861에 기재되어 있다.
추가적인 바람직한 실시태양에서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프절, CSF, 누액, 소변, 담 및 뇌 검체로부터 선택된다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 정의된 수용체의 다발성 경화증 치료 또는 다발성 경화증 또는 이의 소인 진단 용도를 제공한다. KIR4.1 단백질 전체 (즉, 서열번호 3으로 이루어진 단백질)와 같이 본 발명에서 정의된 수용체는 의학적 용도가 있을 것으로 여겨진다. 순환되는 항-KIR4.1 항체 수를 감소시키기 위해 상기 제제들이 투여된다. 하기에 구체적으로 기재될 것과 같이, 상기 제제들은 MS로 고통받는 환자 또는 이의 소인을 가지는 것으로 의심되는 개체에게 투여되는 것뿐만 아니라, MS 환자, 더욱 구체적으로는 상기 환자 또는 MS 발달 위험이 있는 개체의 체액으로부터 자가항체를 제거하기 위해 제공되는 생체 외 방법으로도 사용될 수 있다.
상기 용어 "치료"는 요법(therapy)에 의한 치료를 말하며 질병 및/또는 이의 증상의 완전 완화(complete remission)와 같은 개선을 포함한다. 또한, 상기 용어 "치료"는 예방으로 확장된다.
본 발명에 따른 의학적 용도의 바람직한 실시태양에서, 하나 또는 그 이상의 명시된 제제는 오직 사용될 활성제일 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 명시적으로 기재된 하나 또는 그 이상의 제제는 MS 환자에게 이득이 되거나 MS의 진단에 도움이 되는 것으로 알려진 하나 또는 그 이상의 제제와 함께 사용될 수 있다. 현재까지, MS 진행은 방지되거나 완화되었고, 재발은 하나 또는 그 이상의 인터페론-베타(Interferon-beta), 글라티라머아세테이트(Glatirameracetate), 나탈리주맙(Natalizumab), 미톡산트론(Mitoxantrone), 핑고리모드(Fingolimod), 아자티오프린(Azathioprine) 투여에 의해 방지되었다. 재발은 고용량의 에틸프리드니솔론(Methlprednisolone) 및/또는 혈장 교환 치료(plasma exchange treatment)로 치료된다.
바람직한 실시태양에서, 상기 수용체는 환자로부터 얻은 혈액, 혈청, 혈장, 림프절, CSF, 척수액, 소변, 객담 및/또는 뇌 검체와 접촉된다. 본 실시태양은 진단에 이용될 바람직한 시료에 대한 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 추가적인 바람직한 실시태양에서, 상기 세 번째 측면이 치료에 관한한, 상기 수용체는 환자에게 적어도 2회 투여된다. 다회 투여는 자가항체를 많은 정도 제거하고, 바람직하게는 완전히 제거하여 결국 질병을 완화 또는 개선시킨다.
추가적인 바람직한 실시태양에서, 상기 펩타이드는 치료될 환자의 MHC 대립유전자(MHC allele)에 결합하는 것과 같은 것으로부터 선택될 수 있다. 상기 MHC 분자는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자일 수 있다. MHC 클래스 I과의 결합을 보장하기 위해, 상기 펩타이드는 8 내지 12, 바람직하게는 8 내지 10 및 가장 바람직하게는 9개의 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, MHC 결합에 관련된 것으로 알려진 앵커(anchor) 아미노산 잔기가 존재하는 것이 바람직하다. 서열번호: 1 및 2 내의 적합한 펩타이드 서열의 선택은 통상의 기술자에게 자명하다. 예를 들어, Rammensee et al. (Immunogenetics, 41: 178-228, 1995)은 MHC 결합 펩타이드의 앵커 아미노산을 포함하는 특성을 기재한다. MHC맥락에서의 상기 펩타이드의 존재는 MS의 치료 또는 예방에서의 추가적이거나 대체적인 메커니즘을 표적화하게 한다. 더욱 구체적으로, 이는 KIR4.1에 특이적인 T-세포를 세포사멸(apoptosis)하여, 내재적 KIR4.1 단백질에 대한 자가면역 반응을 감소 또는 멈추게 한다. 추가적인 바람직한 실시태양에서, 다발성 경화증의 치료용 MHC-펩타이드 복합체가 제공된다. 특히 바람직한 것은 MHC 테트라머(MHC tetramers)와 같은 MHC 다량체(multimers)를 이용하는 것이며, 상기에서 각각의 MHC 분자는 본 발명에 따라 결합된 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 가지는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 MHC 다량체 또는 테트라머의 모든 MHC 분자에 대해 동일하다. 통상의 기술분야에 자명하듯이, 테트라머 형성은 비오틴화된(biotinylated) MHC 분자를 이용하여 얻을 수 있다. MNC 분자의 카복실말단은 비오틴화의 타겟인 것이 바람직하다. 스트렙타비딘이 네 개의 비오틴 결합 부위를 가지기 때문에, 스트렙타비딘(streptavidin)과 인큐베이션하였을 때 테트라머가 형성된다. 이런 다량체 또는 테트라머는 항원-특이적인 T-세포 수용체에 특히 높은 친화도로 결합한다. 따라서, MHC 분자 결합된 펩타이드의 다량체, 바람직하게는 테트라머의 이용은 KIR4.1-특이적인 T-세포의 식별뿐만 아니라 불활성화를 허용한다.
나아가, 구체적인 이론에 근거하진 않지만, 펩티드나 펩티도미메틱의 투여는 이 질환에 관여하는 T-세포와 B-세포를 둔감시키는 작용을 할 것으로 추론된다. 여기서, 펩티드나 펩티도미메틱의 하나 또는 그 이상의 자리가 T-세포 수용체와 상호작용하는 자리인데, 펩티드나 펩티도미메틱의 T-세포 수용체를 미세조정 할 수 있게 변형시키는 것으로 파악된다. 이러한 자리와 변형에 대한 인식은 당업계에 널리 알려져 있다; 참조, 예를 들어 Kappos et al., Nature Med. 6, 1176-1182 (2000).
다시 말해서, 본 발명은 KIR 4.1에 저항성을 나타내는 수단 및 방법을 제공한다. 상기 용어 "저항성"은 통상의 기술분야에서 자명하고, 주어진 항원에 면역반응의 비활동성을 뜻한다. 전형적으로, 자가항원과 관련한 저항성이 있다. 자가항원에 대한 저항성 결여는, 자가면역항체가 자기면역질환이 생길 때 발생하는 것을 의미할 수도 있다. 본 발명에서 명백한 사실은, 다발성 경화증은 자가면역질환의 특징을 가진다는 점이다. KIR 4.1 단백질에 대항하는 자가면역항체의 발생을 줄이거나 없애는 것은 저항성을 유도하거나 경감시키는 방법들이 있을 수 있다. 예상되는 효과는 KIR 4.1에 대한 자가 저항성을 확립시키는 것이다. 저항성은 항원 의존적인 효과이기 때문에 B-세포나 T-세포 둘 다 존재할 수 있다. B-세포와 T-세포 저항성은 당업계에 널리 알려져있다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 항체에 결합하는 KIR4.1 (서열번호 3) 또는 다발성 경화증 치료에 사용되기 위한 KIR4.1 세포 외 도메인, 서열번호 1 또는 2로 이루어진 상기 도메인 및 환자의 시료에 포함된 항 KIR4.1 항체의 KIR4.1 결합을 방해하는 항체, 다발성 경화증 또는 소인을 가지는 환자를 제공한다.
바람직하게, 상기 항체와 KIR 4.1의 세포 외 도메인의 결합은 특이적이다. 특이적 항체를 결정하는 수단 및 방법은 통상의 지식을 가진자들에게 알려져 있고 상기에 기술되어있다. 보다 바람직하게 상기 항체는 에피토프(epitope)에 붙을 수 있는 능력을 가지고 있어 다른 자가면역항체들에게 인식되지 못한다. 여기에서, 에피토프 맵핑(mapping)하는 수단 및 방법은 통상의 지식을 가진자들에게 알려져 있다. 에피토프를 선택함으로써, 상기에서 언급한 기술적 요건, 예를 들면, 자가면역항체에 결합하는 것을 방해하는 것이 가능할 수 있다. 보다 바람직하게 치료 항체에 결합하는 것은 KIR 4.1의 생화학적 또는 세포적 기능을 유의적으로 방해하지 못한다. KIR4.1은 중추 신경계에서 수분 및 칼륨 이온의 항상성에 관여한다. KIR4.1의 기능을 유지하거나 재건하는 것은 뉴런 및 투명세포의 보호효과를 가져온다고 알려져 있다.
이러한 실시태양은 그것의 동족 타켓이나 병을 완화시키는 자기면역항체에 결합하여 방해하는 수단을 제공한다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 펩타이드, (ii) 상기에서 정의된 항-KIR4.1 항체에 결합하는 항체 (즉, 자가항체에 결합하는 항체), 및/또는 (iii) 앞선 실시태양의 항체, 즉, 자가항체와 그의 타겟의 결합을 방해하는 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 세가지 대조적인 타입의 항체에 관한 것이다. 첫째, KIR4.1의 세포 외 루프에 결합하는 자가항체(autoantibody)를 밝힌 것이다. MS 환자의 약 절반에서 대체로 MS의 원인이 되고 또는 이를 표시되는 항체이다. 두 번째, 본 발명은 자가항체에 결합할 수 있는 항체를 제공한다. 상기 두 번째 타입의 항체는 본 발명의 치료 및 진단의 목적에 적합하다. 마지막으로, 본 발명은 KIR4.1에 결합하여 동시에 자가항체와 그의 표적의 결합을 방해하는 항체를 제공한다. 후자의 항체는 본 발명에서 기재한 치료 목적에 적합하다.
본 발명에 따른 조성물의 바람직한 실시태양은 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함하는 약학적 조성물, 및, 상기 조성물이 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 항체와 연관되는 한, 진단 조성물이 관련된다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제, 및/또는 희석제는 통상의 기술자로부터 어려움 없이 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체는 완충액(buffered solution)과 같은 용액으로 제공될 수 있다.
완충액(Buffers)은 통상의 기술분야에서 자명하고, 통상의 기술자는 분석되는 물질 의존적인 적절한 완충액을 안다. 일반적인 완충액은 H3PO4 / NaH2PO4 (pKa ,1 = 2.12), 글리신(Glycine) (pKa ,1 = 2.34), 아세트산(Acetic acid) (4.75), 구연산(Citric acid) (4.76), MES (6.15), 카코딜산(Cacodylic acid) (6.27), H2CO3 / NaHCO3 (pKa ,1 = 6.37), Bis-Tris (6.50), ADA (6.60), Bis-Tris 프로판(Propane) (pKa,1 = 6.80), PIPES (6.80), ACES (6.90), 이미다졸(Imidazole) (7.00), BES (7.15), MOPS (7.20), NaH2PO4 / Na2HPO4 (pKa ,2 = 7.21), TES (7.50), HEPES (7.55), HEPPSO (7.80), 트리에탄올아민(Triethanolamine) (7.80), 트리신(Tricine) (8.10), 트리스(Tris) (8.10), 글리신 아마이드(Glycine amide) (8.20), 비신(Bicine) (8.35), 글리실글리신(Glycylglycine) (pKa ,2 = 8.40), TAPS (8.40), Bis-Tris 프로판 (pKa ,2 = 9.00), 붕산(Boric acid) (H3BO3 / Na2B4O7) (9.24), CHES (9.50), Glycine (pKa ,2 = 9.60), NaHCO3 / Na2CO3 (pKa ,2 = 10.25), CAPS (10.40)　 및 Na2HPO4 / Na3PO4 (pKa ,3 = 12.67)를 포함한다 (괄호 안은 pKa 값).
또한, 상기 완충액의 이온 강도(ionic strength)는 예를 들어, 염화나트륨(sodium chloride) 및/또는 염화칼륨(potassium chloride)의 첨가에 의해 조정될 수 있다. 염화나트륨의 농도는 0 내지 2 M, 바람직하게는 100 내지 200 mM이 바람직하다. 염화나트륨을 포함하는 완충액의 예는 pH 7.3로 맞춰진 10-배 수용성 스탁 용액에서 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 43 mM Na2HPO4 ·7H2O 및 14 mM KH2PO4를 함유하는 PBS(phosphate buffered saline); pH 7.0로 맞춰진 20-배 수용성 스탁 용액에서 3 M NaCl 및 0.3 M 구연산나트륨(sodium citrate)을 함유하는 SSC; 및 10 mM Tris base, 10 mM NaCl 및 1mM ETA (acid)를 함유하는 STE(Saline Tris EDTA)를 포함한다. 또는, 염화나트륨은 완충액 제조에서 제외된다. 나트륨 또는 칼륨이 없는 일반적인 완충액 제조에 대한 예는 pH 8.5에서 50-배 수용성 스탁 용액에서 2 M Tris 아세테이트(acetate) 및 0.1 M EDTA를 함유하는 TAE (Tris acetate EDTA); pH 8.0에서 10-배 수용성 스탁 용액에서 0.89 M Tris base, 0.89 M 붕산(Boric acid) 및 0.02 M EDTA를 함유하는 TBE (Tris borate EDTA); 및 pH 7.5에서 10 mM Tris base 및 1 mM EDTA (acid)를 함유하는 TE (Tris EDTA)이다.
본 발명에서 기재한 약학적 조성물은 개체에 적절한 용량으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 투여는 다른 방법으로, 예를 들어, 정맥으로(intravenous), 복강내로(intraperitoneal), 피하로(subcutaneous) 및 경피(transdermal) 투여로 이루어질 수 있다. 더욱 구체적으로, 약학적 조성물은 종래의 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 선택적으로 포함하는 단위 투약 제제로 경구(orally)로, 피하로, 정맥으로, 근육내로, 복강내로, 경막내로(intrathecally), 경피로, 경점막으로(transmucosally), 경막하로(subdurally), 비강으로(nasal), 국부적으로(locally) 또는 국소적으로(topically), 이온삼투법(iontopheresis)을 통해, 설하로(sublingually), 흡입 스프레이(inhalation spray)에 의해, 에어로졸(aerosol) 또는 직장으로(rectally) 및 기타 등등과 같이 비경구(parenterally)로 투여될 수 있다.
투약 방법(dosage regimen)은 주치의 및 임상의에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 잘 알려진 바와 같이, 어떤 환자에 대한 투여 용량은 환자의 사이즈, 체표면적(body surface area), 나이, 투여되어야 하는 특정 화합물, 성별, 투여 횟수 및 경로, 일반 건강(general health), 및 최근 투여되고 있는 다른 약물들을 포함하는 여러 제제에 달려있다.
비경구 투여를 위한 제제(Preparations)는 멸균 수용액 또는 비수성 용매, 현탁액(suspensions) 및 에멀전을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브유와 같은 식물성 오일(vegetable oils) 및 에틸 올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 유기 에스터(organic esters)이다. 수용성 담체는 물, 알콜성/수용성 용액, 식염수(saline) 및 완충된 배지(buffered media)를 포함하는 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 제형(vehicles)은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거(lactated Ringer's), 또는 고정화된 오일을 포함한다. 정맥 주사의 제형은 유동체(fluid) 및 영양 보충물, 전해 보충물(electrolyte replenishers) (링거 덱스트로스에 기초한 것) 및 기타 등등을 포함한다. 또한, 항미생물제(antimicrobials), 항산화제(anti-oxidants), 킬레이트제(chelating agents) 및 불활성 기체(inert gases) 및 기타 등과 같은 보존료(Preservatives) 및 다른 첨가물들이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에 기재된 약학적 조성물은 약학적 조성물의 사용처에 따라 제제를 추가로 포함할 수 있다.
제형에 이용될 수 있는 약학적으로 유용한 첨가제들은 담체, 비히클(vehicles), 희석제(diluents), 에탄올, 이소프로판올(isopropanol)과 같은 일가 알코올(monohydric alcohols) 및 글리콜(glycols)과 같은 다가알코올(polyhydric alcohols)과 같은 용매(solvents), 및 대두유(soybean oil), 코코넛유(coconut oil), 올리브유(olive oil), 해바라기유(safflower oil), 면실유(cottonseed oil), 에틸 올레이트(ethyl oleate), 이소프로필 미리스테이트(isopropyl myristate)와 같은 오일 에스터(oily esters)와 같은 섭취 가능한 오일(edible oils); 결합제(binders), 보조제(adjuvants), 용해제(solubilizers), 농화제(thickening agents), 안정제(stabilizers), 디스인터그란트(disintergrants), 활주제(glidants), 윤활제(lubricating agents), 완충제(buffering agents), 유화제(emulsifiers), 습윤제(wetting agents), 현탁제(suspending agents), 감미제(sweetening agents), 착색제(colourants), 향미제(flavours), 코팅제(coating agents), 보존료(preservatives), 항산화제(antioxidants), 가공제(processing agents), 인산 칼슘(calcium phosphate), 마그네슘 스테이트(magnesium state), 탈크(talc), 단당류(monosaccharides), 이당류(disaccharides), 탄수화물(starch), 젤라틴(gelatin), 셀룰로오스(cellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 소듐 카복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 덱스트로스(dextrose), 사이드록시프로필(hydroxypropyl)-β-사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴리바이닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 저융점 왁스(low melting waxes)와 같은 약물전달 개질제(drug delivery modifiers) 및 촉진제(enhancers), 및/또는 이온 교환 수지(ion exchange resins)를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 다른 적합한 첨가제는 Remington`s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991)에 기재되어 있다.
경구 투여를 위한 제형(Dosage forms)은 알약(tablets), 캡슐(capsules), 정제(lozenges), 환(pills), 웨이퍼(wafers), 과립(granules), 시럽과 같은 구강액(oral liquids), 현탁액, 용액, 에멀전, 재구성을 위한 분말(powder for reconstitution)을 포함한다.
국부/국소 투여를 위한 제형은 흡입제(insufflations), 에어로졸(aerosols), 계량된 에어로졸(metered aerosols), 경피 치료 시스템(transdermal therapeutic systems), 의료용 패치(medicated patches), 직장 좌약(rectal suppositories), 및/또는 오블라(ovula)를 포함한다.
본 발명의 목적을 위하여, 언급된 제제의 치료적으로 유효한 용량은 일반적으로 약 2.5 내지 100 mg/day, 바람직하게는 약 5 내지 50 mg/day, 및 가장 바람직하게는 약 10 내지 30 mg/day일 수 있으며, 이는 단회 또는 반복 투여될 수 있다.
그러나, 특정 환자에 대한 본 발명의 화합물의 특정 용량 정도는 나이, 성별, 몸무게(body weight), 일반 건강 컨디션, 식이(diet), 투여 횟수에 따른 치료될 환자 각각의 반응, 치료될 질병의 심각성, 적용될 특정 화합물의 활성, 제형, 적용 양식 및 의약품의 병용(concomitant medication)과 같은 다양한 제제들에 의존적인 것이 바람직할 것이다. 상기 상황에 대해 치료적으로 유효한 양은 통상적인 실험에 의해 용이하게 결정될 것이며, 통상의 임상의 또는 의사의 기술 및 판단 내에 든다.
여섯 번째 측면에서, 본 발명은 혈액(blood), 혈청(serum), 혈장(plasma), 림프절(lymph nodes), 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF), 누액(lacrimal fluid), 소변(urine), 담(sputum) 및 뇌 검체(brain biopsy) 중 어느 하나에 항-KIR4.1 항체가 존재하는 것으로 특징지어지는 환자의 다발성 경화증을 치료하기 위해 리툭시맙(Rituximab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 오파투무맙(Ofatumumab) 및 FC-결합제(FC-binding agent)로부터 선택되는 제제를 제공한다. 상기에 설명한 바와 같이, 한편으로는 자가 항체를 가진 MS 환자들 및 다른 한편으로는 자가 항체가 없는 MS 환자들이 상기 제제들에 다르게 반응할 것으로 기대된다.
FC-결합제(FC-binding agent)는 항체의 제거에 적합한 제제로 알려져 있다. 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제들은 항체의 제거 또는 불활성에 적합하다. 또한 이러한 제거 과정은 면역 흡착(immunoadsorption)이라고 불리운다.
또한 일곱 번째 측면에서, 본 발명은 (i)상기에서 정의된 항-KIR4.1 항체 (즉, 자가 항체); 및 (ii)상기에서 정의된 KIR4.1 단백질 또는 펩타이드, 또는 펩티도미메틱으로 이루어지거나 이를 포함하는 복합체를 시험 물질과 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 복합체의 양의 감소가 시험 물질이 약물 또는 선도 물질인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 약물(drug) 또는 선도물질(lead compound)을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
항-KIR4.1 항체가 다발성 경화증과 관련되었다는 놀라운 발견에 비추어, 본 발명은 다발성 경화증의 치료 또는 다발성 경화증의 치료에 적합한 약물 개발에 적합한 약물 및 선도물질을 동정하는 수단 및 방법을 제공한다. 앞서의 접촉이 상기 복합체를 유지시키는 조건에 영향을 받는 것이 이해되어야 한다. 통상의 기술자는 예를 들어, 시험 물질, 항-KIR4.1 항체를 포함하는 완충액, 및 본 발명에 따른 KIR4.1 단백질 또는 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 포함하는 이와 같은 적합한 조건을 안다.
바람직하게는, 상기 방법은 고-처리 포맷(high-throughput format)에 영향을 받는다. 생화학, 세포 또는 다른 분석과 관계 없이, 고-처리량 분석 방법은 일반적으로 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 수행될 수 있으며, 각각의 상기 플레이트가 96, 384 또는 1536개의 웰로 이루어질 수 있다. 주위 온도(ambient temperature)와 다른 온도에서 인큐베이션 하는 것, 및 시험 물질과 분석 혼합물을 접촉시키는 것을 포함하는 플레이트의 조작은 피펫팅 기구를 포함한 하나 또는 그 이상의 컴퓨터-조작된 로보트 시스템에 의한 것이 바람직하다. 스크리닝될 시험 물질이 큰 라이브러리 및/또는 짧은 시간 안에 효과적인 스크리닝되어야 하는 경우, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50 또는 100가지의 시험 물질의 혼합물이 각각의 웰에 첨가될 수 있다. 웰이 생물학적으로 활성을 나타내는 경우, 상기 시험 물질들의 혼합물은 하나 또는 그 이상의 시험 물질들을 활성이 생긴 혼합물에서 동정하기 위해 디-콘볼루션될(de-convoluted) 수 있다.
시험 물질, 선도물질 및/또는 약물들은 소분자인 것이 바람직하며, 유기 소분자인 것이 더욱 바람직하다. 분자량은 바람직하게는 2000 달톤 이하, 더욱 바람직하게는 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500 또는 400이하이다. 스크리닝에서 동정된 물질은 그의 약학적 특성(흡수, 분산, 대사 및 배출을 포함한)이 최적화되어 선도물질의 개발로 약물이 될 수 있다.
일반적으로 선도물질로 불리우는 스크리닝에서 식별된 화합물의 약학적인 특성을 최적화하는 방법은 통상의 기술분야에 자명하며, 선도 물질로 식별되어 얻은 화합물의: (i) 카르복시기의 에스터화(esterification), 또는 (ii) 하이드록실기의 카르복시기와의 에스터화, 또는 (iii) 하이드록실기의 예를 들어, 포스페이트(phosphates), 파이로포스페이트(pyrophosphates) 또는 설페이트(sulfates) 또는 헤미-숙시네이트(hemi-succinates)로의 에스터화, 또는 (iv) 약학적으로 허용 가능한 염의 투여, 또는 (v) 약학적으로 허용 가능한 복합체의 처방, 또는 (vi) 약학적으로 활성을 가지는 폴리머의 합성, 또는 (vii) 친수성 모이어티(hydrophilic moieties)의 도입, 또는 (viii) 방향성 또는 측쇄에 치환기의 도입/교환, 치환 패턴(substituent pattern)의 변경, 또는 (ix) 등전자(isosteric) 또는 등배전자(bioisosteric) 모이어티의 도입에 의한 변형, 또는 (x) 상동 화합물(homologous compounds)의 합성, 또는 (xi) 가지달린 측쇄의 도입, 또는 (xii) 알킬 치환기의 고리형 유도체(cyclic analogues)로 의 전환, 또는 (xiii) 하이드록실기의 케탈(ketales), 아세탈(acetales)로의 유도체(derivatisation), 또는 (xiv) 아마이드, 페닐카바메이트로의 N-아세틸화(acetylation), 또는 (xv) 만니히 염기(Mannich bases), 이민(imines)의 합성, 또는 (xvi) 케톤 또는 알데하이드의 쉬프 염기(Schiff's bases), 옥심(oximes), 아세탈(acetales), 케탈(ketales), 에놀에스터(enolesters), 옥사졸리딘(oxazolidines), 티아졸리딘(thiazolidines) 또는 이의 조합으로의 변환에 의해 (i) 작용 부위(site of action), 활성 스펙트럼(spectrum of activity), 기관 특이성(organ specificity)이 변형된, 및/또는 (ii) 효능(potency)이 향상된, 및/또는 (iii) 독성(향상된 치료 지수(therapeutic index))이 감소된, 및/또는 (iv) 부작용이 감소된 및/또는 (v) 치료 작용 개시, 유효 기간이 변형된, 및/또는 (vi) 약동학적 파라미터(pharmacokinetic parameters) (흡수, 분산, 대사 및 배출)가 변형된, 및/또는 (vii) 이-화학(physico-chemical) 파라미터 (용해도, 흡습도, 색깔, 맛, 향, 안정성, 상태)가 변형된, 및/또는 (viii) 일반적인 특이성(general specificity), 기관/조직 특이성이 향상된, 및/또는 (ix) 적용 형태(application form) 및 경로가 최적화된 것과 같은 변형 방법을 포함한다
상기 기재된 다양한 단계들은 통상의 기술 분야에 자명하다. 이들은 저감활성 관계 분석(quantitative structure-action relationship)를 포함하거나 이에 의존한다 (Kubinyi, "Hausch-Analysis and Related Approaches", VCH Verlag, Weinheim, 1992), combinatorial biochemistry, classical chemistry and others (see, for example, Holzgrabe and Bechtold, Deutsche Apotheker Zeitung 140(8), 813-823, 2000).
여덟 번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 정의한 바와 같이 수용체의 항-KIR4.1 항체를 혈액 또는 혈청으로부터 제거하거나 이의 양을 감소시키는 생체 외에서 효과적인 용도를 제공하며, 상기 용도는 생체 외에서 효과적이다.
이와 관련하여, 본 발명은 항-KIR4.1 항체를 혈액 또는 혈청과 같은 체액(bodily fluid)으로부터 제거 또는 이의 양을 감소시키는 생체 외 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 개체로부터 분리된 혈액을 상기에서 정의한 수용체 및/또는 Fc-결합체와 접촉시는 단계; 및/또는
(b) 세포원형질분해(plasmapheresis)를 수행하는 단계를 포함한다.
상기 측면들은 자가항체 수의 감소 또는 이의 완전한 고갈을 겨냥하는 생체 외 적용과 관련된다. 바람직하게는, MS 환자 또는 MS로 발달될 소인을 가지는 개체의 혈액 또는 혈청이 생체 외에서 치료된다. 상기 접촉이 자가항체가, 상기 수용체가 있다면 결합되는 조건하에 효과적임이 이해되어야 한다. 일 실시태양에서, 상기 조건은 본 발명에 따른 혈액 또는 혈청과 하기에서 정의되는 담체 또는 장치의 접촉에 의해 수립될 수 있다. 그런 세포원형질분해는 통상의 기술분야에 자명하며, 순환하는 자가항체의 수를 감소시키기 위해 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 생체 외 방법의 바람직한 실시태양에서, 상기의 접촉 후의 혈액 또는 혈청은 동일한 개체에 반환될 수 있다.
또한 본 발명의 생체 외 용도 또는 생체 외 방법의 바람직한 실시태양에서, 상기 단백질, 펩타이드 및/또는 항체는 담체에 결합된다. 고체 담체를 포함한 임의의 담체가 구상된다. 통상의 기술분야에서 일반적으로 사용되고 유리, 플라스틱, 금 및 실리콘을 포함하는 지지체 또는 담체 재료가 본 발명의 목적을 위해 고려된다. 담체 또는 지지체의 적합한 코팅이 존재한다면, 에폭시(epoxy)-뿐만 아니라 폴리(poly)-L-라이신(lysine)- 및 아미노(amino)-실란(silane)-코팅 및 알게하이드-활성화된 표면(aldehyde-activated surfaces)을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 담체는 컬럼의 매트릭스(matrix of a column)이다. 적합한 매트릭스들은 통상의 기술분야에서 자명하며 상기 수용체의 부착에 의해 유도될 수 있다.
또한, 본 발명은 담체와 그 위에 고정화된 것으로 상기에서 정의된 수용체에 관한 것이다.
이와 관련하여, 항-KIR4.1 항체를 혈액으로부터 제거하기 위한 장치가 제공되며, 상기 장치는 상기에서 정의된 담체를 포함한다.
장치의 바람직한 실시태양에서, 상기 장치는 개체의 혈액 또는 혈청이 필터를 흘러 나가게 하는 유입구(inlet) 및/또는 혈액 혈청이 동일한 개체에 반환되게하는 배출구를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 특징지어진 실시태양에 대하여, 특정 청구항에서, 종속 청구항에서 언급된 각각의 실시태양은 상기 종속항에 종속된 각각의 청구항 (독립 또는 종속)의 각각의 실시태양과 결합되게 하는 것이 목적이다. 예를 들어, 독립 청구항 1항이 3 대안 A, B 및 C를 인용하고, 종속 청구항 2항이 3 대안 D, E 및 F를 인용하며, 청구항 1항 및 2항의 종속항인 청구항 3항이 3 대안인 G, H 및 I를 인용하는 경우에, 특별히 언급하지 않는 한, 명세서가 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I의 조합에 상응하는 실시태양을 명확하게 기재한 것임이 이해되어야 한다.
유사하게, 독립항 및/또는 종속항이 대안들을 인용하지 않은 경우에, 종속항들이 다수의 선행 항들을 다시 인용하면, 포함하고 있는 내용의 조합이 명확하게 기재된 것으로 여겨진다. 예를 들어, 독립 청구항 1항, 청구항 1항을 인용하는 종속 청구항 2항, 및 청구항 2항 및 1항을 모두 재인용하는 종속 청구항 3항의 경우에, 청구항 3항 및 1항이 포함하고 있는 내용의 조합이 청구항 3, 2 및 1항이 포함하고 있는 내용의 조합 그대로 명확하고 분명하게 기재된 것이 된다. 청구항 1 내지 3항 중 어느 한 항을 인용하는 추가 종속 청구항 4항이 있는 경우에, 청구항 4, 3, 2 및 1항과 같이 청구항 4 및 1항, 청구항 4, 2 및 1항, 청구항 4, 3 및 1항이 포함하고 있는 내용의 조합이 명확하고 분명하게 기재된 것이 된다.
첨부된 모든 청구항에 상기 준용 (mutatis mutandis)이 적용된다. 약간의 예를 제시하자면, 청구항 6, 5, 4(b), 3 및 2항은 청구항 구조를 고려하여 명확하고 분명하게 구상된다. 제한하기 위한 것이 아니라 추가적인 예시를 제공하기 위해, 청구항 6, 5, 4(a), 3 및 2항의 조합, 및 청구항 4(a) 및 2항의 조합 및 청구항 5, 4(a) 및 2항의 조합에 대해 동일하게 적용된다.
실시예 :
재료 및 방법
환자 및 대조군
환자와 컨트롤은 뮌헨의 Klinikum rechts der Isar of the Technische Universitaet 신경학과에서 모집했다. MS 환자의 두 개의 독립적인 집단, 임상적으로 고-위험 격리 증후군이 환자들을 본 연구에 포함하였다. 대조군은 연령이 일치하는 건강한 기증자 (HD) 또는 다른 신경 질환 (OND) 환자로 구성하였다. 환자와 대조군의 특성은 하기 표 1에 나타내었다. 대학의 윤리위원회는 본 연구를 승인하였다.
실험 집단 유효 집단
시료
특성		 HD
(n=14)		 OND†
(n=71)		 MS
(n=122)		 OND†
(n=130)		 MS
(n=149)
나이(년)
유의한 범위		 24
(25-48)		 48
(16-85)		 38
(18-73)		 49
(21-78)		 36
(18-63)
성(No.)
여성:남성		 8:6 37:34 77:45 58:72 90:59
요약 : HD = 건강한 기증자, OND = 다른 신경 질환, MS = 다발성 경화증. †OND는 세균성 또는 바이러스성 뇌막염, 바이러스성 뇌염, 신경 매독과 HIV 감염 환자를 포함한다.
항체
토끼 다중클론 항-인간/마우스/래트(rat) KIR4.1 (Millipore, Billerica, MA, USA, 및 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 얻음), 마우스 단일클론 항-인간/랫(Rat)KIR4.1 (Sigma-Aldrich), 단일클론 항-랫트/마우스 GFAP (Invitrogen), 토끼 항-인간 C9 네오 또는 정제된 혈청 IgG는 일차항체로 사용하였고, 비오틴-, AlexaFluor 488, 또는 AlexaFluor 555 표지된 토끼 다중클론 항-인간, 항-래트 (Invitrogen, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 또는 항-마우스 IgG (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)는 모든 면역라벨링(immunolabeling) 실험에서 이차 항체로 사용하였다.
면역형광염색법 및 면역 조직화학
면역형광염색을 하기 위해 마우스의 조직, 쥐 또는 인간 유래의 새롭게 절단된 CNS를 동결 스냅하고 조직-tek O.C.T (VWR Int., LLC, Radnor, PA, USA)에 끼웠다. Cryo-섹션닝(sectioning)은 -20℃에서 하여 10 ㎛ 섹션(section)을 얻었다. 그런 다음 10 분 동안 100 % 얼음의 차가운 메탄올로 고정 후 , 각각 15분 동안 과산화 효소, 아비딘과 비오틴 블랏킹 시약(blocking reagents) (Vector Laboratories Inc.)과 함께 블랏킹 단계를 수행하였고, PBS-T에서 10 % 염소, 마우스 또는 랫트의 혈청(0.05% tween-20 pH 7.0의 인산 완충 식염수에서)과 함께 30 분간 수행하였다. 섹션은 희석 정제 혈청 IgG(PBS-T 에서 10 ㎍/ml) 또는 상업 항체 용액과 함께 하룻밤 동안 4℃에서 배양하였다. 여러 번의 세척 단계 후, 섹션을 실온에서 1 시간 동안 비오틴이 표지된 이차 항체와 함께 배양하였다. 섹션을 H2O2 8.8 mM와 함께 PBS에서 바이오틸 티라마이드(biotinylated tyramide) 1 uL과 함께, 1 시간 동안 아비딘-비오틴 복합(벡터)와 함께 더 배양하였다. 모든 세척 단계는 PBS-T 와 함께 수행하였다. 항체 결합은 AlexaFluor 488-와 함께 또는 AlexaFluor 555-라벨된 아비딘과 함께 검출하였다. 핵 염색은 DAPI (Invitrogen)와 골드 안티파이드(antifade)를 사용하여 수행하였다. 그럼 다음 아비딘-비오틴 복합체와 배양한 후 섹션은 DAB 발색 (DAKO) 또는 AEC 발색 (sigma)와 함께 배양하였다. 대비 염색제(Counterstaining)는 hemalum 용액과 함께하였다. DAB 탈수되는 경우를 대비해 그것들은 탈수되었고 수용성 설치 매체 (벡터)와 함께인 AEC을 위해, 그리고 크실렌 호환 로토-히스토(roto-histo) 조직 키트가 장착되었다. 이미지는 AxioCam MRM 카메라 (Carl Zeiss MicroImaging, Ltd., Goettingen, Germany)가 있는 Zeiss Cell Observer 현미경을 사용하여 촬영하였다.
막 단백질 농축 CNS 조직 부분 의 준비
8마리 랫트의 뇌 또는 사람의 뇌 (2.4 g)에서 나온 CNS의 조직은, 차가운 얼음 균질화 버퍼에 유리 조직 균질 (0.32M 수크로스, 10MM HEPES pH 7.4, 2mM의 EDTA)와 단백 분해 효소 억제제 칵테일 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 균질화하였다. 상층액을 핵 분획물을 펠렛을 다운시키기 위해 1000 g에서 원심 분리하였다. 고속 원심 분리 및 수크로스 기울기 방법은 막 분획의 농축을 위해 사용되었다. 풍부한 막 펠렛은 HEPES 용해 버퍼 (50 MM의 HEPES pH 7.4, 2mM의 EDTA, 및 프로테아제 억제제 칵테일)에 현탁하였다. CNS 조직에서 풍부한 막 분획물은, 제조 업체의 프로토콜에 따라, 시안 브로마이드 (CNBR) 활성화 세파로스(sepharose) 비드 기반 농축 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)을 준비하는 데 사용하였다.
면역 침전, 2-D 전기 영동 및 웨스턴 블라팅( western blotting )
12명의 MS 환자로부터 CNS 막 반응 혈청의 IgG 항체는 CNBR 활성화 세파 농축 컬럼을 사용하여 농축되었고(상기 참조) 단백질 G 비드 기반의 접근 방식 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 정제하였다. 정제된 MS 혈청의 IgG 항체는, 함께 모아졌고, 제조 업체의 프로토콜에 따라 자기 단백질 G 비즈 (Invitrogen) 기반의 정제 칼럼과 함께 반응 항원의 면역 침전을 위해 사용하였다. 용출된 항원 분획은 클로로포름 메탄올과 함께 침전되었고, 2-D 단백질의 가용화제(solubilizer) (Invitrogen)와 함께 용해하였다. 용해된 분획들은 ISO 전기 초점 스트립 (Invitrogen)에 로드되었고, pH 3-10 또는 pH를 4-6에서 실행하였다.면역 침전된 CNS 항원을 식별하기 위해, 2-D-전기영동은 작은 2-D 벤치 탑 기술 (Invitrogen) 로 수행하였다. 반점이 제거하였고, 식별을 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/탠덤 질량 분석기 (MALDI-MS/MS; Alphalyse, Inc., CA, USA)에 장착하였다. 대조군으로써, 24명의 OND 환자에서 정제된 풀 혈청의 IgG 항체를 포함하는 병렬 시료을 실행했다. 유효성 검사를 위해, 쥐의 신장 용해물 (RKL)41, 인간의 두뇌 용해물 (HBL) 및 인비트로에서 번역된 KIR4.1 단백질은 단백질 G 세파로스비드 (Invitrogen)를 사용하여 MS 환자의 대조군 혈청 IgG와 면역 침전을 실시하였다. 5 ml PBS에 희석된 총 4MG의 정제된 혈청의 IgG는 총 400 ㎕ 비드를 상층액에 잡아두고, 50 mM의 붕산 버퍼에 디메틸 피메리미데이트(pimelimidate) (DMP)-2HCl에 의해 상온에서 (RT) 교차 결합하였다. 교차 결합한 후, 여분의 DMP는 50 mM의 붕산 버퍼로 급냉되고 블랏킹(blocking)은 에탄올 아민 버퍼 (200 mM, pH 8.0)로 수행하였다. 준비된 구슬은 인비트로에서 번역 반응 믹스로 RKL HBL과 KIR4.1로부터 KIR4.1를 면역 침강 반응을 하는데 사용하였다. 모든 웨스턴 블랏팅 실험은 ECL 검출 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 토끼 다중클론 항-인간 KIR4.1 항체와 함께 4-12% SDS 젤 (Invitrogen)에서 수행하였다.
인비트로에서 번역된 KIR4 .1 단백질
인간 뇌의 총 RNA는 KIR4.1를 인코딩하는 cDNA 전체-길이를 합성하기 위해 사용하였다. 프라이머 5`GGA TCC ATG ACG TCA GTT GCC AAG GTG 3` 및 3`CTC GAG TCA GAC ATT GCT GAT GCG CAC 5`가 제한 위치(sites) 5 '와 3'끝의 BamH1 및 Xho1을 각각 추가하는데 사용되었다. PCR 제품은 플라스미드 pT7CFE1-CHIS (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)에 클로닝 되었다. 인비트로 번역은 제조 업체의 프로토콜에 따라 인간의 단백질 발현 키트 (Pierce, Thermo Fisher Scientific)로 수행하였다. 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩하는 pT7CFE1-CHIS 컨스트럭트는 인비트로 번역 모든 실험에서 대조군으로 사용되었다. 웨스턴 블랏은 ECL 검출과 함께 토끼 다중 클론 항-인간 KIR4.1 항체를 사용하여 KIR4.1 발현을 확인하기 위해 4-12% SDS 젤 (Invitrogen)에서 수행하였다.
쥐( murine ) 피질의( primary cortical ) 별아교세포 배양( astroglial culture ) 및 유동 세포 계측법의 준비
피질의 별아교세포 분리하기 위해, 마우스 새끼를 죽이고, 소뇌와 시신경은 해부하였으며, 차가운 얼음 버퍼에 놓았다[1.47 M의 NaCl, 5 mM의 KCl, 0.2mM NaHPO4 (2H2O), 0.2mM MKH2PO4, 5.5mM 포도당, 0.058 M 1 리터의 수크로스, Ph 6.5]. 조직을 분쇄한 다음 10 분 동안 37℃에서 0.5 % 트립신으로 소화시켰다. MG 배지로 씻은 다음 [10 % FCS (낮은 독소), 1 % L- 글루타민, 0.5 % Pen/Strep으로 보충된 MEM 배지 (Sigma-Aldrich)으로 세척 한 후, 녹은 팁과 함께 파스퇴르 피펫은 조직 현탁액을 생성하는 데 사용하였다. 별아교세포을 배양하기 위해, 조직 현탁액을 MG 배지에 접종하였다. 새로운 배지는 매 2~3일 후에 제공하였다. 2주 후에, 얻어진 혼합된 신경교세포(glial cell) 배양은 미세아교세포(microglia)를 제거하는 6 시간 동안 37 ℃에서 흔들어 부드럽게 하였다. 별아교세포을 배양은 일차 항체로서 MS 및 OND 환자와 항-마우스 GFAP로부터 혈청 IgG 항체를 사용하여 이중 면역형광염색의 유세포 분석 (CyAn ADP, Beckmann Coulter Inc., FL)에 사용하였다.
복제, 발현 및 정제
HEK293 세포에서 재조합 KIR4.1 발현을 위해, C-말단 헥사 히스티딘 태그된 (his-tag) 인간 KIR4.1을 인코딩하는 cDNA 전체 길이는, 정방향 및 역방향 프라이머 (his-tag 인코딩 시퀀스에 밑줄)로서 5'-GCG GCC GCA CCA TGA CGT CAG TTG CCA AGG TGT ATT ACA GTC AG-3'및 5'-CTC GAG TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GAC ATT GCT GAT GCG CAC-3'을 사용하여 인간의 총 두뇌 mRNA (BD Biosciences, San Jose, California)로부터 합성하였다. pcDNA 3.1(+) (Invitrogen)로의 복제가 NotI과 pcDNA 3.1(+)/KIR4.1식 구조를 얻기 위해 각각 정방향 및 역방향 프라이머를 통해 삽입된 Xhol의 제한 부위를 사용하여 수행하였다. HEK 293 세포는 제조 업체의 지침에 따라 lipofectamine 2000 형질 시약 (Invitrogen)를 사용하여 pcDNA 3.1 (+)/KIR4.1과 함께 일시적으로 형질전환하였다. 6시 시간 후 포스트-감염 배지(post-transfection medium)는 10 % FCS 및 300 mM 염화 바륨으로 보충하였다. 36 시간에서 형질 세포가 수확하였고, 얼음의 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 카운팅 후 30만 세포는 550 mM 염화 나트륨, 5 mM Tris-HCl, 1.0 % 포스-콜린, 500 단위의 BenzonaseRnuclease 핵산(Sigma) 및 1X EDTA 자유 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마)을 포함하는 pH 7.4 인산 나트륨 버퍼 50 mM 중 10 ml이 용해의 대상으로 하였다. 세포 용해물은 4℃에서 30 분간 SS34 Sorvall RC6에 로터 플러스 원심 분리기를 사용하여 20,000 rpm에서 원심 분리되었다. 원심분리 후 상등액 (클리어된 용해물)은 모았고, 총 40 mg의 단백질은, 바인딩 버퍼의 5 ML (용해 버퍼와 동일)로 사전 평형된 HisPureTM 코발트 수지 (Pierce) 1 ㎖를 포함하는 정제 컬럼에 놓았다. 세척은 6 ml의 세척 버퍼(용해 버퍼와 같은)로 수행하였다. his-tag 단백질 분획의 용출은 3 ml 용출 버퍼 (50mM 인산 나트륨, 300mM의 염화나트륨, 150mM의 이미다졸(imidazole);pH 6.0)로 실시하였다. 마지막으로,용출 분획은 PBS에 대항해 투석되었고, 정제된 KIR4.1의 존재를 위해 토끼 항 인간 4.1 항체 (Millipore)로 조사하여 웨스턴 블라팅 분석으로 조사하였다.
효소 결합 면역 분석( ELISA )
MS 및 CNS의 막 단백질을 가진 대조군의 혈청 반응의 검출을 위해, 랫트 소뇌 (400 mg 스냅 냉동)는 막과 세포질 항원에 대한 풍부한 단백질 부획을 준비하기 위해 사용하였다. 단백질 분획은 설포-NHS-SS 비오틴 (Pierce)로 바이오티닐(biotinylated) 표면이었고, 80 ㎍/㎖의 최종 농도로 PBS에 희석하였다. 희석된 단백질 분획의 100 μl를 코팅하기 위하여 NUNC immobilizerTM 스트렙 타비 딘 (Pierce) 사전 코팅 및 사전 차단 ELISA 플레이트의 각 웰(well)에 첨가하였다. 플레이트는 4 ℃ 회전통에 약간의 흔들림과 함께 하룻밤 동안 두었다. 코팅한 후, 플레이트는 PBS-T로 두 번 세척하였다. 혈청 시료에서 항-KIR4.1 반응성의 스크리닝을 위해, 재조합 KIR4.1 정제된 바인딩 고체상을 사용하였다. 정제된 KIR4.1 단백질은 6 ㎍/㎖의 최종 농도로 PBS에 희석하였고, 100 μL은 NUNC immobilizerTM 아미노산 플레이트 (Pierce)의 각 웰에 추가하였다. 플레이트는 4℃에서 회전통에 약간의 흔들림과 함께 하룻밤 동안 두었다. 코팅된 플레이트는 PBS-T로 두 번 세척하였고, 100MM NA-탄산염 pH 9.6에 10mm의 에탄올을 사용하여 1 시간 동안 차단하였다. 혈청 시료에서 항 KIR4.1 세포외의 펩타이드 반응성 스크리닝을 위해, KIR4.1 단백질의 첫번째와 두 번째 세포외 루프(loop)를 나타내는 아미노산 서열[ GVVWYLVAVAHGDLLELDPPANHTPCVVQVHTLTGAFL (대형 세포 도메인 , KIR4.183-120, 서열: 번호: 1; 밑줄 있는 시퀀스 KIR490 - 114 , 서열번호: 4)와 TIGYGFRYISEECPLAIVLLI( 작은 세포 도메인 , KIR4.1128 -148 , 서열번호: 2 , 밑줄 있는 시퀀스 KIR4.1134 -142, 서열번호 : 5) 각각 ] N -말단 비오틴 수정과 함께 JPT 펩타이드 테크놀로지 주식 회사 (Berlin, Germany)로부터 구입하였다. 펩타이드는 16 ㎍/ml 인산 나트륨 버퍼 pH 8.0 ML에 희석하였다. 상기에서 설명한대로 코팅은 NUNC immobilizerTM 스트렙 타비딘 사전 코팅 및 사전 차단 ELISA 플레이트 (Pierce)에서 수행되었다. 대조군 ELISA 플레이트는 모든 스크리닝 실험에서 소의 혈청 알부민(시그마)으로 코팅되었다. 혈청 시료는 10 ㎍/㎖의 IgG의 농도를 얻기 위해 3 % 무지방 우유 (Biorad Inc) 에 희석하였다. HRP가 결합된 항-인간 IgG 항체 (Dako)가 검출하기 위하여 사용하였다. 광학 밀도 (OD) 측정은 TECAN 마이크로 리더 (Tecan Group Ltd., Switzerland)450 nm에서 수행하였다.
경합결합측정 분석( Competitive - binding assay )
전체 혈청 IgG는 제조 업체의 프로토콜에 따라 단백질 G 세파로스 구슬 (GE biosciences)로 정제하였다. 전체 혈청 IgG KIR4.1-바운드(bound)로부터 KIR4.1 활성 IgG 분획을 분리하기 위하여 CNBr가 활성화된 세파로스 친화 비드(GE biosciences)를 사용하였다. 분리된 KIR4.1 반응 혈청 IgG의 분획의 결합 용량은 재조합 KIR4.1를 정제함으로써 직접 ELISA에 의해 측정되었다. 경합결합측정 분석을 하기 위하여 ,KIR4.1 반응 혈청 IgG는 PBS에 5 ㎍/ml ML로 희석 되었고 NUNC immoblizerTM 아미노산 스트립 (Pierce)의 각 웰에 추가되었다. 서술된 바와 같이 코팅 및 블랏킹을 수행하였다. 세포외 KIR4.1 펩타이드 의 농도가 증가 12 nm에서 144 nm) (KIR4.1128 -148) 또는 KIR4.1 세포 내 C -말단 펩타이드 (KIR4.1356 - 375)은 그런 다음 웰에 추가되었다. 1 시간 후 배양 플레이트는 PBS-T로 3회 세척하였고, 145 nM의 재조합 his-tag 정제된 KIR4.1 단백질은 1 시간 동안 각각의 웰에 추가되었다. 세척한 후에 PBS-T로 3회, HRP 결합된 항-his tag 항체는 검출에 사용하였다. 경합결합측정 분석은 중복으로 수행하였으며, 분석의 수행은 상업적으로 이용되는 항-KIR4.1 단일클론 항체 (Millipore)가 C-말단 KIR4.1 펩타이드 (KIR4.1356 - 375)의 결합으로 유효하였다. 경합결합측정 분석을 기반으로 하는 세포는 KIR4.1 활성 혈청 IgG를 이용해서 KIR4.1가 형질 도입된 HEK293 세포에서 포 밖(KIR128 -148) 및 세포안 C-말단 (KIR356 -375) 펩타이드 각각을 프리-인큐베이션(pre-incubation) 하거나 하지 않고 수행하였다.
쥐에 MS 혈청 IgG 척추강내 주입
MS 혈청 전체 IgG, KIR4.1 반응성이 고갈된 MS 혈청 IgG와 PBS (대조군) 주입 표본을 준비하였다. MS 혈청 IgG의 KIR4.1-바운드 Ni-NTA의 KIR4.1 반응성 감소를 위해 제조 업체의 지침에 따라 아가로오스 비즈 (Pierce)를 사용하였다. 주입 표본을 준비하기 위하여 모든 혈청 IgG의 준비 10 kD의 컷오프 회전 농축기 (Pierce)를 사용하여 30 mg/ml로 농축하였다. 20 마이크로리터(microlitre) 주입 분취량과 동일한 양의 농축된 혈청 IgG(또는 PBS)를 포함하고, 인간 총 보체(30 units/ml)를 준비하였다. 6~8주의 C57BL/6 마우스를 KIR4.1 반응성의 감소가 없거나 있는 MS 혈정 전체 IgG 또는 PBS를 각각 주입한 것을 3개 그룹으로 (n=3-6 마우스) 나누었다. 쥐는 아이소플루레인(isoflurane) 흡입을 통해 마취하였다. 경피 낭대(intracisternal) 주입 프로토콜은 이전 기술된 것을 채택하였다(Klein M, Ann Neurol. 2003, Oct;54(4):451-8.). 24 시간 후에 쥐를 죽이고 차가운 PBS 및 포름 알데히드 (4 %, pH 7.4)를 왼쪽 심장의 심실을 통하여 함께 살포하였다. 뇌간과 소뇌는 절개되었고 4 ℃에서 하룻밤 동안 20 % 수크로스에 두었다. 뇌간 및 소뇌와 시상면 조각(Sagittal pieces)은 Tissue Tek (Sakur)에 끼워졌고, 액체 질소에서 냉동되며 10 μm (Leica CM3050S)에서 박절편하였다. 설명과 같이 면역 조직 화학(Immunohistochemistry)을 수행하였다.
통계 분석
혈청는 OD가 HD [추가된 5 번 표준 편차의 중간값 OD]에서 관찰된 적정 농도에 의해 결정된 절단 값(cut-off value)을 초과하였을 때 항체 양성으로 여겼다. Kruskal-Wallis 테스트는 OND 및 MS 그룹에서 항체 양성 및 음성 환자들의 수를 비교하는데 사용하였다. p-value 아래 0.05는 중요하게 여겼다. ROC(Receiver operating characteristic) 분석은 형성되고 및 ROC curves (AUC) 아래의 부분에서 MedCalc(또는 Analyse-it) 소프트웨어을 사용한 시료의 두 개의 독립적인 세트로 계산하였다.
실시예 2:
MS 혈청 IgG 항체는 CNS 에서 막 항원과 특이적 결합
IgG 항체는 19명 MS 환자 및 다른 신경 질환(OND)에 걸린 24명 환자의 혈청 시료로부터 정제되었고 면역 형광 염색법에 의해 랫트 및 인간의 뇌 조직 단편으로써 그들의 반응성을 실험하였다. MS 혈청 IgG을 사용함으로써, 인간 뇌 조직에 58 % (11/19) 및 랫트 소뇌에 37 % (7/19)에 막 면역 반응성을 관찰하였다(도 1a). 반면에 OND 환자 중 어느 환자에서도 혈청 IgG을 사용하여 특별한 염색 패턴을 찾을 수 없었다(도 1a). 특이적 막 반응성을 확인하기 위하여, 막 및 세포질 항원에 풍부한 쥐 소뇌의 단백질 분획을 기본으로 포획 ELISA를 확립하였다. 막 단백질 분획으로써 평가된 반응성은 MS 환자 (n = 56)로부터 혈청에서 뿐만 아니라 MS 환자에서 CNS 막 단백질에 반한 특이적 혈청 IgG 항체의 존재에 제안된 OND 환자(n = 29)로부터 혈청에서도 관찰되었다(도 1b). 이에 비해, 세포질의 단백질 분획에서 반응성은 MS 및 OND 환자들 둘 다에서 유사하였다(데이터 나타내지 않음). 따라서 다음의 면역침강 연구에서 MS에서 타겟 항원의 식별하기 위한 막 단백질이 풍부한 CNS 세포 조직에서 진행하였다.
실시예 3:
MS 에서 혈청 IgG 의 타겟으로써 KIR4 .1의 동정
12명 MS 환자에서 CNS 반응 혈청은 인간 뇌 세포로부터 준비된 막 단백질 분획이 코팅된 CNBr 활성 비드를 사용하여 모으고 축적하였다. 농축 컬럼에서 용출된 MS 혈청 IgG는 다음의 항원 면역 침강을 하기 위하여 사용하였다. 침전 컬럼에서 용출된 항원-IgG 복합체는 SDS-PAGE에서 분석한 다음 2-D 젤 전기영동에 의해 분리하였다(도 2a). 7개 단백질 스팟을 잘라내고, MALDI-MS/MS로 분석하였으며, 약어 "MS"는 이것의 구체적인 맥락에서 질량 분석법으로 언급되었다. 내부의 정류(inward rectifying) 칼슘 채널 KIR4.1 스팟들 중에의 하나에서 확인하였다. MS 혈청 IgG 항체 타겟으로써 KIR4.1의 동정은 다음에 면역침강에 의해 확인되었고 및 랫트 신장 용해물, 인간 뇌 용해물의 농축액을 사용하여 웨스턴 블랏팅하였으며(도 2b), 인비트로에서 KIR4.1 반응 믹스를 번역하였다(도 2c).
실시예 4:
MS 혈청 IgG 와 KIR4 .1 반응성의 해마 및 소뇌의 별아교세포에서의 위치
이중 형광 염색 표지는 MS 혈청으로부터 정제된 IgG 항체 및 항-KIR4.1 단일 클론 항체 둘 다의 랫트 뇌 섹션에서 형성하였다(도 3a). 대조군으로써, 유사한 염색은 OND 환자의 혈청으로부터 정제된 IgG를 써서 형성되었다. 랫트 소뇌 섹션에서 단일 클론 항-KIR4.1 및 혈청 IgG 항체는 특이적으로 동일 위치에 존재하는 것은 OND-IgG를 제외하고 MS-IgG에서 관찰하였다(도 3a). 더 나아가 MS 혈청 IgG를 써서 10일 야생형 및 Kir4 .1 마우스(Kir4.1 -/- )에서 소뇌 섹션의 면역학 표시 형성한 결과를 입증하였다(도 3b). 태어난지 10일 후(P10), KIR4.1은 높은 양(20)이 발현되는 것으로 알려져 있다. KIR 4.1 항체를 가진것으로 판명된(항체에 양성인) 다발성 경화증혈청은 와일드 타입 쥐의 소뇌와 해마 섹션의 별아교세포들을 염색했으나 Kir4.1-/- 쥐의 섹션들과는 반응에 실패하였다(도 3b 및 도 6). KIR4.1 항체 음성 혈청은 야생성 쥐 또는 Kir4 .1 -/- 쥐 둘 중 하나로부터 CNS 조직을 염색되지 않았다(자료 보이지 않음). 혈청에서 항-Kir4.1 반응성의 별아교세포 위치를 확인하기 위하여 첫 번째 배양 신경교가 섞인 쥐를 준비하였다. 높은 MS 혈청-특이적 염색은 GFAP-양성 세포에서 관찰하였다(도 3c). 신경교세포의 유사한 MS 혈청-특이적 표면 염색은 유동세포계수법으로 관찰하였다(도 3d).
실시예 5:
KIR4 .1 댄백질의 세포 외 루프에 대한 고농도 혈성 반응성은 MS 로 제한하였다.
항-KIR4.1 반응성을 정량하기 위하여 인간 PC3 세포 라인으로부터 분리한 KIR4.1 단백질을 기초로 ELISA 포획 분석을 사용하였다. 122명 MS/CIS에게서 받은 혈청, 70명 OND 환자 및 14명 건강한 기증자(HD)를 분석하였다(도 4a). 중요한 KIR4.1 혈청 자기 항체 농도는(건강한 대조군의 평균으로부터 5명 SD보다 높고) OND 환자(12/71)의 16.9% 및 MS 환자(62/122)의 50.8%(p<0.001)에서 검출되었다. 모든 양성 MS 혈청은 OND 그룹의 어떤 혈청보다도 항체 농도를 높게 포함하였다.이러한 결과는 130명 OND 및 149명 MS 환자를 포함하는 두 번째 케이스 컨트롤(case-control) 동일연급군집단에서 독립적으로 확인하였다(도 4d).
유사한 결과는 환자 및 대조군의 더 작은 그룹은 ELISA 분석에서 인비트로에서 번역된 KIR4.1 단백질은 캡쳐 기질로 사용되었다(데이터 나타내지 않음). 반면에 본 실험에서는 MS 환자 혈청 22.5%(10/44)는 항체 양성이였고(P=0.0108) 상기 MS 환자 혈청 22.5%(10/44)는 항체 양성이였으며(P=0.0108) 항체 역가가 유의적으로 증가된 것을 포함하는 OND 환자의 항체에서는 발견되지 않았다. 막 위상 분석(Uniprot database version 107, entry 78508 (last modified April 5, 2011); http://www.uniprot.org/uniprot/P78508)은 KIR4.1 단백질의 두 개 새포 외 루프를 예측하였다; 더 큰 루프 스패닝 25개 아미노산 (KIR4.190-114; 서열번호 4) 및 저 작은 루프 스패닝 9개 아미노산 (KIR4.1134-142; 서열번호 5); 도 4c 참조.
KIR4.1 외부 루프 위상처럼 보이기 위하여, KIR4.1 세포외 위치 및 인접한 막내 도메인의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 비오틴 태그로 합성되고, 플레이트에 코팅된 아비딘에 고정하였다. MS 환자 및 대조군의 혈청은 이들의 펩티드에 결합하는 항체로 실험하였다. 작은 세포외 도메인으로 나타난 펩타이드(KIR4.1128-148; 서열번호 2)에서 항체 반응성은 단지 MS 환자의 4% 및 HD 또는 OND 환자에서 나타나지 않는것으로 관찰하였다(데이터 나타내지 않음). 그러나, MS 혈청은 KIR4.1의 첫 번째 세포외 루프(KIR4.183-120; 서열번호 1)에 그것의 결합력을 분석할 때, OND 환자(1/70, 1.4 %)에 비해 MS 환자(37/122, 30.3 %)에서 항체 농도가 유의적으로 증가된 것을 확인하였다(p<0.0001). 본 결과는 두 번째 환자군-대조군 집단에서 독립적으로 자기 복제하는 것이다. 두 번째 환자군-대조군 집단에서 독립적으로 자기 복제하는 것이다.(데이터 나타내지 않음). 인간 KIR4.1-특이적 항체에 대한 큰 세포외 도메인의 결합은 경쟁적 분석에서 추가적으로 확인하였다; 도 5 참조.
결과적으로, PC3 세포로부터 ELISA에 기반하여 KIR4.1 단백질로 측정한 항체 반응성 및 ELISA에 기반하여 측정한 KIR4.183-120 펩타이드 (서열번호: 1)의 항체 반응성 사이의 강력한 관련성을 확인하였고, 이는 KIR4.1에 대한 MS 혈청 항체가 KIR4.1의 첫 번째 세포외 루프를 에피토프를 인식하는 것을 나타내었다.
실시예 6:
혈청 KIR4 .1-특이적 항체는 생체 내에서 KIR4 .1 발현 손실, GFAP 필라멘트( filament ) 구조 파괴 및 보체 활성화 유도
KIR4.1-특이적 항체를 포함하는 혈청 IgG를 주입한 쥐는 별아교세포에서 FAP 필라멘트 구조 파괴, KIR4.1 발현 손실 및 KIR4.1 발현 손실이 관찰된 부분에서 보체 활성화를 확인하였다. 이러한 변화는 PBS 또는 동일 환자의 혈청 IgG을 주입한 쥐에서는 확인되지 않았으며, KIR4.1-특이적 항체로부터 감소되었다. 상기 자료는 도 7 및 도 8에서 나타내었다.
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Claims (15)

  1. 삭제
  2. 항-KIR4.1 항체에 결합하는 수용체를 사용하여 개체 유래 시료에서 항-KIR4.1 항체의 존재를 측정하는 것을 포함하는, 개체에서 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 다발성 경화증에 대한 소인(predisposition)을 진단하기 위한 정보제공방법으로,
    상기 항-KIR4.1 항체는 서열번호 3의 서열로 이루어진 KIR4.1 단백질에 결합하는 IgG이고,
    상기 수용체는 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱, KIR4.1 단백질, 및 상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    상기 시료에 항-KIR4.1 항체가 존재하는 것이 다발성 경화증 또는 다발성 경화증에 대한 소인을 나타내고, 그리고
    상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 3의 서열 중 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어지고, 서열번호 3의 서열로 이루어지지 않으며, 상기 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시료에 항-KIR4.1 항체가 존재하는 경우,
    (i) 상기 개체에 적어도 하나의 다발성 경화증의 임상 증상이 있는 것은 다발성 경화증을 나타내며; 및
    (ii) 다발성 경화증의 임상 증상이 없는 것은 다발성 경화증에 대한 소인을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다발성 경화증 또는 다발성 경화증에 대한 소인을 진단하기 위한 정보제공방법.
  4. 제3항에 있어서, 적어도 하나의 임상 증상은 임상적 독립증후군(clinically isolated syndrome, CIS)인 것을 특징으로 하는, 다발성 경화증 또는 다발성 경화증에 대한 소인을 진단하기 위한 정보제공방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항-KIR4.1 항체는 서열번호 3의 서열로 이루어진 KIR4.1 또는 서열번호 1,2,4 또는 5의 서열 중 어느 하나의 서열로 이루어진 KIR4.1의 세포 외 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는, 다발성 경화증 또는 다발성 경화증에 대한 소인을 진단하기 위한 정보제공방법.
  6. 삭제
  7. 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱, KIR4.1 단백질, 및 항-KIR4.1 항체에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 수용체를 포함하는, 다발성 경화증 치료 또는 다발성 경화증 또는 그에 대한 소인의 진단용 약학적 조성물로,
    상기 수용체는 환자 유래 시료에 포함된 항-KIR4.1 항체에 결합하며,
    상기 항-KIR4.1 항체는 서열번호 3의 서열로 이루어진 KIR4.1 단백질에 결합하는 IgG이고, 그리고
    상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 3의 서열 중 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어지고, 서열번호 3의 서열로 이루어지지 않으며, 상기 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 혈액(blood), 혈청(혈청), 혈장(plasma), 림프절(lymph nodes), 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF), 누액(lacrimal fluid), 소변(urine), 담(sputum) 및 뇌 검체(brain biopsy) 중 어느 하나에 항-KIR4.1 항체가 존재하는 것으로 특징지어지는 다발성 경화증 환자의 치료를 위한 리툭시맙(Rituximab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 오파투무맙(Ofatumumab) 및 FC-결합제(FC-binding agent)로부터 선택되는 적어도 하나의 제제(agent)를 포함하는 것인, 조성물.
  11. (i) 서열번호 3의 서열로 이루어진 KIR4.1 단백질에 결합하는 항-KIR4.1 항체; 및
    (ii) KIR4.1 단백질 또는 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱
    으로 이루어지거나, 이를 포함하는 복합체를 시험 물질과 접촉시키는 것을 포함하고,
    상기 복합체의 양의 감소가 시험 물질이 약물 또는 선도 물질인 것을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다발성 경화증 치료용 약물(drug) 또는 선도물질(lead compound)을 스크리닝하는 방법으로,
    상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 3의 서열 중 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어지고, 서열번호 3의 서열로 이루어지지 않으며, 상기 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것인, 방법.
  12. 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱, KIR4.1 단백질, 및 항-KIR4.1 항체에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 항-KIR4.1 항체와 결합하는 수용체를 포함하는, 생체 외 혈액 또는 혈청에서 항-KIR4.1 항체를 제거 또는 이의 양을 감소시키기 위한 조성물로,
    상기 수용체는 서열번호 3의 서열로 이루어진 KIR4.1 단백질에 결합하는 항-KIR4.1 항체에 결합하고, 그리고
    상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 3의 서열 중 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어지고, 서열번호 3의 서열로 이루어지지 않으며, 상기 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  13. (a) 환자로부터 분리된 혈액 또는 혈청을 제12항의 조성물과 접촉시키고; 및
    (b) 세포원형질분해(plasmapheresis)를 수행하는 것을 포함하는, 다발성 경화증 또는 이의 소인을 가진 환자의 혈액 또는 혈장에 포함된 항-KIR4.1 항체를 제거 또는 이의 양의 감소시키는 생체 외 방법.
  14. 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱, KIR4.1 단백질, 및 항-KIR4.1 항체에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 수용체가 그 위에 고정화된 담체(carrier)로,
    상기 항-KIR4.1 항체는 서열번호 3의 서열로 이루어진 KIR4.1 단백질에 결합하는 IgG이고, 그리고
    상기 항-KIR4.1 항체에 결합하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 3의 서열 중 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어지고, 서열번호 3의 서열로 이루어지지 않으며, 상기 적어도 8개의 연속하는 아미노산 잔기들은 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것인, 담체.
  15. 제14항의 담체를 포함하는 항-KIR4.1 항체를 혈액으로부터 제거하기 위한 장치.
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