KR102007648B1

KR102007648B1 - 파이토프쏘라 캡사이시 유래의 식물 역병 예방 또는 방제용 조성물

Info

Publication number: KR102007648B1
Application number: KR1020130090484A
Authority: KR
Inventors: 윤문영; 이상춘; 문지영; 조준행
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2019-08-06
Also published as: KR20150015590A

Abstract

본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 합성 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써, 파이토프쏘라 캡사이시에서 세포 분열, 운동성 그리고 형태를 유지하는데 중요한 역할을 하는 미소관을 형성하는 서브유닛인 알파-튜불린에 특이적으로 결합하여 미소관 형성을 저해할 수 있다.

Description

파이토프쏘라 캡사이시 유래의 식물 역병 예방 또는 방제용 조성물{Composition for Preventing or Treating phytophthora rot Induced by Phytophthora Capsici}

본 발명은 특정 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 파이토프쏘라 캡사이시의 증식을 억제하는 조성물에 관한 것이다.

파이토프쏘라 캡사이시(Phytophthora capsici)는 물을 좋아하는 반 수생 곰팡이로서 고추 뿐 아니라 수박, 참외, 호박, 오이 등 다양한 농작물에서 역병을 일으키는 원인균이다.

현재 식물 역병 방제법으로 이용하고 있는 기술은 병원균 유입차단, 돌려짓기, 토양관리, 저항성품종 재배, 접목재배, 및 화학적 방제 등이 있다. 병원균 유입차단이란 역병이 발생되지 않은 건전한 포장으로 병원균이 유입되는 것을 방지하는 것을 말한다. 돌려짓기란 근본적으로 고추역병을 예방하는 방법으로 비기주식물로 3-5년간 돌려짓기를 하여 토양 중 역병균의 밀도를 낮추는 방법이다. 토양관리란 식물 수확 후 이병 잔재물 제거, 가을갈이, 지력증진, 화학비료 과용금지, 토양소독의 방법을 이용하여 토양을 관리하는 것을 말한다. 지금까지 다수확을 위하여 화학비료에 의존한 농업의 연속으로 토양화학성이 악화되어 연작피해 발생이 점차적으로 늘어나고 있다. 또한 돌려짓기가 어려울 때 토양을 소독하는 방법을 선택할 수도 있으나 그 처리방법과 조건 및 경제적 측면에서 농가 부담이 큰 어려운 방법이다. 저항성품종 재배란 고추역병에 대한 저항성이 있는 품종을 재배하는 것을 말하고, 고추역병의 경우 저항성 품종으로는 10여종이 보급되어 재배되고 있는데 일반품종에 비해 역병방제가가 90% 정도로 높으나 고추의 맛과 품질이 다소 떨어지며 바이러스에는 약하다는 단점을 가지고 있다. 접목재배란 우수한 품종의 고추 맛을 그대로 유지하고 역병피해를 줄일 수 있는 반면에 노동력 및 생산비가 많이 소요되므로 경제적 부담이 큰 단점을 가지고 있다. 화학적 방제란 주로 농약에 의존하는 병 방제 수단으로서 농업에서 가장 손쉽게 사용되는 방제법에 해당하고 병원균을 직접 죽이거나 생장 및 번식을 억제시키는 방법이다. 역병방제를 위해서는 무엇보다 병이 발생되기 전에 예방적으로 살포하는 것이 가장 효과적이며 병 발생 후 치료효과는 거의 없다.

이러한 식물 역병 방제 기술로 이용되고 있는 여러 기술 중 본 발명과 가장 유사한 것은 화학적 방제법이라 할 수 있다. 현재까지 식물 역병 방제 방법으로 화학적 방제방법이 많이 사용되고 있다. 그러나 유기합성 농약의 오남용은 저항성 균주의 출현, 오존층의 파괴, 토양과 작물 내의 잔류 등의 문제를 야기시키며, 가장 널리 사용되는 토양 훈증제는 토양 미생물을 파괴시키므로 이를 해결하기 위한 환경 친화적인 방제방법 개발이 필요한 실정이다.

현재 고추 역병에 사용하고 있는 화학적 방제제는 대부분 메틸브로마이드(브롬화메탄)를 사용하고 있다. 이는 수용성으로 침투이행성이 높으나 저항성 균주의 출현이 가장 큰 문제점으로 대두되고 있다. 또한 인체 독성이 극히 적은 잔류 농약으로 비교적 안전하다고 하나 과도한 농약의 사용으로 인한 환경오염 뿐 아니라 인체에도 위협이 되고 있다. 유기합성 농약의 사용은 환경에 대한 부담이나 농산물에 대한 잔류성 및 토양 용탈에 따른 2차 오염 발생 때문에 연작, 돌려짓기 등이 어려워져 토양 이용률을 떨어뜨려 생산율을 감소시키는 단점을 가지고 있다.

이러한 화학적 방제의 단점을 극복하기 위하여 미생물기원 생리활성물질을 사용하기도 하지만, 약효의 보증기간이 짧고 그 효과가 화학적 방제제에 비하면 미미한 수준이다. 또한 환경의 영향에 따라 방제효과가 불안정하며, 다른 생물방제제와 비교 시 화학적 방제제와 동시에 사용하기가 어렵다. 또한 화학적 방제제에 비해 가격 비싸기 때문에 생산물의 가격반영이 어렵다는 단점들을 가진다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 파이토프쏘라 캡사이시에 대한 화학적 방제제를 대체할 수 있는 친환경적 방제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 특정 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 파이토프쏘라 캡사이시에서 세포 분열, 운동성 그리고 형태를 유지하는데 중요한 역할을 하는 미소관을 형성하는 서브유닛인 알파-튜불린에 특이적으로 결합하여 미소관 형성을 저해함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 합성 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 파이토프쏘라 캡사이시 유래의 식물 역병 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 합성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 파이토프쏘라 캡사이시에 대한 화학적 방제제를 대체할 수 있는 친환경적 방제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 특정 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 파이토프쏘라 캡사이시에서 세포 분열, 운동성 그리고 형태를 유지하는데 중요한 역할을 하는 미소관을 형성하는 서브유닛인 알파-튜불린에 특이적으로 결합하여 미소관 형성을 저해함을 규명하였다.

본 발명의 서열목록 제1서열 내지 제5서열 또는 제8서열을 포함하는 펩타이드는 M13 페이지 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB), 약 2.7 × 10⁹개의 아미노산 서열을 지님)를 이용하여 알파-튜불린 단백질과 결합하는 13개의 펩타이드 서열을 찾아내고, 이들 중 6종의 펩타이드가 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 형성을 저해하는 효과가 있다는 결론을 얻어 도출해낸 것이다. 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열을 포함하는 펩타이드는 단독 또는 둘 이상 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 미소관 형성 저해 효과가 가장 좋은 제2서열을 단독으로 사용하거나 또는 제1서열, 제3서열 내지 제5서열 및 제8서열로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 서열을 포함하는 펩타이드와 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함(comprising)한다. 구체적으로, 본 발명에서 이용되는 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나(consisting essentially of) 또는 구성(consisting of)된다. 상기 용어 "필수적으로 구성"된 펩타이드는 본 발명에서 이용되는 펩타이드의 서열, 즉 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열에 기재된 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 각각 추가적으로 10개 이하의 아미노산이 결합되어 있으며, 원래의 활성 즉 파이토프쏘라 캡사이시의 알파-튜불린 합성을 억제하는 활성을 가지고 있는 펩타이드 서열을 의미한다.

본 발명에서 이용되는 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열에 기재된 펩타이드 외에 이의 생물학적 기능 균등물을 포함한다. 본 발명의 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 조성물에 포함되는 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 조성물은 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 형성을 저해한다. 미소관은 세포 골격을 이루는 구성성분에 해당하고, 알파-튜불린과 베타-튜불린의 이합체로 이루어진 중합체이다. 미소관은 세포의 골격을 이루는 외에 세포의 이동, 세포 내 물질의 이동 및 세포 분열 등에 있어서 중요한 역할을 한다. 따라서, 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 형성을 저해하면, 세포가 골격을 유지하고, 세포 내 물질을 수송하고, 세포 분열 하는 것을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 펩타이드는 파이토프쏘라 캡사이시의 알파-튜불린에 대한 결합능을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 미소관은 알파-튜불린과 베타-튜불린을 포함하는 중합체에 해당하고, 본 발명의 조성물은 특히 파이토프쏘라 캡사이시의 알파-튜불린에 대한 결합능을 갖고, 알파-튜불린에 결합하여 미소관 형성을 저해한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 식물 역병의 예방, 치료 또는 방제용 조성물이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "식물 역병"이란, 편모균류에 속하는 파이토프쏘라 속 균에 의해 일어나는 식물의 병을 의미한다. 구체적으로 파이토프쏘라 캡사이시에 의해 유발되는 식물의 병을 의미한다. 파이토프쏘라 캡사이시에 의해 유발된 식물 역병에 대해서라면, 제한 없이 본 발명의 조성물을 이용할 수 있으며, 파이토프쏘라 캡사이시에 의해 유발된 식물 역병이라면 식물의 종류와 상관없이 역병에 대한 예방, 치료 또는 방제 효과가 있음이 자명하다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 식물 역병은 가지과(Solanaceae) 식물, 박과(Cucurbitaceae) 식물 및 콩과(Fabaceae) 식물로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 식물에 대한 역병이다. 가지과(Solanaceae) 식물은 약 75속 2000여종이 분포하며, 예를 들어 고추, 감자, 토마토 및 담배가 이에 속한다. 박과(Cucurbitaceae) 식물은 약 95속 800여종이 분포하며, 예를 들어 오이, 수박, 참외, 멜론, 호박, 수세미 및 박이 이에 속한다. 콩과(Fabaceae) 식물은 약 550속 1만 3000종이 분포하며, 예를 들어 가는갈퀴나물Vicia angustipinnata, 가는등갈퀴, 가는갈퀴Vicia tenuifolia , 갈퀴나물Vicia amoena Fisch, 감초, 강낭콩, 개느삼(Echinosophora koreensis), 개도둑놈의갈고리(Desmodium podocarpum) , 개물푸레나무(Maackia amurensis), 개싸리(Lespedeza tomentosa), 개자리(Medicago hispida Gaertner) , 개황기(Astragalus uliginosus) , 갯완두(Lathyrus jaonicus), 땅콩, 만년콩(Euchresta japonica), 반들갯완두(Lathyrus japonica), 벌완두(Vicia amurensis), 붉은강낭콩, 비진도콩(Dumasia truncata), 새완두(Vicia hirsuta), 새콩, 새팥(Phaseolus nipponensis), 얼치기완두(Vicia tetrasperma), 여우콩(Rhynchosia volubilis), 작두콩(Canavalia gladiata), 팥 및 해녀콩(Canavalia lineata)이 이에 속한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 식물 역병은 고추 역병이다. 상기 "고추 역병"은 고추의 뿌리, 줄기, 잎, 열매 등 모든 부위에 발병하는 대표적인 식물 역병으로서, 고추의 줄기가 쓰러지고, 열매가 썩는 등 심각한 피해를 초래한다. 본 발명의 조성물을 사용하는 경우, 고추 역병을 일으키는 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 형성을 저해하고, 토양 잔류로 인한 환경 오염의 문제가 없이 효과적으로 고추 역병의 예방, 치료 또는 방제가 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 파이토프쏘라 캡사이시 유래의 식물 역병 예방, 치료 또는 방제 방법을 제공한다:

(a) 상기 식물 역병의 예방, 치료 또는 방제용 조성물을 준비하는 단계; 및 (b) 상기 조성물을 식물에 접촉시키는 단계.

본 발명은 상기 식물 역병의 예방, 치료 또는 방제용 조성물을 이용하여 식물 역병을 억제하는 방법에 관한 것이므로, 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복되는 내용에 대한 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 합성 억제용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 파이토프쏘라 캡사이시 유래의 식물 역병 예방, 치료 또는 방제 방법을 제공한다.

(c) 본 발명의 조성물을 이용하면, 파이토프쏘라 캡사이시의 알파-튜불린에 대한 결합을 형성하여 미소관 형성을 저해할 수 있다.

(d) 본 발명의 조성물을 이용하면, 화학 방제제의 과다 사용에 따른 저항성 균주의 출현, 오존층 파괴, 토양과 작물에의 잔류로 인한 환경 오염 문제 등이 발생할 염려 없이 식물 역병에 대한 친환경적인 방제가 가능하다.

(e) 본 발명의 조성물을 이용하면, 토양에 이로운 미생물이나 인체에 무해한 방법을 통해 식물 역병을 예방, 치료 또는 방제할 수 있다.

(f) 본 발명의 조성물을 이용하면, 식물 역병이 발병이 가장 빈번하게 이루어지는 장마 기간에도 식물에 대한 조성물의 살포가 가능하다.

(g) 본 발명의 조성물은 농작물의 생육 시기에 관계없이 살포가 가능하다.

도 1은 파이토프쏘라 캡사이시의 알파-튜불린 유전자 클로닝에 대한 것으로서, (a) 유전자 확보의 확인; (b) 알파-튜불린 유전자를 삽입한 발현벡터 pET28a; (c) 제한효소 처리에 의한 pET28a에의 알파-튜불린 유전자 삽입 확인을 나타낸다.
도 2는 알파-튜불린 단백질의 분리 및 정제를 나타낸다.
도 3은 알파-튜불린 단백질과 결합하는 페이지 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 페이지 스크리닝의 계획도를 나타낸다.
도 4는 알파-튜불린 단백질에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 갖는 페이지 펩타이드를 검출하기 위한 각 실험회차(Round)의 바이오패닝(Biopanning) 조건을 나타낸다.
도 5는 알파-튜불린에 결합하는 13개 펩타이드의 아미노산 서열 및 알파-튜불린에 대한 결합력을 나타낸다.
도 6은 알파-튜불린에 결합하는 13개 펩타이드의 미소관 형성 저해 능력을 나타낸다.
도 7은 서열목록 제2서열을 포함하며 C-말단에 G-C-G-K-FITC를 추가적으로 부착한 합성 펩타이드의 (a) 알파-튜불린에 대한 결합력 및 (b) 미소관 형성 억제능을 측정한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 알파-튜불린 단백질의 대량 생산 및 분리법

식물 역병 균주 파이토프쏘라 캡사이시(Phytophthora capsici)를 V8 액체배지에 계대배양하여 30℃에서 역병균의 균총을 플레이트 전체에 고루 자라도록 4-5일 동안 배양하였다. 다 자란 균주는 원심 분리 후, 수분이 제거 된 균체를 확보하고, 액체질소를 첨가하여 급속히 냉각시킨 후 그라인더를 사용하여 냉각된 역병주 균체를 파쇄시켜 파우더 형태로 만들었다. 이를 1 g씩 취하여 트리졸 용액으로 용해시켜 총(total) mRNA를 추출하고, 추출한 총 mRNA를 역전사(reverse transcription) PCR(4℃ 2분, 42℃ 59분, 70℃ 15분, 4℃ 5분)을 통하여 파이토프쏘라 캡사이시의 cDNA를 합성하여 클로닝에 이용하였다. 합성된 cDNA 주형(template)을 이용하여 알파-튜불린(alpha-tubulin)을 클로닝하기 위하여 포워드(forward) 프라이머로 5'-CATATGCGTGAGGTCATCTCCATCC-3', 리버스(reverse) 프라이머로는 5'-GCGGCCGCTTAGTACTCCTCGCCCAGTTCCT-3'를 사용하였다. 상기합성 프라이머 및 주형 DNA를 포함하는 5% DMSO가 함유된 반응 용액에서, 전변성(pre-denaturation) 95℃ 1분, 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(annealing) 70℃ 45초, 신장(extension) 72℃ 2분 45초를 1 사이클로 하여, 20 사이클의 PCR 반응 후 얻은 주형 DNA를 유전자 염기서열을 통해 확인하였다(참조: 도 1). 이 증폭된 유전자를 각각의 제한효소(NdeI, NotI)로 잘라 박테리아 발현벡터인 pET28a 벡터에 삽입하여 클로닝한 뒤, 이 발현 벡터를 발현숙주인 단백질 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시킨 뒤, 0.5 mM IPTG, 18℃ 조건하에서 12시간 동안 알파-튜불린 단백질의 생산을 유도하였다. 상기 형질전환 방법을 간략하게 기재하면 다음과 같다: 우선 DNA 5 ㎕를 BL21(DE3) 100 ㎕에 넣고 잘 섞어 준 뒤 얼음에 30분간 놓아두었다. 그 다음엔 42℃에서 90초간 열 충격을 가하였다. 오염을 방지하기 위해서, 알콜 램프를 켜놓은 뒤 LB(Luria Bertani) 배지 800㎕을 넣고 37℃에서 45분간 반응을 시켰다. 마지막으로 LB 배지 플레이트에 도포시켜주고, 37℃에서 24시간 반응하였다. 박테리아 세포를 원심분리를 통하여 확보한 후, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법을 이용하여 알파-튜불린을 분리, 정제하였다. 발현된 알파-튜불린의 N-말단 지역에 위치한 6-his tag을 이용하여 금속이온(Ni²⁺)이 결합되어있는 아가로스 레진(agarose resin)과의 친화성(affinity)을 이용하여 특이적으로 알파-튜불린을 분리, 정제하였다(참조: 도 2). 정제과정을 거친 후, SDS-PAGE를 통하여 확인하여 본 결과 약 54 kDa의 크기를 가지는 알파-튜불린 단백질을 얻을 수 있었다. 도 2에서 M은 마커; B.I는 단백질 발현 유도 전; A.I는 단백질 발현 유도 후; B.B는 단백질의 His-tag 레진과 결합 전; A.B는 단백질의 His-tag 레진과 결합 후; 8-20은 알파-튜불린 단백질을 포함하는 분획물을 나타낸다.

실시예 2: 알파-튜불린을 인지하는 M13 페이지 펩타이드 라이브러리 스크리닝과 이로써 얻은 페이지 펩타이드의 결합력 분석

페이지 디스플레이(Phage display)란 박테리오페이지(bacteriophage)의 캡시드 단백질에 외래 펩타이드와 단백질을 삽입 및 융합시켜 페이지 표면에 외래 단백질을 발현되도록 하는 기술이다. 본 발명자들은 현재 상용되고 있는 여러 박테리오페이지 중에서 M13을 페이지로 사용하여 알파-튜불린에 결합하는 펩타이드를 선별 후 이들의 결합력을 분석하여 탐침으로서의 수행력을 확인하였다. 페이지 디스플레이를 통한 M13 페이지 펩타이드 라이브러리 스크리닝법은 도 1에서 보이는 바와 같이 진단 대상 단백질을 플레이트 표면에 고정시킨 후 M13 페이지 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM phage display peptide lirary kit, New England Biolabs(NEB), 약 2.7 × 10⁹개의 아미노산 서열을 지님)를 넣어주어 진단 대상 단백질에 결합하는 페이지 펩타이드를 선별해 내는 것으로서, 이 스크리닝법을 알파-튜불린 단백질에 적용시켰다. 우선, 플레이트의 각 웰(well)에 알파-튜불린을 고정시키고(참조: 도 3의 (a)), M13 페이지 표면에 12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드들이 발현된 페이지 라이브러리를 첨가하였다(참조: 도 3의 (b)). 이에 다양한 세척 조건과 결합 시간의 조절을 적용시켜(참조: 도4) 추출해 내면 알파-튜불린에 특이적으로 결합하는 페이지 펩타이드만이 최종적으로 확보된다(참조: 도 3의 (d)). 도 3에서 나타낸 전 과정을 한 단계(round)라고 보고, 도 4의 조건과 같이 각 단계마다 세척 용액의 NaCl의 농도를 높이고, 반면에 결합 시간은 각 단계마다 더 짧게 하여 마지막 단계(4 round)에서 극한 조건에서도 알파-튜불린에 가장 높은 결합력을 나타내는 페이지 펩타이드를 확보하였다. 참고로, 상기와 같은 과정의 반복을 바이오 패닝(biopanning)이라 칭한다.

실시예 3: 스크리닝을 통하여 얻은 13개의 페이지와 알파-튜불린 단백질의 결합력 분석

바이오 패닝을 통해 얻어진 페이지 펩타이드를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시키고 LB 배지에 증폭시켜서 총 169개의 페이지 플라그(총 13 종류의 서로 다른 페이지 펩타이드군)를 얻었다. 그 후, 이 169개 페이지 플라그의 M13 페이지 게놈성 DNA(단일 가닥 원형 DNA)를 분리 정제하여 유전자 염기서열을 확인한 다음, 알파-튜불린과 결합하는 페이지 표면 단백질(gp3 minor coat)에 발현된 12개의 아미노산 염기서열로 이루어진 펩타이드를 규명하였다(참조: 도 5). 이와 같이 스크리닝하여 얻어진 알파-튜불린 표적 특이적인 페이지 펩타이드의 결합력 분석을 위해 우선 각각의 펩타이드가 발현된 페이지를 증폭시킨 뒤에 타이터링 (titering) 작업을 통하여 페이지 용액의 농도를 측정하였다. 그 후 알파-튜불린을 고정시킨 각 웰에 페이지 펩타이드를 농도별로 희석시켜 넣어주어 결합한 페이지 양을 측정함으로써 각 페이지 펩타이드의 결합력을 추론했다. 구체적으로, 알파-튜불린 단백질(5 μg/ml, 100 μl/웰)을 클리어 바텀(clear bottom) 96-웰 폴리스티렌 플레이트에 고정시킨 후 세척용액(0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween-20 in dH2O, pH 7.5)으로 3회 세척해 준 뒤, 펩타이드와 알파-튜불린이 아닌 폴리스티렌 플레이트의 반응을 방지하기 위하여 TBS-T에 녹인 2% BSA, 100 μl/웰을 넣어주었다. 1시간 후 5회 세척을 해 준 뒤 증폭된 페이지를 넣어주어 다시 1시간 동안 알파-튜불린과의 결합반응을 시켰다. 그 후 5회의 세척 과정을 거치고 마우스 항-M13 단일클론항체(mouse anti-M13 monoclonal antibody, TBST에 1:5000으로 희석, Amersham Bioscience)를 1시간 동안 반응시켰다. 세척용액으로 다시 5번 씻어낸 후 마우스 항-M13 단일클론항체에 결합하는 2차 항체(mouse IgG-HRP, TBST에 1:4000으로 희석, Santacruz)를 1시간 동안 반응시키고, 그 후 5회의 세척 작업을 거친 다음 TMB 기질 용액(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)/H₂O₂, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1 M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. 이 전체 과정을 항체를 이용한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay)라 칭하고 이 실험의 결과로 얻는 K_d값은 각 웰의 고정된 단백질에 반응시킨 페이지 펩타이드의 해당 농도에 따른 ELISA 신호 강도를 450 nm에서 측정하여 나타낸 포화곡선으로 정해진다. 그 결과, 도 5에서 보인 13 종류의 서로 다른 페이지 펩타이드군 중에서 총 두 가지 페이지 펩타이드 서열(IRNPNNHPRTPA과 WPHNWWPHCKVK)이 피코몰(picomolarity)에서 펨토몰(femtomolarity)(10^-12-10^-15M) 수준으로 알파-튜불린 단백질과의 높은 결합력을 나타내었다(참조: 도5).

실시예 4: 펩타이드 서열을 이용한 미소관 형성 저해효과 분석

알파-튜불린에 결합하는 13개의 서열을 각각 10 nM 수준까지 증폭을 시켰다. 알파, 베타-튜불린 각 0.25 mg/ml를 폴리머화 버퍼(polymerization buffer)(80 mM PIPES pH7.4, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 5%v/v 글리세롤)에 섞어준 후, 증폭한 페이지를 넣어준다. 그 후 2.5 mM GTP를 넣어 미소관이 형성되는 정도를 O.D 350 nm에서 1시간동안 관찰하여 미소관이 형성되는 정도를 측정하여 저해효과가 있는지 분석한다. 그 결과 13개의 페이지 중 6개의 페이지 서열이 저해 효과를 나타내었으며, 그 중 알파_02 페이지의 경우 가장 높은 54%의 저해효과를 나타내었다(참조: 도6).

실시예 5: 합성된 알파_02 펩타이드 서열과 알파-튜불린 단백질의 결합력 분석

페이지 펩타이드 상에서 알파-튜불린 단백질을 높은 결합력으로 특이적으로 인지하면서 미소관 형성을 가장 크게 저해하는 알파_02 서열(서열목록 제2서열)에 신호를 나타낼 형광 물질(FITC; fluorescein isothiocyanate 사용)을 붙여 합성하였으며, 그 서열은 다음과 같다.

알파_02-GCGK-FITC: Ac-TNTSWDPQYNPDGCGK-FITC

표기된 아미노산 서열은 아미노 말단부터 나타낸다. N-말단에는 아미노말단의 반응성 제거를 위해 아세틸화(Acetylation)를 시켰고 C-말단에는 카복시말단에 FITC를 부착하기 위해 아미노산 K(Lysine, 라이신)를 첨가하였다. 각각의 아미노산 서열의 카복시말단 부근에는 GCG가 첨가되었는데, 이는 형광 펩타이드 탐침자 알파_02-GCGK-FITC의 민감도를 극대화시키기 위한 추후 실험을 위해서다. 알파_02-GCGK-FITC의 알파-튜불린 단백질에 대한 결합력 분석을 위하여 펩타이드를 알파-튜불린 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 넣어주었다. 각 웰의 알파-튜불린 단백질에 결합한 펩타이드 양을 측정함으로써 각 펩타이드의 결합력을 추론하는 방법은 실시예 3 에서 설명한 바와 비슷하다. 그러나 FITC가 합성된 펩타이드의 경우, 1차 항체, 2차 항체, TMB 기질 용액의 첨가 등 페이지 펩타이드 실험에서와 같이 신호를 나타낼 표지자가 별개로 필요하지 않아서 알파-튜불린 단백질과 펩타이드를 결합시킨 후 세척하여 형광광도계(fluorometer)로 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation 495nm, Emission 520nm)에서 각 펩타이드 농도의 형광세기를 측정하였다. 알파_02-GCGK-FITC 펩타이드의 해당 농도의 FITC 신호강도는 그래프화 시켜서 펩타이드의 K_d 값을 정하였다(참조: 도 7).

실시예 6: 합성된 알파_02 펩타이드 서열을 이용한 미소관 형성 저해효과 분석

합성된 알파_02-GCGK-FITC 서열을 이용하여 실시예 4에서와 같은 방법으로 미소관 형성 저해효과를 분석하였다. 여기에서는 합성된 알파_02-GCGK-FITC 서열을 0-5 nM 까지 다양한 농도로 희석을 하여 각 농도에서의 저해효과를 나타내어 그래프로 표시 하였다. 이때 미소관 형성을 50% 저해시키는 농도인 IC50를 구하였으며, 알파_02-GCGK-FITC 서열의 IC50은 890 nM로 나타났다(참조: 도 7).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Composition for Preventing or Treating phytophthora rot Induced by Phytophthora Capsici <130> PN130386 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 1 Ile Thr Met Ser Val Pro Ala His Asn Ala Lys Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 2 Thr Asn Thr Ser Trp Asp Pro Gln Tyr Asn Pro Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 3 Asn His Phe Val Pro Thr Ser Asn Arg Phe Asn Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 4 Asn Phe Thr Ile Asn Gly Lys Thr His Arg Leu Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 5 Asn Ala Ile Thr Leu Leu Ser Pro Pro Leu His Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 6 Ser Ser His Asn His Asp Ser Tyr His Gly Thr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 7 Leu Met Asn Pro Ala Thr Met Lys Thr Ser Ser Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 8 Thr Asn Thr Ser Trp Asp Pro Gln Tyr Asn Pro Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 9 Ser Asn Met Lys Pro Ser Met Glu Tyr Ser Ser Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 10 Ile Gly Asn Ser Trp Pro Leu Arg Ser His Ser Trp 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 11 Ser Tyr Asn Thr Phe Met Tyr Glu Arg Ala Ser Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 12 Met Val His Ser Lys Ala Ser Met Trp Pro Gly Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB) <400> 13 Lys Val Tyr Ala Ile Asn Ser Trp Thr Asn Tyr Tyr 1 5 10

Claims

서열목록 제1서열 내지 제5서열 및 제8서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 파이토프쏘라 캡사이시의 미소관 합성 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 파이토프쏘라 캡사이시의 알파-튜불린에 대한 결합능을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 식물 역병의 예방, 치료 또는 방제용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 식물 역병은 가지과(Solanaceae) 식물, 박과(Cucurbitaceae) 식물, 및 콩과(Fabaceae) 식물로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 식물에 대한 역병인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 식물 역병은 고추 역병인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음 단계를 포함하는 파이토프쏘라 캡사이시 유래의 식물 역병 예방 또는 치료 방법:
(a) 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 조성물을 식물에 접촉시키는 단계.