KR101988627B1 - 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속 유래의 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 골 흡수 억제 효과 및 골 형성 촉진 효과를 가질 수 있다.
Description
본 발명은 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 골 흡수 억제 효과 및 골 형성 촉진 효과를 가지는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대표적인 뼈 질환 중 하나인 골다공증은 노령화에 따른 골격대사 이상에 의해서 뼈의 절대량이 감소함에 따라 나타나는 대표적인 대사질환의 하나이다. 골다공증은 골밀도 감소 및 골조직의 미세구조 파괴로 인하여 작은 충격에도 척추와 대퇴, 요골 등이 쉽게 골절되는 질환으로 심한 관절 통증을 유발하고, 평생 불구로 만들기도 하며 이로 인해 사망에 이를 수 있는 매우 흔하고 치명적인 질환이다.
정상적인 뼈는 파골세포에 의해 매일 조금씩 흡수 분해되고, 조골세포에 의해 분해된 양만큼 새로운 뼈가 채워지는 ‘골 재형성’과정을 통해 항상성이 유지된다. 골의 재형성(bone remodeling)은 다양한 뼈 세포가 관여하는 것으로, 병적상태에서 골량을 결정하는 중요한 역할을 담당한다.
고령화, 여성의 폐경 등과 같은 다양한 요인에 의해 조골세포에 의한 새로운 뼈 형성보다 파골세포에 의한 뼈 흡수가 증가하게 되면 골다공증과 같은 뼈 질환이 유발된다.
현재 다양한 골 흡수 억제제(anti-resorptive agent)가 개발되어 골다공증의 치료제로 이용되고 있으나, 보다 효과적이고, 부작용이 적은 새로운 골 흡수 억제제의 개발이 필요하다. 또한, 골 흡수 억제제를 대체할 수 있는 골 형성 촉진제(anabolic agent)의 개발은 아직까지 미미한 실정이나, 최근에는 뼈 형성 세포의 분화 및 골 형성에 대한 기전 연구가 활발히 진행됨에 따라, 골 형성 촉진제의 개발도 많이 시도되고 있다.
본 발명의 일 실시형태의 목적은 골 흡수 억제 효과 및 골 형성 촉진 효과를 가지는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태는 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속 유래의 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 바이오 폴리머 및 황칠 추출물은 3:0.3 내지 3의 중량비로 포함될 수 있다.
상기 바이오 폴리머는 수용성 베타-1,3/1,6 글루칸을 포함할 수 있다.
상기 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속은 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidim pullulans) SM-2001일 수 있다.
상기 골 질환은 골다공증, 골다공증, 뼈의 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성 골질환일 수 있다.
상기 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 건강기능식품의 조성물로 사용될 수 있다.
상기 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 의약외품 조성물로 사용될 수 있다.
상기 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 화장품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속 유래의 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 포함하여, 골 흡수 억제 효과 및 골 형성 촉진 효과를 가져 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 포함하여 약효 상승효과가 있으며, 에스트로겐 결핍성 골다공증 개선에 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
또한, 본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 천연물질에서 분리될 수 있고, 신체에 독성이 없으며, 부작용이 없어 골 질환 예방 또는 치료를 위한 다양한 분야에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물, 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 또는 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
도 1은 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 전후의 체중 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2 및 도 3은 각각 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 오스테칼신(Osteocalcin) 함량 레벨 및 bALP 활성 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 마우스의 체중 및 대퇴골의 골밀도의 변화를 나타내는 Dual-energy x-ray absorptionmetry 이미지이다.
도 5a 내지 도 5c는 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 6은 도 1은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 전후의 체중 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 래트의 체중 및 대퇴골의 골밀도의 변화를 나타내는 Dual-energy x-ray absorptionmetry 이미지이다.
도 8은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 9는 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 경골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 10은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 L5의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 11은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골, 경골, 및 L5의 파골세포를 나타내는 이미지이다.
도 2 및 도 3은 각각 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 오스테칼신(Osteocalcin) 함량 레벨 및 bALP 활성 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 마우스의 체중 및 대퇴골의 골밀도의 변화를 나타내는 Dual-energy x-ray absorptionmetry 이미지이다.
도 5a 내지 도 5c는 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 6은 도 1은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 전후의 체중 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 래트의 체중 및 대퇴골의 골밀도의 변화를 나타내는 Dual-energy x-ray absorptionmetry 이미지이다.
도 8은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 9는 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 경골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 10은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 L5의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 11은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골, 경골, 및 L5의 파골세포를 나타내는 이미지이다.
이하, 본원의 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
용어 “약”이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, “포함하다” 및 “포함하는”이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명은 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시형태에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속 유래의 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 포함한다.
본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 골 흡수 억제 효과 및 골 형성 촉진 효과를 가져 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 포함하여 약효 상승효과가 있으며, 에스트로겐 결핍성 골다공증 개선에 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
또한, 본 발명에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 천연물질에서 분리될 수 있고, 신체에 독성이 없으며, 부작용이 없어 골 질환 예방 또는 치료를 위한 다양한 분야에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 Aureobasidium(아우레오바시디움 속) 유래의 바이오 폴리머(이하, ‘바이오 폴리머’또는 ‘엑소폴리머(Exopolymer)’라 함) 및 황칠 추출물을 포함한다.
상기 바이오 폴리머는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidim pullulans ) SM-2001 유래의 수용성 베타-1,3/1,6 글루칸(β-1,3/1,6-glucan)을 포함할 수 있다.
아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidim pullulans ) SM-2001이 생산하는 수용성 베타-1,3/1,6 글루칸은 하기와 같은 방법으로 얻어질 수 있다.
아우레오바시디움 풀루란스 SM2001(KCCM 10307)을 탄소원과 질소원, 무기염류를 포함하는 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고, 25℃ 에서 200rpm으로 호기적인 조건에서 3일간 배양하여 수용성의 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산할 수 있다. 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 에탄올을 2배 부피로 첨가, 혼합하여 생산된 베타-1,3/1,6-글루칸을 침전시켜 회수한 후 동결 건조하여 분리·정제하여 사용할 수 있다.
상기 황칠 추출물은 황칠을 추출용매를 가하고, 가열하여 얻어질 수 있다.
황칠 추출물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 사용되는 방법을 사용할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 추출용매를 이용하여 황칠 추출물을 얻을 수 있다.
상기 황칠은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 지상부, 뿌리, 종자를 모두 사용할 수 있다. 황칠나무의 뿌리, 줄기, 꽃, 잎 및 열매로부터 황칠 추출물을 얻을 수 있으며, 예를 들면, 황칠나무의 잎을 추출한 것일 수 있다.
상기 추출 용매는 당업계에서 통상적으로 사용하는 추출 용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으며, 예를 들면 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 상기 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 부탄올일 수 있다.
상기 추출 용매는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들면, 감수 분량의 2 내지 20배, 또는 4 내지 10배 첨가할 수 있다. 상기 추출의 방법은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들면, 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출의 방법을 사용할 수 있다.
추출 시 추출 용매의 온도는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들면, 20 내지 100℃, 또는 상온일 수 있다. 추출시간은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들면, 12시간 내지 10일, 또는 5일 내지 8일, 또는 2 내지 3일일 수 있다. 추출횟수는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들면, 1 내지 5회, 또는 3회일 수 있다.
상기와 같은 추출의 조건을 이용하여 황칠을 추출, 여과하여 황칠 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 바이오 폴리머 및 황칠 추출물은 3: 0.3 내지 3일 수 있다. 보다 구체적으로는 3:0.5 내지 2, 또는 3:0.8 내지 1.2, 또는 3:1일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 골 질환과 관련된 다양한 질병의 치료 또는 예방의 목적으로 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 “예방”은 상기 조성물의 투여로 골 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있고, “치료”는 상기 조성물의 투여로 골 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니나, 골 질환은 골다공증, 골다공증, 뼈의 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성 골질환 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약제학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
일반적으로, 일일 투여량은 예를 들면, 1 내지 600mg/kg일 수 있으며, 또는 50 내지 400mg/kg, 또는 100 내지 400mg/kg일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 약제학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조될 수 있으며, 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속 유래의 바이오 폴리머 및 황칠 잎 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물을 의약외품 조성물로 제공하는 것이다.
본 발명에서 “의약외품”은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 조성물을 의약외품의 조성물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속 유래의 바이오 폴리머 및 황칠 잎 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물은 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 골 질환 예방 또는 치료용 조성물로 건강기능식품을 제조하는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 건강기능 조성물의 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 0.1 중량부 내지 20 중량부의 양으로 첨가될 수 있다.
그러나 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취 등의 특별한 경우에는 상기 범위 이하의 양 또는 이상의 범위로도 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 아우레오바시디움(Aureobasidium) 속 유래의 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 화장료 조성물은 통상적으로 화장료 조성물로 사용되는 물질과 함께 사용될 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 등 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
난소적출(Ovariectomy;
OVX
) 마우스 모델을 이용한 실험
본 실험에서는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidim pullulans ) SM-2001 유래의 β-1,3/1,6-글루칸을 13% 함유하는 엑소폴리머(Exopolymer, PolycanTM) EAP 및 DM의 복합조성물 투여군에서의 효과는 프리디닐 비스포스포네이트(pridinyl bisphosphonate)계열의 골다공증 치료제(골 흡수 억제제)로 시판 중인 RES 2.5 mg/kg를 경구 투여한 OVX 마우스에서의 결과와 비교평가하였다.
1. 실험동물
7주령의 암컷 마우스(virgin SPF/VAF Outbred CrljOri:CD1[ICR], OrientBio, Seungnam, Korea) [ANNEX I, II]를 8일간 순화 후 사용하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회의 사전 승인 하에 실시하였다.
1) 군 분리 (총 14개 군; 군 당 8마리)
A. Sham control: 위 수술후 멸균 증류수 10 ml/kg 투여 매체 대조군
B. OVX control: OVX 수술후 멸균 증류수 10 ml/kg 투여 매체 대조군
C. RES: OVX 수술 후, RES 2.5 mg/kg/day 경구 투여 대조약물군
D. EAP: OVX 수술 후, EAP 단독 조성물 200 mg/kg 투여군
E. DM: OVX 수술 후, DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군
-
OVX
수술 후
9 종의
EAP:DM
복합 조성물 (g/g) 투여군:
F. OVX 수술 후, EAP:DM 1:1(100:100 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
G. OVX 수술 후, EAP:DM 1:3(50:150 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
H. OVX 수술 후, EAP:DM 1:5(33:167 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
I. OVX 수술 후, EAP:DM 1:7(25:175 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
J. OVX 수술 후, EAP:DM 1:9(20:180 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
K. OVX 수술 후, EAP:DM 3:1(150:50 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
L. OVX 수술 후, EAP:DM 5:1(167:33 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
M. OVX 수술 후, EAP:DM 7:1(175:25 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
N. OVX 수술 후, EAP:DM 9:1(180:20 mg:mg) 복합 조성물 200mg/kg 투여군
2) 투여
EAP 및 DM 단독조성물을 각각 20mg/ml의 농도로 멸균증류수에 용해시켜, 0ml/kg의 용량(200 mg/kg)으로 OVX 35일 후부터, 매일 1회씩 35일간 금속제 존데가 부착된 1ml 주사기를 사용하여 강제 경구투여하였다.
EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1(g/g) 복합물 투여군에서는 EAP:DM을 각각 100:100, 50:150, 33:167, 25:175, 20:180, 150:50, 167:33, 175:25 및 180:20ng:mg 비율로 10ml의 멸균 증류수에 용해시켜, 10ml/kg(복합 조성물 총량으로써 200mg/kg)의 용량으로 35일간 연속 경구투여하였고, RES 역시 0.25mg/ml의 농도로 멸균 증류슈에 용해시켜, 10ml/kg(2.5 mg/kg)의 용량으로 OVX 수술 35일 후부터 매일 1회씩 35일간 강제 경구투여하였다.
위 수술(sham) 및 OVX 대조군에서는 동일한 보정 및 강제 투여에 따른 스트레스(stress)를 가하기 위해, 실험물질 대신 매체인 멸균 증류수만 동일한 용량으로 동일한 기간동안 경구 투여하였다.
3)
OVX에
의한 골다공증 유발
위 수술(sham) 대조군을 제외한 모든 실험동물을 무작위로 선정하여, 실험동물을 8일간 실험실 환경에 순화시킨 다음, 설치류용 흡입마취기(Surgivet, Waukesha, WI, USA)와 환기 장치(Model 687, Harvard Apparatus, Cambridge, UK)를 이용하여 3% isoflurane(Hana Pharm. Co., Hwasung, Korea)과 70% N2O및 28.5% O2 혼합가스로 전신 흡입 마취한 다음, 개복 수술을 통해 양쪽 난소를 완전히 절제하여 에스트로겐-결핍(estrogen-deficient) 골다공증을 유발하였다.
한편, 위 수술 군에서는 동일한 방법으로 양쪽 난소를 확인 후 절제하지 않고 복강을 다시 폐쇄하였다. 위 수술 군을 포함한 모든 실험동물은 OVX 수술 34일 후, 체중(OVX mouse: 37.38g, 34.2~44.4 g; 위 수술 mouse: 33.86g, 30.3~37.5 g)을 기준으로, 군 당 8마리씩 선정하여 실험에 사용하였다.
4) 관찰항목
OVX 수술 전 1일, OVX 수술일, 투여 전 1일 (OVX 34일 후), 투여 시작일, 투여 시작 1, 7, 14, 21, 28, 34 및 35일 (최종 희생일) 후의 체중을 각각 기록하였으며, OVX에 의한 골다공증 유발기 및 투여 5주 동안의 증체량의 변화를 산출하였다. 최종 희생일에 양쪽 대퇴골을 적출한 다음 중량, 무기질 함량, 골밀도 및 골강도를 기록하였으며, 일반적인 방법을 통하여 조직병리학적 변화를 평가하였고, 혈액생화학적 변화 역시 관찰하였다.
2. 결과
조직형태계측(Histomorphometry)으로 골량에 관련된 지주골량(TV/BV), 지주골 수(Tbn), 두께(Tbt), 길이(Tbl), 피질골 두께(Cbt)를 측정하였으며, 골 흡수와 관련된 파골세포 수(Ocn) 및 파골세포 면적(OS/BS)의 변화를 좌측 대퇴골에서 각각 측정하였다.
관찰 뼈: 대퇴골
골중량: 습중량/건조중량/탄화골중량
혈액 생화학치: Osteocalcin 함량 및 bALP 활성
골강도, 골밀도
골 무기질 함량: Ca, P, Ca/IP 비율
1) 체중 및
증체량의
변화
본 실험에서 OVX 수술 34일 후, 위 수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 현저한 체중의 증가를 나타내는 실험동물만 선정하여 사용하였으므로 (OVX mouse: 37.38g, 34.2~44.4 g; 위수술 mouse: 33.86g, 30.3~37.5 g), 위 수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중 및 OVX 후 유발기인 5주 동안의 증체량의 증가가 모든 OVX 수술군에서 인정되었다.
한편, EAP:DM 1:1, 1:5, 3:1 및 7:1 복합 조성물 투여군에 국한되어 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 일부 투여기간에 국한되어 인정된 이외에 OVX 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중의 변화는 모든 실험물질 투여군에서 인정되지 않았으나, EAP 및 DM 단독 조성물과 9종의 모든 EAP:DM(g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 투여 기간인 35일 동안의 증체량의 감소가 각각 인정되었다.
특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단일 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.05) 증체량의 감소가 인정되었다. 한편 RES 2.5 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 인정되지 않았다.
도 1은 각 실험물질을 투여 전후의 체중변화를 나타내는 그래프이다. 이를 참조하면, OVX 대조군의 경우, 위 수술 대조군에 비해 투여기간 5주 동안의 증체량이 147.86%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -35.17, -70.34, -73.45, -62.76, -73.10, -75.52, -70.34, -68.28, -128.28, -72.76, -73.79 및 -72.41%의 변화를 나타내었다.
2) 대퇴골 중량의 변화
하기 표 1과 같이 OVX 대조군에서는 위 수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중에 대한 대퇴골의 상대 습중량의 감소와 함께 건조 및 탄화골의 절대 및 상대 중량의 감소가 인정되었으나, RES 2.5 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 현저한 대퇴골 중량의 증가가 각각 인정되었다.
특히, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골의 상대 습중량의 증가와 건조 및 탄화골의 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었다.
보다 구체적으로, OVX 대조군의 경우, 위 수술 대조군에 비해 대퇴골 절대 습중량 및 체중에 대한 상대 습중량이 각각 -2.93 및 -19.07%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 7.28, 2.61, 3.43, 2.75, 4.12, 2.34, 3.57, 5.22, 7.69, 4.40, 2.88 및 4.12%의 절대 습중량의 변화를 나타내었고, 각각 12.94, 9.72, 11.02, 12.08, 11.21, 11.43, 11.90, 12.23, 23.64, 12.10, 10.62 및 11.79%의 상대 습중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위 수술 대조군에 비해 대퇴골 절대 건조중량 및 체중에 대한 상대 건조 중량이 각각 -29.85 및 -41.31%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 39.89, 22.61, 23.40, 19.41, 22.87, 21.01, 19.95, 23.14, 38.56, 25.80, 22.87 및 27.39%의 절대 건조중량의 변화를 나타내었고, 각각 47.34, 30.73, 32.00, 29.89, 31.13, 32.33, 29.32, 31.25, 59.09, 34.82, 31.99 및 36.10%의 상대 건조중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위 수술 대조군에 비해 대퇴골 절대 탄화 중량 및 체중에 대한 상대 탄화중량이 각각 -46.06 및 -54.84%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 71.70, 27.83, 32.55, 32.08, 32.08, 29.72, 27.83, 33.02, 65.57, 35.38, 31.60 및 32.55%의 절대 탄화중량의 변화를 나타내었고, 각각 80.45, 36.23, 41.69, 43.41, 40.92, 41.20, 37.61, 41.65, 89.40, 45.90, 41.13 및 41.50%의 상대 탄화 중량의 변화를 나타내었다.
3) 혈액 생화학적 변화:
Osteocalcin
함량 및
bALP
활성
OVX 대조군에서는 위 수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 osteocalcin 함량의 증가와 함께 유의성 있는 (p<0.01) bALP 활성의 감소가 인정되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물과 모든 9종의 EAP:DM (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 osteocalcin 함량의 감소가 혈중 bALP활성의 증가와 함께 각각 인정되었다.
특히, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 osteocalcin 함량의 감소 및 혈중 bALP활성의 증가가 인정되었다.
한편, RES 2.5 mg/kg 투여군에서도 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 osteocalcin 함량의 감소가 인정되었으나, OVX 대조군과 유사한 bALP 활성이 인정되었다.
도 2 및 도 3은 각각 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후Osteocalcin 함량 변화 및 bALP 활성 변화를 나타내는 그래프이다. 이를 참조하면, OVX 대조군의 경우, 위 수술 대조군에 비해 혈중 osteocalcin 함량 및 bALP 활성이 각각 108.62 및 -43.28%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -51.87, -32.98, -28.69, -33.25, -29.44, -32.33, -30.16, -28.72, -45.57, -34.33, -34.52 및 -32.66%의 혈중 osteocalcin 함량의 변화를 나타내었고, 각각 1.09, 30.50, 20.11, 22.97, 24.93, 23.15, 25.91, 23.62, 55.49, 30.65, 21.75 및 32.95%의 혈중 bALP 활성의 변화를 나타내었다.
4) 골밀도의 변화
하기 표 2와 같이, OVX 대조군에서는 위 수술 대조군에 비해 평균 total body 및 대퇴골 전체 골밀도가 각각 유의성 있게 (p<0.01) 감소된 반면, EAP 단독 조성물을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) total body 및 대퇴골 골밀도의 증가가 각각 인정되었고, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 평균 total body 및 대퇴골 골밀도의 증가가 인정되었다.
도 4a 내지 도 4c는 마우스 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 마우스의 total body 및 대퇴골의 골밀도의 변화를 나타내는 Dual-energy x-ray absorptionmetry 이미지이다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 평균 total body 골밀도가 -13.52%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 16.73, 8.19, 7.32, 8.25, 7.67, 7.38, 7.84, 7.61, 13.19, 8.95, 7.67 및 7.79%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 전체 골밀도가 -15.40%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 13.07, 9.02, 7.24, 9.51, 9.51, 8.10, 8.86, 7.56, 15.94, 10.80, 7.73및 8.21%의 변화를 나타내었다.
5) 대퇴골
골강도의
변화
상기 표 2와 같이, OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 대퇴골 mid-shaft 부위의 골강도가 유의성 있게 (p<0.01) 감소된 반면, DM 단독 조성물을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골 골강도의 증가가 각각 인정되었다. 특히, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 골강도의 증가가 인정되었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 mid-shaft 부위의 골강도가 -46.38% 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 68.51, 28.35, 19.02, 24.41, 20.16, 23.08, 20.78, 23.88, 58.23, 26.76, 24.99 및 26.39%의 변화를 나타내었다.
6) 대퇴골 무기질 함량의 변화
상기 표 2와 같이 OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 대퇴골 Ca 및 IP 함량의 유의성 있는 (p<0.01) 감소가 인정되었으나, EAP:DM 1:1 (g/g) 복합 조성물 단독 조성물을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골 Ca 및 IP 함량의 증가가 각각 인정되었고, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골 Ca 및 IP 함량의 증가가 인정되었다. 한편 OVX 대조군에서 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 대퇴골 Ca/IP 비율의 변화는 인정되지 않았으며, OVX 대조군에 비해 유의성 있는 대퇴골 Ca/IP 비율의 변화 역시 RES 2.5 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서 인정되지 않았다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 Ca 함량이 -43.51% 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 65.80, 28.14, 17.72, 21.76, 22.16, 24.30, 21.04, 20.92, 46.73, 27.88, 26.62 및 20.50%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 IP 함량이 -42.45% 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 68.44, 27.28, 19.80, 21.61, 23.93, 25.68, 20.56, 23.06, 46.35, 28.76, 27.24 및 20.94%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 Ca 함량이 -1.23% 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -1.61, 0.10, -2.20, -0.22, -1.80, -1.47, -0.16, -2.35, -0.16, -1.08, -0.73 및 -1.10%의 변화를 나타내었다.
7) 조직병리학적 변화: 대퇴골
하기 표 3 및 표 4와 같이, 위 수술 군의 대퇴골에서는 비교적 잘 발달된 지주골과 피질골이 관찰된 반면 OVX 대조군에서는 파골세포의 현저한 수적 및 활성 증가에 따른 지주골 및 피질골량의 감소가 인정되었다. 한편 RES 2.5 mg/kg 투여군에서는 OVX대조군에 비해 지주골의 현저한 증가가 인정되었으나, 피질골은 매체 대조군과 유사하게 관찰된 반면, EAP 및 DM 단독 조성물과 모든 9 종의 EAP:DM (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 대퇴골의 파골세포 활성 억제에 의한 지주골 및 피질골의 골량 및 두께의 유의성 있는 현저한 증가가 인정되었으며, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 현저한 파골세포 활성 억제 및 골량 보존 효과가 각각 인정되었다.
도 5a 내지 도 5c는 각 실험물질 투약에 따른 대퇴골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
7)-1. Bone mass 및 구조
OVX 대조군의 경우, 대퇴골 지주골량, 지주골 평균 길이, 두께 및 수, mid-shaft 부분의 피질골 두께가 각각 위수술 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 감소되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물과 모든 9 종의 EAP:DM (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골 지주골량, 지주골 평균 길이, 두께 및 수, 피질골 두께의 증가가 인정되었으며, 특히 EAP:DM 3:1, (g/g) 복합물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 지주골량, 지주골 평균 길이, 두께 및 수, 피질골 두께의 증가가 인정되었다. 한편 risedronate 투여군에서도 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 지주골량, 지주골 평균 길이 및 수의 증가가 인정되었으나, 지주골 및 피질골 두께는 OVX 대조군과 유사하게 관찰되었다.
대퇴골의 지주골량 및 지주골의 평균 수는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -71.19 및 -81.88%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 288.20, 118.43, 100.92, 115.13, 108.99, 97.78, 106.36, 108.77, 212.57, 121.16, 115.20 및 109.93%의 지주골량의 변화를 나타내었고, 각각 714.81, 211.11, 159.26, 192.59, 203.70, 185.19, 177.78, 222.22, 429.63, 200.00, 196.30 및 214.81%의 평균 지주골의 수의 변화를 나타내었다.
대퇴골 지주골의 평균 길이 및 두께는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -67.13 및 -47.53%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 160.34, 86.98, 106.22, 107.92, 103.57, 99.86, 103.23, 95.94, 187.15, 108.56, 99.16 및 88.67%의 지주골의 평균 길이의 변화를 나타내었고, 각각 1.67, 37.65, 35.07, 35.63, 38.59, 46.84, 38.41, 45.88, 72.06, 41.43, 40.09 및 34.93%의 지주골의 평균 두께의 변화를 나타내었다.
대퇴골 피질골 두께가 OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 -44.07%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -0.35, 15.02, 10.36, 13.97, 12.08, 11.03, 11.57, 11.37, 38.01, 13.60, 13.89 및 14.73%의 변화를 나타내었다.
7)-2.
골흡수
OVX 대조군의 경우, 대퇴골의 파골세포 수와 비율 (OS/BS) 이 각각 위수술 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물과 모든 9 종의 EAP:DM (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 파골세포 수와 OS/BS의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 파골세포 수와 OS/BS의 감소가 인정되었다. 한편 RES 2.5 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군과 유사한 파골세포의 수적 변화가 대퇴골에서 인정되었으나, OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) OS/BS의 감소를 나타내었다.
대퇴골의 파골세포 수 및 OS/BS는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 554.17 및 582.79%의 변화를 나타내었으나, RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 3:1, 5:1, 7:1 및 9:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 3.16, -29.30, -33.12, -31.21, -32.48, -29.94, -36.31, -33.12, -66.24, -36.31, -37.58 및 -32.48%의 파골세포 수 의 변화를 나타내었고, 각각 -60.10, -38.59, -42.75, -39.88, -41.51, -36.30, -41.23, -40.95, -71.62, -44.99, -44.57 및 -40.12%의 OS/BS의 변화를 나타내었다.
소결
본 실험의 결과, OVX 대조군에서는 현저한 체중 증가와 함께 대퇴골의 중량, 골밀도, 골강도, 무기질 Ca 및 IP 함량 감소가 지주골 및 피질골의 현저한 조직병리학적 감소와 함께 인정되었으며, 혈중 오스테오칼신(osteocalcin) 함량의 증가와 함께 혈중 bALP 활성의 감소가 각각 인정되었다. 즉, 전형적인 에스트로겐 결핍성 골다공증 소견이 OVX수술에 의해 유발되는 것으로 관찰되었다.
한편, 이러한 OVX에 의해 유발된 에스트로겐 결핍성 골다공증 소견이 EAP 및 DM 단독 조성물과 9종의 모든 EAP:DM(g/g) 복합 조성물의 35일에 걸친 연속 경구 투여에 의해 현저히 억제되었으나, EAP:DM(g/g) 복합 조성물, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 OVX로 유발 에스트로겐 결핍성 골다공증 개선 효과가 인정되었다.
한편, RES 2.5 mg/kg 투여군에서는 알려진 것과 같이 OVX에 의한 에스트로겐 결핍성 골다공증 시 초래되는 골 교체(bone turn over) 증가에 의한 골밀도 및 지주골량의 감소 억제에 따른 골강도의 증가를 나타내었으나, 골형성 지표 - bALP 활성, 피질골 및 지주골 두께에는 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
본 실험의 결과, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물은 RES 2.5 mg/kg 보다 비교적 낮은 골흡수 억제 효과를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg 투여군에서 인정되지 않은 골 형성 촉진 효과가 인정되어, 전체적으로 RES 2.5 mg/kg과 비교할만한 골다공증 개선 효과를 나타내는 것으로 판단된다. 따라서 적어도 본 실험의 OVX 마우스 실험의 조건하에서, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성은 함유한 생리활성 성분의 다양화를 통해, EAP와 DM의 골다공증 개선 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 것으로 판단된다.
난소적출 (Ovariectomy;
OVX
)
랫트
모델을 이용한 실험
1. 실험동물
7주령의 virgin SPF/VAF Outbred Crl:CD[Sprague-Dawley] 암컷 랫트 (OrientBio, Seungnam, Korea) [ANNEX I, II]를 7일간 순화 후 사용하였으며, OVX 수술 27일 후 체중이 일정한 실험동물만 선정하여, 군 당 8마리씩 총 8개 군으로 분리하여 실험에 이용하였다(OVX 랫트 체중: 357.55 g, 339~403 g; 위수술 랫트 체중: 277.00g, 254~295 g). 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회의 사전 승인 하에 실시하였다.
1) 군 분리 (총 8 개군; 군 당 8마리)
A: Sham control: 위 수술후 멸균 증류수 5 ml/kg 투여 매체 대조군
B: OVX control: OVX 수술후 멸균 증류수 5 ml/kg 투여 매체 대조군
C: RES: OVX 수술 후, RES 2.5 mg/kg/day 경구 투여 대조 약물군
D: EAP: OVX 수술 후, EAP 단독 조성물 200 mg/kg 투여군
E: DM: OVX 수술 후, DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군
F: Mix400: OVX 수술 후 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 mg/kg (300:100 mg/kg) 투여군
G: Mix200: OVX 수술 후 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 200 mg/kg (150:50 mg/kg) 투여군
H: Mix100: OVX 수술 후 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg (75:25 mg/kg) 투여군
2) 약물의 투여
EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg, 또는 RES 2.5 mg/kg 을 OVX 28일 후부터, 매일 1회씩 56일간 금속제 존데가 부착된 5ml 주사기를 사용하여 강제 경구투여하였다.
즉, EAP 및 DM 단독 조성물 투여군에서는 각각 40 mg/ml의 농도로 멸균증류수에 용해시켜, 5 ml/kg의 용량 (200 mg/kg/day)으로 경구 투여하였으며, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 최고용량, 중간용량 및 최저용량 투여군에서는 EAP와 DM을 각각 60:20, 30:10 및 15:5 mg/ml의 농도로 멸균 증류수에 동시에 용해시켜 5 ml/kg의 용량 (400, 200 및 100 mg/kg/day)으로 강제 경구 투여하였고, RES 역시 멸균 증류수에 0.5 mg/ml의 농도로 용해시켜 5 ml/kg의 용량 (2.5 mg/kg/day)으로 연속 경구 투여하였다. 위수술 (sham) 및 OVX 대조군에서는 동일한 보정 및 강제 투여에 따른 stress를 가하기 위해, 실험물질 대신 매체인 멸균 증류수만 동일한 용량으로 동일한 기간 동안 경구 투여하였다.
3)
OVX에
의한 골다공증 유발
본 연구자 등의 이전 방법 [Choi et al., 2014; Kang et al., 2015; Jung et al., 2016]에 따라, 위수술 대조군을 제외한 모든 실험동물을 무작위로 선정하여, 실험동물을 7일간 실험실 환경에 순화 시킨 다음, 설치류용 흡입마취기 (Surgivet, Waukesha, WI, USA)와 환기 장치 (Model 687, Harvard Apparatus, Cambridge, UK)를 이용하여2~3% isoflurane (Hana Pharm. Co., Hwasung, Korea)과 70% N2O및 28.5% O2혼합가스로 전신 흡입 마취를 유도한 다음, 1~1.5% isoflurane과 70% N2O및 28.5% O2혼합가스로 마취를 유지하면서, 개복 수술을 통해 양쪽 난소를 완전히 절제하여 estrogen-deficient 골다공증을 유발하였다. 한편 위수술군에서는 동일한 방법으로 양쪽 난소를 확인 후, 절제하지 않고 복강을 다시 폐쇄하였다. 위수술군을 포함한 모든 실험동물은 OVX수술 34일 후, 체중 (OVX rat: 357.55 g, 339~403 g; 위수술 rat: 277.00g, 254~295 g)을 기준으로, 군당 8마리씩 선정하여 실험에 사용하였다.
4) 관찰항목
OVX 수술 전 1일, OVX 수술일, 투여 전 1일 (OVX 27일 후), 투여 시작일, 투여 시작 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 55 및 56 일 (최종 희생일) 후의 체중을 각각 기록하였으며, OVX에 의한 골다공증 유발기 및 투여 8주 동안의 증체량의 변화 역시 산출하였다. 최종 희생일에 골중량 (습, 건조 및 탄화 중량), 외부 계측치 (장축 길이, neck 및 mid-shaft두께), 골무기질 Ca 및 IP 함량, 골밀도, 골강도 및 골량 및 구조와 골흡수에 대한 조직병리학적 변화를 혈중 osteocalcin, P1NP, Ca 및 IP 함량, bALP 활성, 뇨 Dpd/creatinine 비율의 변화와 함께 각각 측정하였다. 본 실험에서 양쪽 대퇴골과 경골, 4번 및 5번 요추골 (L4 및 L5)을 샘플하여, 우측 대퇴골과 경골 및 L4를 이용하여 골중량, 외부계측, 골무기질함량, 골밀도 및 골강도 측정에 각각 이용하였으며, 좌측 대퇴골과 경골 및 L5를 각각 조직병리학적 검사에 이용하였다.
관찰 뼈: 대퇴골, 경골 및 L4 또는 L5
골 외부 계측치: 전체 길이 (장축), neck 및 mid-shaft 두께 (단축)
골중량: 습중량/건조중량/탄화골중량
혈액 생화학치: Osteocalcin, P1NP, Ca 및 IP 함량, bALP 활성
뇨검사: Dpd 및 Creatinine 함량, Dpd/Creatinine 비율
골강도, 골밀도
골 무기질 함량: Ca, P, Ca/IP 비율
조직형태계측(Histomorphometry): 골량에 관련된 지주골량 (TV/BV), 지주골 수 (Tbn), 두께 (Tbt), 길이 (Tbl), 피질골 두께 (Cbt)를 측정하였으며, 골흡수와 관련된 파골세포 수 (Ocn) 및 파골세포 면적 (OS/BS)의 변화
2. 결과
1) 체중 및
증체량의
변화
본 실험에서 OVX 수술 27일 후, 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중의 증가를 나타내는 실험동물만 선정하여 사용하였으므로 (OVX 랫트: 357.55g, 339~ 403 g; 위수술 랫트: 277.00g, 254~295 g), 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중 및 OVX 후 유발기인 4주 동안의 증체량의 증가가 모든 OVX 수술군에서 인정되었다.
하기 표 5와 같이, EAP 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 투여 시작 35일 후부터 인정되기 시작하여, OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 투여기간 8주 동안의 증체량의 감소를 각각 나타내었고, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 200 mg/kg 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 투여기간 8주 동안의 증체량의 감소를 각각 나타내었다.
한편, RES 2.5 mg/kg과 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 인정되지 않았고, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서도 OVX 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중의 변화는 인정되지 않았으나, 투여기간 8주 동안의 증체량은 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었으며, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여 유의성 있는 체중 및 투여기간 동안의 증체량의 변화 역시 인정되지 않았다.
도 6은 각 실험물질의 투약 전후의 체중 변화를 나타내는 그래프이다. 이를 참조하면, OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 투여기간 8주 동안의 증체량이54.11%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -6.15, -17.76, -8.88, -37.70, -29.92 및 -16.80%의 변화를 나타내었다.
2)
골중량의
변화
하기 표 6(대퇴골), 표 7(경골) 및 표 8(L4)과 같이, OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중에 대한 대퇴골, 경골 및 L4 상대 습중량의 감소와 함께 건조 및 탄화골의 절대 및 상대 중량의 감소가 각각 인정되었으나, RES 2.5 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L4 중량의 증가가 각각 인정되었다. 특히, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L4 상대 습중량의 증가와 건조 및 탄화골의 절대 및 상대 중량의 증가가 각각 인정되었다. 한편 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 대퇴골, 경골 및 L4 습중량, 건조 및 탄화골 절대 및 상대 중량의 변화는 인정되지 않았다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 절대 습중량 및 체중에 대한 상대 습중량이 각각 -1.22 및 -24.42%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 3.00, -0.45, 0.06, 5.44, 5.35 및 4.61%의 대퇴골 절대 습중량의 변화를 나타내었고, 각각 4.92, 3.86, 3.01, 15.34, 13.21 및 8.17%의 대퇴골 상대 습중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 절대 건조중량 및 체중에 대한 상대 건조중량이 각각 -18.68 및 -39.40%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 14.38, 6.58, 5.97, 16.69, 13.51 및 7.12%의 대퇴골 절대 건조중량의 변화를 나타내었고, 각각 16.55, 11.19, 8.90, 27.57, 22.17 및 10.93%의 대퇴골 상대 건조중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 절대 탄화중량 및 체중에 대한 상대 탄화중량이 각각 -29.12 및 -47.09%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 26.29, 14.98, 13.86, 24.97, 22.49 및 15.43%의 대퇴골 절대 탄화중량의 변화를 나타내었고, 각각 28.56, 19.90, 17.31, 36.51, 31.67 및 19.33%의 대퇴골 상대 탄화중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 경골 절대 습중량 및 체중에 대한 상대 습중량이 각각 -1.29 및 -26.42%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 3.83, 0.31, -0.21, 3.69, 2.73 및 1.83%의 경골 절대 습중량의 변화를 나타내었고, 각각 5.83, 4.68, 2.78, 13.39, 10.50 및 5.44%의 경골 상대 습중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 경골 절대 건조중량 및 체중에 대한 상대 건조중량이 각각 -21.05 및 -41.08%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 23.17, 8.50, 7.53, 22.15, 17.66 및 8.98%의 경골 절대 건조중량의 변화를 나타내었고, 각각 25.06, 13.08, 10.62, 33.15, 26.49 및 12.62%의 경골 상대 건조중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 경골 절대 탄화중량 및 체중에 대한 상대 탄화중량이 각각 -27.62 및 -46.12%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 29.01, 12.79, 10.80, 27.87, 24.40 및 12.20%의 경골 절대 탄화중량의 변화를 나타내었고, 각각 31.77, 17.86, 14.31, 39.86, 31.14 및 16.27%의 경골 상대 탄화중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 L4 절대 습중량 및 체중에 대한 상대 습중량이 각각 -3.65 및 -28.27%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 4.77, 1.36, 0.37, 7.29, 7.84 및 2.62%의 L4 절대 습중량의 변화를 나타내었고, 각각 6.60, 5.76, 3.27, 17.31, 15.94 및 6.09%의 L4 상대 습중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 L4 절대 건조중량 및 체중에 대한 상대 건조중량이 각각 -22.63 및 -42.30%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 20.76, 9.77, 8.20, 20.64, 17.73 및 10.81%의 L4 절대 건조중량의 변화를 나타내었고, 각각 22.97, 14.54, 11.44, 32.00, 26.70 및 14.68%의 L4 상대 건조중량의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 L4 절대 탄화중량 및 체중에 대한 상대 탄화중량이 각각 -36.63 및 -52.79%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 33.71, 12.67, 9.73, 32.13, 25.23 및 12.44%의 L4 절대 탄화중량의 변화를 나타내었고, 각각 36.13, 17.67, 13.00, 44.32, 34.81 및 16.47%의 L4 상대 탄화중량의 변화를 나타내었다.
3) 골 외부 계측치의 변화
OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골, 경골 및 L4 neck 및 mid-shaft두께의 감소가 각각 인정되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L4 neck 및 mid-shaft두께의 증가가 각각 인정되었다. 특히, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L4 neck 및 mid-shaft두께의 증가가 각각 인정되었다. 한편 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 대퇴골, 경골 및 L4 neck 및 mid-shaft두께의 변화는 인정되지 않았다. 또한 OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) L4 전체 길이의 감소가 인정되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) L4 전체 길이의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) L4 전체 길이의 증가가 각각 인정되었다.
한편, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 L4 전체 길이의 변화는 인정되지 않았다. RES 2.5 mg/kg 투여군에서도 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골, 경골 및 L4 neck 두께, L4 전체 길이의 증가가 인정되었으나, 대퇴골, 경골 및 L4 mid-shaft 두께에는 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. OVX 대조군에서 위수술 대조군과 비교하여 유의성 있는 대퇴골 및 경골의 전체 길이 변화는 인정되지 않았으며, EAP 단독 조성물 200 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험 물질 투여군에서도 OVX 및 위수술 대조군과 비교하여 유의성 있는 대퇴골 및 경골의 전체 길이 변화는 각각 인정되지 않았다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 전체 길이, neck 및 mid-shaft 두께가 각각 0.45, -12.83 및 -7.24%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -0.93, 0.54, 0.63, 0.09, 0.56 및 0.31%의 대퇴골 전체 길이의 변화를 나타내었고, 16.69, 5.10, 4.26, 10.87, 9.20 및 5.25%의 대퇴골 neck 두께 의 변화를 나타내었으며, 0.32, 2.92, 2.12, 6.65, 5.32 및 2.88%의 대퇴골 mid-shaft 두께의 변화를 각각 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 경골 전체 길이, neck 및 mid-shaft 두께가 각각 0.34, -9.18 및 -8.55%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 0.60, 0.54, 0.35, 0.28, 0.27 및 0.01%의 경골 전체 길이의 변화를 나타내었고, 8.11, 2.43, 2.19, 7.74, 6.68 및 2.40%의 경골 neck 두께 의 변화를 나타내었으며, 0.16, 3.99, 3.39, 10.26, 8.19 및 3.35%의 경골 mid-shaft 두께의 변화를 각각 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 L4 전체 길이, neck 및 mid-shaft 두께가 각각 -10.84, -18.95 및 -19.62%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 10.87, 4.01, 3.81, 10.29, 9.35 및 3.98%의 L4 전체 길이의 변화를 나타내었고, 22.82, 9.38, 8.31, 22.12, 18.27 및 9.44%의 L4 neck 두께 의 변화를 나타내었 으며, 0.48, 5.45, 4.02, 14.93, 11.27 및 4.98%의 L4 mid-shaft 두께의 변화를 각각 나타내었다.
4) 골밀도의 변화
하기 표 12와 같이, OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 평균 total body, 대퇴골, 경골 및 L4 골밀도가 각각 유의성 있게 (p<0.01) 감소된 반면, DM 단독 조성물 200 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) total body, 대퇴골, 경골 및 L4 골밀도의 증가가 각각 인정되었고, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 평균 total body, 대퇴골, 경골 및 L4 골밀도의 증가가 인정되었다. 한편 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 평균 total body, 대퇴골, 경골 및 L4 골밀도의 변화는 인정되지 않았다.
도 7은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약 후 래트의 total body 및 대퇴골의 골밀도의 변화를 나타내는 Dual-energy x-ray absorptionmetry 이미지이다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 평균 total body 골밀도가 -10.73%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 13.20, 5.90, 5.43, 12.36, 10.30 및 5.88%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 평균 대퇴골 골밀도가 -12.85%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 9.44, 3.31, 3.21, 8.56, 6.61 및 3.33%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 평균 경골 골밀도가 -11.45%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 14.80, 4.05, 3.05, 9.45, 8.04 및 3.57%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 평균 L4 골밀도가 -19.05%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 21.04, 9.51, 8.26, 19.43, 16.21 및 8.98%의 변화를 나타내었다.
5)
골강도의
변화
상기 표 12와 같이, OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 대퇴골 및 경골 mid-shaft 부위의 골강도가 각각 유의성 있게 (p<0.01) 감소된 반면, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 mg/kg을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 및 경골 골강도의 증가가 각각 인정되었다. 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골 및 경골 mid-shaft 부위 골강도의 증가가 인정되었다. 한편 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 대퇴골 및 경골 mid-shaft 골강도의 변화는 인정되지 않았다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 mid-shaft 골강도가 -39.81%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 48.58, 11.87, 10.79, 45.99, 32.50 및 10.99%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 경골 mid-shaft 골강도가 -37.40%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 45.12, 22.48, 20.25, 41.44, 32.97 및 21.72%의 변화를 나타내었다.
6) 골 무기질 함량의 변화
하기 표 13, 표 14, 표 15와 같이, OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 대퇴골, 경골 및 L4 Ca 및 IP 함량의 유의성 있는 (p<0.01) 감소가 인정되었으나, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 200 mg/kg 을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L4 Ca 및 IP 함량의 증가가 각각 인정되었고, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L4 Ca 및 IP 함량의 증가가 인정되었다.
한편 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 대퇴골, 경골 및 L4 Ca 및 IP 함량의 변화는 인정되지 않았고, OVX 대조군에서 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 대퇴골 Ca/IP 비율의 변화는 인정되지 않았으며, OVX 대조군에 비해 유의성 있는 대퇴골 Ca/IP 비율의 변화 역시 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군을 포함한 모든 실험물질 투여군에서 인정되지 않았다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 대퇴골 Ca 과 IP 함량 및 Ca/IP 비율이 각각 -29.80, -31.05 및 1.72%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 38.47, 16.63, 16.29, 32.62, 25.43 및 16.60%의 대퇴골 Ca 함량의 변화를 나타내었고, 32.34, 13.33, 12.66, 28.33, 23.39 및 12.99%의 대퇴골 IP 함량의 변화를 나타내었으며, 6.00, 2.89, 3.15, 3.36, 1.57 및 3.07%의 대퇴골 Ca/IP 비율의 변화를 각각 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 경골 Ca 과 IP 함량 및 Ca/IP 비율이 각각 -37.20, -38.25 및 1.53%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 54.63, 19.91, 19.55, 45.46, 29.94 및 19.62%의 경골 Ca 함량의 변화를 나타내었고, 52.08, 23.16, 20.28, 46.42, 35.28 및 22.93%의 경골 IP 함량의 변화를 나타내었으며, 1.87, -2.38, -0.77, -0.49, -4.24 및 -2.76%의 경골 Ca/IP 비율의 변화를 각각 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 L4 Ca 과 IP 함량 및 Ca/IP 비율이 각각 -39.92, -39.26 및 -0.88%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 53.04, 15.35, 12.66, 36.53, 26.67 및 14.45%의 L4 Ca 함량의 변화를 나타내었고, 50.60, 15.49, 12.40, 35.36, 26.22 및 13.99%의 L4 IP 함량의 변화를 나타내었 으며, 1.36, -0.50, -0.16, 0.27, 0.05 및 0.37%의 L4 Ca/IP 비율의 변화를 각각 나타내었다.
7) 혈액 생화학적 변화:
Osteocalcin
,
bALP
, Ca 및
IP함량과
bALP
활성
하기 표 16과 같이, OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 osteocalcin 함량의 증가와 함께 유의성 있는 (p<0.01) P1NP, Ca 및 IP 함량과 bALP 활성의 감소가 각각 인정되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, 모든 3 용량의 EAP:DM (g/g) 3:1 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 osteocalcin 함량의 감소가 혈중 P1NP, Ca 및 IP 함량, bALP활성의 증가와 함께 각각 인정되었다. 특히, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 osteocalcin 함량의 감소, 혈중 P1NP, Ca 및 IP 함량과 bALP활성의 증가가 인정되었다. 한편 RES 2.5 mg/kg 투여군에서도 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 osteocalcin 함량의 감소가 인정되었으나, OVX 대조군과 유사한 혈중 P1NP, Ca 및 IP 함량과 bALP 활성이 각각 인정되었으며, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 혈중 osteocalcin, P1NP, Ca 및 IP 함량과 bALP활성의 변화는 인정되지 않았다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 혈중 osteocalcin 함량이 144.14%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -59.69, -28.45, -26.72, -46.61, -41.81 및 -27.76%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 혈중 bALP 활성이 -55.68%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 0.98, 27.40, 22.43, 65.67, 54.23 및 25.04%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 혈중 P1NP 함량이 -58.58%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 3.55, 36.65, 31.06, 95.37, 75.75 및 34.87%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 혈중 Ca 함량이 -44.42%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 1.48, 30.23, 27.13, 62.85, 46.81 및 28.37%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 혈중 IP 함량이 -37.12%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 0.16, 19.11, 16.99, 48.16, 36.79 및 18.62%의 변화를 나타내었다.
8) 뇨 분석:
Dpd
및
creatinine
함량과
Dpd
/
Creatinine
비율
하기 표 17과 같이, OVX 대조군에서는 위수술 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 뇨중 Dpd 함량의 증가에 따른 Dpd/Creatinine 비율의 증가가 각각 인정되었으나, EAP:DM (g/g) 3:1 복합 조성물 100 mg/kg을 포함한 모든 실험 물질 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 뇨중 Dpd 함량 및 Dpd/Creatinine 비율의 감소가 각각 인정되었다.
특히, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 뇨중 Dpd 함량 및 Dpd/Creatinine 비율의 감소가 인정되었다. 한편 OVX 대조군을 포함한 모든 투여군에서는 위수술 대조군과 비교하여 의미 있는 뇨중 creatinine 함량의 변화는 인정되지 않았으며, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 뇨중 Dpd 및 creatinine 함량과 Dpd/Creatinine 비율의 변화는 인정되지 않았다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 뇨중 Dpd 함량이 111.29%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -60.36, -20.93, -18.38, -48.20, -36.34 및 -19.90%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 뇨중 Creatinine 함량이 -4.71%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 2.28, 3.99, 2.85, 1.33, 4.75 및 3.04%의 변화를 나타내었다.
OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 뇨중 Dpd/Creatinine 비율이 125.48%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -61.55, -24.88, -20.02, -49.03, -39.36 및 -22.81%의 변화를 나타내었다.
9) 조직병리학적 변화
하기 표 18, 표 19, 표 20과 같이, 위 수술군의 대퇴골, 경골 및 L5에서는 비교적 잘 발달된 지주골과 피질골이 관찰된 반면 OVX 대조군에서는 파골세포의 현저한 수적 및 활성 증가에 따른 지주골 및 피질골량의 감소가 각각 인정되었다. EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 모든 3 용량의 모든 EAP:DM (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 대퇴골의 파골세포 활성 억제에 의한 지주골 및 피질골의 골량 및 두께의 유의성 있는 현저한 증가가 대퇴골, 경골 및 L5에서 각각 인정되었으며, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg투여군에 비해서도 현저한 파골세포 활성 억제 및 골량 보존 효과가 각각 인정되었다. 한편 RES 2.5 mg/kg 투여군에서는 OVX대조군에 비해 지주골의 현저한 증가가 대퇴골, 경골 및 L5에서 각각 인정되었으나, 피질골은 매체 대조군과 유사하게 관찰되었으며, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 대퇴골, 경골 및 L5의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다.
도 8은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 9는 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 경골의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
도 10은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 L5의 조직학적 변화를 나타내는 이미지이다.
9-1) Bone mass 및 구조
OVX 대조군의 경우, 대퇴골, 경골 및 L5의 지주골량, 지주골 평균 길이, 두께 및 수, mid-shaft 부분의 피질골 두께가 각각 위수술 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 감소되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg과 모든 3 용량의 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L5지주골량, 지주골 평균 길이, 두께 및 수, 피질골 두께의 증가가 인정되었으며, 특히 EAP:DM 3:1, (g/g) 복합물 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골, 경골 및 L5지주골량, 지주골 평균 길이, 두께 및 수, 피질골 두께의 증가가 각각 인정되었다. 한편 RES 투여군에서도 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골, 경골 및 L5지주골량, 지주골 평균 길이 및 수의 증가가 인정되었으나, 지주골 및 피질골 두께는 OVX 대조군과 유사하게 관찰되었으며, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 대퇴골, 경골 및 L5 지주골량, 지주골 평균 길이, 두께 및 수, mid-shaft 부분의 피질골 두께의 유의성 있는 변화는 각각 인정되지 않았다.
대퇴골 지주골량 및 지주골의 평균 수는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -61.68 및 -61.18%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 170.92, 38.25, 25.11, 118.88, 75.03 및 36.26%의 대퇴골 지주골량의 변화를 나타내었고, 각각 376.09, 68.48, 57.61, 142.39, 114.13 및 67.39%의 대퇴골 평균 지주골 수의 변화를 나타내었다.
대퇴골 지주골의 평균 길이 및 두께는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -48.67 및 -51.54%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 45.32, 29.39, 18.80, 87.61, 62.82 및 21.90%의 대퇴골 지주골 평균 길이의 변화를 나타내었고, 각각 -2.99, 36.26, 26.83, 86.46, 68.94 및 30.60%의 대퇴골 지주골 평균 길이의 변화를 나타내었다.
대퇴골 피질골 두께가 OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 -17.94%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 2.79, 10.44, 8.01, 21.20, 16.99 및 8.65%의 변화를 나타내었다.
경골 지주골량 및 지주골의 평균 수는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -64.10 및 -61.09%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 185.71, 49.44, 42.06, 132.94, 95.78 및 45.54%의 경골 지주골량의 변화를 나타내었고, 각각 211.00, 25.00, 34.00, 124.00, 96.00 및 29.00%의 경골 평균 지주골 수의 변화를 나타내었다.
경골 지주골의 평균 길이 및 두께는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -69.97 및 -53.88%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 217.28, 69.67, 59.81, 153.90, 92.49 및 62.91%의 경골 지주골 평균 길이의 변화를 나타내었고, 각각 -4.30, 45.86, 39.98, 98.78, 91.07 및 44.71%의 경골 지주골 평균 길이의 변화를 나타내었다.
경골 피질골 두께가 OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 -32.86%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -0.16, 9.94, 8.26, 40.24, 23.10 및 8.96%의 변화를 나타내었다.
L5 지주골량 및 지주골의 평균 수는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -41.39 및 -37.75%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 45.04, 24.53, 16.87, 58.77, 43.05 및 18.13%의 L5 지주골량의 변화를 나타내었고, 각각 48.94, 17.02, 15.96, 60.64, 39.36 및 17.02%의 L5 평균 지주골 수의 변화를 나타내었다.
L5 지주골의 평균 길이 및 두께는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 -33.79 및 -35.73%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 43.52, 16.48, 9.55, 41.43, 32.06 및 13.91%의 L5 지주골 평균 길이의 변화를 나타내었고, 각각 -1.88, 22.55, 20.51, 50.82, 44.06 및 21.94%의 L5 지주골 평균 길이의 변화를 나타내었다.
L5 피질골 두께가 OVX 대조군의 경우, 위수술 대조군에 비해 -33.42%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 2.67, 13.16, 13.22, 39.45, 29.15 및 12.62%의 변화를 나타내었다.
9-2) 골 흡수
도 11은 래트 실험에서 RES, EAP 및 DM 단독 조성물, EAP:DM의 복합조성물의 투약에 따른 대퇴골, 경골, 및 L5의 파골세포를 나타내는 이미지이다.
OVX 대조군의 경우, 대퇴골, 경골 및 L5의 파골세포 수와 비율 (OS/BS) 이 각각 위수술 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었으나, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg과 모든 3종의 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 각각 OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L5 파골세포 수와 OS/BS의 감소가 각각 인정되었으며, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 대퇴골, 경골 및 L5 파골세포 수와 OS/BS의 감소가 인정되었다. 한편 RES 2.5 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군과 유사한 파골세포의 수적 변화가 대퇴골, 경골 및 L5에서 인정되었으나, OVX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) OS/BS의 감소를 대퇴골, 경골 및 L5에서 각각 나타내었고, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 대퇴골, 경골 및 L5 파골세포 수와 OS/BS의 유의성 있는 변화는 각각 인정되지 않았다.
대퇴골의 파골세포 수 및 OS/BS는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 308.33 및 401.21%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 19.18, -29.39, -26.94, -65.31, -52.65 및 -27.76%의 대퇴골 파골세포 수의 변화를 나타내었고, 각각 -71.40, -34.01, -28.61, -64.54, -53.10 및 -32.74%의 대퇴골 OS/BS의 변화를 나타내었다.
경골의 파골세포 수 및 OS/BS는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 253.33 및 482.51%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 7.55, -31.32, -26.04, -52.08, -45.28 및 -27.92%의 경골 파골세포 수의 변화를 나타내었고, 각각 -76.25, -25.83, -23.61, -52.60, -44.09 및 -25.51%의 경골OS/BS의 변화를 나타내었다.
L5의 파골세포 수 및 OS/BS는 OVX대조군에서 정상 대조군에 비해 각각 322.45 및 588.89%의 변화를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg, EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비해 각각 -3.38, -27.54, -26.57, -56.52, -43.96 및 -27.05%의 L5 파골세포 수의 변화를 나타내었고, 각각 -64.66, -26.78, -24.55, -60.28, -39.24 및 -25.83%의 L5 OS/BS의 변화를 나타내었다.
소결
본 실험의 결과, OVX 랫트에서 초래된 에스트로겐 결핍성 골다공증 소견이 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg과 세 용량의 모든 EAP:DM (g/g) 복합 조성물 400, 200 및 100의 56일에 걸친 연속 경구 투여에 의해 현저히 억제되었고, 특히 EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 400 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각의 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군에 비해서도 유의성 있는 OVX로 유발 에스트로겐 결핍성 골다공증 개선 효과가 인정되었다.
한편, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성물 100 mg/kg 투여군에서는 EAP 및 DM 단독 조성물 200 mg/kg 투여군과 비교하여, 유의성 있는 골다공증 개선 효과의 변화는 인정되지 않았다. EAP:DM 3:1(g/g) 복합 조성물 400 mg/kg은 RES 2.5 mg/kg 보다 비교적 낮은 골 흡수 억제 효과를 나타내었으나, RES 2.5 mg/kg 투여군에서 인정되지 않은 골 형성 촉진 효과가 인정되어, 전체적으로 RES 2.5 mg/kg과 비교할만한 골다공증 개선 효과를 나타내는 것으로 판단된다. 따라서 적어도 본 실험의 OVX 랫트 실험의 조건하에서, EAP:DM 3:1 (g/g) 복합 조성은 함유한 생리활성 성분의 다양화를 통해, EAP와 DM의 골다공증 개선 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 것으로 다시 한번 판단되었다.
이상, 구현예 및 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 구현예들에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다. 또한, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.
Claims (9)
- 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001 유래의 수용성 베타-1,3/1,6 글루칸을 포함하는 바이오 폴리머 및 황칠 추출물을 3:0.8 내지 1.2의 중량비로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 골 질환은 골다공증, 뼈의 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성 골질환인 골 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물로 사용되는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품의 조성물로 사용되는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 의약외품 조성물로 사용되는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
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