KR101974135B1 - 방광암 및/또는 방광의 염증성 병태의 검출을 위한 새로운 마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 방광암의 검출을 위한 인간 호중성구 마커 인터루킨 8 수용체 B (IL8Rb)의 용도, 보다 상세하게는 방광의 이행성 세포 암종 (TCC) 및 방광의 염증성 병태를 판별하는 IL8Rb의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 질환의 검출에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 방광 질환의 검출을 위한 유전적 및/또는 단백질 마커들의 용도, 보다 상세하게는 방광의 이행성 세포 암종 (TCC)의 검출 또는 방광의 염증성 병태의 검출을 위한 유전적 및/또는 단백질 마커들의 용도에 관한 것이다.
암 환자들의 생존은 암이 조기에 치료될 때 크게 증진된다. 방광암의 경우에, 일차적 부위에 한정되는 질환으로 진단된 환자들은 전이성 질환을 가진 환자들의 6%와 대비하여 73%의 5년 생존율을 가진다 (Altekruse et al.). 따라서, 방광암의 조기 진단 및 정확한 진단을 가져오는 개발들이 환자들에게 개선된 예후를 유도할 수 있다. 암의 조기 검출을 돕기 위하여 많은 암 특이 마커들이 확인되어 왔다. 그러나, 이들 마커들의 사용은 방광암이 아닌 염증성 방광 질환들을 가진 환자들에서 위양성 결과들을 유발할 수 있다.
NMP22® ELISA (미국 메사추세스주의 매트리테크사 (Matritech, Inc.)의 등록 상표), 휴대용 블래더체크® (point-of-care BladderChek®) 검정법들 (미국 메사추세스주의 매트리테크사의 등록 상표), 유로비전® (UroVysion®) (미국 일리노이주의 애보트 래보러토리사 (Abbott Laboratories, Inc.)의 등록 상표), 이뮤노사이트® (ImmunoCyt®) (캐나다 온타리오의 사노피 파스퇴르사 (Sanofi Pasteur Limited/Sanofi Pasteur Limitee), 및 캐나다 온타리오의 아벤티스 파스퇴르사 (Aventis Pasteur Limited/Adventis Pasteur Limitee), 또한 BTA (방광 종양 항원)을 포함하는 여러 가지 테스트들이, 모두가 세포학을 일상적으로 대체하도록 충분한 성적을 보여주지는 못하였더라도 방광암 진단 또는 감시를 위한 FDA 승인을 받았다.
Altekruse SF, Kosary CL, Krapcho M, Neyman N, Aminou R, Waldron W, Ruhl J, Howlader N, Tatalovich Z, Cho H, Mariotto A, Eisner MP, Lewis DR, Cronin K, Chen HS, Feuer EJ, Stinchcomb DG, Edwards BK (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2007, National Cancer Institute. Bethesda, MD, http:// seer.cancer.gov/csr/1975_2007/, based on November 2009 SEER data submission, posted to the SEER web site, 2010.
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방광에서의 염증성 질환의 진단을 위해, 또한 방광의 이행성 세포 암종 (transitional cell carcinoma, TCC)의 진단을 개선하도록, 방광에서 염증성 질환에 특이적인 심화 (further) 마커들의 필요성이 있다. 상세하게는, 다른 염증성 병태로부터 TCC의 분화를 허용하는 마커들의 필요성이 있다.
본 발명의 관점들은 방광에서 염증성 질환의 검출을, 또한 방광의 이행성 세포 암종 (TCC)의 진단에서 위양성 결과들의 빈도를 감소시키도록 제공할 수 있는 방법들, 조성물들 및 장치들을 제공한다.
세포에 의해 분비되거나 이로부터 절단되거나, 세포사멸 기작들에 의해 단독또는 서로 조합으로 소실되는 단백질들 또는 핵산들은, 방광에서 염증성 질환 및/또는 방광암을 포함하는 질환의 진단을 위한 혈청 또는 체액 마커들로서 또는 확립된 질환의 진행을 감시하는 마커들로서 유용성을 가진다. 단백질 및 세포 마커들의 검출은 당해 기술분야에서 알려져 있는 방법들을 사용하여 수행될 수 있고, RT-PCR, qRT-PCR, 모노클론 항체들, 폴리클론 혈청들 등의 사용을 포함한다.
상세하게, 본 발명은 (i) 생물학적 시료를 제공하고; 또한 (ii) 상기 시료에서 하나 이상의 방광 종양 마커들 (BTM)과 연관된 인간 호중성구 마커 인터루킨 8 수용체 B (IL8Rb)의 수준들을 검출하는: 단계를 포함하는, 방광암을 검출하거나 진단하는 방법을 제공한다. 암의 존재는 IL8Rb 및 하나 이상의 BTM의 수준들을 정상 환자들, 방광암을 가진 환자들, 및/또는 염증성 질환을 가진 환자들에서의 수준들과 비교하여 확립될 수 있다. 예를 들어, 암의 존재는 역치 (threshold)에 대비한 IL8Rb를 포함하는 마커의 발현을 비교하여 확립될 수 있다. 역치는 정상 발현의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 이상이 되는 발현의 차원일 수 있다. IL8Rb의 높은 발현은 암이라기 보다는 염증성 질환의 표시가 될 수 있다.
본 발명의 방법은 방광암을 검출하는 적합한 마커라면 모두와 결합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 사용에 적합한 마커들의 예들은 도 6 및 도 7에 개괄된다. 본 발명은 환자에서의 방광암을 검출하도록 IL8Rb와 결합시킨 도 6 또는 도 7에서 개괄된 하나 이상의 마커들이라면 모두의 사용을 포함한다.
상세하게, 본 발명은 방광암을 진단하도록 하나 이상의 마커들 MDK, CDC2, HOXA13 및 IGFBP5이라면 모두와 결합시킨 IL8Rb의 사용과 연관된다. 즉, 본 발명은 하나 이상의 마커들 MDK, CDC2, HOXA13 및 IGFBP5이라면 모두와 IL8Rb의 조합이라면 모두도 역시 포함하고, 이는 방광암을 검출하는 데 적합한 하나 이상의 다른 마커, 예를 들어 도 6 또는 도 7에서 개괄된 하나 이상의 마커들이라면 모두와도 역시 조합될 수 있다. 상세하게, 본 발명은 마커들의 조합의 하나라면 모두를 포함한다: IL8Rb / MDK, IL8Rb / CDC2, IL8Rb / HOXA13, IL8Rb / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2, IL8Rb / MDK / HOXA13, IL8Rb / MDK / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / HOXA13 / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / MDK / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5, 및 IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5. 이들 조합들은 임의적으로 방광암을 검출하는 데 적합한 하나 이상의 심화 마커들, 도 6 또는 도 7에서 개관된 하나 이상의 마커들을 포함할 수 있다.
본 발명은 (i) 환자로부터 나온 생물학적 시료를 제공하고; 또한 (ii) 상기 시료에서 인간 호중성구 마커 인터루킨 8 수용체 B (IL8Rb)의 수준들을 검출하는: 단계를 포함하는, 방광의 염증성 병태를 검출하는 방법도 역시 제공한다. 방광의 염증성 병태의 존재는 IL8Rb 수준들을 정상 환자들, 및 방광의 염증성 병태를 가진 환자들에서의 수준들과 비교하여 확립될 수 있다. 예를 들어, 방광의 염증성 병태의 존재는 역치에 대비한 IL8Rb를 포함하는 마커의 발현을 비교하여 확립될 수 있다. 역치는 정상 발현의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 이상이 되는 발현의 차원일 수 있다.
본 발명의 방법들은 유전자 발현의 적합한 마커라면 모두를 검출하여, 예를 들어 적합한 방법이라면 모두를 사용하여 mRNA, cDNA, 단백질 또는 펩타이드의 수준들을 결정하여 수행될 수 있다.
진단의 확립은 사용 분류인자 체계 (use classifier system), 예를 들어 선형 판별 분석 (Linear Discriminant Analysis, LDA), 로지스틱 회귀분석 (Logistic Regression, LogReg), 서포트 벡터 머신 (Support Vector Machine, SVM), K-최근접 5개 이웃들 (KN5N), 및 분배 트리 분류인자 (Partition Tree Classifier, TREE)를 통하여 확립될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 IL8RB 포획 시약 및 그 위의 하나 이상의 방광 종양 마커 (BTM)에 대한 포획 시약을 가지는 기질; 또한 상기 포획 시약과 연관된 발현을 검출할 수 있는, 상기 기질과 연관된 검출기:를 포함하는, 방광암 및 방광의 염증성 병태를 검출하는 장치를 제공한다.
본 발명은 IL8RB 포획 시약 및 그 위의 하나 이상의 방광 종양 마커들 (BTM)에 대한 포획 시약을 가지는 기질; 상기 포획 시약 및 마커의 복합체를 영상화하는 수단; 시약들; 또한 사용시 지침들:을 포함하는, 방광암을 검출하는 키트도 역시 제공한다.
좀 더 나아간 구현예에서, 본 발명은 방광암을 가질 위험성이 있는 환자로부터 나온 테스트 시료를 제공하고; 상기 테스트 시료에서 IL8Rb 단백질 및 하나 이상의 방광 종양 마커 (BTM)의 발현을 측정하고; 또한 상기 테스트 시료에 존재하는 IL8Rb 발현 및 하나 이상의 BTMs의 양을 방광암을 가지지 않은 개체들로부터 나온 하나 이상의 대조군 시료들로부터 얻은 수치, 및/또는 방광의 염증성 병태를 가진 개체들의 하나 이상의 대조군 시료들과 비교하는: 단계들을 포함하는, 방광암을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 테스트 개체로부터 나온 테스트 시료를 제공하고; 상기 테스트 시료에서 IL8Rb 및 하나 이상의 방광 종양 마커들 (BTM)의 존재를 측정하고; 또한 상기 테스트 시료에 존재하는 마커들의 양을 방광암을 가지지 않은 개체들로부터 나온 하나 이상의 대조군 시료들로부터 얻은 수치, 및/또는 방광의 염증성 병태를 가진 하나 이상의 개체들의 대조군 시료들과 비교하는: 단계들을 포함하는, 방광암을 검색하는 방법도 역시 제공한다.
놀랍게도, IL8Rb는 염증성 방광 질환의 존재를 검출할 수 있고, 이것이 염증성 방광 병태에 의해 초래되는 위양성 결과들의 잠재성을 감소시켜서 환자에서 방광암을 정확하게 검출하도록 방광암에 대한 마커의 능력을 증가시키는 데 사용될 수 있는 점이 확인되었다.
정의들
본 발명의 구현예들을 자세하게 기술하기 이전에, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 일정 용어들의 정의들을 제공하는 것이 유용할 것이다.
용어 "마커 (marker)"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 말한다. "마커들"의 예들로는 현상의 선행 기작과 직접 또는 간접적으로 관련되는, 유전자 또는 유전자 단편, RNA 또는 RNA 단편과 같은 폴리뉴클레오타이드; 또는 펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질 또는 단백질 단편과 같은 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 산물; 또는 산물들로서 관련 대사물들; 또는 항체들 또는 항체 단편들과 같은 기타 확인용 분자들이라면 모두를 포함한다. 본 발명의 마커들은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열들 (예로, 진뱅크 서열들), 상세하게 전장의 서열들, 코딩 서열들이라면 모두, 단편들이라면 모두, 그들의 상보물들이라면 모두 및 상기 정의된 바와 같은 그들의 측정가능한 마커를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바 "항체들 (antibodies)" 등의 용어들은 면역글로불린 분자들 및 면역글로불린 (IgG) 분자들의 면역학적으로 활성을 가진 일부분들, 예로 항원과 특이적으로 결합하는 (면역반응하는) 항원 결합 부위를 포함하는 분자들을 말한다. 이들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리클론, 모노클론, 키메라, 단일 사슬, Fc, Fab, Fab', 및 Fab2 단편들, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함한다. 항체 분자들은 IgG, IgM, IgA, IgE, 및 IgD 부류들이라면 모두에 관한 것이고, 이들은 분자에 존재하는 중쇄의 본성에 의해 다른 것들과 구별된다. 이들은 마찬가지로 IgG1, IgG2, 및 기타와 같은 소부류들을 포함한다. 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다. 본 명세서에서 항체들에 대한 언급은 모든 부류들, 소부류들, 및 유형들에 대한 언급을 포함한다. 키메라 항체들, 예를 들어 하나 이상의 출처 예로 마우스 또는 인간 서열에 특이적인 모노클론 항체들 또는 그들의 단편들도 역시 포함된다.
용어들 "암 (cancer)" 및 "암성 (cancerous)"은 비정상적 또는 미조절된 세포 성장으로 전형적으로 특징 지워지는 포유동물들에서의 생리학적 조건을 말하거나 기술한다. 암 및 암 병리학은, 예를 들어 전이, 이웃하는 세포들의 정상적 기능작용과의 간섭, 비정상적 수준들로 사이토카인들 또는 다른 분비성 산물들의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화, 신생물 증식, 전악성 종양 (premalignancy), 악성 종양, 림프절 등과 같은 주변 또는 먼 조직들 또는 기관들의 침입과 연관될 수 있다.
용어 "종양 (tumour)"은 악성 또는 양성인 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 또한 모든 전암성 및 암성 세포들 및 조직들을 말한다.
용어 "방광암 (bladder cancer)"은 방광에서 기원하는 종양을 말한다. 이들 종양들은 기관이라면 모두로 전이될 수 있다.
용어 "BTM" 또는 "방광 종양 마커 (bladder tumour marker)" 또는 "BTM 패밀리 구성원 (BTM family member)"은 방광암 및 방광의 이행성 세포 암종 (TCC)과 연관된 종양 마커 (TM)를 의미한다. 용어 BTM은 그의 조합이 방광암을 검출하는 민감도 및 특이도를 개선시키는 개별적 마커들의 조합들도 역시 포함한다. 용어 BTM은 마커가 단지 방광 종양들에 대해 특이적일 것을 요구하지 않는 것으로 이해된다. 오히려, BTM의 발현은 다른 유형들의 세포들, 병적인 세포들, 악성 종양들을 포함하는 종양들에서 변경될 수 있다.
용어 "과소 발현되는 BTM (under expressing BTM)"은 비악성 방광 조직보다 방광 종양들에서 더 낮은 발현을 나타내는 마커를 의미한다.
용어 "과다 발현되는 BTM (over expressing BTM)"은 비악성 방광 조직보다 방광 종양들에서 더 높은 발현을 나타내는 마커를 의미한다 .
용어들 "차별적으로 발현되는 (differentially expressed)", "차별적 발현 (differential expression)" 등의 어구들은 대조군 개체 (예로, 기준 시료)에서의 그의 발현과 대비하여, 병태 상세하게는 흑색종과 같은 암을 가지는 개체 (예로, 테스트 시료)에서 발현이 더 높거나 더 낮은 수준으로 활성화되는 유전자 마커를 말한다. 용어들은 동일한 병태의 서로 다른 단계들에서; 좋거나 나쁜 예후를 가진 질환들에서; 또는 더 높거나 더 낮은 증식 수준들을 가진 세포들에서 발현이 더 높거나 더 낮은 수준으로 활성화되는 마커들도 역시 포함한다. 차별적으로 발현되는 마커는 폴리뉴클레오타이드 수준 또는 폴리펩타이드 수준에서 활성화 또는 저해 둘 중 하나가 될 수 있거나, 서로 다른 폴리펩타이드 산물을 가져오는 대안의 스프라이싱이 일어날 수 있다. 이러한 차이점들은, 예를 들어 폴리펩타이드의 mRNA 수준들, 표면 발현, 분비 또는 기타 다른 분배 (partitioning)에서의 변화에 의해 입증될 수 있다.
차별적 발현은 둘 이상의 마커들 (예로, 유전자들 또는 그들의 유전자 산물들) 간의 발현 비교; 또는 둘 이상의 마커들 (예로, 유전자들 또는 그들의 유전자 산물들) 간의 발현율들의 비교; 또는 동일한 마커의 서로 다르게 가공되는 산물들 둘 (예로, 전사물들 또는 폴리펩타이드들)의 비교를 포함할 수 있고, 이는 정상 개체들 및 병적인 개체들 사이; 또는 동일한 질환의 다양한 단계들 사이; 또는 좋거나 나쁜 예후를 가진 질환들 사이; 또는 더 높거나 낮은 증식 수준들을 가진 세포들 사이; 또는 정상 조직 및 병적인 조직, 상세하게는 암 또는 흑색종 사이에 서로 달라진다. 차별적 발현은, 예를 들어 정상 및 병적인 세포들 중에서, 또는 서로 다른 질환 진행들 (events) 또는 질환 단계들을 겪었던 세포들, 또는 서로 다른 증식의 수준들을 가진 세포들 중에서 유전자 또는 그의 발현 산물들의 일시적 또는 세포성 발현 양상에서의 정량적 뿐만 아니라 정성적 차이점들 둘 다를 포함한다.
용어 "발현 (expression)"은 폴리뉴클레오타이드들 및 폴리펩타이드들의 생산, 상세하게는 유전자 또는 유전자의 일부분으로부터 RNA (예로, mRNA)의 생산을 포함하고,RNA 또는 유전자 또는 유전자의 일부분에 의해 인코드되는 폴리펩타이드의 생산 및 발현과 연관된 검출가능한 물질의 출현을 포함한다. 예를 들어, 예로는 폴리펩타이드-폴리펩타이드 상호작용, 폴리펩타이드-뉴클레오타이드 상호작용 등으로부터 복합체의 형성이 용어 "발현"의 범주 속에 포함된다. 또 다른 예로는 혼성화 탐침 또는 항체와 같은 결합 리간드의 유전자 또는 기타 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편과의 결합 및 결합 리간드의 영상화이다. 따라서, 마이크로어레이 (microarray) 상, 노던 블럿과 같은 혼성화 블럿 상, 또는 웨스턴 블럿과 같은 면역블럿 상, 또는 비드 어레이 (bead array) 상의, 또는 PCR 분석에 의한 스폿 (spot)의 강도는 용어 내재 생물학적 분자의 "발현" 속에 포함된다.
용어 "유전자 발현 역치 (gene expression threshold)", 및 "정의된 발현 역치 (defined expression threshold)"는 상호교환적으로 사용되고, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 수준이 환자에서 병태에 대한 예측 마커로서 작용하는 문제가 되는 마커의 수준을 말한다. 예를 들어, 소정의 역치를 초과하는 IL8Rb의 발현은 환자가 염증성 병태를 가진 점을 진단한다. 역치는 방광암 마커들을 사용하여 의심되는 방광암에 대하여 환자를 테스트할 때도 역시 사용될 수 있다. 역치초과의 발현 수준들은 환자가 암에 대한 위양성 테스트를 초래하기 쉽도록 염증성 방광 병태를 가진 점을 가리키는 한편, 역치 미만의 IL8Rb의 발현 수준들은 환자가 염증성 방광 병태를 가지지 않는 점을 예측한다. IL8Rb의 측정을 포함하는 것에 의해, 방광 종양 마커들의 발현으로부터 나온 결과들이라면 모두가 IL8Rb의 수준들이 역치 미만인지 여부에 의존될 수 있다 (예로, 양성 결과는 실제로 염증으로부터 생긴 점막으로부터 나온 비악성 세포들의 탈락으로부터 유발되는 방광 종양 마커들의 증가된 수준들이라기 보다는 암을 가진 환자에 대해 양성일 가능성이 있다).
용어 "진단적 역치 (diagnostic threshold)"는 환자가 주어진 병태, 예를 들어 방광암이 있거나 없는 것으로 진단되었던 것으로 주장될 수 있는 역치를 말한다. 일반적으로 진단적 역치는 집단 (populations), 유병률, 및 임상적 성과와 같은 요인들에 의존하여, 원하는 민감도 및 특이도를 달성하도록 설정된다. 일반적으로 진단적 역치는 알고리즘들, 및/또는 전산화된 데이타 분석을 사용하여 계산되고 및/또는 확립될 수 있다.
정확한 역치는 집단에 의존적일 것이고 또한 모델이라면 모두가 질환을 예측하는 데 사용된다 (예측 모델). 역치는 하기 실시예들에서 기술된 것들과 같은 임상적 연구들로부터 실험적으로 확립된다. 사용된 예측 모델에 의존하여, 발현 역치는 최대의 민감도, 또는 최대의 특이도, 또는 최소의 오차 (최대의 분류율 (classification rate))를 달성하도록 설정될 수 있다. 예를 들어, 더 높은 역치는 최소의 오차들을 달성하도록 설정될 수 있지만, 이것이 더 낮은 민감도를 가져올 수 있다. 따라서, 주어진 예측 모델이라면 모두의 경우 임상적 연구들이 일반적으로 최고의 민감도를 달성하면서 최소의 오차율을 가지는 발현 역치를 달성하는 데 사용될 것이다. 일반적으로, 역치는 아마도 정상 발현의 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 이상이 되는 발현의 차원일 수 있다.
용어 "민감도 (sensitivity)"는 (모델에 의해) 양성으로 테스트된 질환을 가진 개인들의 비율을 의미한다. 따라서, 증가된 민감도는 더 적은 위음성 테스트 결과들을 의미한다.
용어 "특이도 (specificity)"는 (모델에 의해) 음성으로 테스트된 질환을 가지지 않은 개인들의 비율을 의미한다. 따라서, 증가된 특이도는 더 적은 위양성 테스트 결과들을 의미한다.
용어 "ROC 곡선 (ROC curve)" 또는 수신자 작동 특징 (Receiver Operating Characterisitc) 곡선은 특정한 마커 또는 테스트의 서로 다른 컷오프 점수들에 대한 위양성율 (특이도)과 대비한 진정 양성율 (민감도)의 좌표를 의미한다. ROC 곡선 상의 각 점수는 주어진 역치에 해당하는 특이적 민감도/특이도 점수를 나타낸다. ROC 곡선은 원하는 성과를 내도록 역치를 확립하는 데 중요할 수 있다. ROC 곡선 아래의 영역은 (AUC 분석으로서 표현됨), 주어진 테스트의 마커가 진단적 성과들로 서로 간 구별할 수 있는 정도의 척도가 될 수 있다. ROC 곡선은 두 가지 서로 다른 테스트들의 정확성을 비교하는 데도 역시 사용될 수 있다.
용어 "올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)"는, 제한되는 것은 아니지만 단일가닥 데옥시리보뉴클레오타이드들, 단일- 또는 이중가닥 리보뉴클레오타이드들, RNA:DNA 혼성체들, 및 이중가닥 DNAs를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 전형적으로 탐침 또는 프라이머를 말한다. 단일가닥 DNA 탐침 올리고뉴클레오타이드들과 같은 올리고뉴클레오타이드들은, 예를 들어 시판되고 있는 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성기들을 사용하는 화학적 방법들에 의해, 또는 시험관내 발현 시스템들, 재조합 기법들, 또한 세포들 및 생물들에서의 발현을 포함하는 다양한 기타 방법들에 의해 종종 합성된다.
용어 "과다 발현 (overexpression)" 또는 "과다 발현된 (overe xpressed)"은 정상 조직에서 관찰되는 것 초과의 환자에서 유전자 또는 마커의 발현 수준을 말한다. 발현은 정상 조직에서의 발현보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2배 이상인 경우라면 과다 발현된 것으로 고려될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)"는 단수 또는 복수로 사용될 때, 일반적으로 미변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드라면 모두를 말한다. 이것은 제한되는 것은 아니지만, 단일- 및 이중가닥 DNA, 단일- 및 이중가닥 부위들을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중가닥 RNA, 또한 단일- 및 이중가닥 부위들을 포함하는 RNA, 단일가닥 또는 더욱 전형적으로 이중가닥이거나 단일- 및 이중가닥 부위들을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 혼성체 분자들을 포함한다. RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중가닥 부위들도 역시 포함된다. 상세하게는, mRNAs, cDNAs, 및 게놈 DNAs, 및 그들의 단편들이라면 모두가 포함된다. 본 용어는 삼중수소 (tritiated) 염기들과 같은 변형된 염기들, 또는 이노신과 같은 비정상적 염기들 하나 이상을 포함하는 DNAs 및 RNAs를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드들은 코딩 또는 비코딩 서열들, 또는 센스 또는 안티센스 서열들을 포괄할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드" 또는 유사 용어의 각 언급은 본 명세서에서 전장의 서열들뿐만 아니라 그들의 단편들, 유도체들, 또는 변이체들이라면 모두를 포함할 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "폴리펩타이드 (polypeptide)"는 올리고펩타이드, 펩타이드, 또는 단백질 서열 또는 그의 단편을, 또한 자연적으로 발생하는, 재조합, 합성, 또는 일부-합성 (semi-synthetic) 분자들을 말한다. 본 명세서에서 "폴리펩타이드"가 자연적으로 발생하는 단백질 분자의 아미노산 서열을 말하도록 재인용되는 곳에서, "폴리펩타이드" 및 유사 용어들은 아미노산 서열을 전장의 분자에 관한 완전하고 자연 그대로의 아미노산 서열에 제한되도록 의미하지는 않는다. 본 명세서에서 "폴리펩타이드" 또는 유사 용어에 대한 각 언급은 전장의 서열뿐만 아니라 그의 단편들, 유도체들, 또는 변이체들이라면 모두를 포함할 것으로 이해될 것이다.
용어 "qPCR" 또는 "QPCR"은, 예를 들어 PCR Technique: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997, 및 A-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004에 기술된 바와 같은 정량적 중합효소 연쇄반응을 말한다.
혼성화 반응들의 "엄격도 (stringency)"는 당업자라면 바로 결정가능하고, 일반적으로 탐침 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 의존적인 경험적 계산이다. 일반적으로, 더 긴 탐침들은 적절한 아닐링을 위한 더 높은 온도들을 요구하는 한편, 더 짧은 탐침들은 더 낮은 온도들을 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥들이 융해 온도 미만의 환경에 존재할 때 재아닐링하는 변성된 DNA의 능력에 의존한다. 탐침 및 혼성화가능한 서열 간의 원하는 상동성의 정도가 더 높을수록, 사용될 수 있는 상대 온도가 더 높아진다. 그 결과, 더 높은 상대 온도는 반응 조건들을 더 엄격하게 하는 경향일 수 있는 한편 더 낮은 온도는 덜 그러하게 된다. 추가적인 자세한 사항들 및 혼성화 반응들의 엄격도의 설명은, 예로 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)에서 확인된다.
본 명세서에서 정의되는 바, "엄격한 조건들 (stringent conditions)" 또는 "높은 엄격도 조건들 (high stringency conditions)"은 전형적으로: (1) 세척 시 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 소듐 사이트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 50℃에서 적용하고; (2) 혼성화 과정 동안 포름아마이드, 예를 들어 0.1% 소혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 소듐 포스페이트를 가진 50% (v/v) 포름아마이드와 같은 변성화제 (denaturating agent)를 750 mM 염화나트륨, 75 mM 소듐 사이트레이트를 가진 pH 6.5의 완충용액으로 42℃에서 적용하고; (3) 50% 포름아마이드, 5X SSC (0.75 M NaC1, 0.075 M 소듐 사이트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5X, 덴하르트 용액, 초음파 파쇄된 연어 정자 DNA (50 μg/m1), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 42℃에서 적용하면서, 0.2X SSC (염화나트륨/소듐 사이트레이트) 및 50% 포름아마이드로 55℃에서 세척하고, 이어서 EDTA를 포함하는 0.1X SSC를 포함하는 높은 엄격도 세척을 55℃에서 시행한다.
"적당하게 엄격한 조건들 (moderately stringent conditions)"은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 기술된 바와 같이 확인될 수 있고, 상기에 기술된 내용들보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건들 (예로, 온도, 이온 강도 및 % SDS)의 사용을 포함한다. 적당하게 엄격한 조건들의 예로는: 20% 포름아마이드, 5X SSC (150 mM NaC1, 15 mM 트리소듐 사이트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.6), 5X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/ml 변성된 파쇄된 연어 정자를 포함하는 용액으로 37℃에서 밤샘 배양을 시행하고, 이어서 1X SSC로 약 37 내지 50℃에서 필터들을 세척한다. 당업자라면 탐침 길이 등과 같은 요인들을 수용하는 데 필요한 온도, 이온 강도 등을 적응시키는 방법을 숙지하고 있을 것이다.
용어 "IL8Rb"는 호중성구 마커 인터루킨 8 수용체 B (케모카인 (C-X-C 모티브) 수용체 2 [CXCR2]라고도 알려져 있음) (도 1; 서열번호 1 및 2)를 의미하고, 마커 IL8Rb를 포함한다. 본 용어는 유전자 또는 유전자 단편, RNA 또는 RNA 단편; 또는 펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질 또는 단백질 단편과 같은 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 산물; 또는 산물들로서 관련 대사물들이라면 모두, 또는 항체들 또는 항체 단편들과 같은 기타 확인용 분자들이라면 모두를 포함한다.
용어 "신뢰도 (reliability)"는 위양성들 및 위음성들의 낮은 유병율를 포함한다. 따라서, 마커의 더 높은 신뢰도로는 더 적은 위양성들 및/또는 위음성들이 마커를 사용하여 시행되는 진단들과 연관되게 된다. 따라서 소정의 구현예들에서, 50% 이상의 선행기술 마커들의 신뢰도보다 더 큰 신뢰도로 방광의 염증성 질환 또는 암의 검출을 허용하는 마커들이 제공된다. 다른 구현예들에서, 약 70% 이상의 신뢰도를 가지는 마커들이 제공되고; 다른 구현예들에서, 약 73% 이상의 신뢰도를 가지는 마커들, 더욱 다른 구현예들에서 약 80% 이상, 보다 좀 더 나아간 구현예들에서 약 90% 이상, 더욱 다른 구현예들에서 약 95% 이상, 보다 좀 더 나아간 구현예들에서 약 98% 이상, 또한 소정의 구현예들에서 약 100% 신뢰도를 가지는 마커들을 제공한다.
본 발명의 관행은 달리 표시되지 않는 경우라면, 당해 기술분야에 속하는 분자생물학 (재조합 기법들을 포함), 미생물학, 세포생물학, 및 생화학의 통상적인 기법들을 적용할 것이다. 이러한 기법들은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D .M. Weir ＆ CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.M. Miller ＆ M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., 1987; 및 PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994와 같은 문헌에 전부 설명되어 있다.
상기 용어들은 단백질, DNA 서열 및/또는 RNA 서열을 말할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 상기 용어들은 본 명세서에서 나타난 바와 같은 동종의 (homologous) 서열들을 가지는 비인간 단백질들, DNA 및/또는 RNA도 역시 말하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 그의 특정한 구현예들을 참조하고 다음과 같은 도면들을 참조하여 기술된다.
도 1은 IL8Rb (CXCR2라고도 알려져 있음)의 단백질 및 mRNA 서열들을 나타낸 것이다.
도 2는 비악성 질환 (방광염, 요로 감염 및 요로결석증)으로부터 TCC의 분리에 미치는 IL8Rb의 효과를 보여주는 분산 좌표들을 나타낸 것이다. IL8Rb은 도 2c 및 2f에서 서로 다른 방광암 RNA 마커들로 치환되었다. (a) MDK/IGFBP5; (b) MDK/HOXA13; (c) MDK/IL8Rb; (d) CDC2/IGFBP5; (e) CDC2/HOXA13; (f) CDC2/IL8Rb.
도 3은 선형 판별분석 (LD) 및 선형 회귀분석 (LR)을 사용하여 유래된 진단적 알고리즘들에서 IL8Rb를 포함하는 효과를 보여주는 ROC 곡선 분석 (민감도 vs 특이도)을 나타낸 것이다. ROC 곡선들은 TCC (n = 56) 및 비악성 질환들인 방광염, 요로 감염 및 요로결석증 (n = 61)을 가진 환자들로부터 유래된다. (a) LD1 (직선) 및 LD2 (점선). (b) LR1 (직선) 및 LR2 (점선). IL8Rb는 LD2 및 LR2에 포함된다.
도 4는 선형 판별분석 (LD) 및 선형 회귀분석 (LR)을 사용하여 유래된 진단적 알고리즘들에서 IL8Rb를 포함하는 효과를 보여주는 확장된 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다. ROC 곡선들은 TCC (n = 56), 및 도 3과 달리 집단 (n = 386)에서 비악성 질환이라면 모두를 가진 환자들로부터 유래된다. (a) LD1 (직선) 및 LD2 (점선). (b) LR1 (직선) 및 LR2 (점선). IL8Rb는 LD2 및 LR2에 포함된다.
도 5는 비악성 소변학적 질환을 가진 환자들의 소변에서 IL8Rb mRNA의 축적을 보여주는 박스 좌표들을 나타낸 것이다. RNA는 델타-Ct 방법을 사용하는 qRT-PCR에 의해 정량되었다 (Holyoake et al, 2008). 본 방법으로는, 더 낮은 Ct가 더 높은 RNA 수준들을 반영한다. BPH: 전립선 비대증; UTI: 요로 감염; NS 전립선: 비특이 전립선 질환들; Vasc. 전립선: 혈관 전립선; 와파린 (warfarin): 와파린 사용에 따른 이차적인 혈뇨. 방광염/UTI를 가진 환자들에서 관찰들은 확인된 다른 비악성 연구들과는 유의하게 (p = 0.001) 서로 다르다.
도 6은 방광암에서 과다 발현되는 것으로 알려져 있고 본 발명에서의 사용에 적합한 마커들을 나타낸 것이다.
도 7은 방광암에서 과소 발현되는 것으로 알려져 있고 본 발명에서의 사용에 적합한 마커들을 나타낸 것이다.
도 8은 환자 채용 절차들의 흐름도 및 실시예 2의 숫자들을 나타낸 것이다.
도 9는 질환 상태 3개월까지 환자들의 기본 임상적 및 인구통계학적 특징들을 나타낸 것이다.
도 10은 소변 테스트들의 전반적인 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 ROC 곡선들을 나타낸 것이다. 도 11a는 NMP22 ELISA 및 uRNA-D에 대한 ROC 곡선들 (네 가지 마커들 MDK + CDC2 + IGFBP5 + HOXA13을 포함하는 테스트); 또한 도 11b는 다섯 가지의 마커들 MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 및 IL8Rb에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12는 단계, 등급, 종양의 위치, 종양의 다중도, 혈뇨 상태, 소변 시료의 크레아티닌 및 성별에 의해 소변 테스트들의 민감도를 나타낸 것이다. 도표들은 TCC를 가진 개체들 중에서 양성 소변 테스트를 가진 숫자들 및 백분율을 나타낸다.
도 13은 진단, 미세혈뇨, 크레아티닌 및 성별에 의해 소변 테스트들의 특이도를 나타낸 것이다. 도표들은 TCC가 없는 개체들 중에서 음성 소변 테스트를 가진 숫자 및 백분율을 나타낸다.
도 14는 다섯 가지의 서로 다른 분류인자 모델들 (i) 선형 판별 분석 (LDA), (ii) 로지스틱 회귀분석 (LogReg), (iii) 서포트 벡터 머신 (SVM), (iv) K-최근접 5개 이웃들 (KN5N), 및 (v) 분배 트리 분류인자 (TREE)를 사용하여, IL8Rb를 더하거나 뺀 마커들의 조합들 (a) MDK, (b) CDC, (c) IGFBP5, (d) HOXA13, (e) MDK+CDC2, (f) MDK+IGFBP5, (g) MDK+HOXA13, (h) CDC2+IGFBP5, (i) CDC+HOXA13, (j) IGF+HOXA13, (k) MDK+CDC2+IGFBP5, (l) MDK+CDC2+HOXA13, (m) MDK+IGFBP5+HOXA13, (n) CDC2+IGFBP5+HOXA13, (o) MDK+CDC2+IGFBP5+HOXA13에 대한 ROC 곡선들을 나타낸 것이다.
도 15는 (a) 도 14로부터 나온 ROC 곡선들의 20%까지의 위양성율 (80% 특이도)를 위한 "곡선 아래의 영역" (AUC)을 나타내고, (b) IL8Rb의 포함으로부터 유도되는 AUC 차이들을 나타낸 것이다.
도 16은 다섯 가지의 서로 다른 분류인자 모델들 (i) 선형 판별 분석 (LDA), (ii) 로지스틱 회귀분석 (LogReg), (iii) 서포트 벡터 머신 (SVM), (iv) K-최근접 5개 이웃들 (KN5N), 및 (v) 분배 트리 분류인자 (TREE)를 사용하여, IL8Rb를 더하거나 뺀 네 가지 마커들 MDK, CDC2, IGFBP5, 및 HOXA13의 조합들의 민감도를 서로 다른 설정의 특이도들 (a) 80%, (b) 85%, (c) 90%, (d) 95%, (e) 98%에서 나타낸 것이다.
도 17은 서로 다른 설정의 특이도들 (a) 80%, (b) 85%, (c) 90%, (d) 95%, (e) 98%에서 IL8Rb를 첨가함으로부터 그 결과 나온 민감도에서의 증가들, 또한 서로 다른 설정의 특이도들 (f) 80%, (g) 85%, (h) 90%, (i) 95%, (j) 98%에서 IL8Rb를 첨가함으로부터 그 결과 나온 민감도에서의 증가들을 나타낸 것이다.
도 1은 IL8Rb (CXCR2라고도 알려져 있음)의 단백질 및 mRNA 서열들을 나타낸 것이다.
도 2는 비악성 질환 (방광염, 요로 감염 및 요로결석증)으로부터 TCC의 분리에 미치는 IL8Rb의 효과를 보여주는 분산 좌표들을 나타낸 것이다. IL8Rb은 도 2c 및 2f에서 서로 다른 방광암 RNA 마커들로 치환되었다. (a) MDK/IGFBP5; (b) MDK/HOXA13; (c) MDK/IL8Rb; (d) CDC2/IGFBP5; (e) CDC2/HOXA13; (f) CDC2/IL8Rb.
도 3은 선형 판별분석 (LD) 및 선형 회귀분석 (LR)을 사용하여 유래된 진단적 알고리즘들에서 IL8Rb를 포함하는 효과를 보여주는 ROC 곡선 분석 (민감도 vs 특이도)을 나타낸 것이다. ROC 곡선들은 TCC (n = 56) 및 비악성 질환들인 방광염, 요로 감염 및 요로결석증 (n = 61)을 가진 환자들로부터 유래된다. (a) LD1 (직선) 및 LD2 (점선). (b) LR1 (직선) 및 LR2 (점선). IL8Rb는 LD2 및 LR2에 포함된다.
도 4는 선형 판별분석 (LD) 및 선형 회귀분석 (LR)을 사용하여 유래된 진단적 알고리즘들에서 IL8Rb를 포함하는 효과를 보여주는 확장된 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다. ROC 곡선들은 TCC (n = 56), 및 도 3과 달리 집단 (n = 386)에서 비악성 질환이라면 모두를 가진 환자들로부터 유래된다. (a) LD1 (직선) 및 LD2 (점선). (b) LR1 (직선) 및 LR2 (점선). IL8Rb는 LD2 및 LR2에 포함된다.
도 5는 비악성 소변학적 질환을 가진 환자들의 소변에서 IL8Rb mRNA의 축적을 보여주는 박스 좌표들을 나타낸 것이다. RNA는 델타-Ct 방법을 사용하는 qRT-PCR에 의해 정량되었다 (Holyoake et al, 2008). 본 방법으로는, 더 낮은 Ct가 더 높은 RNA 수준들을 반영한다. BPH: 전립선 비대증; UTI: 요로 감염; NS 전립선: 비특이 전립선 질환들; Vasc. 전립선: 혈관 전립선; 와파린 (warfarin): 와파린 사용에 따른 이차적인 혈뇨. 방광염/UTI를 가진 환자들에서 관찰들은 확인된 다른 비악성 연구들과는 유의하게 (p = 0.001) 서로 다르다.
도 6은 방광암에서 과다 발현되는 것으로 알려져 있고 본 발명에서의 사용에 적합한 마커들을 나타낸 것이다.
도 7은 방광암에서 과소 발현되는 것으로 알려져 있고 본 발명에서의 사용에 적합한 마커들을 나타낸 것이다.
도 8은 환자 채용 절차들의 흐름도 및 실시예 2의 숫자들을 나타낸 것이다.
도 9는 질환 상태 3개월까지 환자들의 기본 임상적 및 인구통계학적 특징들을 나타낸 것이다.
도 10은 소변 테스트들의 전반적인 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 ROC 곡선들을 나타낸 것이다. 도 11a는 NMP22 ELISA 및 uRNA-D에 대한 ROC 곡선들 (네 가지 마커들 MDK + CDC2 + IGFBP5 + HOXA13을 포함하는 테스트); 또한 도 11b는 다섯 가지의 마커들 MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 및 IL8Rb에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12는 단계, 등급, 종양의 위치, 종양의 다중도, 혈뇨 상태, 소변 시료의 크레아티닌 및 성별에 의해 소변 테스트들의 민감도를 나타낸 것이다. 도표들은 TCC를 가진 개체들 중에서 양성 소변 테스트를 가진 숫자들 및 백분율을 나타낸다.
도 13은 진단, 미세혈뇨, 크레아티닌 및 성별에 의해 소변 테스트들의 특이도를 나타낸 것이다. 도표들은 TCC가 없는 개체들 중에서 음성 소변 테스트를 가진 숫자 및 백분율을 나타낸다.
도 14는 다섯 가지의 서로 다른 분류인자 모델들 (i) 선형 판별 분석 (LDA), (ii) 로지스틱 회귀분석 (LogReg), (iii) 서포트 벡터 머신 (SVM), (iv) K-최근접 5개 이웃들 (KN5N), 및 (v) 분배 트리 분류인자 (TREE)를 사용하여, IL8Rb를 더하거나 뺀 마커들의 조합들 (a) MDK, (b) CDC, (c) IGFBP5, (d) HOXA13, (e) MDK+CDC2, (f) MDK+IGFBP5, (g) MDK+HOXA13, (h) CDC2+IGFBP5, (i) CDC+HOXA13, (j) IGF+HOXA13, (k) MDK+CDC2+IGFBP5, (l) MDK+CDC2+HOXA13, (m) MDK+IGFBP5+HOXA13, (n) CDC2+IGFBP5+HOXA13, (o) MDK+CDC2+IGFBP5+HOXA13에 대한 ROC 곡선들을 나타낸 것이다.
도 15는 (a) 도 14로부터 나온 ROC 곡선들의 20%까지의 위양성율 (80% 특이도)를 위한 "곡선 아래의 영역" (AUC)을 나타내고, (b) IL8Rb의 포함으로부터 유도되는 AUC 차이들을 나타낸 것이다.
도 16은 다섯 가지의 서로 다른 분류인자 모델들 (i) 선형 판별 분석 (LDA), (ii) 로지스틱 회귀분석 (LogReg), (iii) 서포트 벡터 머신 (SVM), (iv) K-최근접 5개 이웃들 (KN5N), 및 (v) 분배 트리 분류인자 (TREE)를 사용하여, IL8Rb를 더하거나 뺀 네 가지 마커들 MDK, CDC2, IGFBP5, 및 HOXA13의 조합들의 민감도를 서로 다른 설정의 특이도들 (a) 80%, (b) 85%, (c) 90%, (d) 95%, (e) 98%에서 나타낸 것이다.
도 17은 서로 다른 설정의 특이도들 (a) 80%, (b) 85%, (c) 90%, (d) 95%, (e) 98%에서 IL8Rb를 첨가함으로부터 그 결과 나온 민감도에서의 증가들, 또한 서로 다른 설정의 특이도들 (f) 80%, (g) 85%, (h) 90%, (i) 95%, (j) 98%에서 IL8Rb를 첨가함으로부터 그 결과 나온 민감도에서의 증가들을 나타낸 것이다.
유전자 마커들은 환자에 있는 질환을 검출하는 진단적 도구들로서 사용될 수 있다. 마커들은, 예를 들어 질환 조직 및 해당하는 비질환 조직 간에 차별적으로 발현될 수 있다. 본 상황에서, 차별적 발현의 검출은 질환의 존재와 연관된다. 임의적으로, 마커는 질환 조직들에서 일어나는 변화들, 또는 질환으로부터 유발되는 변화들과 직접적으로 연관될 수 있다. 염증성 질환들은 호중성구들에서 증가와 연관되어 있다. 호중성구 마커 인터루킨 8 수용체 B (IL8Rb)는 (케모카인 (C-X-C 모티브) 수용체 2 [CXCR2]라고도 알려져 있음) (도 1; 서열번호 1 및 2)는 시료에서 호중성구들의 존재에 대한 좋은 마커를 제공하고, 따라서 시료에서 염증성 질환의 검출을 위한, 상세하게는 방광의 염증성 질환의 검출 시 진단적 마커로서 사용될 수 있다.
도 5에 나타난 바와 같이, 소변에서 IL8Rb의 축적은 방광의 염증성 질환의 존재의 표시가 된다. 상세하게, 도 5는 병태들, 양성 전립선 비대증, 요로 감염, 비특이적 전립선 질환들, 혈관성 전립선 및 이차적인 와파린 사용을 가지는 환자들의 소변에서 IL8Rb의 축적을 보여준다. 그러나, IL8Rb의 사용은 이들 질환들의 검출에만 제한되지 않고, 이들 예들은 IL8Rb가 방광의 염증성 질환을 가진 환자들로부터 나온 시료들에서 증가하는 것을 보여주고 있는 점도 이해될 것이다. 즉, IL8Rb는 방광 질환과 연관된 염증의 마커로서 사용될 수 있고, 따라서 염증과 연관된 병태라면 모두를 검출하는 데 사용에 적합하다. 따라서, IL8Rb 양의 검출은 방광의 염증성 질환에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 보다 상세하게, IL8Rb는 호중성구들의 축적과 연관된 방광의 염증성 질환을 검출하는 데 사용될 수 있다.
방광의 이행성 세포 암종 (TCC)에 대한 소변 테스트들은 주로 소변에서 탈락된 종양 세포들에 있는 마커들의 존재에 의존한다. 이들 세포들을 검출하는 능력은 혈액 및 염증성 세포들과 같은 많은 수의 오염된 세포들의 존재에 의해 차단될 수 있다. 게다가, 방광 내층의 염증은 점막으로부터 비악성 세포들의 증가된 탈락을 유발할 수 있다. 그 결과, 방광 이행성 세포들로부터 유래된 마커들을 사용하는 소변 테스트들은 방광염, 요로 감염 또는 요로 염증 또는 요로결석증과 같은 이행성 세포 탈락을 유발하는 기타 병폐들을 가진 환자들로부터 수집한 소변 시료들로부터 위양성 결과를 줄 더 높은 가능성을 가진다.
이러한 위양성 결과들을 회피하는 한 가지 방식은 혈액 또는 염증성 세포들에서 낮은 상대적 발현을 가지는 마커들을 선택하도록 시도하려는 것이었다. 이러한 마커들의 사용은 비악성 염증성 병태들을 나타내는 TCC 환자들에서 더 적은 위양성들을 유도한다. 그러나, 혈액학적으로 유래된 세포들에서 마커들의 낮은 발현은 비악성 이행성 세포들의 탈락의 증진된 비율을 보상하지는 못한다.
방광암 소변 테스트들의 정확성에 미치는 염증성 조직으로부터 나온 탈락된 이행성 세포들의 부정적 영향은 요로의 염증성 병태를 가진 환자들의 확인과정을 개선하여 최소화될 수 있는 점이 발견되었다. 본 발명에서는 하나 이상의 방광 종양 마커들 (BTM's)과 조합으로 마커 IL8Rb를 사용하는 것이 방광암의 더 정확한 검출을 제공하는 점을 놀랍게도 확인하였다. 상세하게, 마커 IL8Rb를 포함하는 방광암의 마커를 기초로 한 테스트는 위양성 결과들에 덜 취약하고, 이는 염증성 비암 (non-cancer) 병태를 앓고 있는 환자들을 구별할 수 있다.
일반적으로, 염증성 병태의 존재 또는 부재는 역치를 초과 시 IL8Rb의 발현이 염증성 병태를 표시하는 유전자 발현의 역치를 가지는 것에 의해 확립된다. 예를 들어, 소정의 역치를 초과하는 IL8Rb의 발현은 환자가 염증성 병태를 가지는 점을 진단한다. IL8Rb가 방광암의 존재를 예측하는 하나 이상의 마커들과 결합하여 사용될 때, 소정의 역치를 초과하는 방광 종양 마커(들)의 증가된 발현, 및 IL8Rb 발현의 존재는 암이 아닌 염증성 병태를 가지는 환자를 예측한다. 또한, 테스트가 환자로부터 나온 소변 상에서 수행되는 경우라면, 다음으로 본 결과는 염증성 방광 병태를 가진 환자를 예측한다. 방광 종양 마커들의 높은 수준들은 염증의 결과로서 점막으로부터 나온 비악성 세포들의 결과일 가능성이 가장 있다. 즉, 방광 종양 마커(들)의 높은 수준들을 가지더라도 실제로 방광암을 가지지 않는다 - 위양성.
임의적으로, 환자가 하나 이상의 방광 종양 마커들의 높은 수준들 또는 진단적 수준들을 가지지만 IL8Rb의 수준은 역치 미만인 경우라면, 다음으로 이것은 환자가 암, 상세하게 방광암을 가질 가능성이 있는 점을 진단한다. 이것은 특히 테스트가 환자로부터 나온 소변 상에서 수행되는 경우라면, 그러하다. 본 결과는 의료 관계자들이 환자가 암을 가지는 것을 확신할 수 있고, 즉시 치료를 시작할 수 있으며, 실제로 결과가 위양성 결과를 주는 염증성 병태에 의해 초래되는 점을 걱정하지 않을 수 있기 때문에 의료 관계자에게 유의한 유익이 된다.
놀랍게도 호중성구 마커 인터루킨 8 수용체 B (IL8Rb)를 인코딩하는 유전자로부터 나온 RNA의 정량은 기지의 TCC 또는 BTM 마커들을 사용하여 TCC를 가진 환자들을 검출하는 전반적인 성적을 개선하는 점을 보여주었다. IL8Rb (케모카인 (C-X-C 모티브) 수용체 2 [CXCR2]라고도 알려져 있음)에 대한 기준 서열들은 도 1 또한 서열번호 1 및 2에 나타나 있다. TCC 검출에서 그의 역할에 추가하여, IL8Rb는 염증성 질환의 진단을 돕도록 소변 마커로서 사용될 수 있는지 여부가 탐구되어 왔다.
새로운 IL8Rb 마커의 용도는 유전자 발현 수준들을 검출하는 기지의 방법을 사용하는 방광의 염증성 병태의 검출을 위한 분리 (isolation)에 사용될 수 있다. 유전자 발현을 검출하는 방법들의 예들은 하기에 개괄된다.
임의적으로, IL8Rb는 방광암을 검출하도록 하나 이상의 BTMs와 조합될 수 있다. 방광암에 대한 테스트의 일부로서 새로운 염증성 질환 마커 IL8Rb를 사용하여, 위음성 결과를 만드는 미치는 염증 조직의 영향이 최소화되는 점이 확인되었다. 마커 IL8Rb는 방광암 마커들이라면 모두와 연관되어 사용될 수 있거나, 임의적으로 표식 (signature)의 일부로서 방광암을 검출하는 둘 이상의 마커들과 함께 사용될 수 있다.
방광암의 검출을 개선하는 IL8Rb의 작용은 방광암을 가진 환자들로부터 비악성 병태를 구분하는 능력으로부터 유도된다. 이것은 IL8Rb의 증가가 시료에 있는 호중성구들의 존재에서 증가를 표시하기 때문에 달성된다. 따라서, IL8Rb의 능력은 사용되는 방광 종양 마커에 의존하지 않는다. 도 2, 및 도 12 내지 15에서 나타난 바와 같이, 다양한 방광 종양 마커들 및 방광 종양 마커들의 조합들과 조합될 때, IL8Rb는 개체들에서 암을 검출하도록 마커(들) 능력의 특이도를 증가하는 일반적인 효과를 가진다.
방광암을 검출할 수 있는 마커라면 모두가 IL8Rb와 조합으로 사용에 적합한 것으로 이해될 것이다. TCC의 검출에서 IL8Rb와의 조합으로 사용에 적합한 기지의 BTMs의 예들은 도 6 및 7에 개괄된다. 상세하게, 도 6은 방광암에서 과다 발현되는 것으로 알려져 있는 마커들을 개괄하고, 도 7은 방광암에서 과소 발현되는 것으로 알려져 있는 많은 마커들을 개괄한다. 본 발명의 마커 IL8Rb의 새로운 용도는 도 6 또는 도 7의 마커들 하나 이상과 조합으로, 또는 임의적으로 도 6 또는 도 7로부터 선택되는 둘 이상의 마커들을 포함하는 증거와 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 증거의 한 가지 예는 MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13와의 조합으로 IL8Rb의 사용이고, 이는 방광암 예를 들어 도 6 또는 도 7에 개괄된 마커들의 하나 이상을 검출하는 데 적합한 하나 이상의 다른 마커와 조합으로도 역시 될 수 있다. 도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, IL8Rb는 마커들의 조합이라면 모두로, 상세하게는 조합들 IL8Rb / MDK, IL8Rb / CDC2, IL8Rb / HOXA13, IL8Rb / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2, IL8Rb / MDK / HOXA13, IL8Rb / MDK / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / HOXA13 / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / MDK / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5, and IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5로 사용될 수 있다. 도 14 및 도 15에서 나타낸 바와 같이, IL8Rb의 포함은 개체에서 방광암을 정확하게 진단하도록 마커, 또는 마커들의 조합의 능력을 증가시켰다. 본 발명은 이들 특이적 조합들에 제한되는 것은 아니지만, 선택적으로 방광암을 검출하는 데 적합한 하나 이상의 심화 마커들, 예를 들어 도 6 또는 도 7에 개괄된 하나 이상의 마커들이라면 모두를 포함할 수 있다.
표 1은 특이적 마커들 MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13 또한 IL8Rb에 대한 확인인자들 (identifiers)을 보여준다.
[표 1]
도 2 내지 도 4, 및 도 12 내지 도 17은 네 가지의 대표적인 방광암의 마커들: MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13과 조합으로 IL8Rb를 사용하는 것의 효과를 보여준다. 결과들은 IL8Rb가 각 마커와 개별적으로 사용되는 경우 (도 2, 도 14 및 도 15 내지 도 17)뿐만 아니라 네 가지 BTM 마커들의 가능한 모든 조합들로 사용될 때 증거로서 사용하여, TCC를 가진 환자들 및 비악성 병태를 가진 환자들의 시료들을 구분하는 능력을 개선하는 점을 보여주고 있다.
보다 상세하게, 도 10 내지 도 13에서 나타낸 바와 같이 네 가지 마커들 MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13 (uRNA-D)과 함께 IL8Rb의 포함은 네 가지 마커들 단독과 대비한 테스트뿐만 아니라 다른 기지의 테스트들, NMP22® " 미국 매사추세스주의 매트리테크사의 등록 상표" 엘라이자, NMP22 블래더체크® " 미국 매사추세스주의 매트리테크사의 등록 상표", 및 세포학과 매우 바람직하게 비교되는 테스트도 전반적인 성적을 증가시켰다. 도 14 내지 도 17도 역시 네 가지 마커들 MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13의 다양한 조합들에서 IL8Rb의 효과를 보여주고 있다.
상세하게, 도 14는 다섯 가지의 서로 다른 분류인자 모델들 (i) 선형 판별 분석 (LDA), (ii) 로지스틱 회귀분석 (LogReg), (iii) 서포트 벡터 머신 (SVM), (iv) K-최근접 5개 이웃들 (KN5N), 및 (v) 분배 트리 분류인자 (TREE)를 사용하여, IL8Rb가 있거나 없이 네 가지 마커들 MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13의 모든 조합들에 대한 ROC 곡선들을 나타내고 있다. 도 15는 5가지 분류인자들 모두 및 IL8Rb가 있거나 없는 4가지 생물마커들의 15가지 조합들 모두에 대한 곡선 아래의 영역 (AUC)을 도표화한 것이다. 본 AUC 계산은 0의 위양성율로부터 20%의 위양성율까지 특이도의 유용한 범위들을 포괄하는 (80 - 100%) 영역에 제한된다. AUC는 도 14의 ROC 곡선들 상의 가시적 차이점들을 정량하고 있다. 도 16은 IL8Rb가 있거나 없이 측정된 네 가지 마커들의 조합들의 민감도를 (a) 80%, (b) 85%, (c) 90%, (d) 95%, (e) 98%의 특이도들에서 나타낸다. 도 17은 (a, f) 80%, (b, g) 85%, (c, h) 90%, (d, l) 95%, 및 (e, j) 98%의 고정된 특이도들에서 민감도 (ROC 곡선들 상의 수직 방향; "위쪽"이 더 나음) 또는 특이도 (ROC 곡선 상의 수평 방향; 왼쪽이 더 나음) 둘 중 하나에서 변화들을 도표화하고 있다.
이들 도표들은 일반적으로 IL8Rb가 정상 시료들로부터 종양을 분류하도록 단독 또는 조합으로 생물마커들 (MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13)의 능력을 개선시킨다.
일반적으로 이들 결과들은 IL8Rb는 테스트가 방광암을 검출할 수 있는 정확도를 증가시킬 수 있었던 점을 보여주고 있다. 가장 큰 유익들은 마찬가지로 IL8Rb 포함이 없이 성적을 내지 못하던 마커들, 또는 마찬가지로 성적을 내지 못하던 분류인자들 둘 중 하나와 함께 관찰되는 곳이다. 가장 작은 유익들은 IL8Rb를 첨가하기 이전에 잘 성적을 내던 마커들 및/또는 분류인자들이 관찰되는 곳이고 따라서 개선의 여지가 적었다. 결과들이 집단 기초한 분석을 보여주고 IL8Rb 도입의 유익이 개별 환자들, 특히 BTM 마커들의 발현에 관한 진단이 불명확할 수 있는 환자들을 진단할 때 더욱 클 수 있는 점을 주목하는 것이 중요하다.
이들 결과들은 IL8Rb가 방광의 염증성 질환을 검출하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 방광암의 마커들과 조합으로 사용될 때 "위양성" 결과들의 감소로부터 생기는 방광암의 개선된 검출을 유도하는 점을 보여주고 있다.
이들 결과들은 다양한 마커들의 조합들의 전반적인 성적에 영향을 주는 IL8Rb의 유용성도 역시 보여주고, 환자에서 암을 정확하게 검출하도록 하나 이상의 방광암 마커들의 성적을 개선하는 IL8Rb의 능력을 확인시켜 주고 있다. 좀 더 나아가, 도 14 및 도 15는 동일한 결과들이 많은 범위의 분류인자 모델들을 사용하여 달성될 수 있는 점을 보여주고, 결과가 분류인자 모델 또는 알고리즘이라기 보다는 오히려 사용된 마커들의 조합에 의존하는 점을 보여준다. 이들 결과들은 적합한 분류인자 모델 또는 알고리즘이라면 모두가 본 발명에서 사용될 수 있는 점을 확인시켜준다. 상세하게, 도 14 및 도 15는 IL8Rb가 더 높은 특이도들에서, 상세하게 가장 임상적으로 적용가능한 범위들에서 더 큰 효과를 가지는 점을 보여준다.
본 발명은 소변에 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 수준 둘 중 하나에서 IL8Rb의 증가된 수준들의 검출이 염증성 방광 질환의 표시라는 연구를 기초로 한다. 이것은 단독으로 개체에서 염증성 방광 질환을 확립하는 진단 도구로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 위양성 결과 (예로, 방광암에 대해 양성으로 테스트되지만 사실상 염증성 방광 질환을 가지는 개체)로부터 진정한 양성 결과 (예로, 방광암을 가지는 양성 테스트되는 개체)의 구별을 허용하여 테스트의 특이도를 증가시키기 위하여 방광암에 대한 테스트와 결합하여 사용될 수 있다.
본 방법은 소변, 그러나 이상적으로는 IL8Rb의 수준의 표시가 될 수 있는 신체로부터 나온 적합한 시료라면 모두 상에서 시행될 수 있고, 심화 암 마커라면 모두가 소변 시료로부터 직접적으로 확립될 수 있다.
신체 시료들에서 마커들의 검출
여러 구현예들에서, 암의 검정법들은 바람직하게 혈액, 혈장, 혈청, 예를 들어 복강 세척액들을 사용하여 얻은 복강액, 또는 소변, 림프, 뇌척수액, 위액 또는 소변 시료들과 같은 기타 체액들 상에서 수행될 수 있다. 방광의 염증성 병태 또는 방광암의 검출을 위해, 이상적으로 테스트는 소변 시료 상에서 수행된다.
상세하게, 본 방광의 염증성 병태 또는 방광암의 검출하는 방법은 소변, 그러나 이상적으로는 IL8Rb의 수준의 표시가 될 수 있는 신체로부터 나온 적합한 시료라면 모두 상에서 시행될 수 있고, 어떠한 심화 암 마커라도 소변 시료로부터 직접적으로 확립될 수 있다.
테스트는 소변 시료 상에서 직접적으로 수행되거나, 시료에서 RNA 및/또는 단백질을 안정화하고 그들의 분해 (breakdown)를 예방하도록 당해 기술분야에 알려져 있는 화합물들 또는 완충액들이라면 모두의 첨가에 의해 안정화될 수 있다.
개체의 소변에서 단백질 및/또는 RNA 수준 둘 중 하나의 결정은 소변 상에서 직접 수행될 수 있거나, RNA 및/또는 단백질을 좀 더 정제하고 및/또는 농축하도록 소변이 처리될 수 있다. 단백질들 및 RNA를 추출하고 및/또는 농축하는 많은 방법들이 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 본 발명에서 사용될 수 있다.
특정한 개체가 IL8Rb의 차별적인 발현을 가지는지 여부 또한 암 마커라면 모두가 좀 더 필요한지 여부를 확립하기 위하여, IL8Rb의 RNA 및/또는 단백질 둘 중 하나의 수준 또한 선택적으로 하나 이상의 암 마커들이 시료에서 측정될 수 있다. 특정한 유전자의 수준을 RNA 및/또는 단백질 수준 둘 중 하나로 확립하는 많은 방법들이 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 적합한 방법이라면 모두가 본 발명에서 사용될 수 있는 점이 이해될 것이다. 일정 보편적인 방법들이 하기에 개괄되고 있지만, 본 발명은 이들 방법들에 제한되지 않고, 단백질 및/또는 RNA 수준들을 정량하는 방법이라면 모두가 본 발명에서의 사용에 적합하다.
유전자 마커들을 사용하는 질환 및 암 검출의 일반적인 접근법들
발현 수준들을 결정하는 방법이라면 모두가 적합할 것이라는 점이 이해될 것이지만, 발현 수준들을 결정하는 일반적인 방법론들이 하기에 개괄된다.
정량적 PCR (qPCR)
정량적 PCR (qPCR)이 특이적 프라이머들 및 탐침들을 사용하여 종양 시료들 상에서, 혈청 및 혈장 상에서 수행될 수 있다. 조절된 반응들에서, PCR 반응에서 형성되는 산물의 양은 초기 (starting) 주형의 양과 상관이 있다 (Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd.Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)) PCR 산물의 정량은 시약들이 제한되기 이전 로그 상에 있을 때 PCR 반응을 종결시켜서 수행될 수 있다. 다음으로 PCR 산물들은 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 젤들에서 전기영동되고, 에티디움 브로마이드 또는 비교가능한 DNA 염료로 염색되고 염색의 강도는 음영계측법 (densitometry)에 의해 측정된다. 임의적으로, PCR 반응의 진행은 어플라이드 바이오시스템사 프리즘 7000TM (Prism 7000TM)"미국 코네티컷의 어플레라사 (Applera Corporation)의 상표" 또는 실시간으로 산물 축적을 측정하는 로슈 라이트사이클러TM (Roche LightCyclerTM) (미국 캘리포니아의 로슈 몰레큘라 시스템사 (Roche Molecular Systems, Inc.)의 상표)와 같은 PCR 기계들을 사용하여 측정될 수 있다. 실시간 PCR은 합성된 PCR 산물 내로 사이버 그린 (Sybr Green)과 같은 DNA 삽입 염료들 (intercalating dyes)의 형광, 또는 제거물질 (quencher) 분자로부터 절단될 때 리포터 분자에 의해 방출되는 형광을 측정하고; 리포터 및 제거물질 분자는 프라이머 올리고뉴클레오타이드로부터 DNA 가닥 연장에 이어서 표적 DNA 분자와 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 탐침 내로 도입된다. 올리고뉴클레오타이드 탐침은 다음 번 PCR 반응 (cycle)에서 Taq 중합효소의 효소적 작용에 의해 치환되고 분해되고, 제거물질 분자로부터 리포터를 방출한다. 스콜피온 (Scorpion)이라고 알려진 한 가지 변형으로는, 탐침이 프라이머에 공유적으로 연결된다.
역전사 PCR (RT-PCR)
RT-PCR은 서로 다른 시료 집단들에서, 정상 및 종양 조직들에서, 약물 치료가 있거나 없이 RNA 수준들을 비교하고, 발현의 양상들을 특성분석하고, 밀접하게 관련된 RNAs 간을 판별하고, RNA 구조를 분석하는 데 사용될 수 있다.
RT-PCR의 경우, 첫 번째 단계는 표적 시료로부터 RNA의 분리이다. 시작 물질은 전형적으로 인간 종양들 또는 종양 세포주들로부터 분리된 전체 RNA, 및 해당하는 정상 조직들 또는 세포주들 각각이다. RNA는 유방, 폐, 결장 (예로, 대장 또는 소장), 결장직장, 위, 식도, 항문, 직장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 정소, 난소, 자궁, 방광 등으로부터 나온 종양 시료들, 조직들과 같은 다양한 시료들로부터, 일차 종양들, 또는 종양 세포주들로부터, 또한 건강한 공여자들로부터 나온 시료 풀들로부터 분리될 수 있다. RNA의 출처가 종양인 경우라면, RNA는 예를 들어 냉동 또는 보관된 파라핀-포매 및 고정된 (예로, 포르말린-고정) 조직 시료들로부터 추출될 수 있다.
RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일화 (profiling)에서 첫 번째 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사 (reverse transcription)이고, PCR 반응으로 그의 지수적 증폭이 이어진다. 가장 보편적으로 사용되는 역전사효소들의 두 가지는 조류 골수모세포종 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 상황들 및 발현 프로파일화의 목표에 따라, 특이적 프라이머들, 무작위 육중체들 (random hexamers), 또는 올리고-dT 프라이머들을 사용하여 전형적으로 감작된다. 예를 들어, 추출된 RNA는 제조사의 지침들에 따라 GeneAmp® RNA PCR 키트 (Perkin Elmer, CA, USA)를 사용하여 역전사될 수 있다. 다음으로 유래된 RNA는 연속되는 PCR 반응에서 주형으로서 사용될 수 있다.
PCR 단계는 다양한 열안정한 (thermostable) DNA-의존성 DNA 중합효소들을 사용할 수 있긴 하더라도, 전형적으로 5'-3' 핵산분해제 활성을 가지지만 3'-5' 프루프리딩 엔도핵산분해효소 활성은 결여된 Taq DNA 중합효소를 적용한다. 따라서, TaqMan® qPCR (미국 캘리포니아의 로슈 몰레큘라 시스템사의 등록 상표)는 전형적으로 그의 표적 증폭원점 (amplicon)과 결합된 혼성화 탐침을 가수분해하도록 Taq 또는 Tth 중합효소의 5' 핵산분해효소 활성을 사용하지만, 동등한 5' 핵산분해효소 활성을 가진 효소라면 모두가 사용될 수 있다.
두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머들이 PCR 반응의 전형적인 증폭원점을 생성하는 데 사용된다. 세 번째 올리고뉴클레오타이드, 또는 탐침은 두 개의 프라이머들 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 검출하도록 설계된다. 탐침은 Taq DNA 중합효소에 의해 연장가능하지 않고, 리포터 형광 염료 및 제거물질 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료로부터 레이저-유도성 방출이라면 모두가 두 가지 염료들이 탐침 상에서 서로 인접하여 위치할 때 제거물질 염료에 의해 제거된다 (quenched). 증폭 반응 동안, Taq DNA 중합효소는 주형-의존성 방식으로 탐침을 절단한다. 그 결과 나온 탐침 단편들은 용액 내에 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터 나온 신호는 두 번째 형광단의 제거 효과로부터 자유로와 진다. 리포터 염료의 분자 하나가 합성된 새로운 분자 각각으로 유리되고, 비제거된 (unquenched) 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 해석을 위한 기초를 제공한다.
TaqMan® RT-PCR (미국 캘리포니아주의 로슈 몰레큘라 시스템사의 등록 상표)는 예를 들어 ABI PRISM 7700TM 서열 검출 시스템 (미국 코네티컷주의 아플레라사의 상표) (퍼킨-엘머-어플라이드 바이오시스템사 (Perkin-Elmer-Applied Biosystems), Foster City, CA, USA), 또는 라이트사이클러TM (미국 캘리포니아의 로슈 몰레큘라 시스템사의 등록 상표) (로슈 몰레큘라 바이오케미칼사, 맨하임, 독일)와 같은 시판되는 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 5' 핵산분해효소 절차는 ABI PRISM 7700TM "미국 코네티컷주의 아플레라사의 상표" 서열 검출 시스템과 같은 실시간 정량적 PCR 장치 상에서 전개된다. 본 시스템은 써모사이클러 (thermocycler), 레이저, 전하-결합 장치 (CCD), 카메라, 및 컴퓨터로 구성된다. 본 시스템은 써모사이클러 상의 96-웰 포맷에서 시료들을 증폭시킨다. 증폭 과정 동안, 레이저-유도성 형광 신호는 모든 96 웰들을 위한 광섬유 케이블들을 통해 실시간으로 수집되고 CCD에서 검출된다. 본 시스템은 기구를 작동시키고 데이타를 분석하는 소프트웨어를 포함하고 있다.
5' 핵산분해효소 검정 데이타는 Cp, 또는 역치 순환 (threshold cycle)으로서 처음에 표현된다. 상기에 논의된 바와 같이, 형광 수치들은 모든 순환과정 동안 기록되고 증폭 반응에서 해당 지점까지 증폭된 산물의 양을 나타낸다. 형광 신호는 먼저 통계적으로 유의한 것으로 기록되는 지점이 역치 순환이다.
실시간 정량적 PCR (qRT-PCR)
RT-PCR 기법의 더 최신 변형이 실시간 정량적 PCR이고, 이는 이중-표지된 형광원성 탐침 (TaqMan® 탐침 (미국 캘리포니아주, 로슈 몰레큘라 시스템사의 등록 상표)을 통하여 PCR 산물의 축적을 측정한다. 실시간 PCR은 정량적 경쟁 PCR 및 정량적 비교 PCR 둘 다와 양립가능하다. 전자는 정상화 (normalization)를 위해 각 표적 서열에 대한 내부적 경쟁자를 사용하는 한편, 후자는 RT-PCR을 위해 시료 내에 포함되는 정상화 유전자, 또는 살림 (housekeeping) 유전자를 사용한다. 좀 더 자세한 사항들은, 예로 Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)에 의해 제공된다.
발현 수준들은 RNA 출처로서 고정된, 파라핀-포매된 조직들을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 한 가지 관점에 따르면, PCR 프라이머들은 유전자에 존재하는 인트론 서열들 사이에 넣어 증폭되도록 설계된다. 본 구현예에서, 프라이머/탐침 설계에서 첫 번째 단계는 유전자들 내의 인트론 서열들의 도시하는 것이다. 이것은 Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002)에 의해 개발된 DNA BLAT 소프트웨어와 같이 공개적으로 입수가능한 소프트웨어에 의해, 또는 그의 변형들을 포함하는 BLAST 소프트웨어에 의해 시행될 수 있다. 연속되는 단계들은 PCR 프라이머 및 탐침 설계의 잘 확립된 방법들을 따른다.
비특이적 신호들을 피하기 위하여, 프라이머들 및 탐침들을 설계할 때 인트론들 내의 반복적인 서열들을 차단하는 것이 유용하다. 이것은 베일러 의과대학 (Baylor College of Medicine)을 통하여 온라인으로 입수가능한 반복서열 차단 프로그램 (Repeat Masker program)을 사용하여 쉽게 달성될 수 있고, 이는 반복 요소들의 라이브러리와 대비한 DNA 서열들을 검색하고 반복 요소들이 차단된 조회 (query) 서열로 돌아온다. 다음으로 차단된 서열들은 프라이머 익스프레스 (Primer Express) (어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems)); MGB 설계에 의한 검정 (MGB assay-by-design) (어플라이드 바이오시스템사); 프라이머 3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the VIMNV for general users and for biologist programmers in: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)와 같이, 시판되거나 그렇지 않는 경우라면 공개적으로 입수가능한 프라이머/탐침 설계 패키지들이라면 모두를 사용하여 프라이머 및 탐침 서열들을 설계하는 데 사용될 수 있다.
PCR 프라이머 설계에서 고려되는 가장 중요한 요인들은 프라이머 길이, 융해 온도 (Tm), G/C 함량, 특이도, 상보적인 프라이머 서열들, 및 3' 말단 서열을 포함한다. 일반적으로, 최적의 PCR 프라이머들은 길이가 17 내지 30개 염기들이고, 예를 들어 약 50 내지 60%와 같이 약 20 내지 80%의 G+C 염기들을 포함한다. 전형적으로는 약 50 및 80℃ 사이, 예로 50 및 70℃ 사이의 융해 온도들이 바람직하다. PCR 프라이머 및 탐침 설계를 위한 좀 더 자세한 정보들은, 예로 Dieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp.133-155; Innis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; 또한 Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997)를 참고하고, 이들의 내용 전부는 본 명세서에 의해 참고문헌으로 명확하게 통합되어 있다.
마이크로어레이 분석
차별적인 발현은 마이크로어레이 기법을 사용하여 역시 확인되거나 검증될 수 있다. 따라서, 질환 특이 마커들의 발현 프로파일은 마이크로어레이 기술학을 사용하여 신선한 또는 파라핀-포매된 종양 조직 둘 중 하나에서 측정될 수 있다. 본 방법에서, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 서열들 (cDNAs 및 올리고뉴클레오타이드들을 포함)은 마이크로칩 기질 상에 도말되거나 배열된다. 다음으로 배열된 서열들 (예로, 포획 탐침들)은 관심 있는 세포들 또는 조직들 (예로, 표적들)로부터 나온 특이적 폴리뉴클레오타이드들과 혼성화된다. RT-PCR 방법에서와 거의 동일하게, RNA의 출처는 전형적으로 인간 종양들 또는 종양 세포주들, 및 해당하는 정상 조직들 또는 세포주들로부터 분리된 전체 RNA이다. 따라서, RNA는 다양한 일차 종양들 또는 종양 세포주들로부터 분리될 수 있다. RNA의 출처가 일차 종양인 경우라면, RNA는 예를 들어 냉동 또는 보관된 포르말린 고정된 파라핀-포매 (FFPE) 조직 시료들 및 고정된 (예로, 포르말린-고정된) 조직 시료들로부터 추출될 수 있고, 이들은 매일의 임상적 관행으로 일상적으로 준비되고 보존된다.
마이크로어레이 기법의 특정한 구현예에서, cDNA 클론들의 PCR 증폭된 삽입자들이 기질에 적용된다. 본 기질은 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75개까지의 뉴클레오타이드 서열들을 포함할 수 있다. 다른 관점들에서, 기질은 적어도 10,000개의 뉴클레오타이드 서열들을 포함할 수 있다. 마이크로칩 상에 고정된 마이크로어레이된 서열들은 엄격한 조건들 하의 혼성화에 적합하다. 다른 구현예들로서, 마이크로어레이들을 위한 표적들은 길이가 적어도 50, 100, 200, 400, 500, 1,000, 또는 2,000개 염기들; 또는 길이가 50 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 500, 100 내지 1000, 100 내지 2,000, 또는 500 내지 5,000개 염기들일 수 있다. 좀 더 나아간 구현예들에서, 마이크로어레이들을 위한 포획 탐침들은 길이가 적어도 10, 15, 20, 25, 50, 75, 80, 또는 100개의 염기들; 또는 10 내지 15개, 10 내지 20개, 10 내지 25개, 10 내지 50개, 10 내지 75개, 10 내지 80개, 또는 20 내지 80개 염기들일 수 있다.
형광으로 표지된 cDNA 탐침들은 형광 뉴클레오타이드들의 도입을 통하여 관심 있는 조직들부터 추출된 RNA의 역전사에 의해 생성될 수 있다. 칩에 적용되어 있는 표지된 cDNA 탐침들은 특이도를 가지고 어레이 상에서 DNA의 각 스폿과 혼성화한다. 비특이적으로 결합된 탐침들을 제거하는 엄격한 세척 이후에, 칩은 공초점 레이저 현미경법에 의해 또는 CCD 카메라와 같은 또 다른 검출 방법에 의해 스캔된다. 각 배열된 요소의 혼성화의 정량은 해당하는 mRNA 과다 (abundance)의 평가를 허용한다. 이중 색상 형광으로, 두 개의 RNA 출처로부터 생성된 따로 표지된 cDNA 탐침들은 어레이에 쌍을 이루어 혼성화된다. 따라서 각 특정된 유전자에 해당하는 두 가지 출처들로부터 나온 전사물들의 상대적 과다는 동시에 측정된다.
소형 (miniaturized) 규모의 혼성화는 많은 수의 유전자들에 대한 발현 양상의 편리하고 신속한 평가를 가능하게 한다. 이러한 방법들은 세포 당 수 개의 사본들로 발현되는 희귀한 전사물들을 검출하는 데 요구되는 민감도를 가지고, 또한 발현 수준들에서 적어도 대략 2배의 차이들을 재현가능하게 검출하는 것으로 확인되었다 (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)). 마이크로어레이 분석은 애피매트릭스사 (Affymetrix) 유전자칩 (GenChip) 기술학, 일루미나사 (Illumina) 마이크로어레이 기술학, 또는 인사이트사 (Incyte)의 마이크로어레이를 사용하는 것에 의해서와 같이 제조사의 프로토콜들에 따라 시판되는 장비에 의해 수행될 수 있다. 유전자 발현의 대규모 분석의 마이크로어레이 방법들의 개발은 다양한 종양 유형들에서 암 분류 및 결과 예측의 분자적 마커들을 체계적으로 찾는 것을 가능하게 한다.
RNA 분리, 정제, 및 증폭
일반적인 mRNA 추출 방법들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고 Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)을 포함하는 분자생물학의 표준 교재들에 기술되어 있다. 파라핀-포매된 조직들로부터 RNA 추출 방법들은, 예를 들어 Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), 및 De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)에 기재되어 있다. 상세하게, RNA 분리는 퀴아젠사 (Qiagen)과 같은 시판하는 제조사들로부터 나온 정제 키트, 완충액 세트, 및 단백분해효소를 제조사의 지침들에 따라 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 배양에서의 세포들로부터 나온 전체 RNA는 퀴아젠사 RNeasy® "독일 힐덴의 퀴아젠사 GmbH의 등록 상표" 미니-컬럼들을 사용하여 분리될 수 있다. 다른 시판되는 RNA 분리 키트들은 마스터퓨어 (MasterPure) 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (에피센터사 (EPICENTRE D), Madison, WI), 또한 파라핀 블록 (Paraffin Block) RNA 분리 키트 (앰바이온사 (Ambion, Inc.))를 포함한다. 조직 시료들로부터 나온 전체 RNA는 RNA Stat-60 (Tel-테스트)를 사용하여 분리될 수 있다. 종양으로부터 준비된 RNA는, 예를 들어 염화세슘 밀도 구배 원심분리법에 의해 분리될 수 있다.
RNA 출처로서 고정된 파라핀-포매된 조직들을 사용하여 유전자 발현을 프로파일화하는, mRNA 분리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는 대표적인 프로토콜의 단계들은 다양한 발표된 저널 논문들에 주어져 있다 (예를 들어, T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). 간략하게는, 대표적인 공정들은 파라핀-포매된 종양 조직 시료들의 약 10 마이크론 두께의 절편들을 절단하는 것으로 시작한다. 다음으로 RNA는 추출되고, 단백질 및 DNA는 제거된다. RNA 농도의 분석 이후에, RNA 복구 및/또는 증폭 단계들이 필요한 경우 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이 프로모터들을 사용하여 역전사되고 RT-PCR이 어어진다. 최종적으로, 데이타가 환자에게 사용가능한 최고의 치료 옵션(들)을 확인하도록 조사된 종양 시료에서 확인된 특징적인 유전자 발현 양상을 기초로 하여 분석된다.
면역조직화학 및 단백질체학
면역조직화학 방법들은 본 발명의 증식 마커들의 발현 수준들을 검출하는 데도 역시 적합하다. 따라서, 항체들 또는 항혈청들, 바람직하게 폴리클론 항혈청들, 가장 바람직하게는 각 마커에 특이적인 모노클론 항체들이 발현을 검출하는 데 사용된다. 항체들은 항체들 자체의 직접적인 표지화에 의해, 예를 들어 방사성 표지들, 형광 표지들, 바이오틴과 같은 햅텐 (hapten) 표지들, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제와 같은 효소로 검출될 수 있다. 대안으로, 비표지된 일차 항체가 항혈청들, 폴리클론 항혈청들 또는 일차 항체에 특이적인 모노클론 항체를 포함하는 표지된 이차 항체와 결합하여 사용된다. 면역조직화학 프로토콜들 및 키트들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 시판되고 있다.
단백질체학 (proteomics)은 소정의 시점에서 시료 (예로, 조직, 생물, 또는 세포 배양)에 존재하는 폴리펩타이드들을 분석하는 데 사용될 수 있다. 상세하게, 단백질체학 기법들은 시료에서 폴리펩타이드 발현의 전반적인 변화들을 평가하는 데 사용될 수 있다 (발현 단백질체학이라고도 말함). 단백질체 분석은 전형적으로: (1) 2-D 젤 전기영동 (2-D PAGE)에 의해 시료에 있는 개별 폴리펩타이드의 분리, (2) 예로 질량 분광분석법 또는 N-말단 서열분석에 의해 젤로부터 회수된 개별 폴리펩타이드들의 확인, 또한 (3) 생물정보학 (bioinformatics)을 사용하는 데이타의 분석을 포함한다. 단백질체학 방법들은 유전자 발현 프로파일화의 다른 방법들에 대한 소중한 보완책들이고, 단독으로 또는 다른 방법들과 조합으로 본 발명의 증식 마커들의 산물들을 검출하는 데 사용될 수 있다.
마커에 선택적인 핵산 탐침을 사용하는 혼성화 방법들
이들 방법들은 기질에 핵산 탐침을 결합시키는 것, 및 적절한 조건들 하에서 테스트 시료들로부터 유래한 RNA 또는 cDNA와 혼성화하는 것이 관여한다 (Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 제 3판.Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)). 이들 방법들은 종양 조직 또는 체액 시료로부터 유래한 마커들에 적용될 수 있다. RNA 또는 cDNA 제조물들은 전형적으로 검출 및 정량을 허용하도록 형광 또는 방사성 분자로 표지된다. 일정 적용들에서, DNA를 혼성화하는 것은 신호 강도를 증진시키도록 가지친 (branched) 형광으로 표지된 구조로 태그 표시될 수 있다 (tagged)(Nolte, F.S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201-35 (1998)). 비혼성화된 표지는 0.1x SSC, 0.5% SDS와 같은 낮은 염 용액들로 계속된 세척에 의해 형광 검출 또는 젤 영상들의 음영계측법에 의해 혼성화의 양을 정량하기 이전에 제거된다. 기질들 (supports)은 나일론 또는 니트로셀룰로스 막들과 같이 고체이거나, 액체 현탁일 때 혼성화되는 미세구들 (microspheres) 또는 비드들 (beads)로 구성될 수 있다. 세척 및 정제를 허용하기 위하여, 비드들은 유동 세포측정법을 가능하도록 자석 (Haukanes, B-1 and Kvam, C., Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993)) 또는 형광으로 표지 (예를 들어, Spiro, A., Lowe, M. and Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 4258-4265 (2000)를 참조하라)될 수 있다.
혼성화 기술학의 변형은 가지친 DNA 신호 증폭과 형광 비드 기질을 조합시킨 QuantiGene Plex® 검정법 (미국 캘리포니아wn의 파노믹스사 (Panomics)의 등록 상표) (제노스펙트라사 (Genospectra), Fremont)이다. 혼성화 기술학에 관한 보다 또 다른 변형은 Quantikine® mRNA 검정법 (R＆D 시스템사, Minneapolis)이다. 기술학은 제조사의 지침들에 기술된 바와 같다. 간략하게, 본 검정법은 디옥시제닌 (digoxigenin)과 결합된 올리고뉴클레오타이드 혼성화 탐침들을 사용한다. 혼성화는 비색 검정법들에서 알칼라인 포스파타제와 결합된 항-디옥시제닌 항체들을 사용하여 검출된다.
추가적인 방법들이 당해 기술분야에 잘 알려져 있어 본 명세서에서 좀 더 기술될 필요는 없다.
효소-결합 면역학적 검정법들 (엘라이자)
간략하게, 샌드위치 엘라이자 (ELISA) 검정법들에서 마커들에 대한 폴리클론 또는 모노클론 항체는 고체 기질 (Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)) 또는 현탁 비드들에 부착된다. 다른 방법들이 당해 기술분야에 알려져 있어 본 명세서에서 좀 더 기술될 필요는 없다. 모노클론 항체들은 하이브리도마-유래되거나 파지 항체 라이브러리들로부터 선택될 수 있다 (Hust M. and Dubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments. Methods Mol Biol. 295:71-96 (2005)). 비특이 결합 부위들은 비-표적 단백질 제조물들 및 계면활성제들로 차단될 수 있다. 다음으로 포획 항체는 항원을 포함하는 환자로부터 나온 시료 또는 조직의 제조물과 배양된다. 혼합물은 미리 세척되고 항체/항원 복합체는 표적 마커를 검출하는 이차 항체와 배양된다. 이차 항체는 전형적으로 형광 분자 또는 효소적 반응으로 또는 리포터와 결합된 삼차 항체로 검출될 수 있는 다른 리포터 분자와 결합된다 (Crowther, Id.). 대안으로, 직접적인 ELISAs에서 마커를 포함하는 제조물은 기질 또는 비드에 결합되고 표적 항원은 항체-리포터 결합체로 직접 검출될 수 있다 (Crowther, Id.).
모노클론 항체들 및 폴리클론 항혈청을 생산하는 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있어 본 명세서에서 좀 더 기술될 필요는 없다.
면역검출
본 방법들은 종양을 제거하는 수술 이전 및 이후에 채취한 방광암 환자들로부터 나온 혈청들 또는 혈장에서 마커 패밀리 구성원들의 면역검출, 이에 제한되는 것은 아니지만 결장직장, 췌장, 난소, 흑색종, 식도, 위, 자궁내막, 및 뇌를 포함하는 기타 다른 암들을 가진 환자들에 있는 마커 패밀리 구성원들의 면역검출 또한 방광암 환자들로부터 나온 소변 및 대변에 있는 마커 패밀리 구성원들의 면역검출에도 역시 사용될 수 있다.
질환 마커들은 면역블럿팅 또는 면역침전과 같은 다른 표준 면역검출 기법들을 사용하여 조직들 또는 시료들에서도 역시 검출될 수 있다 (Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). 면역블럿팅에서는, 마커를 포함하는 조직 또는 체액으로부터 나온 단백질 제조물들이 변성 또는 비변성 조건들 하에서 폴리아크릴아마이드 젤들을 통하여 전기영동된다. 다음으로 단백질들은 나일론과 같은 막 기질로 전달된다. 다음으로 마커는 면역조직화학의 경우에 기술된 바와 같이 모노클론 또는 폴리클론 항체들과 직접 또는 간접적으로 반응시킨다. 대안으로, 일정 제조물들에서 단백질들은 선행하는 전기영동적 분리 없이 막들 상에 직접 스폿으로 제작될 수 있다. 신호는 음영계측법에 의해 정량될 수 있다.
면역침전에서, 마커를 포함하는 용해성 제조물은 마커에 대한 모노클론 또는 폴리클론 항체와 배양된다. 다음으로 반응은 공유적으로 부착된 프로테인 A 또는 프로테인 G를 가진 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드로 제조된 불활성 비드들과 배양된다. 프로테인 A 또는 프로테인 G 비드들은 특이적으로 비드들과 결합된 항체-마커-항원의 고정된 복합체를 형성하는 항체들과 반응한다. 세척 이후에, 결합된 마커는 면역블럿팅 또는 엘라이자에 의해 검출되고 정량될 수 있다.
진단을 확립하는 것
일단 IL8Rb, 선택적으로 하나 이상의 심화 암 마커들의 발현 수준이 획득되고 나면, 다음으로 해당 개체를 위한 진단이 확립될 수 있다. IL8Rb의 발현이 염증성 방광 질환을 가지지 않는 개체들에서 관찰되는 발현을 초과하고, 및/또는 염증성 방광 질환을 가지는 것으로 알려진 개체들에서의 발현 수준과 일치하는 경우라면, 다음으로 개체는 염증성 방광 질환을 가지는 것으로 진단될 것이다. 대안으로, 발현이 염증성 방광 질환을 가지지 않는 개체들에서 관찰되는 발현을 초과하지 않고, 및/또는 염증성 방광 질환을 가지는 것으로 알려진 개체들에서의 발현 수준 미만인 경우라면, 다음으로 개체는 염증성 방광 질환을 가지는 않는 것으로 진단될 것이다.
IL8Rb가 방광에 대한 하나 이상의 머커들과 결합되어 사용되는 상황에서, 다음으로 IL8Rb의 발현 수준은 염증성 방광 질환이 없는 개체들, 및/또는 염증성 방광 질환을 가지는 것으로 알려진 개체들의 발현 수준과 비교될 수 있다. 하나 이상의 암 마커들은 염증성 방광 질환이 없는 개체들, 및/또는 염증성 방광 질환을 가지는 것으로 알려진 개체들에서 발현 수준과 대비된다. IL8Rb의 발현 수준이 염증성 방광 질환을 가지지 않는 개체 (염증성 방광 질환을 덜 가지는 개체)와 일치하고 하나 이상의 방광암 마커들의 발현 수준이 방광암을 가진 개체 (방광암을 가지지 않는 개체와는 차별적임)의 발현 수준과 일치하는 경우라면, 다음으로 개체는 방광암을 가지는 것으로 진단된다. IL8Rb의 발현 수준이 염증성 방광 질환을 가지지 않는 개체보다 높고 (염증성 방광 질환을 가지는 개체와 일치함), 하나 이상의 방광암 마커들의 발현 수준이 방광암을 가진 개체 (방광암을 가지지 않는 개체와는 차별적임)의 발현 수준과 일치하는 경우라면, 다음으로 개체는 염증성 방광 질환을 가지는 것으로 진단된다. IL8Rb의 발현 수준이 염증성 방광 질환을 가지지 않는 개체 (염증성 방광 질환을 덜 가지는 개체)와 일치하고, 하나 이상의 방광암 마커들의 발현 수준이 방광암을 가지지 않는 개체 (방광암을 가지는 개체와는 차별적임)의 발현 수준과 일치하는 경우라면, 다음으로 개체는 방광암 또는 염증성 방광 질환 모두를 가지지 않는 것으로 진단된다.
진단적 마커의 정상적 및 질환 발현 간의 발현 수준들에서 중복 부분 (overlap)이 있기 때문에, 개체에 대한 진단을 확립하기 위하여 분류하는 역치를 확립하는 것이 전형적이다. 분류하는 역치는 개체들을 질환 또는 비질환 카테고리들로 구분하는 수치 또는 역치이다. 역치는 보편적으로 모든 가능한 역치들에 대한 특이도 대비 민감도를 좌표 표시하는 수신자 작동 특징 (ROC)의 사용으로 평가된다.
진단적 역치 결정
질환 마커들을 사용하는 테스트들의 경우, 시료를 질환, 예로 방광암에 대해 양성 또는 음성 둘 중 하나로 말하는 것을 허용하는 진단적 역치들이 유도된다. 이들 진단적 역치들은 방광암 또는 염증성 방광 질환의 존재에 관해 연구된 환자들 집단들의 분석에 의해 결정된다. 진단적 역치들은 서로 다른 테스트 적용들의 경우에 다양해질 수 있고, 예를 들어 인구통계학적 검색에서 테스트의 용도를 위한 진단적 역치들은 소변학적 증상들이 거의 없는 환자들의 집단들을 사용하여 결정되며, 이들 진단적 역치들은 방광암 재발을 감시하는 환자들을 위한 테스트들에 사용된 것들과는 서로 다를 수 있다. 진단적 역치는 요구되는 임상적 설정에서 테스트 특이도의 실제적인 수준을 제공하도록 선택된다; 즉 위양성 결과들을 받는 환자들이 과도하게 많지는 않은 합리적인 민감도를 허용하는 특이도. 본 특이도는 80 내지 100%의 범위 이내일 수 있다.
진단적 역치는 각 마커의 유전자 발현 수준들을 조합하는 알고리즘들을 향후 임상시험으로부터 얻을 각 시료에 적용하여 결정된다. 사용되는 시료들은 방광암및 광범위한 비악성 소변학적 장애들을 가진 환자들로부터 나온다. 진단적 역치는 원하는 특이도를 유도하는 알고리즘의 점수를 결정하여 선택된다. 예를 들어, 일정 적용들에서 85%의 특이도가 바람직하다. 다음으로 진단적 역치는 정확하게는 암에 대해 음성으로 분류된 방광암이 없는 85%의 환자들을 유도하는 알고리즘 점수를 선택하여 설정된다. 다른 적용들에서는 (인구통계학적 검색과 같음), 90%와 같은 더 높은 특이도가 선호된다. 본 적용을 위한 역치를 설정하기 위하여, 정확하게는 암에 대해 음성으로 분류된 방광암이 없는 90%의 환자들을 유도하는 알고리즘 점수가 선택된다. 알고리즘의 사용의 예들은 실시예들에서 개괄된다.
단일 역치들에 대한 대안으로서, 테스트는 질환의 존재 가능성의 서로 다른 정도들을 제공하고, 이들과 연관된 서로 다른 임상적 결과들을 가지는 테스트 범위들 (intervals)을 사용할 수 있다. 예를 들어, 테스트는 세 가지의 범위들을 가질 수 있다; 하나는 방광암 존재의 높은 (예로, 90%) 위험도와 연관되고, 두 번째는 방광암의 낮은 위험도와 연관되고, 세 번째는 질환이 의심되는 것으로 간주됨. "의심되는" 범위는 정해진 기간 내에 반복 테스트에 대한 추천과 연관될 수 있다.
데이타 분석
일단 RNA 및/또는 단백질의 양을 테스트하는 방법이 완성되었으면, 다음으로 종양 및 정상 시료들과 연관된 생물마커 수치들의 분포를 결정하기 위하여 데이타가 분석되어야 한다. 전형적으로 이것은 미가공 (raw) 데이타를 정상화하는 것, 예로 기저의 "노이즈" 등을 제거하고 두 벌 (이상)의 평균을 내는 것, 표준들과 비교, 또한 두 가지 부류들의 시료들을 최적으로 분리하도록 컷오프들 또는 역치들을 확립하는 것이 관여한다. 많은 방법들이 이것을 시행하는 것으로 알려져 있고, 정확한 방법은 사용되는 RNA 및/또는 단백질의 양을 결정하는 특정한 방법에 의존할 것이다.
데이타 분석을 qRT-PCR을 사용할 때 수행할 수 있는 방식의 예는 하기에 기술된다. 그러나, 일반적인 공정은 RNA 및/또는 단백질 함량을 확립하는 다른 방법들에 사용되도록 적응될 수 있거나, 다른 방법들이 동일한 결과를 달성하도록 당업자에 의해 확립될 수 있는 점이 이해될 것이다.
데이타
형광의 측정들은 PCR의 각 순환에서 파장ω i = 1, 2에서 시행된다. 따라서 각 웰의 경우 우리는 fi(ω i ) k 에 의해 표시되는 한 쌍의 형광 곡선들을 관찰하고, 여기에서 t = 1,....k는 순환 횟수를 표시하고 i = 1, 2은 파장들을 지시한다.
형광 곡선들은 근처 평행 기저선으로 시작하고 상부 점근선으로 완만하게 증가하는 S자형 만곡 (sigmoidal) 모양을 가진다. 형광 곡선이 선형의 기저선으로부터 분리되는 지점 Cp의 위치는 표적 유전자의 농도를 특성 분석하는 데 사용될 것이다. Cp의 명확한 정의는 다음에 기술된다.
다음은 이들 데이타를 가공하는 계획의 예이다.
● 주파수 밴드들 간에 형광 중복을 보상한다.
● Cp를 추정하기 위하여 각 형광 곡선에 대한 완만한 모델을 추정한다.
● 복제된 웰들로부터 나온 데이타를 조합한다.
● 표준 곡선들을 추정한다.
● 표준 대비 농도를 전산적으로 산정한다.
각 생물학적 시료는 5개 유전자들의 상대적 농도들을 수득하고, 이는 판별 함수를 위한 유입정보들이 된다.
색상 보상
W tj (ω)에 의해 순환 t 및 주파수 ω에서 염료 j의 형광 수준을 표시하라. 복합화된 검정법에서, 주파수 ω라면 모두에서 측정된 반응은 해당 주파수에서 모든 염료들로부터 나온 기여도들의 합 (sum)이고, 각 순환의 경우
색상 보상의 목적은 관찰된 혼합물들 f t (ω)로부터 개별 기여도들 W tj (ω)를 추출하는 것이다.
이상적인 상황에서, 주파수 ω에서 염료 j로 인한 형광 W tj (ω o )은 W tj (ω o )의 수준과는 상관없이 기준 주파수 ωo에서 그의 형광 W tj (ω o )과 비례한다. 이것은 결정될 일정의 비례도 상수들 A 12 및 A 21 에 대한 선형 관계를 제시한다.
실제로, 본 체계에 선형의 조건들을 도입하여 효과적으로 모델화되는 추가적인 효과들이 있다.
"색상 보상" 매개변수들 A 12 및 A 21 을 추정한 이후, 우리는 매트릭스 배가에 의해 선형의 기저선에 의해 왜곡되더라도 W t1 (ω 1 ) 및 W t2 (ω 2 )를 회수할 수 있다.
W t1 (ω 1 ) 및 W t2 (ω 2 )는 "색상 보상된" 데이타라고 부를 수 있을 것이다. 본 발현의 마지막 조건에서 선형의 왜곡들 
은 2 미만인 색상 보상된 데이타에 대한 모델을 추정할 때 기저선 추정으로 수용될 것이다. 이는 C p 의 추정치에는 전혀 영향이 없다.
색상 보상 계수들의 추정은 단일 (이중체와는 정반대됨) 탐침들을 사용하는 별도의 검정법을 요구한다. 다음으로
를 주는 W t2 (ω 2 ) = 0
따라서
지금은 계수 A 21 이 F t (ω 1 ) 상의 F t (ω 2 )의 보통의 선형 회귀 및 t = 1,··,k 경우의 PCR 순환 t에 의해 추정될 수 있다.
모델 추정
본 섹션에서, yt t = 1,···,k 는 색상 보상된 형광 곡선을 표시한다.
증폭
모델들은 비범한 증폭을 보여주는 형광 곡선들에 대해서만 추정된다. 우리는 용어 "증폭 (amplification)"을 색상 보상된 형광 곡선의 선형 기저선으로부터의 비범한 일탈 (departure)로서 정의한다. 증폭을 정의하도록 신호 대비 노이즈 비율 (SNR)을 사용하라. 여기에서는 SNR이 신호 분산 (variance) 대비 노이즈 분산의 비율로서 정의된다. 노이즈 분산은 검정 절차의 산정의 일부로서 설정되고 변하지 않는다: 본 목적으로는, 증폭을 전혀 가질 수 없는 웰들, 예로 RNA가 없는 웰들로부터 나온 기저선의 선형 모델로부터 나온 잔여 (residual) 분산을 사용하라. 각 형광 곡선의 경우, 신호 분산을 최고로 맞춘 (fitting) 직선으로부터 나온 잔여 분산으로서 추정하라 (여기에서 "최고"는 가장 작은 스퀘어 의미로 말한다).
● SNR이 특정된 역치 이하인 경우라면, 형광 곡선은 선형에 근접하고 증폭은 전혀 존재하지 않는다. 그러면 기저선으로부터 일탈 지점이 전혀 없고 시료에서의 농도는 제로로서 진술될 수 있다.
● SNR이 역치를 초과하는 경우라면, 증폭이 존재하고 농도는 추정될 수 있다.
(무차원) SNR에 대한 역치들은 "증폭된" 및 "비증폭된" 곡선들 사이에 분명한 판별을 제공하도록 선택된다. 예를 들어, 역치들에 대한 다음의 범위들이 마커들에게 효과적이다.
모델
각 형광 곡선에 대한 S자형 곡선 모델을 추정하라. 모델의 적합한 지표 형태라면 모두가 사용될 수 있지만, 다음의 특징들을 모델화할 수 있어야 한다:
● 비-제로 기울기를 가질 수 있는 선형의 기저선
● 중간 지점 근처의 비대칭들
● 저부 및 상부 수준들에서 점근선들
● 기저선으로부터 상부 점근선까지 완만한 증가
이들 요구사항들을 달성하는 모델의 예로는 다음이다.
우리는 이것을 "6PL 모델"이라고 부른다. 매개변수 벡터 
는 g t (θ)가 t의 증가 함수이고 형광 곡선의 경험적 성질들을 가지는 점을 입증하는 다음의 한계들을 가질 수 있다.
다른 두 가지 매개변수들은 기저선 A + A s t을 결정하고, 이들 매개변수들은 A가 항상 양성이고 기울기 매개변수 A s 가 항상 작더라도 분명한 한계들을 필요로 하지 않는다.
매개변수 D는 기저선 초과의 증폭 수준을 결정한다. 남아있는 매개변수들 B.E.F는 자체가 고유의 해석을 가지지 않지만 곡선의 모양을 통제한다. 이들 매개변수들도 역시 Cp의 추정에 영향을 주는 매개변수들일 뿐이다. A s = 0일 때 이것은 5개-매개변수 로지스틱 함수 (5PL)로서 알려져 있고, 또한 F = 1이라면, 본 모델은 4개-매개변수 로지스틱 모델 (4PL)을 환원시킨다, Gottschalk and Dunn (2005), Spiess et al. (2008).
초기화
비선형 추정을 위한 초기 수치들은
● A s = 0, F = 1
● A = 평균 (y,·····, y 5 )
● D = 범위 (y,·····, y k )
● B = 절반 높이에 해당하는 순환
● E는 g t (θ)를 남아있는 매개변수들의 수치들을 상기 정의된 그들의 초기 수치들로 설정하였던 선형 형태로 전환시켜서 초기화된다. 선형화는 다음을 획득한다.
지금 선택된 t에 대한 
상의 
의 회귀에 의해 E를 추정하면 다음과 같다.
거의 일치하는 분석을 유도하는 (그의 자신의 초기화로) 본 모델의 대안의 형태는 다음이다.
A s = 0일 때, 이것은 때로 리차드 공식으로서 알려져 있다, Richards (1959).
추정 판단기준
스퀘어들 판단기준의 불리한 합산을 최소화하도록 매개변수들을 추정하라.
여기에서 λ(θ)는 θ에서 매개변수들의 일부 (또는 모두)의 큰 수치들을 벌점을 주는 비음성 함수이다. 본 방법은 정규화 (regularization) 또는 융기 회귀 (ridge regression)로서 알려져 있고 (Hoerl, 1962) 적합한 선행 분포를 매개변수 벡터 θ로 설정하여 베이시안 (Bayesian) 관점으로부터 유래될 수 있다. 벌점을 위한 만족스러운 선택은 다음이다.
λ의 큰 수치는 매개변수 추정치들을 제로로 편향시키고 매개변수 추정치들의 분산을 감소시킨다. 반대로, 작은 (또는 제로) λ는 불안정한 매개변수 추정치들 및 최소화 알고리즘들에서 수렴 (convergence) 문제들을 유도한다. λ의 선택은 편향성 및 분산 또는 안정도 간의 타협이다. 경험적 증거는 편향성 및 분산 간의 만족스러운 타협이 λ가 다음의 범위에서 선택되는 경우라면 달성될 수 있는 점을 보여준다.
0.01 > λ > 0.0001
본 선택도 역시 최적화 알고리즘의 수렴을 입증한다.
알고리즘 선택
상기 범위에서 λ의 선택이라면 모두의 경우, 이전의 단락에서의 설명은 매개변수 추정치들을 완벽하게 정의한다. 고전적인 가우스-뉴튼 절차를 기초로 하는 비선형 최소 스퀘어들 절차 (More, 1978에서 시행되는 바와 같은 레벤버그-마르쿼트 (Levenberg-Marquardt) 알고리즘과 같음)가 성공적으로 사용되어 왔고 적합한 접근법이다. Nelder and Mead, 1965와 같은 일반 목적 최적화 알고리즘들, 또는 Byrd, et al., 1995에 의해 시행되는 바와 같은 브로이덴-플레처 (Broyden-Fletcher) 알고리즘도 역시 본 문맥에서 성공적으로 시도되어 왔다.
C
p
추정치
C p 는 g t (θ)의 두 번째 도함수를 최대화하는 지점 t이다. 각 형광 곡선은 표적 유전자의 농도를 특성 분석하는 C p 를 수득한다.
각 집합의 기술적인 복제들의 경우에 추정된 C p 의 평균은 전산적으로 산정되고 연속되는 분석에 사용된다.
1. 표준 곡선들
절대 또는 상대 농도들은 동일한 PCR 플레이트 상의 표준 곡선들과의 비교로부터 유도된다.
선형 모델을 사용하는 일련의 희석 모델은 다음과 같다.
여기에서 Conc는 표준의 절대 또는 상대 농도이다. 절편 및 기울기 매개변수들은 플레이트 특이적이다. 절편 및 기울기 매개변수들에서 플레이트 간 다양성을 집단 모델들을 설정하여 모델화하고,
여기에서 매개변수들 
은 하기에 기술된 바와 같은 선행 데이타를 기초로 하여 설정된다. 다음으로 주어진 플레이트의 경우 R 및 S는 이들 집단들로부터 나온 관찰들로서 해석될 수 있다.
농도 Conc j 에서의 표준의 복제 i의 경우 다음의 모델이 사용될 수 있다.
여기에서 
이다. 나머지들의 분산은 C p 에 의존하는 점을 주목하라. 
의 경험적인 추정치들은 표 2에 주어져 있다. 가능성 함수를 최대화하여 매개변수들 R 및 S를 추정하라. 다음을 통하여 PCR 공정의 효율의 견지에서 기울기 매개변수를 해석하라.
본 모델은 베이시안 해석을 가진다: 불명확한 (비-정보적) 선행 분포들을 매개변수들 
로 준다. 다음으로 R 및 S 또한 Cp(i,j)에 대한 집단 모델들은 선행 데이타에 대한 가능성 모델을 전적으로 결정한다. 마르코브 체인 몬데 카를로 (MCMC) 알고리즘 (Lunn et al., 2009)은 
의 추정을 허용한다. 선행 분포가 생략되는 경우라면, 통상적인 빈도 해석이 나온다. 본 추정 절차를 이어서, 표 3에서 유전자-의존성 집단 매개변수 추정치들을 획득하는 것이 가능하다. 하기 표 2는 나머지들의 분산을 나타낸다.
[표 2]
하기 표 3은 표준 곡선들의 기울기들 및 절편들에 대한 집단 매개변수들을 나타낸다.
[표 3]
표준 곡선의 절편 및 기울기의 추정치들은 
및
에 의해 표시된다.
2. 상대 농도들
△C
p
다음으로부터 농도 Conc REF 에서 C p(REF) 를 전산적으로 산정하도록 표준 곡선을 사용하라.
시료의 상대 농도는 다음에 의해 주어진다.
임의적으로 
는 PCR 효율 2에 해당하는 고정된 수준에서 대략 정해질 수 있다. 그러면 
이다. 어느 선택에 대해서도 동일한 표시 △C p 를 사용하라. 각 유전자에 대해 하나인 그 결과 나온 △C p 추정치들은 다음 단계에서 판별 함수에 유입정보들이다.
3. 판별 함수
△C p 수치들은 제거된 플레이트-대비-플레이트 분산을 가진 상대적인 생물마커 수치에 해당한다. 서로 비교하는 5△Cp 수치들의 조사는 (예를 들어, 도 2를 참조하라), 종양 시료들이 전형적으로 비종양 시료들보다 다른 생물마커 수치들을 가지는 방식을 보여준다. 또한, 종양 및 정상의 영역들에서 겹치는 부분이 있으면서도, 많은 수의 시료들이 효과적으로 잘 구분된다. 이들 상황들 하에서, 많은 서로 다른 통계적인 분류인자들이 종양 시료들부터 정상의 것을 구분하도록 작용한다. 우리는 5가지의 서로 다른 분류 방법들을 사용하였다: (i) 선형 판별 분석 (LDA), (ii) 로지스틱 회귀분석 (LogReg), (iii) 서포트 벡터 머신 (SVM), (iv) 5개 이웃들을 기초로 하는 K-최근접-이웃들 (KNN) (KN5N), 및 (v) 반복적인 분배 트리들 (TREE) (Venables ＆ Ripley and Dalgaard를 인용하라).
분류인자들의 생성은 분류인자에 의해 테스트될 궁극적인 집단을 대표하는 많은 수의 시료들에 대한 생물마커 수치들을 포함하는 데이타 집합을 요구한다. 예를 들어, 분류인자가 위험성 집단 (예로, 50세 이상의 연령, 흡연자들)을 검색하는 데 사용될 경우라면, 분류인자를 생성하는 데 요구되는 데이타 집합 ("훈련 세트 (training set)"라고 말함)가 해당 집단을 반영하고 흡연하는 50세 이상의 사람들로부터 나온 시료들만을 포함해야 한다. 전형적으로 민감도 및 특이도와 같은 변수들에 대해 10% 이하 오차의 측정 정확도를 획득하기 위하여, 훈련 세트는 300개 이상의 시료들일 필요가 있다.
분류인자의 효율성의 추정은 교차-검증을 사용하여 시행될 수 있다. 교차-검증 (Wikipedia: Cross-validation)에서, 데이타 집합은 적은 수의 동등한 크기를 가진 부분들로 나뉜다 (전형적으로 3 내지 10개). 한 부분 (section)은 남기고 나머지 부분들은 분류인자를 구축하는 데 사용된다; 다음으로 나머지 부분은 새로운 분류인자에 의해 테스트되고 그의 예측들은 기록된다. 이것은 각 부분에 대해 순서대로 시행되고 모든 예측들은 분류인자의 특징들: 민감도, 특이도 등을 전산적으로 처리하도록 조합되고분석된다. 교차-검증이 데이타를 10개 부분들로 분배하여 수행되는 경우라며, 10배 교차-검증으로 불린다; 유사하게, 3개 부분들은 3배 교차-검증이 될 것이다. 데이타가 시료들 만큼이나 많은 분류들로 분배되는 경우라면, 이것은 "교차-검증을 생략하는 것 (leave one out cross-validation)"으로 불린다. 분류인자를 구축하는 데 사용되지 않는 데이타에 관해 테스트하여, 본 방법은 추가적인 시료들의 부재 시 분류인자 성적의 추정치를 제공한다.
우리는 본 명세서의 다른 부분에서 (실시예 1) 기술된 임상시험 데이타 집합을 사용하여, 모두 IL8RB 생물마커가 있거나 없이 4가지 생물마커들, MDK, IGFBP5, CDC2, 및 HOXA13의 15개 조합들 모두를 사용하여 분류인자들을 구축하였고, 이들 30개 분류인자들을 10배 교차-검증을 사용하여 테스트하였다. 이것은 상기에 나열된 5가지 분류인자 유형들의 각각에 대해 시행되었고 ROC 곡선들이 전산적으로 산정되었다. 모든 작업은 R 통계학적 프로그램화 환경 (CITE)을 사용하여 수행되었다. 이들 결과들 (도 14)은 대부분의 경우들에서, IL8Rb를 가진 분류인자가 진단적으로 유용한 특이도 수치들에 대해 더욱 민감한 점을 보여준다 (0 내지 20%의 위양성율; 100으로부터 80%까지의 특이도). 특이도들의 진단적 유용성을 가진 부위의 곡선 아래의 영역 (AUC)은 분류인자들이 더 나은 분류인자 성적을 더 큰 수치들로 나타내는 정도를 측정하는 데 사용된다. 도 15a는 각 분류인자 및 생물마커 조합의 AUC를 도표화하는 한편, 도 15b는 IL8Rb가 첨가될 때 각 조건의 경우 AUC의 증가량을 보여준다. 대부분의 경우들에서, IL8Rb의 첨가는 정확한 진단을 시행하는 능력을 개선시킨다. 진단적으로 유용한 특이도 수치들을 위한 특이적 민감도는 도 16에서 모든 분류인자들에 대해 도표화된다. 또한, 도 17은 IL8Rb의 첨가가 제공하는 민감도 또는 특이도의 증가량을 도표화하고 있다.
분류인자의 유용성은, 이를 미리 생성하고 테스트하고 나서 새로운 시료를 테스트하는 데 사용될 때 생성된다. 결과들의 해석을 단순화하기 위하여, 역치의 컷오프 점수가 확립된다; 컷오프의 한쪽 측면의 시료들은 종양에 대해 양성으로, 또한 다른 측면은 음성으로 고려된다. 추가적인 컷오프들이 결과들 예를 들어 확실성의 증가하는 수준들을 가리키도록 확립될 수 있다. 본 경우에서, 우리의 훈련 세트에서 우리는 15%의 위양성율을 주는 컷오프를 확립하였다. 우리의 교차-검증된 ROC 곡선들을 사용하여, 우리는 다음으로 우리의 민감도를 추정할 수 있다. 전형적으로, 우리는 75%의 양성 예측 수치에서도 역시 컷오프를 확립하였다. 이들 컷오프들을 사용하기 위하여, 우리는 85% 특이도에 의해 확립된 컷오프 이하의 점수들에 대한 "음성" 결과를 확립하였다. 75% PPV 이상의 점수들은 "양성"이라고 불리고 둘 사이의 점수는 "비결정 (indeterminate)" 또는 "의심"이라고 불린다.
IL8Rb 마커에 대한 항체들
추가적인 관점들에서, 본 발명은 IL8Rb에 대한 항체들의 제조를 포함한다. 마커 IL8Rb는 면역학적 반응을 나타내는 데 적합하도록 충분한 양으로 생산될 수 있다. 일정 경우들에서, 전장의 IL8Rb가 사용될 수 있고, 다른 경우들에서는 IL8Rb의 펩타이드 단편이 면역원으로서 충분할 수 있다. 면역원은 적합한 숙주 (예로, 마우스, 토끼 등) 내에 주사될 수 있고, 원하는 경우 프런드 완전 아쥬반트 또는 프런드 불완전 아쥬반트와 같은 아쥬반트가 면역 반응을 증가시키도록 주사될 수 있다. 항체들을 제조하는 것은 면역학적 기술분야에서 일상적이고 본 명세서에서 좀 더 기술될 필요가 없는 점은 이해될 수 있다. 그 결과, 누구라도 IL8Rb에 대한 모노클론 또는 파지-디스플레이 항체들을 포함하는 항체들을 생산할 수 있다.
보다 좀 더 나아간 구현예들에서, 항체들은 본 명세서에서 확인된 종양 마커들의 단백질 또는 단백질 코아와 대비하여, 또는 IL8Rb에 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열와 대비하여 제조될 수 있다. 소정의 단백질들이 당화될 수 있더라도, 당화 양식에서의 변화들이 소정의 상황들에서 보통의 당화 양식들이 결여된 IL8Rb 형태들의 오류-검출 (mis-detection)을 유발한다. 따라서, 본 발명의 소정의 관점들에서, IL8Rb 면역원들은 탈당화된 IL8Rb 또는 탈당화된 IL8Rb 단편들을 포함할 수 있다. 탈당화 (deglycosylation)는 당해 기술분야에 알려져 있는 하나 이상의 글리코시다제들을 사용하여 달성될 수 있다. 임의적으로, IL8Rb cDNA는 대장균 등을 포함하는 원핵 세포주들과 같은 당화-결핍 세포주들에서 발현될 수 있다.
본 발명에서는 IL8Rb-인코딩 올리고뉴클레오타이드들을 가지는 벡터들이 제조될 수 있다. 많은 이러한 벡터들은 당해 기술분야에 알려져 있는 표준 벡터들을 기초로 할 수 있다. 벡터들은 IL8Rb-생산 세포주들을 생산하도록 다양한 세포주들을 형질전환시키는 데 사용될 수 있고, 이는 IL8Rb의 검출 또는 IL8Rb의 개발된 검정법들을 표준화하는 특이 항체들 또는 기타 시약들의 개발을 위한 IL8Rb의 원하는 양들을 생산하는 데 사용될 수 있다.
키트들
본 발명의 발견들을 기초로 하여, 여러 유형들의 테스트 키트들이 고안되어 생산될 수 있다. 먼저, 검출 분자 (또는 "포획 시약")로 미리 로딩된 검출 장치를 가지는 키트들이 제작될 수 있다. IL8Rb mRNA의 검출을 위한 구현예들에서, 이러한 장치들은 검출된 mRNA와 혼성화하는 포획 시약들로서 올리고뉴클레오타이드들이 부착되어 있는 기질 (예로, 유리, 실리콘, 수정, 금속 등)을 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, mRNA의 직접적인 검출은 mRNA (cy3, cy5, 방사성 표지 또는 기타 표지로 표지됨)를 기질 상에서 올리고뉴클레오타이드들과 혼성화하여 달성될 수 있다. 다른 구현예들에서, mRNA의 검출은 먼저 원하는 mRNA에 상보적 DNA (cDNA)를 제작하여 달성될 수 있다. 다음으로, 표지된 cDNA는 기질 상에서 올리고뉴클레오타이드들과 혼성화되고 검출될 수 있다.
항체들은 키트들에 있는 포획 시약들로서도 역시 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 기질 (예로, 다중웰 플레이트)은 부착된 특이적 IL8Rb 및 BTM 포획 시약들을 가질 수 있다. 일정 구현예들에서, 키트는 포함된 차단 시약 (blocking reagent)을 가질 수 있다. 차단 시약들은 비특이적 결합을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비특이적 올리고뉴클레오타이드 결합은 연어 정자 DNA와 같은 IL8Rb 및 BTM 올리고뉴클레오타이드들을 포함하지 않는 편리한 출처라면 모두로부터 나온 과다의 DNA를 사용하여 감소시킬 수 있다. 비특이적 항체 결합은 혈청 알부민과 같은 과다의 차단 단백질을 사용하여 감소시킬 수 있다. 올리고뉴클레오타이드들 및 단백질들을 검출하는 수많은 방법들이 당해 기술분야에서 알려져 있고, 마커 연관된 분자들을 특이적으로 검출할 수 있는 전략이라면 모두가 사용될 수 있고 본 발명의 범주 내에 속하는 점이 이해될 수 있다.
항체들은 또한 예를 들어 항체 칩을 사용하여 고체 기질에 부착되어 있을 때, 사용될 수 있고, 이는 단일 칩으로 복수의 마커들의 검출을 허용할 것이다.
기질에 추가하여, 테스트 키트는 포획 시약들 (탐침들과 같음), 세척 용액들 (예로, SSC, 기타 염들, 완충액들, 계면활성제 등)뿐만 아니라 검출 분체들 (예로, cy3, cy5, 방사성 표지들 등)을 포함할 수 있다.
시료에서 IL8Rb 및 BTMs의 검출은 적합한 기법이라면 모두를 사용하여 수행될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만 올리고뉴클레오타이드 탐침들, qPCR 또는 암 마커들에 대해 올라가는 항체들을 포함할 수 있다.
테스트될 시료는 염증성 질환 또는 종양이 될 것으로 의심되는 조직의 시료에 제한되지 않는 점은 이해될 것이다. 마커는 혈청 또는 기타 체액 내로 분비될 수 있다. 따라서, 시료는 신체 시료라면 모두를 포함할 수 있고, 생검들, 혈액, 혈청, 복강 세척액들, 뇌척수액, 소변 및 대변 시료들을 포함한다.
본 발명이 인간들에서 암의 검출에 제한되지 않고, 이에 제한되는 것은 아니지만 개들, 고양이들, 말들, 소들, 양들, 사슴들, 돼지들 및 암을 가지는 것으로 알려진 기타 다른 동물을 포함하는 동물이라면 모두에서 암의 검출에 적합한 점도 역시 이해될 것이다.
체액들에서 염증성 질환 또는 암 마커들에 대한 일반 테스트들
일반적으로, 이들 체액들에서 올리고뉴클레오타이드들, 단백질들 및 펩타이드들을 검정하는 방법들이 당해 기술분야에서 알려져 있다. 올리고뉴클레오타이드들의 검출은 노던 블럿들, 서던 블럿들 또는 마이크로어레이 방법들, 또는 qPCR과 같은 혼성화 방법들을 사용하여 수행될 수 있다. 단백질들을 검출하는 방법들은 효소 결합 면역흡착 검정법들 (ELISA), 항체들을 가지는 단백질 칩들, 현탁 비드 방사성면역검정법 (RIA), 웨스턴 블럿팅 및 렉틴 블럿팅을 포함한다. 그러나, 설명자하면 질환 마커들의 체액 수준들이 샌드위치-유형의 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)를 사용하여 정량될 수 있다. 혈장 검정법들의 경우, 5 μL 분량의 적절하게 희석된 시료 또는 일련 희석된 표준 마커, 및 75 μL의 퍼옥시다제 결합 항-인간 마커 항체가 마이크로타이터 플레이트의 웰들에 첨가된다. 30℃에서 30분 배양 기간 이후에, 웰들은 미결합 항체를 제거하도록 포스페이트-완충 식염수 (PBS)에 녹인 0.05% 트윈 20으로 세척된다. 다음으로 마커 및 항-마커 항체의 결합 복합체들은 H2O2를 포함하는 o-페닐렌디아민과 30℃에서 15분 동안 배양된다. 본 반응은 1 M H2SO4를 첨가하여 종결되고 492 nm에서의 흡광도가 마이크로타이터 플레이트 해독기로 측정된다.
항-IL8Rb 항체들이 모노클론 항체들 또는 폴리클론 항체들일 수 있는 점이 이해될 수 있다. 다른 체액이라면 모두가 적합하게 연구될 수 있는 점도 역시 이해될 수 있다.
마커는 분비되거나, 생리학적 의미로 유용할 필요는 없다. 오히려, 마커 단백질 또는 유전자가 혈청으로 들어가는 기작은 검출가능하고 정량가능한 수준의 마커를 생산하는 데 효과적일 수 있다. 따라서, 세포들로부터 나온 용해성 단백질들의 정상적인 분비, 형질막으로부터 나온 막 단백질들의 분비 (slaughing), mRNA의 임의적으로 스프라이싱된 형태들 또는 이들로부터 발현되는 단백질들의 분비, 세포 사망 (세포사멸)은 유용할 마커의 충분한 수준들을 생산할 수 있다.
다양한 암 유형들을 진단하고 및/또는 치료법의 효능을 평가하는 도구들로서 혈청 마커들의 용도에 관한 지지 의견이 증가하고 있다.
Yoshikawa et al., (Cancer Letters, 151: 81-86, 2000)는 위암을 가진 환자들의 혈장에서 기질 금속분해효소-1 (matrix metalloproteinase-1)의 조직 저해제를 기술하고 있다.
Rudland et al., (Cancer Research 62: 3417-3427, 2002)는 인간 유방암에서 전이 관련 단백질로서 오스티오폰틴 (osteopontin)을 기술하고 있다.
Buckhaults et al., (Cancer Research 61: 6996-7001, 2002)는 결장직장 종양들에서 발현되는 소정의 분비 및 세포 표면 유전자들을 기술하고 있다.
Kim et al., (JAMA 287(13): 1671-1679, 2002)는 난소암에 대한 잠재적인 진단적 생물마커로서 오스티오폰틴을 기술하고 있다.
Hotte et al., (AJ. American Cancer Society 95(3): 507-512, 2002)는 인간 체액들에서 검출가능하고 소정의 암들과 연관되어 있는 단백질로서 혈장 오스티오폰틴을 기술하고 있다.
Martin et al., (Prostate Cancer Prostatic Dis. March 9, 2004 (PMID: 15007379) (초록)은 인간 칼리크레인 2 (kallikrein 2), 전립선-특이 항원 (PSA) 및 자유 PSA의 전립선암의 검출을 위한 마커들로서의 용도를 기술하고 있다.
Hall et al (Laryngoscope 113(1): 77-81 (2003) (PMID: 12679418) (초록)은 갑상샘암에서 혈청 티오글로불린의 예측적 수치를 기술하고 있다.
Mazzaferri et al., (J. Clin. Endocrinol. Metab. 88(4): 1433-1441, 2003)은 갑상샘 암종을 가진 환자들을 감시하는 가능성 있는 방법으로서 티오글로불린을 기술하고 있다.
Whitley et al, (Dim Lab. Med. 24(1): 29-47, 2004) (초록)은 갑상샘 암종에 대한 혈청 마커로서 티오글로불린을 기술하고 있다.
Kuo et al (Clin. Chim. Acta. 294(1-2): 157-168, 2000) (초록)은 HCF- 및 HBV-감염 환자들에 있는 혈청 기질 금속단백분해효소-2 및 -9를 기술하고 있다.
Koopman et al., (Cancer Epidemiol. Biomarkers Prey 13(3): 487-491, 2004) (초록)은 췌장 샘암종에 대한 생물마커로서 오스티오폰틴을 기술하고 있다.
Pellegrini et al., (Cancer Immunol. Immunother. 49(7): 388-394, 2000) (초록)은 전-침습적 결장직장암에 대한 마커들로서 용해성 암배아 항원 (carcinoembryonic antigen) 및 TIMP 1의 측정을 기술하고 있다.
Melle et al., (Clin. Chem. 53(4): 629-635, 2007) (초록)은 췌장 샘암종에 대한 혈청 마커로서 HSP27를 기술하고 있다.
Leman et al., (Urology, 69(4): 714-20, 2007) (초록)은 전립선암에 대한 혈청 마커로서 EPCA-2를 기술하고 있다.
Tsigkou et al., (I. Clin. Endocrinol. Metab., 92(7): 2526-31, 2007) (초록)은 난소암에 대한 잠재적인 혈청 마커로서 전체 인히빈 (inhibin)을 기술하고 있다.
Marchi et al., (Cancer 112: 1313-1324, 2008) (초록)은 폐암 환자들에서 뇌 전이들의 혈청 마커로서 프로아포지질단백질 A1 (ProApolipoprotein Al)을 기술하고 있다.
실시예들
본 명세서에서 기술된 실시예들은 본 발명의 구현예들을 설명할 목적을 위한 것이다. 다른 구현예들, 방법들 및 분석들의 유형들은 분자적 진단 기술분야에서의 당업자의 범주 내에 속하고 본 명세서 상에서 자세하게 기술될 필요는 없다. 당해 기술분야의 범주 내의 다른 구현예들은 본 발명의 일부가 되는 것으로 고려된다.
실시예 1:
방법들
환자들: 2008년 4월 및 2009년 9월 사이에, 육안적 혈뇨를 제시하지만 요로 암의 사전 병력이 전혀 없었던 환자들이 뉴질랜드 및 호주에 있는 11개 비뇨기과 병원들에서 채용되었다. 각 환자는 방광경 검사 (cystoscopy) 및 기타 추가적인 진단 절차들을 거치기 직전에 소변 시료를 제공하였다. 진단은 본 연구에 참가 이후에 3개월까지 시행되었다. 이들 471명의 환자들 중에서, 442명의 환자들의 경우에 모두 5개 연구 유전자들에 관한 유전자 발현 데이타가 하기 기술된 방법들을 사용하여 성공적으로 획득되었다. 이들 환자들의 특징들은 표 4에 나타나 있다. 표 4는 연구 집단의 특징들을 나타내고, 전반적 혈뇨를 가지는 환자의 초기 발현 이후 3개월에 각 주요 진단적 카테고리들에서 환자들의 수를 보여준다.
[표 4]
소변 분석: 소변 시료들은 센트럴 리뷰 세포학 (남부 지역 연구소 (Southern Community Laboratories), Dunedin, 뉴질랜드)에 의해 분석되었다. NMP22 블래더체크 (매트리테크사) 및 NMP22 ELISA (매트리테크사)는 임상 장소에서 (블래더체크) 또는 남부지역 연구소에 의해 (NMP22 ELISA) 제조사의 지침들에 따라 수행되었다.
RNA 정량: 각 환자로부터 2 mLs의 소변이 5.64 M 구아니딘 티오시아네이트, 0.5% 사코실 및 50 mM NaoAc pH 6.5를 포함하는 RNA 추출 완충액과 혼합되었다. 다음으로 전체 RNA가 트리졸 (Trizol) (인비트로겐사) 추출 및 RNeasy 절차 (퀴아젠사)에 의해 추출되었다. RNA는 35 μL의 물로 컬럼으로부터 용출시켰고 3 μL가 연속되는 단일체 또는 이중체 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (qRT-PCR) 검정법 각각에 사용되었다. 16 μL의 qRT-PCR 반응 각각은 0.3 U의 RNAse-OUT (인비트로겐사), 0.225 μM의 각 Taqman 탐침, 1.25 U의 슈퍼스크립트 Ⅲ (인비트로겐사), 0.275 μM의 각 프라이머, 1.5 U의 신속 시작 (Fast Start) Taq 중합효소 (로슈사), 10 mM DTT, 0.375 mM dNTPs, 4.5 mM MgSO4, 1.6 μL의 10x 신속 시작 PCR 완충액 (로슈사) 및 2.6 μL의 GC 풍부 (GC rich) 용액 (로슈사)를 포함하였다. 프라이머들 및 형광 이중-표지된 탐침들은 5가지 연구 유전자들 각각: MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 및 IL8Rb에 대해 통합된 DNA 기법들로부터 획득되었다. 프라이머/탐침 서열들은 표 5에 나타나 있다. 반응들은 96웰 플레이트들에서 설정되었고 로슈 라이트 사이클러® 480 상에서 다음과 같이 순환되었다: 50℃, 15분; 95℃ 8분; 95℃ 15초의 10회, 60℃ 2분; 및 95℃ 15초의 30회, 60℃ 1분. 기준 RNA (세포주 풀들 RNAs로부터 유래됨)의 1/16 일련 희석들의 표준 곡선들은 0.3 pg/μL 내지 20 ng/μL의 범위를 생성하도록 각 플레이트 상에 포함되었다. 데이타는 최종 30회의 열순환들의 연장 단계에서 수집되었고 미가공 텍스트 파일로서 출력되었다. 하기 표 5는 5가지 RNA 마커들의 qRT-PCR 정량에 사용된 프라이머 및 탐침 서열들을 나타낸다.
[표 5]
qRT-PCR 데이타 분석: 미가공 형광 데이타는 로슈 라이트사이클러® 480으로부터 순환 횟수 대비 플레이트 상의 모든 웰들에 대한 두 개 채널의 형광 데이타를 포함하는 탭-구획된 파일로서 출력되었다. 데이타는 색상 보상을 데이타로 적용하였던 R 프로그램을 사용하여 한쪽 형광 채널로부터 다른 쪽 내로 번짐 (bleed over)을 교정하도록 가공되었다 ([Bernard 1999]). 다음으로 두 번째 도함수 최대값 (second derivative maximum)를 사용하여 Cp를 추정하도록 5점 로지스틱 모델을 맞추었다 ([Spiess 2008]).
모든 시료들 및 대조군들은 PCR 플레이트들에 두 벌로 적용되었다. 두 벌의 웰들로부터 나온 Cp 수치들은 사용 전에 평균을 내었다. 두 개 Cp 수치들 간의 차이가 3 단위들을 초과하는 경우라면, 해당 시료는 반복 측정되었다. PCR 플레이트들을 통틀어 표준화를 제공하기 위하여, Cp 수치들은 20 ng/μL에서 기준 RNA와 대비하여 △Cp's로서 표현되었다:
통계적인 분석: MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 및 IL8Rb로부터 나온 qRT-PCR △CP 수치들은 선형 판별 분석 또는 로지스틱 회귀분석을 기초로 하여, TCCs를 전혀 포함하지 않는 시료들로부터 TCCs를 포함하는 시료들을 구분하도록 분류인자들을 생성하는 데 사용되었다 ([Venables 2002]). LDA의 생성은, 예를 들어 " Modern Applied Statistics with S, 제 4판" by W.N. Venables and B.D. Ripley (2002), Springer에서 기술된 바와 같이 표준 절차들을 따른다. 연구로부터 얻은 데이타 집합은 불완전한 데이타라면 모두를 제거하였고, 다음으로 R 통계적 환경 (R Development Core Team (2009)) 및 패키지 MASS로부터 나온 함수 "Ida" (Venables and Ripley (2002))가 임상시험 데이타에 관한 선형 판별인자 (linear discriminant)을 생성하고 테스트하는 데 사용되었다.
로지스틱 회귀 분류인자의 생성은 LDA의 생성과 유사한 방식으로 수행되었다. 다시 연구 데이타는 불완전한 데이타를 제거하였다. 로지스틱 회귀 분류인자는 R을 사용하여 작성되었고; 추가적인 패키지들은 전혀 요구되지 않았다. 로지스틱 회귀는 Dalgaard (2008)에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 분류인자들 간의 비교는 R 패키지, ROCR를 사용하는 ROC 곡선들을 사용하여 시행되었다 (Sing et al. 2009). ROC 곡선들에 대한 신뢰 범위들은 맥스카시 등 (Macskassy et al.)의 방법들을 사용하여 생성되었다 ([Macskassy 2005]).
다음의 알고리즘들이 생성되었다:
선형 판별 분류인자
첫 번째 분류인자, 선형 판별인자 (LDA-3라고 불림)는 유전자들의 다중방식의 상호작용들을 허용하는 5가지 유전자 수치들 (기준 수치를 차감하여 기준 수치로 정상화됨)을 기초로 한다. 분류인자는 "MASS"라고 불리는 패키지로부터 "Ida" 함수를 사용하여 R에서 구축되었다 (R 버전 2.9.1; MASS 버전 7.2-49). 분류인자는 다음의 공식을 사용하여 구축되었다.
여기에서 Ida3는 제작된 모델이고; TCC.YN은 우리의 골드-표준, 방광경 검사에 의해 결정된 바와 같은 "소변에서 TCC의 존재"에 대한 실제 수치이고; MDK, IGF, CDC, HOXA 및 IL8R은 정상화된 유전자 Cp 수치이고; 또한 uRNA.Trial은 데이타 프레임이고 유전자들 및 TCC에 대한 수치들을 포함한다. 공식에서 별표 (*)의 사용은 곱하기를 의미하지 않고, 오히려 분류인자에서 "상호작용하는 조건들"을 의미한다.
분류인자 점수의 평가는 분류인자 점수를 유출하도록 5개 유전자 수치들뿐만 아니라 분류인자 Ida3를 포함하는 새로운 데이타 프레임을 유입정보로서 가져간다.
여기에서 점수는 TCCs의 존재를 예측하도록 분류인자로부터 사용된 유입정보이고; Ida3는 상기에서 작성된 분류인자이며, new.data는 분류인자 작성에 사용된 것과 동일한 명칭들로 불리는 5가지 유전자들의 측정된 수치들을 포함하는 데이타 프레임이다. 논리어 
및 "c"는 예측 함수에 의해 회수되는 많은 양의 정보로부터 점수를 특이적으로 추출하도록 존재한다.
점수의 컷오프를 0.112로 설정하기 위하여, 소변 시료에서 TCCs의 존재의 경우 우리의 특이도를 85%로 설정하라.
LDA-3에 대한 계수들은 다음과 같다:
로지스틱 회귀 분류인자
로지스틱 회귀를 기초로 하는 두 번째 분류인자는 LDA-3와 동일한 청소된 데이타 집합으로부터 유래되었다. 그러나, Ida 함수를 사용하는 대신에 우리는 패키지 통계 (R의 기초 설정과 함께 포함됨)로부터 glm 함수를 하기에 나타난 바와 같이 사용하였다:
여기에서 Ir1은 작성된 분류인자이고, 다른 계수들은 선형 판별인자의 경우에 기술된 바와 같다. 다시 한 번, 전적인 상호작용은 (*) 작동인자를 사용하여 특정된다. 분류는 LDA-3의 경우와 매우 유사한 방식으로 수행된다.
여기에서 점수는 상기와 같이 new.data에서 5가지 유전자들의 측정을 기초로 하여 소변 시료들을 분류하는 데 사용된 수치이다. Ir1에 대한 컷오프는 85%의 특이도를 달성하도록 0.102로 설정되고; 컷오프 주변의 수치들은 TCCs에 대해 양성으로 고려된다. 분류인자들에 대한 계수들은 다음과 같다:
결과들
소변 시료들의 qRT-PCR
TCC 검출에 미치는 전반적인 IL8Rb의 효과를 획득하기 위하여, 이차원 분산 좌표들이 TCC (n = 56) 또는 비악성 병태 요로결석증 (n = 25), 요로 감염 (n = 18) 또는 방광염 (n = 18)을 가진 환자들의 소변으로부터 얻은 qRT-PCR을 사용하여 작성되었다. 분산 좌표들은 네 가지의 유전자 표식 (MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5)으로부터 나온 유전자들의 쌍들을 사용하여 작성되었다. 다음으로 IL8Rb가 각 쌍의 한 유전자로 치환되었고 데이타는 다시 좌표 표시되었다. 이들 좌표들은 도 2a 내지 2f에 나타나 있다. MDK를 가진 좌표들에서 IGFBP5 및 HOXA13로 IL8Rb의 치환은 TCC를 가진 환자들로부터 나온 시료들 및 비악성 병태를 가진 것들 간의 개선된 분리를 보여주었다 (도 2a 내지 2c). 동일한 경향이 IL8Rb가 IGFBP5 및 HOXA13로 치환된 CDC2를 가진 좌표들에서 관찰되었다 (도 2d 내지 2f).
다음으로 전반적 혈뇨를 나타내는 환자들에서 TCC의 정확한 진단에 IL8Rb의 기여가 ROC 곡선 분석에 의해 정량되었다. 표식 (MDK, CDC2, IGFBP5 및 HOXA13)에 있는 각 유전자 및 IL8Rb에 대한 qRT-PCR 데이타는 TCC를 가진 환자들 및 이것이 없는 환자들 간의 판별을 최대화하는 선형 판별 알고리즘들을 개발하는 데 사용되었다. 두 가지의 선형 판별 알고리즘들이 전체 442개 시료들의 집단을 사용하여 개발되었다: MDK, CDC2, HOXA13 및 IGFBP5로부터 나온 qRT-PCR 데이타를 사용하였던 LD1, 또한 MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 및 IL8Rb를 사용하였던 LD2. 다음으로 LD1 및 LD2은 검증된 TCC (n = 56) 또는 비악성 병태 요로결석증 (n = 25), 요로 감염 (n = 18) 또는 방광염 (n = 18)을 가진 환자들의 그룹에서 TCC 검출의 민감도 및 특이도를 보여주는 ROC 곡선들을 생성하는 데 사용되었다. 도 3a는 LD1 및 LD2에 대한 ROC 곡선들을 보여주고 있다. LD1의 경우 ROC 곡선 아래의 영역은 LD2의 경우 84%와 대비하여 78%이었다.
선형 판별 분석의 대안으로서, 로지스틱 회귀분석이 TCC를 가진 환자들 및 비악성 질환을 가진 환자들 간의 판별을 위한 알고리즘을 개발하는 데 독립적인 방법으로서 사용되었다. 선형 판별 분석의 경우와 같이, 로지스틱 회귀 알고리즘들은 전체 442개 시료들의 집단을 사용하여 개발되었다. 로지스틱 회귀분석 또한 상기 기술된 56개 TCC 및 61개 비악성 시료들을 사용하여 얻은 ROC 곡선들은 도 3b에 나타나 있다. LR1의 경우 (MDK, CDC2, HOXA13 및 IGFBP5로부터 나온 qRT-PCR 데이타를 사용하여 얻음) ROC 곡선 아래의 영역은 LD2의 경우 (MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 및 IL8Rb로부터 나온 qRT-PCR 데이타를 사용하여 얻음) 86%와 대비하여 80%이었다. 본 데이타는 소변 시료들을 사용하는 TCC의 검출 방법들에서 IL8Rb의 포함이 TCC 또한 방광염, 요로 감염 및 요로결석증과 같은 비악성 질환들을 가지는 환자들 간의 개선된 판별을 유도할 수 있는 점을 분명하게 설명하고 있다.
TCC 및 요로결석증, 요로 감염 또는 방광염을 가진 환자들 간의 판별을 위해 IL8Rb에 의해 부여되는 개선된 정확성이 더 많고 다양한 비악성 환자들을 포함하는 환자들의 비선택된 집단에서 유지되었던 점을 검증하기 위하여, 표 1에 기술된 전체 442명의 집단으로 ROC 곡선 분석들이 반복되었다. 본 분석에서, LD1 및 LD2에 대한 곡선 아래의 영역은 각각 86 및 89%이었다 (도 4a). 유사하게, LR1에 대한 곡선 아래의 영역은 87%, LR2는 91%이었다 (도 4b). 본 결과는 IL8Rb가 소변 시료들을 사용하는 TCC의 검출에서 개선된 정확성을 유도하는 점을 검증하고 있다.
IL8Rb의 포함으로 인한 암 검출에서 개선은 442명의 환자 집단에 LD1/LD2 및 LR1/LR2를 적용하고 다음으로 Ta TCC 단독 단계의 검출의 민감도를 결정하여 좀 더 설명된다. 단계 Ta 종양들은 더 높은 단계의 종양들보다 전형적으로 검출하는 것이 더욱 어려운 더 작고 더 분화된 종양들이다. LD1은 85%의 특이도에서 LD2의 경우 19/31개 (61%)와 대비하여 Ta 종양들의 18/31개 (58%)를 검출하였다. LR1은 LR2의 경우 21/31개 (77%)와 대비하여 21/31개 (68%)를 검출하였다 (85%의 특이도). 본 데이타는 LD 및 LR 알고리즘들 내로 IL8Rb의 포함이 Ta 종양들 단계의 검출 민감도를 9%까지 증가시켰던 점을 보여주고 있다. 이들 RNA 테스트들과 대비하여, 본 연구에서 세 가지 다른 방광암 테스트들은 Ta 종양들의 검출에 대해 현저하게 더 낮은 정확성을 보여주었다: 소변 세포학 (39% 민감도, 94% 특이도), NMP22 ELISA (35% 민감도, 88% 특이도) 및 NMP22 (블래더체크® "미국 매서추세스주의 매트리테크사의 등록 상표) (39% 민감도, 96% 특이도).
요로 염증의 진단의 조력자로서 IL8Rb
방광염 또는 요로 감염들과 같은 원인들로 인해 요로의 염증을 가진 환자들의 진단에 사용될 IL8Rb의 능력을 결정하기 위하여, 양성 전립선 비대증, 비특이적 전립선 질환들, 혈관 전립선, 와파린 사용에 따른 이차적인 혈뇨, 및 방광염/요로 감염으로 진단된 혈뇨 환자들에서 IL8Rb mRNA의 소변 수준들은 qRT-PCR에 의해 결정되었다. 이들 병태들 각각에 대한 평균 IL8Rb △Ct 수준들은 각각 -3.12, -3.10, -2.84, -1.98 및 -5.27이었다. 방광염/요로 감염 및 기타 조합된 비악성 상태들을 가지는 환자들에서 IL8Rb 수준의 평균 간의 차이는 윌콕슨 (Wilcoxon) 순위 합산 테스트를 사용하여 유의한 것으로 결정되었다 (p = 0.001). 본 데이타를 표현하는 박스 좌표들은 도 5에 나타나 있다. 본 데이타는 조사된 다른 비악성 병태와 대비하여 방광염 또는 요로 감염 둘 중 하나로 진단된 대부분의 환자들에서 IL8Rb 수준들의 증가를 보여준다. 좌표들 간의 중복은 세 가지 요인들의 조합에 의해 설명될 수 있다: (i) 각 병태를 정확하게 진단하는 표준 임상 관행의 무능력, (ii) 공동-유병율 (예로, 감염 및 양성 전립선 비대증), 또한 (iii) 양성 전립선 비대증, 비특이적 전립선 질환들, 혈관 전립선, 또는 와파린 사용에 따른 이차적인 혈뇨를 가진 환자들의 소집합에서 높은 소변 호중성구 수들의 정상적인 연관성. 그럼에도 불구하고 염증 및 호중성구 수들 간의 엄격한 연관성이 주어져 있어, 소변에서 IL8Rb의 정량이 이것이 감염의 결과이거나 다른 비악성 병태들과 연관이 있기 때문에 요로의 염증을 검출하는 정확한 방법을 제공한다.
실시예 2
방법들
연구 집단
연속되는 일련의 TCC의 사전 병력이 없는 환자들이 뉴질랜드에 있는 9개 비뇨기과 병원들 및 호주에 있는 2개 병원들에서 2008년 4월 28일 및 2009년 8월 11일 사이에 전망 있게 채용되었다. 환자 집합은 실시예 1에서 사용된 환자들을 포함하였지만, 첫 번째 분석에 대한 데이타가 입수가능하지 않은 추가적인 46면의 환자들이 포함되었다. 심화 연구는 획득된 결과들의 심화 분석도 역시 포함하고 있다.
시료들이 채집되었고 RNA는 실시예 1에서 기술된 바와 같이 채집되고 테스트되었다.
RNA 테스트 개발
uRNA®는 네 가지 mRNA 마커들, CDC2, HOXA13, MDK 및 IGFBP5로 구성된다. 이들 마커들은 혈액 및 염증성 세포들에서 그들의 낮은 발현 및 TCC에서 과다-발현을 기초로 하여 선택되었다. 본 집단 연구에서, 우리는 네 가지의 마커들을 단일 점수 내로 조합하는 선형 판별 알고리즘 (uRNA-D)을 전망 있게 특정하였다. uRNA-D는 독립적이었고 초기 데이타 집합 상에서 개발되었다. 그러나, 이것은 테스트를 위한 의도된 표적 집단을 대표하는 엄격하게 특성분석된 환자 그룹을 사용하여 유도되지 않았다. 그 결과, 연구 프로토콜은 현재의 집단 연구에 채용된 환자들로부터 획득된 데이타를 사용하여 다섯 가지 마커들 CDC2, HOXA13, MDK,IGFBP5 및 IL8Rb의 사용을 위한 새로운 알고리즘 (분류인자-D)의 개발도 역시 정하였다.
분류인자-D에 추가하여, 두 번째 알고리즘 (분류인자-S)이 진행 단계 (≥ 단계 1) 또는 높은 등급 (WHO/ISUP 1998 분류) 둘 중 하나인 종양들의 확인을 가능하게 하는 집단 연구 데이타를 사용하여 유도되었다. 알고리즘-S는 Ta 종양들 단계 및 ≥ 단계 1 사이에서 차별적으로 발현되는 것으로 이전에 밝혀졌던 CDC2 및 HOXA13를 포함하는 모두 다섯 개 마커들을 포함한다.
분류인자 개발
다섯 가지의 마커들 CDC2, HOXA13, MDK,IGFBP5 및 IL8Rb (분류인자-D and 분류인자-S)의 사용을 위한 두 가지 분류인자들의 개발은 본 연구에서 획득된 데이타를 기초로 하였다. 간략하게, 로지스틱 회귀분석 모델들은 통계적 프로그램화 환경, R을 사용하여 작성되었다 (R Development Core Team (2011). R: 통계적인 전산화를 위한 언어 및 환경. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http:// www.R-project.org/). 다섯 가지 마커들 및 그들의 투웨이 상호작용들 (예로, MDK x CDC2, MDK x IGFBP5, 등) 각각에 대한 △Cp 수치들을 사용하여 작성된 모델들이 분류하는 그들의 능력에 대해 평가되었다; 가장 낮은 AIC 수치들을 가진 것들은 특이도가 85%로 설정될 때 그들의 민감도에 대해 생략 (leave-one-out) 교차 검증으로 평가되었다. 여러 모델들은 선택된 매개변수들을 가장 적은 수들로 가진 모델로 분류인자-D 및 분류인자-S 각각에 대해 비교가능한 성적을 보여주었다.
통계적인 방법들
진단적 테스트가 프로토콜로 특정되는 곳에서, 비율들 및 95% 확신 범위들이 민감도 및 특이도를 위해 계산되었다. 수신된 작동 특징 (ROC) 곡선들은 스타타 록탭 및 록콤 명령들을 사용하여 좌표 표시되고 비교되었다 (Statacorp and Delong). 분류인자-D의 경우 확신 범위들이 적절하지 않지만, (시료 크기가 허용하는) 피셔 익잭트 (Fishers exact) 및 카이 스퀘어 테스트들 (Chi squared tests) 가 TCC 또는 환자 특징들 및 진정한 양성 또는 위양성 결과들의 기회들 간의 연관성을 테스트하는 데 사용되었다. 로지스틱 회귀분석 모델들이 위양성 및 위음성 결과들과 연관된 요인들을 탐구하는 데 사용되었다. 모든 분석들은 스타타 버전 11.2에서 수행되었다.
결과들
처음에 전부 517명의 환자들이 본 연구에 채용되었다; 4%의 환자들이 부적격한 것으로 확인되었거나 (n = 10), 방광경 검사를 받지 않았거나 (n = 9), TCC 상태가 진술되지 않았거나 (n = 2), 허용가능한 소변 시료를 제공하지 않았기 (n = 2) 때문에 제외되었다 (도 8). 좀 더 나아가 10명의 환자들이 하나 이상의 소변 테스트들의 결과들을 가지지 않았기 때문에 분석으로부터 배제되었다. 485명의 남은 환자들의 기본 인구통계학적 및 임상적 특징들은 도 9에 나타나 있다.
집단에서 TCC의 유병율은 13.6%이었다. 두 명은 리뷰 단계를 생략하였고 (둘 다 로칼 리뷰에서 Ta이었다) 두 명은 리뷰 등급이 주어지지 않았다 (하나는 로칼 임상병리사에 의한 등급 1이었고 다른 하나는 낮았다). 66명의 종양들 중에서 55명은 표재성 (단계 Ta, T1 또는 Tis)이었고 11명은 근육 침습적 (T2)이었다. 환자들은 검출가능한 전이들 또는 부위적 림프절들의 관여가 전혀 없었다. 1973년 등급화 체계를 사용하여, 24명은 등급 3으로, 38명은 등급 2, 3명은 등급 1 및 한 명은 미지로서 분류되었다. WHO 98 체계로는, 29명은 높은 등급으로, 4명은 혼합, 32명은 낮은 등급 및 한 명은 미지로서 분류되었다. TCCs에 추가하여, 두 명의 환자들은 파필로마로 진단되었고, 일곱 명은 다른 신생물들로 (이들의 다섯은 비뇨기적임) 진단되었다.
uRNA-D 테스트의 컷오프는 85%로 설정된 특이도로 연구 집단 상에서 결정되었다. 본 컷오프를 사용하여, uRNA-D는 66명 TCC 사례들 중 41명을 NMP22TM ELISA (50%), 블래더체크TM(38%) 및 세포학 (56%)과 비교하여 검출하였다 (62%의 민감도). 집단 데이타 분류인자-D 상에서 개발된 RNA 테스트는 85%의 특이도에서 TCC 사례들의 54명 (82%) 또한 90%의 특이도에서 48명 (73%)을 검출하였다. uRNA-D 및 NMP22TM ELISA 수치들은 테스트들 둘 다가 연구 이전에 전부 특정되었기 때문에 직접적으로 비교될 수 있다. 도 2a는 ROC 곡선들을 보여준다; 곡선 아래의 영역 (AUCs)은 각각 0.81 및 0.73이었다 (p = 0.03). 분류인자-D에 대한 ROC 곡선은 0.87이었고 (도 11b), uRNA-D과 대비한 성적의 개선은 주로 임상적으로 적절한 특이도들의 범위에 속하는 (80% 초과) 것으로 나타난다.
전반적으로, 분류인자-D는 uRNA-D (83%), 세포학 (83%), NMP22 ELISA (69%) 및 블래더체크 (38%)와 대비하여 높은 등급의 3개 종양들의 97%를 검출하였다. 분류인자-D는 28 내지 41% 범위의 다른 테스트들과 비교하여 낮은 등급 종양들 (69%)의 검출에 역시 더욱 민감하였다 (도 12). 분류인자-D는 단계 ≥ 1의 TCC 사례들 모두 및 Tis 둘 다에 대해 양성이었지만 민감도는 단계 Ta에 대해 68%이었다 (p = 0.016, 도 12). 이것은 다른 테스트들보다 여전히 실질적으로 더 높았고, uRNA-D는 41%로 다음으로 가장 높았다. 소변 시료에서 분명한 미세혈뇨를 가진 TCC 환자들은 이것이 적어도 부분적으로는 미세혈뇨를 가지는 환자들 중에서 더 높은 비율의 높은 단계 및 등급 TCCs의 결과일 가능성이 있더라고, 미세혈뇨가 없는 환자들보다 IL8Rb를 포함하는 것에 의해 검출되는 TCC를 아마도 더 가질 수 있었다 (p < 0.0005). 숫자들은 이것을 회귀 분석들로 좀 더 연구하는 데 불충분하였다.
분류인자-D에 의해 생략되는 12가지의 사례들 모두는 단계 Ta이었고 하나를 제외한 모두는 낮은 등급이었다 (WHO ISUP 1998). 12개 중의 2개만이 (둘 다 낮은 등급, 단계 Ta TCC) 또 다른 테스트에 의해 선택되었다 (하나는 NMP22TM ELISA 및 블래더체크TM 둘 다에 의해 또한 하나는 uRNA-D에 의해). 세포학은 분류인자-D가 생략한 TCCs라면 모두를 선택하지 않았다.
환자 A: 높은 등급 신장 골반 T2 종양, 동시적인 Tis 없음, 주어진 크기 없음.
환자 B: 높은 등급 방광 T3a, 동시적인 Tis 없음, 2 x 3 cm.
환자 C: 확장된 간질 및 고유근 (muscularis propria) 침습으로 전이의 증거는 없지만 방광주위 지방으로 확장된, 4.8 x 5.6 cm로 측정되는 높은 등급 종양.
대안의 진단들로 또한 소변 시료 특징들에 따라 이들 중에서 소변 테스트들의 특이도는 도 13에 나타나 있다. 미세혈뇨를 가진 대조군 환자들은 미세혈뇨가 없는 환자들보다 위양성 테스트들을 아마도 더 가질 수 있었고 (p = 0.002), 결석을 가진 환자들은 진단에 의한 특이도의 차이들이 전부 통계적으로 유의하지 않더라도 (p = 0.12) 마찬가지일 수 있는 점을 제시하였다. 다른 비뇨기 암들을 가진 5명의 환자들이 있었고; 이들의 한 명만이 양성 분류인자-D 테스트 결과를 주었다. 맞춤 로지스틱 회귀분석 모델들로부터 얻은 결과들은 유사하였다. 진단 및 미세혈뇨를 가진 로지스틱 회귀분석 모델에서, 미세혈뇨 상태와의 연관성은 유의하게 남아있었고 (p=0.006), 무진단과 직접적으로 대비할 때 결석을 가진 환자들은 위양성 테스트의 2.7배 증가된 오류들을 가졌다 (95% CI (1.1 내지 6.4), p = 0.03). 연령은 테스트의 특이도에 영향을 주지 않았다.
소변 시료에서 검출되는 미세혈뇨는 테스트 민감도와 분명하게 연관된 유일한 요인이었다. 본 집단에서 양성 테스트의 예측 수치는 혈뇨를 가진 환자들의 경우 63%, 또한 혈뇨가 없는 환자의 경우는 24%이었으며, 미세혈뇨를 가진 환자들에서 TCC의 더 큰 유병율을 크게 반영하였다 (39% 대비 6%).
분류인자-D 테스트가 양성인 TCC를 가진 54명 환자들이 있었다. 이들 환자들은 분류인자-S를 사용하여 심각한 및 덜 심각한 TCC로 분류되었다. 심각한 TCC는 단계라면 모두에서 단계 ≥ 1 또는 등급 3으로서 정의되었다. 90%의 특이도에서, 분류인자-S는 심각한 TCC 사례들의 32/35개 (91%)를 정확하게 분류하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Pacific Edge Limited
<120> Novel Marker For the Detection of Bladder Cancer
<130> IF13P112/NZ
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> PRT
<213> Human
<400> 1
Met Glu Asp Phe Asn Met Glu Ser Asp Ser Phe Glu Asp Phe Trp Lys
1 5 10 15
Gly Glu Asp Leu Ser Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Pro Pro Phe
20 25 30
Leu Leu Asp Ala Ala Pro Cys Glu Pro Glu Ser Leu Glu Ile Asn Lys
35 40 45
Tyr Phe Val Val Ile Ile Tyr Ala Leu Val Phe Leu Leu Ser Leu Leu
50 55 60
Gly Asn Ser Leu Val Met Leu Val Ile Leu Tyr Ser Arg Val Gly Arg
65 70 75 80
Ser Val Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu
85 90 95
Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ile Trp Ala Ala Ser Lys Val Asn Gly Trp
100 105 110
Ile Phe Gly Thr Phe Leu Cys Lys Val Val Ser Leu Leu Lys Glu Val
115 120 125
Asn Phe Tyr Ser Gly Ile Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ser Val Asp Arg
130 135 140
Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Arg Thr Leu Thr Gln Lys Arg Tyr
145 150 155 160
Leu Val Lys Phe Ile Cys Leu Ser Ile Trp Gly Leu Ser Leu Leu Leu
165 170 175
Ala Leu Pro Val Leu Leu Phe Arg Arg Thr Val Tyr Ser Ser Asn Val
180 185 190
Ser Pro Ala Cys Tyr Glu Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Asn Trp Arg
195 200 205
Met Leu Leu Arg Ile Leu Pro Gln Ser Phe Gly Phe Ile Val Pro Leu
210 215 220
Leu Ile Met Leu Phe Cys Tyr Gly Phe Thr Leu Arg Thr Leu Phe Lys
225 230 235 240
Ala His Met Gly Gln Lys His Arg Ala Met Arg Val Ile Phe Ala Val
245 250 255
Val Leu Ile Phe Leu Leu Cys Trp Leu Pro Tyr Asn Leu Val Leu Leu
260 265 270
Ala Asp Thr Leu Met Arg Thr Gln Val Ile Gln Glu Thr Cys Glu Arg
275 280 285
Arg Asn His Ile Asp Arg Ala Leu Asp Ala Thr Glu Ile Leu Gly Ile
290 295 300
Leu His Ser Cys Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ile Gly Gln Lys
305 310 315 320
Phe Arg His Gly Leu Leu Lys Ile Leu Ala Ile His Gly Leu Ile Ser
325 330 335
Lys Asp Ser Leu Pro Lys Asp Ser Arg Pro Ser Phe Val Gly Ser Ser
340 345 350
Ser Gly His Thr Ser Thr Thr Leu
355 360
<210> 2
<211> 2880
<212> DNA
<213> Human
<400> 2
aggttcaaaa cattcagaga cagaaggtgg atagacaaat ctccaccttc agactggtag 60
gctcctccag aagccatcag acaggaagat gtgaaaatcc ccagcactca tcccagaatc 120
actaagtggc acctgtcctg ggccaaagtc ccaggacaga cctcattgtt cctctgtggg 180
aatacctccc caggagggca tcctggattt cccccttgca acccaggtca gaagtttcat 240
cgtcaaggtt gtttcatctt ttttttcctg tctaacagct ctgactacca cccaaccttg 300
aggcacagtg aagacatcgg tggccactcc aataacagca ggtcacagct gctcttctgg 360
aggtgtccta caggtgaaaa gcccagcgac ccagtcagga tttaagttta cctcaaaaat 420
ggaagatttt aacatggaga gtgacagctt tgaagatttc tggaaaggtg aagatcttag 480
taattacagt tacagctcta ccctgccccc ttttctacta gatgccgccc catgtgaacc 540
agaatccctg gaaatcaaca agtattttgt ggtcattatc tatgccctgg tattcctgct 600
gagcctgctg ggaaactccc tcgtgatgct ggtcatctta tacagcaggg tcggccgctc 660
cgtcactgat gtctacctgc tgaacctagc cttggccgac ctactctttg ccctgacctt 720
gcccatctgg gccgcctcca aggtgaatgg ctggattttt ggcacattcc tgtgcaaggt 780
ggtctcactc ctgaaggaag tcaacttcta tagtggcatc ctgctactgg cctgcatcag 840
tgtggaccgt tacctggcca ttgtccatgc cacacgcaca ctgacccaga agcgctactt 900
ggtcaaattc atatgtctca gcatctgggg tctgtccttg ctcctggccc tgcctgtctt 960
acttttccga aggaccgtct actcatccaa tgttagccca gcctgctatg aggacatggg 1020
caacaataca gcaaactggc ggatgctgtt acggatcctg ccccagtcct ttggcttcat 1080
cgtgccactg ctgatcatgc tgttctgcta cggattcacc ctgcgtacgc tgtttaaggc 1140
ccacatgggg cagaagcacc gggccatgcg ggtcatcttt gctgtcgtcc tcatcttcct 1200
gctctgctgg ctgccctaca acctggtcct gctggcagac accctcatga ggacccaggt 1260
gatccaggag acctgtgagc gccgcaatca catcgaccgg gctctggatg ccaccgagat 1320
tctgggcatc cttcacagct gcctcaaccc cctcatctac gccttcattg gccagaagtt 1380
tcgccatgga ctcctcaaga ttctagctat acatggcttg atcagcaagg actccctgcc 1440
caaagacagc aggccttcct ttgttggctc ttcttcaggg cacacttcca ctactctcta 1500
agacctcctg cctaagtgca gccccgtggg gttcctccct tctcttcaca gtcacattcc 1560
aagcctcatg tccactggtt cttcttggtc tcagtgtcaa tgcagccccc attgtggtca 1620
caggaagtag aggaggccac gttcttacta gtttcccttg catggtttag aaagcttgcc 1680
ctggtgcctc accccttgcc ataattacta tgtcatttgc tggagctctg cccatcctgc 1740
ccctgagccc atggcactct atgttctaag aagtgaaaat ctacactcca gtgagacagc 1800
tctgcatact cattaggatg gctagtatca aaagaaagaa aatcaggctg gccaacgggg 1860
tgaaaccctg tctctactaa aaatacaaaa aaaaaaaaaa attagccggg cgtggtggtg 1920
agtgcctgta atcacagcta cttgggaggc tgagatggga gaatcacttg aacccgggag 1980
gcagaggttg cagtgagccg agattgtgcc cctgcactcc agcctgagcg acagtgagac 2040
tctgtctcag tccatgaaga tgtagaggag aaactggaac tctcgagcgt tgctgggggg 2100
gattgtaaaa tggtgtgacc actgcagaag acagtatggc agctttcctc aaaacttcag 2160
acatagaatt aacacatgat cctgcaattc cacttatagg aattgaccca caagaaatga 2220
aagcagggac ttgaacccat atttgtacac caatattcat agcagcttat tcacaagacc 2280
caaaaggcag aagcaaccca aatgttcatc aatgaatgaa tgaatggcta agcaaaatgt 2340
gatatgtacc taacgaagta tccttcagcc tgaaagagga atgaagtact catacatgtt 2400
acaacacgga cgaaccttga aaactttatg ctaagtgaaa taagccagac atcaacagat 2460
aaatagttta tgattccacc tacatgaggt actgagagtg aacaaattta cagagacaga 2520
aagcagaaca gtgattacca gggactgagg ggaggggagc atgggaagtg acggtttaat 2580
gggcacaggg tttatgttta ggatgttgaa aaagttctgc agataaacag tagtgatagt 2640
tgtaccgcaa tgtgacttaa tgccactaaa ttgacactta aaaatggttt aaatggtcaa 2700
ttttgttatg tatattttat atcaatttaa aaaaaaacct gagccccaaa aggtatttta 2760
atcaccaagg ctgattaaac caaggctaga accacctgcc tatatttttt gttaaatgat 2820
ttcattcaat atcttttttt taataaacca tttttacttg ggtgtttata aaaaaaaaaa 2880
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 3
tgcaccccca agaccaaa 18
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 4
tgattaaagc taacgagcag acagaa 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 5
ccttcccttt cttggctttg gccttt 26
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 6
cgttgtacct gcccaattgt ga 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 7
gggacgcatc actcaacgtt 20
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 8
aagagaaagc agtgcaaacc ttcccgt 27
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 9
gccgccgcgg aataat 16
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 10
tgtctaccct tatacacaac tccatagg 28
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 11
agccgggatc taccataccc attgactaac t 31
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 12
tggaacggcc aaatgtactg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 13
tggcgtattc ccgttcaagt 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 14
actctgcccg acgtggtctc cca 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 15
ccttgaggca cagtgaagac atc 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 16
cctgtaggac acctccagaa gag 23
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 17
tggccactcc aataacagca ggtcaca 27
Claims (37)
- 방광암 검출을 위한 정보 제공 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 소변 시료를 제공하는 단계;
(ii) 상기 시료에서 인간 호중성구 마커 인터루킨 8 수용체 B (IL8Rb) 유전자 및 방광암 마커 (BTM) 유전자들의 수준들을 검출하는 단계로서, 상기 BTM 유전자들은 CDC2 (cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M), MDK (midkine; neurite growth-promoting factor 2), HOXA13 (Homeo Box A13), 및 IGFBP5 (insulin-like growth factor binding protein 5)를 포함하고; 및
(iii) IL8Rb 및 BTM 유전자들의 수준들을 정상 환자들, 방광암을 가진 환자들 및 염증성 방광 병태를 가진 환자들 중 하나 이상에서의 수준들과 비교하여, 환자가 방광암을 가지는지 여부를 확립하여, 암의 존재 여부가 확립되는 단계;를 포함하고,
IL8Rb의 수준이 증가하지 않으면서 상기 BTM 유전자들의 수준들이 증가하는 것은 방광암을 가진 환자의 표시(indicative)이고, IL8Rb의 수준이 증가하는 것은 염증성 방광 병태를 가진 환자의 표시인 것인, 방광암 검출을 위한 정보 제공 방법.
- 제1항에 있어서,
(a) 암의 존재 가능성은 IL8Rb 유전자 및 BTM 유전자들의 기지의 발현 수준들을 기초로 하는 진단적 역치를 정상 환자들, 방광암을 가진 환자들 및 염증성 방광 병태를 가진 환자들 중 하나 이상에서의 수준들로 확립하여 결정되거나 결정되고,
(b) 상기 BTM 유전자들은 도 6 또는 도 7로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적 마커를 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 역치는 통계적인 방법을 사용하여 확립되는 것인, 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 통계적인 방법은 선형 판별 분석 (LDA), 로지스틱 회귀분석 (LogReg), 서포트 벡터 머신 (SVM), K-최근접 5개 이웃들 (KN5N), 및 분배 트리 분류인자 (TREE) 중 어느 하나인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
(a) 상기 검출하는 단계는 mRNA의 수준을 검출하여 수행하거나; 또는
(b) 상기 검출하는 단계는 cDNA의 수준을 검출하여 수행하는 것인, 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 cDNA의 수준을 검출하는 것은 상기 cDNA의 적어도 일부분과 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행되거나, 전방 프라이머 및 역방 프라이머를 사용하는 qRT-PCR을 사용하여 수행되는 것인, 방법.
- 소변 시료 내에서 방광암을 검출하는 장치로서, 상기 장치는:
IL8RB 유전자 포획 시약 및 방광암 마커 (BTM) 유전자들에 대한 포획 시약을 상부에 가지는 기판으로서, 상기 BTM 유전자들은 CDC2 (cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M), MDK (midkine; neurite growth-promoting factor 2), HOXA13 (Homeo Box A13), 및 IGFBP5 (insulin-like growth factor binding protein 5)를 포함하는, 기판; 및
상기 포획 시약과 연관된 발현을 검출할 수 있는, 상기 기판과 연관된 검출기;를 포함하고,
IL8Rb의 수준이 증가하지 않으면서 상기 BTM 유전자들의 수준들이 증가하는 것은 방광암을 가진 환자의 표시(indicative)이고, IL8Rb의 수준이 증가하는 것은 염증성 방광 병태를 가진 환자의 표시인 것인, 방광암을 검출하는 장치.
- 제7항에 있어서,
상기 BTM 유전자들은 도 6 또는 도 7로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적 마커를 포함하는, 장치.
- 제7항 또는 제8항에 있어서,
(a) 상기 포획 시약은 올리고뉴클레오타이드; 또는
(b) 상기 포획 시약은 올리고뉴클레오타이드, 단백질 또는 펩타이드에 특이적인 항체인, 장치.
- 소변 시료 내에서 방광암을 검출하는 키트로서, 상기 키트는:
IL8RB 유전자 포획 시약 및 방광암 마커 (BTM) 유전자들에 대한 포획 시약을 상부에 가지는 기판으로서, 상기 BTM 유전자들은 CDC2 (cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M), MDK (midkine; neurite growth-promoting factor 2), HOXA13 (Homeo Box A13), 및 IGFBP5 (insulin-like growth factor binding protein 5)를 포함하는, 기판; 및
상기 포획 시약과 마커의 복합체를 시각화하는 수단; 시약들; 및 사용시 지침들;을 포함하고,
IL8Rb의 수준이 증가하지 않으면서 상기 BTM 유전자들의 수준들이 증가하는 것은 방광암을 가진 환자의 표시(indicative)이고, IL8Rb의 수준이 증가하는 것은 염증성 방광 병태를 가진 환자의 표시인 것인, 방광암을 검출하는 키트.
- 제10항에 있어서,
(a) 상기 포획 시약은 올리고뉴클레오타이드; 또는
(b) 상기 포획 시약은 올리고뉴클레오타이드, 단백질 또는 펩타이드에 선택적인 항체인, 키트.
- 방광암 스크리닝을 위한 정보 제공 방법으로서, 상기 방법은:
테스트 개체로부터 나온 테스트 소변 시료를 제공하는 단계;
상기 테스트 소변 시료에서 IL8Rb 유전자 및 방광암 마커 (BTM) 유전자들의 존재를 측정하되, 상기 BTM 유전자들은 CDC2 (cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M), MDK (midkine; neurite growth-promoting factor 2), HOXA13 (Homeo Box A13), 및 IGFBP5 (insulin-like growth factor binding protein 5)를 포함하는 단계; 및
상기 테스트 소변 시료에 존재하는 마커들의 양을 방광암을 가지지 않은 개체로부터 나온 대조군 시료로부터 얻은 수치 또는 염증성 방광 병태를 가진 개체의 대조군 시료로부터 얻은 수치 중 하나 이상과 비교하여, 방광암 존재 여부를 확립하는 단계를 포함하고,
IL8Rb의 수준이 증가하지 않으면서 상기 BTM 유전자들의 수준들이 증가하는 것은 방광암을 가진 환자의 표시(indicative)이고, IL8Rb의 수준이 증가하는 것은 염증성 방광 병태를 가진 환자의 표시인 것인, 방광암 스크리닝을 위한 정보 제공 방법.
- 제12항에 있어서,
하기 (a) 또는 (b) 중 하나 이상을 만족하는 것인, 방법:
(a) 상기 마커는 올리고뉴클레오타이드, DNA 또는 RNA이거나;
(b) 상기 측정하는 단계는 ELISA 검정법을 사용하는 것인, 방법.
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Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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