BR112013011875B1 - Método para rastreamento de câncer de bexiga, dispositivo e kit para detecção de um câncer de bexiga - Google Patents

Método para rastreamento de câncer de bexiga, dispositivo e kit para detecção de um câncer de bexiga Download PDF

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Abstract

método para detecção do câncer de bexiga, método para rastreamento do mesmo, dispositivo para detecção de um câncer de bexiga e kit para detecção deste. a presente invenção refere-se ao uso de receptor b de interleucina 8 marcador de neutrófilo humano (il8rb) para detecção do câncer de bexiga, e mais particularmente ao uso de el8rb para distinguir carcinoma celular transicional da bexiga (tcc) e condições inflamatórias da bexiga.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere à detecção da doença. Es pecificamente, a presente invenção se refere ao uso de marcadores genéticos e/ou proteicos para detecção de doença da bexiga, e mais particularmente ao uso de marcadores genéticos e/ou proteicos para detecção de carcinoma de célula transicional da bexiga (TCC) ou para a detecção de condições inflamatórias da bexiga.
ANTECEDENTES Introdução
[002] A sobrevida de pacientes com câncer é muito aumentada quando o câncer é tratado cedo. No caso de câncer de bexiga, os pacientes diagnosticados com a doença que é confinada ao sítio primário têm uma taxa de sobrevida de 5 anos de 73%, em comparação com 6% de pacientes com a doença metastásica (Altekruse et al.). Por isso, desenvolvimentos que levam ao diagnóstico precoce e exato do câncer de bexiga podem levar a um prognóstico melhorado dos pacientes. Para ajudar na detecção precoce do câncer, diversos marcadores específicos de câncer foram identificados. Entretanto, o uso destes marcadores pode resultar em resultados falsos-positivos em pacientes tendo doenças de bexiga inflamatórias, e não câncer de bexiga.
[003] Vários testes receberam a aprovação do FDA para diagnós tico de câncer de bexiga ou monitoramento incluindo ELISA NMP22® (uma marca comercial registrada de Matritech, Inc., de Massachusetts, Estados Unidos) e ensaios locais BladderChek® (uma marca comercial registrada de Matritech, Inc. de Massachusetts, Estados Unidos), UroVysion® (uma marca comercial registrada de Abbott Laboratories, Inc., de Illinois, Estados Unidos), ImmunoCyt® (uma marca comercial registrada de Sanofi Pasteur Limited/Sanofi Pasteur Limitee, Ontário, Canadá e Aventis Pasteur Limited/Adventis Pasteur Limitee, Ontário, Canadá) e BTA (antígeno de tumor de bexiga), embora nenhum tenha demonstrado desempenho suficiente para dispensar rotineiramente a citologia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004] Há uma necessidade de marcadores adicionais que sejam específicos para a doença inflamatória na bexiga, tanto para o diagnóstico da doença inflamatória na bexiga como também melhorar o diagnóstico do carcinoma de célula transicional da bexiga (TCC). Especificamente, há uma necessidade de marcadores para permitir a diferenciação de TCC de outras condições inflamatórias.
[005] Os aspectos desta invenção fornecem métodos, composi ções e dispositivos que podem prover a detecção da doença inflamatória na bexiga e também reduzir a frequência de resultados falsos- positivos no diagnóstico do carcinoma de célula transicional da bexiga (TCC).
[006] Proteínas ou ácidos nucleicos que são secretados ou cliva dos da célula ou perdidos por mecanismos apoptóticos, sozinhos ou em combinação entre si, têm utilidade como marcadores de soro ou fluido corporais para o diagnóstico da doença, incluindo a doença inflamatória na bexiga e/ou câncer de bexiga ou como marcadores para monitorar a progressão da doença estabelecida. A detecção de proteínas e marcadores celulares pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica e inclui o uso de RT-PCT, qRT-PCR, anticorpos monoclonais, antissoros policlonais e similares.
[007] Especificamente, a presente invenção fornece um método para detectar ou diagnosticar o câncer de bexiga, compreendendo: (i) fornecimento de uma amostra biológica; e (ii) detecção dos níveis do receptor B de interleucina 8 marcador de neutrófilo humano (IL8Rb) em associação com um ou mais marcadores de tumor de bexiga (BTM) na dita amostra. A presença do câncer pode ser estabelecida comparando os níveis de IL8Rb e aquele ou BTM com os níveis em pacientes normais, pacientes tendo câncer de bexiga e/ou pacientes tendo uma doença inflamatória. Por exemplo, a presença do câncer pode ser estabelecida comparando a expressão do marcador, incluindo IL8Rb, contra um limiar. O limiar pode estar na ordem de expressão que é pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes a expressão normal ou superior. Uma alta expressão de IL8Rb pode ser indicativa de uma doença inflamatória em vez de câncer.
[008] O método da presente invenção pode ser usado em con junto com qualquer marcador adequado para detectar o câncer de bexiga. Exemplos de marcadores adequados para uso na invenção são delineados na Figura 6 ou na Figura 7. A presente invenção inclui o uso de um ou mais dos marcadores delineados na Figura 6 ou na Figura 7 em conjunto com IL8Rb para detectar o câncer de bexiga em um paciente.
[009] Especialmente, a presente invenção envolve o uso de IL8Rb em conjunto com um ou mais dos marcadores MDK, CDC2, HOXA13 e IGFBP5 para diagnosticar câncer de bexiga. Isto é, a presente invenção também inclui qualquer combinação de IL8Rb com um ou mais dos marcadores MDK, CDC2, HOXA13 e IGFBP5, que também pode estar em combinação com um ou mais marcadores adequados para detectar o câncer de bexiga, por exemplo, qualquer um de mais dos marcadores delineados na Figura 6 ou na Figura 7. Especificamente, a presente invenção inclui qualquer uma da combinação de marcadores: IL8Rb / MDK, IL8Rb / CDC2, IL8Rb / HOXA13, IL8Rb / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2, IL8Rb / MDK / HOXA13, IL8Rb / MDK / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / HOXA13 / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / MDK / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5 e IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5. Estas combinações podem incluir opcionalmente um ou mais marcadores adicionais adequados para detectar o câncer de bexiga, por exemplo, qualquer um de mais dos marcadores delineados na Figura 6 ou na Figura 7.
[010] A presente invenção também fornece um método para de tectar condições inflamatórias da bexiga, compreendendo: (i) fornecimento de uma amostra biológica de um paciente; e (ii) detecção dos níveis do receptor B de interleucina 8 marcador de neutrófilo humano (IL8Rb) na dita amostra. A presença de condições inflamatórias da bexiga é estabelecida comparando os níveis de IL8Rb com os níveis em pacientes normais e pacientes tendo uma condição inflamatória da bexiga. Por exemplo, a presença de uma condição inflamatória da bexiga pode ser estabelecida comparando a expressão do marcador, incluindo IL8Rb, contra um limiar, o limiar pode estar na ordem da expressão que é pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes a expressão normal ou superior.
[011] Os métodos da presente invenção podem ser realizados pela detecção de qualquer marcador adequado da expressão gênica, por exemplo, determinando os níveis de mRNA, cDNA, uma proteína ou peptídeo usando qualquer método adequado.
[012] O estabelecimento de um diagnóstico pode ser estabeleci do pelo sistema classificador de uso, por exemplo, Análise Discriminante Linear (LDA), Regressão Logística (LogReg), Máquina de Vetor de Suporte (SVM), 5 K-vizinhos mais próximos (KN5N) e Classificador de Árvore de Partição (TREE).
[013] Em outra modalidade, a invenção fornece um dispositivo para detectar um câncer de bexiga, e ou uma condição inflamatória da bexiga, compreendendo: um substrato tendo um reagente de captura de IL8Rb e o reagente de captura para um ou mais marcadores de tumor de bexiga (BTM) neste; e um detector associado ao dito substrato, o dito detector capaz de detectar a expressão associada com o dito reagente de captura.
[014] A invenção também fornece um kit para detectar o câncer de bexiga, compreendendo: um substrato tendo um reagente de captura de IL8Rb e um reagente de captura para um ou mais marcadores de tumor de bexiga (BTM) neste; um meio para visualizar um complexo de dito agente de captura e um marcador; reagentes; e instruções de uso.
[015] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um mé todo para detectar o câncer de bexiga, compreendendo as etapas de: fornecimento de uma amostra teste de um paciente em risco de ter câncer de bexiga; medida da expressão da proteína de IL8Rb e um ou mais marcadores de tumor de bexiga (BTM) na dita amostra teste; e comparação da quantidade da expressão de IL8Rb e um ou mais BTMs presentes na dita amostra teste com um valor obtido de uma ou mais amostras controle de indivíduos que não têm câncer de bexiga, e/ou com um ou mais amostras controle com indivíduos tendo uma condição inflamatória da bexiga.
[016] A presente invenção também fornece um método para ras- trear o câncer de bexiga, compreendendo as etapas de: fornecimento de uma amostra teste de um indivíduo teste; medida da presença de IL8Rb e em um ou mais marcadores de tumor de bexiga (BTM) na dita amostra teste; e comparação da quantidade de marcadores presentes na dita amostra teste com um valor obtido de uma ou mais amostras controle de indivíduos que não têm câncer de bexiga, e/ou com amostras controle com um ou mais indivíduos tendo uma condição inflamatória da bexiga.
[017] Foi verificado surpreendentemente que IL8Rb pode detec tar a presença de doença inflamatória da bexiga, e que isto pode ser usado para aumentar a capacidade de um marcador do câncer de bexiga para detectar exatamente o câncer de bexiga em um paciente reduzindo o potencial de resultados falsos-positivos causados por uma condição inflamatória de bexiga.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[018] A presente invenção é descrita com referência a modalida des específicas disso e com referência às Figuras, em que:
[019] Figura 1: mostra sequências de proteína e de mRNA de IL8Rb (também conhecido como CXCR2).
[020] Figura 2: mostra gráficos de dispersão mostrando o efeito de IL8Rb na separação de TCC da doença não maligna (cistite, infecção do aparelho urinário e urolitíase). IL8Rb foi substituído por marcadores de RNA de câncer de bexiga diferentes na Fig. 2c e 2f. (a). MDK/IGFBP5; (b). MDK/HOXA13; (c) MDK/IL8Rb; (d) CDC2/IGFBP5; (e). CDC2/HOXA13; (f). CDC2/IL8Rb.
[021] Figura 3: análise de curva ROC (sensibilidade contra espe cificidade) mostrando o efeito da inclusão de IL8Rb nos algoritmos di-agnósticos derivados usando análise discriminante linear (LD) e regressão linear (LR). As curvas ROC são derivadas de pacientes com TCC (n=56) e doenças não malignas cistite, infecção do aparelho urinário e urolitíase (n=61). (a). LD1 (sólida) e LD2 (tracejada), (b) LR1 (sólida) e LR2 (tracejada). IL8Rb está incluído em LD2 e LR2.
[022] Figura 4: análise de curva ROC estendida mostrando o efeito da inclusão de IL8Rb nos algoritmos diagnósticos derivados usando análise discriminante linear (LD) e regressão linear (LR). As curvas ROC são derivadas de pacientes com TCC (n=56) e, diferentemente da Fig. 3, qualquer doença não maligna na coorte (n=386). (a). LD1 (sólida) e LD2 (tracejada), (b) LR1 (tracejada) e LR2 (sólida). IL8Rb está incluído em LD2 e LR2.
[023] Figura 5: mostra gráficos de caixa mostrando o acúmulo do mRNA de IL8Rb na urina de pacientes com doença urológica não maligna. RNA foi quantificado por qRT-PCR usando o método delta-Ct (Holyoake et al., 2008). Com este método, um Ct mais baixo reflete níveis de RNA mais altos. BPH: hiperplasia prostática benigna; UTI: infecção do aparelho urinário; NS de próstata: doenças de próstata não específicas; Próstata Vasc.: próstata vascular; warfarina: hematúria secundária ao uso de warfarina. A observação em pacientes com cistite/UTI é significativamente diferente (p=0,001) a outras apresentações não malignas mostradas.
[024] Figura 6: mostra marcadores conhecidos por serem supe- rexpressos no câncer de bexiga e são adequados ao uso na presente invenção.
[025] Figura 7: mostra marcadores conhecidos por serem supe- rexpressos no câncer de bexiga e são adequados ao uso na presente invenção.
[026] Figura 8: mostra um diagrama de fluxo dos procedimentos de recrutamento de pacientes e números para o Exemplo 2.
[027] Figura 9: características clínicas e demográficas de refe rência dos pacientes por status de doença em 3 meses.
[028] Figura 10: mostra a sensibilidade total e a especificidade dos testes de urina.
[029] Figura 11: mostra várias curvas ROC; 11a. curvas ROC para ELISA NMP22 e uRNA-D (teste que compreende os quatro marcadores MDK+CDC2+IGFBP5+HOXA13); e 11b. curva ROC para os cinco marcadores MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 e IL8Rb.
[030] Figura 12: mostra a sensibilidade de testes de urina por estágio, classe, posição do tumor, multiplicidade do tumor, status da hematúria, creatinina da amostra de urina e sexo. As tabelas mostram números e porcentagem com um teste de urina positivo entre aqueles com TCC.
[031] Figura 13: mostra a especificidade de testes de urina por diagnóstico, micro-hematúria, creatinina e sexo. As tabelas mostram o número e o% com um resultado de prova de urina negativo entre aqueles sem TCC.
[032] Figura 14: mostra curvas ROC das combinações de marca dores: (a) MDK, (b) CDC, (c) IGFBP5, (d) HOXA13, (e) MDK+CDC2, (f) MDK+IGFBP5, (g) MDK+HOXA13, (h) CDC2+IGFBP5, (i) CDC+HO XA13, (i) IGF+HOXA13, (k) MDK+CDC2+IGFBP5, (I) MDK+CDC2+ HOXA13, (m) MDK+IGFBP5+HOXA13, (n) CDC2+IGFBP5+HOXA13, (o) MDK+CDC2+IGFBP5+HOXA13, mais ou menos IL8Rb, usando cinco modelos de classificadores diferentes (i) Análise Discriminante Linear (LDA), (ii) Regressão Logística (LogReg), (iii) Máquina de Vetor de Suporte (SVM), (iv) 5 K-vizinhos mais próximos (KN5N), e (v) Classificador de Árvore de Partição (TREE).
[033] Figura 15: mostra (a) a "Área Sob a Curva" (AUC) da taxa de falsos-positivos de até 20% (especificidade de 80%) das curvas ROC da Figura 14 e (b) mostra a diferença da AUC resultante da inclusão de IL8Rb.
[034] Figura 16: mostra a sensibilidade das combinações dos qua tro marcadores MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13, mais ou menos IL8Rb, usando cinco modelos de classificadores diferentes (i) Análise Discriminante Linear (LDA), (ii) Regressão Logística (LogReg), (iii) Máquina de Vetor de Suporte (SVM), (iv) 5 K-vizinhos mais próximos (KN5N), e (v) Classificador de Árvore de Partição (TREE), em especificidades de conjunto diferentes; (a) 80%, (b) 85%, (c) 90%, (d) 95%, (e) 98%.
[035] Figura 17: mostra os ganhos resultantes na sensibilidade de adicionar IL8Rb em especificidades de conjunto diferentes (a) 80%, (b) 85%, (c) 90%, (d) 95%, (e) 98%, e os ganhos resultantes na especificidade de adicionar IL8Rb em especificidades de conjunto diferen- tes (f) 80%, (g) 85%, (h) 90%, (i) 95%, (j) 98%
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[036] Antes de descrever as modalidades da invenção detalha damente, será útil fornecer algumas definições de termos como usados neste pedido.
[037] O termo "marcador" se refere a uma molécula que está asso ciada quantitativamente ou qualitativamente com a presença de um fenômeno biológico. Exemplos de "marcadores" incluem um polinucleotí- deo, como um gene ou fragmento gênico, RNA ou fragmento de RNA; ou um produto gênico, incluindo um polipeptídeo como um peptídeo, oli- gopeptídeo, proteína ou fragmento proteico; ou qualquer metabólito relacionado, por produtos, ou qualquer outra molécula de identificação, como anticorpos ou fragmentos de anticorpo, se relacionados diretamente ou indiretamente a um mecanismo que é a base do fenômeno. Os marcadores da invenção incluem as sequências nucleotídicas (por exemplo, sequências do GenBank) como descrito neste pedido, especialmente, as sequências completas, qualquer sequência de codificação, qualquer fragmento, ou qualquer complemento dos mesmos e qualquer marcador mensurável dos mesmos como definido acima.
[038] Como usado neste pedido, "anticorpos" e termos similares referem-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamen- te ativas das moléculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que especificamente se liga (imunoreage com) a um antígeno. Estes incluem, mas não são limitados à cadeia policlonal, monoclonal, quimérica, única, fragmentos Fc, Fab, Fab’ e Fab2, e uma biblioteca de expressão de Fab. As moléculas de anticorpo relacionam-se a qualquer uma das classes de IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que se diferenciam entre si pela natureza da cadeia pesada presente na molécula. Estas incluem subclasses também, co- mo IgG1, lgG2, e outras. A cadeia leve pode ser uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda. Referência neste pedido para anticorpos inclui uma referência para todas as classes, subclasses e tipos. Também são incluídos anticorpos quiméricos, por exemplo, anticorpos mono- clonais ou fragmentos dos mesmos que são específicos para mais de uma fonte, por exemplo, uma sequência de camundongo ou humana. Ainda incluídos são anticorpos camelídeos, anticorpos de tubarão ou nanocorpos.
[039] Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular anormal ou não regulado. O câncer e a patologia do câncer podem estar associados, por exemplo, com metástase, interferência no funcionamento normal de células vizinhas, liberação de citocinas ou outros produtos secretórios em níveis anormais, supressão ou agravação da resposta inflamatória ou imunológica, neoplasia, pré-malignidade, malignidade, invasão de tecidos ou órgãos circundantes ou distantes, como linfonodos, etc.
[040] O termo "tumor" se refere a todo crescimento e proliferação celular neoplásicos, ou malignos ou benignos, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
[041] O termo "câncer de bexiga" se refere a um tumor que se origina na bexiga. Estes tumores são capazes de se metastatizarem a qualquer órgão.
[042] O termo "BTM" ou "marcador de tumor de bexiga" ou "membro da família BTM" significa um marcador de tumor (TM) que está associado ao câncer de bexiga e carcinoma de célula transicional da bexiga (TCC). O termo BTM também inclui combinações de marcadores individuais, cuja combinação melhora a sensibilidade e especificidade de detecção do câncer de bexiga. Deve ser entendido que o termo BTM não requer que o marcador seja somente específico para tumores de bexiga. Ao invés disso, a expressão de BTM pode ser alterada em outros tipos de células, células doentes, tumores, incluindo tumores malignos.
[043] O termo "subexpressão de BTM" significa um marcador que mostra expressão mais baixa em tumores de bexiga do que no tecido de bexiga não maligno.
[044] O termo "superexpressão de BTM" significa um marcador que mostra a expressão mais alta em tumores de bexiga do que no tecido não maligno.
[045] Os termos "diferencialmente expressos", "expressão dife rencial" e frases similares se referem a um marcador gênico cuja expressão é ativada em um nível mais alto ou mais baixo em um indivíduo (por exemplo, amostra teste) tendo uma condição, especificamente câncer, como melanoma, relativa à sua expressão em um indivíduo controle (por exemplo, amostra de referência). Os termos também incluem marcadores cuja expressão é ativada em um nível mais alto ou mais baixo em estágios diferentes da mesma condição; em doenças com um prognóstico bom ou ruim; ou em células com níveis mais altos ou mais baixos de proliferação. Um marcador diferencialmente expresso pode ser ativado ou inibido no nível de polinucleotídeo ou nível de polipeptídeo, ou pode ser submetido ao splicing alternativo para resultar em um produto de polipeptídeo diferente. Tais diferenças podem ser evidenciadas por uma modificação em níveis de mRNA, expressão superficial, secreção ou outro particionamento de um polipeptídeo, por exemplo.
[046] A expressão diferencial pode incluir uma comparação da expressão entre dois ou mais marcadores (por exemplo, genes ou seus produtos gênicos); ou uma comparação das proporções da expressão entre dois ou mais marcadores (por exemplo, genes ou seus produtos gênicos); ou uma comparação de dois produtos diferente- mente processados (por exemplo, transcritos ou polipeptídeos) do mesmo marcador, que se diferenciam entre indivíduos normais e indivíduos doentes; ou entre vários estágios da mesma doença; ou entre doenças que têm um prognóstico bom ou ruim; ou entre células com níveis mais altos e mais baixos de proliferação; ou entre tecido normal e tecido doente, especificamente câncer ou melanoma. A expressão diferencial inclui ambas diferenças quantitativas, bem como qualitativas no padrão de expressão temporal ou celular em um gene ou seus produtos de expressão entre, por exemplo, células normais e doentes, ou entre células que sofreram eventos de doença diferentes ou estágios de doença ou células com níveis diferentes de proliferação.
[047] O termo "expressão" inclui a produção de polinucleotídeos e polipeptídeos, especialmente, a produção de RNA (por exemplo, mRNA) de um gene ou porção de um gene, e inclui a produção de um polipeptídeo codificado por RNA ou gene ou porção de um gene e o aparecimento de um material detectável associado à expressão. Por exemplo, a formação de um complexo, por exemplo, de uma interação de polipeptídeo-polipeptídeo, interação polipeptídeo-nucleotídeo ou similares, está incluída dentro do escopo do termo "expressão". Outro exemplo é a ligação de um ligante de ligação, como uma sonda de hi- bridização ou anticorpo, a um gene ou outro polinucleotídeo ou oligo- nucleotídeo, um polipeptídeo ou um fragmento proteico e a visualização do ligante de ligação. Dessa forma, a intensidade de um ponto em um microarranjo, em um blot de hibridização tal como um Northern blot, ou em uma imunomarcação tal como um Western blot, ou em um arranjo de contas, ou pela análise de PCR, está incluída dentro do termo "expressão" da molécula biológica subjacente.
[048] Os termos "limiar de expressão gênica," e "limiar de ex pressão definido" são usados intercambiavelmente e referem-se ao nível de um marcador em questão, fora que o nível de expressão do polinucleotídeo ou polipeptídeo serve como um marcador preditivo de uma condição no paciente. Por exemplo, a expressão de IL8Rb acima de certo limiar é diagnóstica que o paciente tenha uma condição inflamatória. Um limiar também pode ser usado ao testar um paciente suspeito para o câncer de bexiga, usando marcadores de câncer de bexiga. Os níveis de expressão acima de um limiar indicam que o paciente tem uma condição inflamatória de bexiga, provavelmente por ocasionar um teste falso-positivo de câncer, ao passo que um nível de expressão de IL8Rb abaixo de um limiar é preditivo que o paciente não tenha uma condição inflamatória de bexiga. Pela inclusão da medida de IL8Rb, qualquer resultado a partir da expressão dos marcadores de tumor de bexiga pode ser dependente de se os níveis de IL8Rb forem abaixo do limiar (isto é, um resultado positivo será provavelmente positivo para o paciente tendo câncer em vez de níveis aumentados dos marcadores de tumor de bexiga que de fato resultam da esfoliação de células não malignas da mucosa da inflamação).
[049] O termo "limiar diagnóstico" se refere a um limiar no qual pode ser dito que um paciente tenha sido diagnosticado com ou sem uma condição dada, por exemplo, câncer de bexiga. Um limiar diagnóstico é geralmente definido para alcançar uma sensibilidade e especificidade desejadas, dependendo de fatores como população, prevalência e, provavelmente, resultado clínico. Em geral, o limiar diagnóstico pode ser calculado e/ou estabelecido usando algoritmos e/ou análise de dados computadorizada.
[050] O limiar exato será dependente da população e também qualquer modelo sendo usado para predizer a doença (modelo prediti- vo). Um limiar é estabelecido experimentalmente de estudos clínicos como os descritos nos Exemplos abaixo. Dependendo do modelo de predição usado, o limiar de expressão pode ser definido para alcançar a sensibilidade máxima, ou para a especificidade máxima, ou para o erro mínimo (taxa de classificação máxima). Por exemplo, um limiar mais alto pode ser definido para alcançar erros mínimos, mas isto pode resultar em uma sensibilidade mais baixa. Por isso, para qualquer modelo preditivo dado, os estudos clínicos serão usados para definir um limiar de expressão que geralmente alcança a sensibilidade mais alta ao ter uma taxa de erro mínima. Em geral o limiar provavelmente estará na ordem da expressão que é pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes a expressão normal ou superior.
[051] O termo "sensibilidade" significa a proporção de indivíduos com a doença que testam positivo (pelo modelo). Dessa forma, a sensibilidade aumentada significa menos resultados de testes falsos- negativos.
[052] O termo "especificidade" significa a proporção de indivíduos sem a doença que testam (pelo modelo) negativo. Dessa forma, a es-pecificidade aumentada significa menos resultados de prova positivos falsos.
[053] O termo "curva ROC" ou curva Característica Operacional de Receptor significa um gráfico da taxa de verdadeiros-positivos (sensibilidade) contra a taxa de falsos-positivos (especificidade) para corte diferente de pontos de um marcador ou teste particular. Cada ponto na curva ROC representa um ponto de sensibilida- de/especificidade específico que corresponderá a um limiar dado. A curva ROC pode ser importante para estabelecer um limiar para fornecer um resultado desejado. A área sob uma curva ROC representa (expressa como uma análise de AUC), pode ser uma medida de como bem um marcador dado ou teste podem distinguir-se entre resultados diagnósticos. A curva ROC também pode ser usada para comparar a exatidão de dois testes diferentes.
[054] O termo "oligonucleotídeo" se refere a um polinucleotídeo, tipicamente uma sonda ou iniciador, incluindo, sem limitação, desoxir- ribonucleotídeos de fita simples, ribonucleotídeos de fita única ou dupla, híbridos de RNA:DNA, e DNAs de fita dupla. Os oligonucleotídeos, tais como oligonucleotídeos de sonda de DNA de fita simples, muitas vezes são sintetizados por métodos químicos, por exemplo, usando sintetizadores de oligonucleotídeos automatizados que estão comercialmente disponíveis, ou por uma variedade de outros métodos, incluindo sistemas de expressão in vitro, técnicas recombinantes e expressão em células e organismos.
[055] O termo "superexpressão" ou "superexpresso" se refere a um nível de expressão de um gene ou marcador em um paciente que está acima daquele visto no tecido normal. Pode ser considerado que a expressão é superexpressa se for 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 ou maior que 2 vezes a expressão no tecido normal.
[056] O termo "polinucleotídeo", quando usado no singular ou plural, geralmente se refere a qualquer polirribonucleotídeo ou polide- soxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Isto inclui, sem limitação, DNA de fita única e dupla, DNA incluindo regiões de fita única e dupla, RNA de fita única e dupla, e RNA incluindo regiões de fita única e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que pode ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou incluir regiões de fita única e dupla. Também estão incluídas regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou tanto RNA como DNA. Especificamente estão incluídos mRNAs, cDNAs, e DNAs genômicos e qualquer fragmento dos mesmos. O termo inclui DNAs e RNAs que contêm uma ou mais bases modificadas, como bases tritiadas ou bases não usuais, como inosina. Os polinucleotídeos da invenção podem englobar sequências codifi- cantes ou não codificantes ou sequências sentido ou antissentido. Será entendido que cada referência a um "polinucleotídeo" ou termo simi lar, neste pedido, incluirá as sequências completas bem como quaisquer fragmentos, derivados ou variantes das mesmas.
[057] "Polipeptídeo", como usado neste pedido, se refere a um oligopeptídeo, peptídeo, ou sequência proteica ou fragmento dos mesmos, e a moléculas de ocorrência natural, recombinantes, sintéticas ou semissintéticas. Onde "polipeptídeo" é citado neste pedido para referir-se a uma sequência de aminoácidos de uma molécula de proteína de ocorrência natural, "polipeptídeo" e termos similares, não é destinado a limitar a sequência de aminoácidos à sequência de aminoáci- dos completa, nativa, da molécula completa. Será entendido que cada referência para um "polipeptídeo" ou termo similar, neste pedido, incluirá sequência completa, bem como quaisquer fragmentos, derivados ou variantes da mesma.
[058] O termo "qPCR" ou "QPCR" se refere à reação de polime- rase em cadeia qualitativa como descrito, por exemplo, em PCR Technique: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed, Eaton Publishing, 1997, e AZ of Quantitative PCR, S. Bustin, ed, IUL Press, 2004.
[059] "Estringência" de reações de hibridização é prontamente determinável por um versado ordinário na técnica, e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas mais altas para anelamento apropriado, enquanto sondas mais curtas precisam de temperaturas reduzidas. A hibridi- zação geralmente depende da capacidade de DNA desnaturado de reanelar quando as fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejada entre a sonda e sequência hibridizável, mais alta a temperatura relativa que pode ser usada. Como resultado, resulta que as temperaturas relativas mais altas tenderiam a tornar as condições de reação mais estringentes, enquanto temperaturas mais bai- xas, menos. Detalhes adicionais e explicação da estringência de reações de hibridização são encontrados, por exemplo, em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
[060] "Condições estringentes" ou "condições de alta estringên- cia", como definido neste pedido, tipicamente: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura de lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M / citrato de sódio 0,0015 M / dodecil sulfato de sódio 0,1% a 50°C; (2) empregam um agente desnaturante durante a hibridização, tal como formamida, por exemplo, formamida 50% (v/v) com albumina sérica bovina 0,1% / Ficoll 0,1% / polivinilpirrolidona 0,1% / fosfato de sódio 50 mM, tampão em pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida 50%, SSC 5X (NaC1 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5X, DNA de esperma de salmão sonicado (50 ug/mL), SDS 0,1% e sulfato de dextra- na 10% a 42°C, com lavagem a 42°C em SSC 0,2X (cloreto de sódio / citrato de sódio) e formamida 50% a 55°C, seguido de uma lavagem de alta estringência compreendendo SSC 0,1X contendo EDTA a 55°C.
[061] "Condições moderadamente estringentes" podem ser iden tificadas como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e inclui o uso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, força iônica e % de SDS) menos estringentes que as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente estringen- tes é a incubação noturna a 37°C em uma solução compreendendo: formamida 20%, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5X, sulfato de dex- trana 10% e DNA de esperma de salmão cortado desnaturado 20 mg/mL, seguido por lavagem dos filtros em SSC 1X em aproximadamente 37-50°C. O versado reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica, etc. de acordo com a necessidade para acomodar fatores como comprimento de sonda e similares.
[062] O termo "IL8Rb" significa receptor B de interleucina 8 mar cador de neutrófilo humano (também conhecido como receptor 2 de quimiocina (motivo C-X-C) [CXCR2]) (Figura 1; SEQ ID No. 1 e 2), e inclui o marcador de IL8Rb. O termo inclui um polinucleotídeo, como um gene ou fragmento gênico, RNA ou fragmento de RNA; ou um produto gênico, incluindo um polipeptídeo como um peptídeo, oligopeptí- deo, proteína ou fragmento proteico; ou qualquer metabólito relacionado, por produtos, ou qualquer outra molécula de identificação, como anticorpos ou fragmentos de anticorpo.
[063] O termo "confiabilidade" inclui baixa incidência de falsos- positivos e/ou falsos-negativos. Dessa forma, com confiabilidade mais alta de um marcador, menos falsos-positivos e/ou falsos-negativos estão associados com diagnósticos feitos usando aquele marcador. Por isso, em certas modalidades, marcadores são fornecidos que permitem detecção de doença inflamatória da bexiga ou câncer com confiabilidade maior do que a confiabilidade de marcadores da arte anterior maior que 50%. Em outras modalidades, marcadores são fornecidos tendo confiança maior do que aproximadamente 70%; em outras modalidades, maior do que aproximadamente 73%, ainda em outras modalidades, maior do que aproximadamente 80%, em modalidades ainda adicionais, maior do que aproximadamente 90%, ainda em outras, maior do que aproximadamente 95%, em modalidades ainda adicionais maior do que aproximadamente 98%, e em certas modalidades, confiança de aproximadamente 100%.
[064] A prática da presente invenção empregará, a menos que de outra maneira indicado, técnicas convencionais da biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, citologia e bioquímica, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edition, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed, 1984; Animal Cell Culture, R.l. Freshney, ed, 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D. M Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., 1987; e PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994.
[065] Deve ser entendido que os termos acima podem referir-se a proteína, sequência de DNA e/ou sequência de RNA. Também deve ser entendido que os termos acima também se referem a proteínas não humanas, DNA e/ou RNA tendo sequências homólogas como representados neste pedido.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO
[066] Os marcadores gênicos podem ser usados como instru mentos diagnósticos para detectar a doença em um paciente. Os marcadores, por exemplo, podem ser diferencialmente expressos entre tecido com doença e tecido sem doença correspondente. Nesta situação, a detecção da expressão diferencial está associada à presença da doença. Alternativamente, o marcador pode estar associado diretamente com modificações que ocorrem nos tecidos de doença ou modificações que resultam da doença. As doenças inflamatórias estão associadas a um aumento em neutrófilos. Foi verificado que receptor B de interleucina 8 marcador de neutrófilo humano (IL8Rb), (também conhecido como receptor 2 de quimiocina (motivo C-X-C) [CXCR2]) (Figura 1; SEQ ID No 1 e 2), fornece um bom marcador da presença de neutrófilos em uma amostra, e por isso pode ser usado como um mar- cador diagnóstico para a detecção da doença inflamatória em uma amostra, e especialmente, na detecção da doença inflamatória da bexiga.
[067] Como mostrado na Figura 5, o acúmulo de IL8Rb na urina é indicativo da presença da doença inflamatória da bexiga. Especificamente, a Figura 5 mostra o acúmulo de IL8Rb na urina de pacientes tendo as condições; hiperplasia prostática benigna, infecção do aparelho urinário, doenças de próstata não específicas, próstata vascular e uso de warfarina secundário. Será apreciado entretanto, que o uso de IL8Rb não é ser limitado à detecção destas doenças somente, mas que estes exemplos mostram que IL8Rb realmente aumenta em amostras de pacientes que têm uma doença inflamatória da bexiga. Isto é, IL8Rb pode ser usado como um marcador da inflamação associada com a doença de bexiga e por isso é adequado para o uso na detecção de qualquer condição associada com a inflamação. Por isso, a detecção da quantidade de IL8Rb pode ser usada como um marcador para a doença inflamatória da bexiga. Mais particularmente, IL8Rb pode ser usado para detectar a doença inflamatória da bexiga associada ao acúmulo de neutrófilos.
[068] Os testes de urina para carcinoma de célula transicional da bexiga (TCC) dependem basicamente da presença de marcadores em células tumorais esfoliadas na urina. A capacidade de detectar estas células pode ser mascarada pela presença de grandes números de células contaminantes, tal como, sangue e células inflamatórias. Além disso, a inflamação do revestimento de bexiga pode resultar na esfoli- ação aumentada de células não malignas da mucosa. Como resultado, os testes de urina que usam marcadores derivados das células transi- cionais da bexiga têm uma probabilidade mais alta de dar um resultado falso-positivo das amostras de urina tomadas de pacientes com cistite, infecção do aparelho urinário ou outras condições que resultam em inflamação de aparelho urinário ou esfoliação celular transicional, tal como, urolitíase (Sanchez-Carbayo et al.).
[069] Um modo de tentar e evitar tais resultados falsos-positivos foi selecionar marcadores com a expressão relativa baixa em sangue ou células inflamatórias. O uso de tais marcadores resulta em menos falsos-positivos em pacientes com TCC que apresentam condições inflamatórias não malignas. Entretanto, a baixa expressão dos marcadores em células derivadas hematologicamente não consegue compensar a taxa aumentada da esfoliação de células transicionais não malignas.
[070] Foi verificado que o impacto negativo de células transicio- nais esfoliadas do tecido inflamado não tem acurácia dos testes de urina para câncer de bexiga pode ser minimizado melhorando a identificação de pacientes com condições inflamatórias do aparelho urinário. Aqui foi verificado surpreendentemente que usar o marcador de IL8Rb em combinação com um ou mais marcadores de tumor de bexiga (BTM’s) fornece uma detecção mais exata do câncer de bexiga. Especialmente, um teste baseado em marcador de câncer de bexiga que inclui o marcador de IL8Rb é menos suscetível a resultados falsos- positivos, que pode resultar em pacientes que sofrem de uma condição de câncer não inflamatória.
[071] Em geral, a presença ou ausência de uma condição infla matória é estabelecida tendo um limiar da expressão gênica, acima da qual a expressão de IL8Rb é indicativa de uma condição inflamatória. Por exemplo, a expressão de IL8Rb acima de certo limiar é diagnóstica de que o paciente tem uma condição inflamatória. Quando IL8Rb é usado em conjunto com um ou mais marcadores preditivos para a presença do câncer de bexiga, a presença da expressão elevada do mar- cador(es) de tumor de bexiga, e a expressão de IL8Rb, acima de certo limiar, é preditiva do paciente tendo uma condição de câncer não in- flamatória. Além disso, se o teste é pré-formado na urina do paciente, então este resultado é preditivo do paciente que tem uma condição inflamatória de bexiga. Os altos níveis dos marcadores de tumor de bexiga são os mais provavelmente o resultado de células não malignas que vêm da mucosa em consequência da inflamação. Isto é, o paciente, embora tendo os altos níveis do marcador(es) de tumor de bexiga não tenha de fato câncer de bexiga - um falso-positivo.
[072] Alternativamente, se o paciente tem altos níveis ou níveis diagnósticos de um ou mais marcadores de tumor de bexiga, mas o nível de IL8Rb está abaixo de um limiar, então isto é diagnóstico de que o paciente provavelmente tenha câncer, e em particular câncer de bexiga. Isto é especialmente dessa forma, se o teste for pré-formado na urina do paciente. Este resultado é de benefício significante ao prestador de serviços de saúde porque podem estar seguros que o paciente realmente tem câncer, e pode começar o tratamento imediatamente e não estar preocupado que o resultado é de fato causado uma condição inflamatória que dá um resultado falso-positivo.
[073] Foi mostrado surpreendentemente que a quantificação de RNA do gene que codifica o receptor B de interleucina 8 marcador de neutrófilo (IL8Rb) melhora a eficiência operacional de detectar pacientes com TCC, usando marcadores conhecidos de TCC ou BTM. As sequências de referência de IL8Rb (também conhecido como receptor 2 de quimiocina (motivo C-X-C) [CXCR2]) são mostradas em Figura 1 e Seq ID Nos 1 e 2). Além do seu papel na detecção de TCC, foi explorado se IL8Rb pode ser usado como um marcador de urina para ajudar no diagnóstico da doença inflamatória (Figura 5).
[074] O uso novo do marcador de IL8Rb pode ser usado em iso lamento para a detecção de condições inflamatórias da bexiga que utiliza métodos conhecidos para detectar níveis de expressão gênica. Exemplos de métodos para detectar a expressão gênica são delinea- dos abaixo.
[075] Alternativamente, IL8Rb pode ser combinado com um de mais BTMs para detectar o câncer de bexiga. Foi mostrado que utilizando o marcador de IL8Rb de nova doença inflamatória como parte do teste do câncer de bexiga, a influência do tecido inflamado na criação de um resultado falso-positivo é minimizada. O marcador de IL8Rb pode ser usado em associação com quaisquer marcadores de câncer de bexiga, ou alternativamente pode ser usado com dois ou mais marcadores, como parte de uma assinatura, para detectar o câncer de bexiga.
[076] A ação de IL8Rb para melhorar a detecção do câncer de bexiga resulta da capacidade de separar condições não malignas de pacientes tendo câncer de bexiga. Isto é alcançado porque um aumento de IL8Rb é indicativo de um aumento na presença de neutrófilos em uma amostra. Por isso, a capacidade de IL8Rb não é dependente no marcador de tumor de bexiga usado. Como mostrado nas Figuras 2, e 12 a 15, quando combinado com uma variedade de marcadores de tumor de bexiga e combinações de marcadores de tumor de bexiga, IL8Rb tinha o efeito geral de aumentar a especificidade da capacidade do marcador(es) de detectar o câncer nos indivíduos.
[077] Será apreciado que qualquer marcador que é capaz de de tectar o câncer de bexiga é adequado para o uso em combinação com IL8Rb. Exemplos de BTMs conhecidos adequados para o uso em combinação com IL8Rb na detecção de TCC são delineados nas Figuras 6 e 7. Especificamente, a Figura 6 delineia marcadores conhecidos por serem superexpressos no câncer de bexiga, e a Figura 7 delineia diversos marcadores conhecidos por serem subexpressos no câncer de bexiga. O uso do novo marcador, IL8Rb, da presente invenção pode ser usado em combinação com um ou mais dos marcadores da Figura 6 ou da Figura 7, ou alternativamente em combinação com uma assinatura que compreende dois ou mais marcadores selecionados a partir da Figura 6 ou da Figura 7.
[078] Um exemplo de uma assinatura de acordo com a presente invenção é o uso de IL8Rb em combinação com MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13, que também pode estar em combinação com um ou mais marcadores adequados para detectar o câncer de bexiga, por exemplo, qualquer um de mais dos marcadores delineados na Figura 6 ou na Figura 7. Como mostrado nas Figuras 14 e 15, IL8Rb pode ser usado em qualquer combinação de marcadores, especificamente nas combinações IL8Rb / MDK, IL8Rb / CDC2, IL8Rb / HOXA13, IL8Rb / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2, IL8Rb / MDK / HOXA13, IL8Rb / MDK / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / HOXA13 / IGFBP5, IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13, IL8Rb / MDK / CDC2 / IGFBP5, IL8Rb / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5 e IL8Rb / MDK / CDC2 / HOXA13 / IGFBP5. Como mostrado nas Figuras 14 e 15, a inclusão de IL8Rb aumentou a capacidade do marcador ou combinação de marcadores para diagnosticar exatamente o câncer de bexiga em um indivíduo. A presente invenção não é para ser limitada a estas combinações específicas mas pode incluir opcionalmente um ou mais marcadores adicionais adequados para detectar o câncer de bexiga, por exemplo, qualquer um de mais dos marcadores delineados na Fi- gura 6 ou na Figura 7.
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Tabela 1, mostra os identificadores dos marcadores específicos MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13 e IL8Rb.
[079] As Figuras 2 a 4, e 12 a 17 mostram o efeito de usar IL8Rb em combinação com quatro marcadores do câncer de bexiga conhecidos, representativos; MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13. Os resultados mostram que incorporando o uso de IL8Rb individualmente com cada marcador (Figuras 2, 14 e 15 a 17), mas também quando usado com todas as combinações possíveis de quatro marcadores BTM como uma assinatura, há uma melhora na capacidade de separar as amostras de pacientes com TCC e aqueles com condições não malignas.
[080] Mais especificamente, como mostrado nas Figuras 10 a 13, a inclusão de IL8Rb com os quatro marcadores MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13 (uRNA-D não somente aumentou o desempenho total do teste em comparação com os quatro marcadores sozinhos, o teste também comparou extremamente favoravelmente com outros testes conhecidos, NMP22® "uma marca comercial registrada de Matritech, Inc., de Massachusetts, Estados Unidos" Elisa, NMP22 BladderChek® "uma marca comercial registrada de Matritech, Inc., de Massachusetts, Estados Unidos" e citologia. As Figuras 14 a 17 também mostram o efeito de IL8Rb em várias combinações dos quatro marcadores MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13.
[081] Especificamente, a Figura 14 mostra as curvas ROC de to das as combinações dos quatro marcadores MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13, com e sem IL8Rb, calculada usando cinco modelos de classificador diferentes (i) Análise Discriminante Linear (LDA), (ii) Regressão Logística (LogReg), (iii) Máquinas de Vetor de Suporte (SVM), (iv) 5 K-vizinhos mais próximos (KN5N), e (v) Classificador de Árvore de Partição (TREE). A Figura 15 tabula a Área Sob a Curva (AUC) para todos os 5 classificadores e as 15 combinações dos 4 biomarcadores, com e sem IL8Rb. Este cálculo de AUC é restringido à área de uma taxa de falsos-positivos de 0 a uma taxa de falsos-positivos de 20%, cobrindo as faixas úteis da especificidade (80 - 100%). A AUC quantifica as diferenças visíveis nas curvas ROC da Figura 14. A Figura 16 mostra a sensibilidade de todas as combinações dos quatro marcadores medidos com e sem IL8Rb em especificidades de 80% (a), (b) 85%, (c) 90%, (d) 95% e (e) 98%. A Figura 17 tabula as modificações em qualquer sensibilidade (direção vertical nas curvas ROC; melhor é "acima") ou especificidade (direção horizontal na curva ROC; melhor é à esquerda) nas especificidades fixadas de (a, f) 80%, (b, g) 85%, (c, h) 90%, (d, I) 95%, e (e, j) 98%.
[082] Estas tabelas mostram que IL8Rb, em geral, melhora a ca pacidade dos biomarcadores (MDK, CDC, IGFBP5, e HOXA13), isoladamente ou em combinação, para classificar o tumor de amostras normais.
[083] Estes resultados geralmente mostram que o IL8Rb foi ca paz de aumentar a exatidão na qual o teste pode detectar o câncer de bexiga. Os ganhos maiores onde vistos com marcadores que não desempenharam bem como sem a inclusão de IL8Rb ou com classificadores que não desempenharam da mesma forma. Os ganhos menores onde vistos para marcadores e/ou classificadores que se pré-formaram bem antes da adição de IL8Rb e por isso houve menos espaço para melhora. É importante observar que os resultados mostram que uma análise baseada na população e o benefício de incorporar IL8Rb pode ser maior quando diagnóstico de pacientes individuais, especialmente aqueles cujo diagnóstico de acordo com a expressão dos marcadores BTM podem ser pouco nítidos.
[084] Estes resultados mostram que não somente IL8Rb pode ser usado para detectar a doença inflamatória da bexiga, mas também quando usado em combinação com marcadores do câncer de bexiga, resulta em uma detecção melhorada do câncer de bexiga, resultando em uma redução de resultados falsos "positivos".
[085] Estes resultados também mostram a utilidade de IL8Rb em que afeta a eficiência operacional de várias combinações de marcadores e confirma a capacidade de IL8Rb de melhorar o desempenho de um ou mais marcadores de câncer de bexiga para detectar exatamente o câncer em um paciente. Além disso, as Figuras 14 e 15 mostram que os mesmos resultados podem ser alcançados usando uma faixa de modelos de classificadores e mostram que o resultado não é dependente de um modelo de classificador ou algoritmo, mas sim a combinação de marcadores usados. Estes resultados confirmam que qualquer modelo adequado de classificador ou algoritmo pode ser usado na presente invenção. Em particular, Figuras 14 e 15 mostram que IL:8Rb tem um maior efeito nas especificidades mais altas, e em particular nas faixas mais clinicamente aplicáveis.
[086] A presente invenção é baseada no achado que a detecção de níveis elevados de IL8Rb no nível de polinucleotídeo ou de proteína na urina é indicativa de uma doença inflamatória da bexiga. Isto pode ser usado como um instrumento de diagnóstico sozinho para estabelecer uma doença inflamatória da bexiga em um indivíduo, mas também pode ser usado em conjunto com um teste do câncer de bexiga a fim de aumentar a especificidade do teste permitindo a diferenciação do resultado verdadeiro-positivo (isto é, o indivíduo testando positivo tendo bexiga) do resultado falso-positivo (isto é, o indivíduo testando positivo para câncer de bexiga mas de fato tendo uma doença inflamatória da bexiga).
[087] O método pode ser conduzido em qualquer amostra ade quada do corpo que seria indicativo da urina, mas de maneira ideal o nível de IL8Rb, e qualquer marcador de câncer adicional é estabelecido diretamente de uma amostra de urina.
Detecção de marcadores em amostras corporais
[088] Em várias modalidades, os ensaios do câncer podem ser desejavelmente realizados em amostras obtidas de sangue, plasma, soro, fluido peritoneal obtido, por exemplo, usando lavagem peritoneal, ou outros fluidos corporais, como amostras de urina, linfa, fluido cerebrospinal, fluido gástrico ou fezes. Para a detecção de condições inflamatórias da bexiga ou câncer de bexiga, o teste é de maneira ideal pré-formado em uma amostra de urina.
[089] Especificamente, o presente método para detectar a doen ça inflamatória da bexiga ou câncer de bexiga pode ser conduzido em qualquer amostra adequada do corpo que seria indicativo da urina, mas de maneira ideal o nível de IL8Rb, e qualquer marcador de câncer adicional é estabelecido diretamente de uma amostra de urina.
[090] Um teste pode ser pré-formado diretamente em uma amos tra de urina, ou a amostra pode ser estabilizada pela adição de quaisquer compostos ou tampões adequados conhecidos na técnica para estabilizar e prevenir o colapso do RNA e/ou proteína na amostra para que possa ser analisado mais tarde, ou até assegurar que o RNA e/ou a proteína estão estabilizados durante a análise.
[091] A determinação do nível de proteína e/ou de RNA na urina do indivíduo pode ser pré-formada diretamente na urina, ou da urina pode ser tratada para purificar e/ou concentrar mais RNA e/ou proteína. Muitos métodos para extrair e/ou concentrar proteínas e/ou RNA são bem conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção.
[092] A fim de estabelecer se um indivíduo particular tem expres são diferencial de IL8Rb e se necessário qualquer marcador de câncer adicional, o nível de RNA e/ou proteína de IL8Rb e opcionalmente um ou mais marcadores de câncer podem ser medidos na amostra. Será apreciado que muitos métodos são bem conhecidos na técnica por estabelecer o nível de um gene particular, no nível de RNA e/ou proteína, e qualquer método adequado pode ser usado na presente invenção. Alguns métodos comuns são delineados abaixo, entretanto, a invenção não é restringida a estes métodos e qualquer método para quantificar níveis de proteína e/ou de RNA é adequado para o uso na presente invenção. Abordagens Gerais para Detecção de Doença e Câncer Usando Marcadores Gênicos
[093] As metodologias gerais para determinar níveis de expres são são delineadas abaixo, embora seja apreciado que qualquer método para determinar níveis de expressão seria adequado. PCR quantitativa (qPCR)
[094] PCR quantitativa (qPCR) pode ser realizada em amostras de tumor, em soro e plasma usando iniciadores e sondas específicos. Em reações controladas, a quantidade de produto formado em uma reação de PCR (Sambrook, J., E Fritsch, E. e T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)) correlaciona-se com a quantidade do molde inicial. A quantificação do produto de PCR pode ser realizada parando a reação de PCR quando está na fase log, antes que os reagentes se tornem limitantes. Os produtos de PCR então passam por eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida, marcados com brometo de etídeo ou uma marcação de DNA comparável e a intensidade de marcação medida pela densitometria. Alternativamente, a progressão de uma reação de PCR pode ser medida usando máquinas de PCR como Prisma 7000™ de Applied Biosystems "uma marca comercial de Applera Corporation, Connecticut, Estados Unidos" ou Roche LightCycler™ (uma marca comercial de Roche Molecular Systems, Inc. Califórnia, Estados Unidos) que medem o acúmulo de produto em tempo real. PCR em tempo real mede a fluorescência de corantes intercalando DNA como Sybr Green no produto de PCR sinteti-zado ou fluorescência liberada por uma molécula repórter quando cli- vada de uma molécula supressora; as moléculas repórter e supressoras são incorporadas em uma sonda oligonucleotídica que se hibridiza à molécula de DNA alvo após extensão de fita de DNA dos oligonucle- otídeos do iniciador. A sonda oligonucleotídica é deslocada e degradada pela ação enzimática da Taq polimerase no ciclo seguinte de PCR, liberando o repórter da molécula supressora. Em uma variação, conhecida como Scorpion, a sonda é covalentemente ligada ao iniciador. PCR de Transcrição Reversa (RT-PCR)
[095] RT-PCR pode ser usada para comparar níveis de RNA em populações de amostras diferentes, em tecidos normais e tumorais, com ou sem tratamento medicamentoso, para caracterizar modelos de expressão, para distinguir entre RNAs estritamente relacionados e analisar a estrutura de RNA.
[096] Para RT-PCR, a primeira etapa é o isolamento de RNA de uma amostra alvo. O material inicial é tipicamente RNA total isolado de tumores humanos ou linhagens celulares de tumor, e tecidos normais ou linhagens celulares correspondentes, respectivamente. RNA pode ser isolado de uma variedade de amostras, como amostras de tumor de mama, pulmão, cólon (por exemplo, intestino grosso ou intestino delgado), colorretal, gástrico, esofágico, anal, retal, próstata, cérebro, fígado, rim, pâncreas, baço, timo, testículo, ovário, útero, bexiga etc., tecidos, de tumores primários ou linhagens celulares de tumor, e de amostras agrupadas de doadores saudáveis. Se a fonte de RNA for um tumor, RNA pode ser extraído, por exemplo, de amostras de tecido congeladas ou arquivadas embebidas em parafina e fixadas (por exemplo, fixadas em formalina).
[097] A primeira etapa no perfil de expressão gênica por RT-PCR é a transcrição reversa do molde de RNA em cDNA, seguido da sua amplificação exponencial em uma reação de PCR. As duas transcrip tases reversas mais comumente usadas são transcriptase reversa de vírus de mieloblastose aviária (AMV-RT) e transcriptase reversa de vírus de leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). A etapa de transcrição reversa é tipicamente preparada usando iniciadores específicos, hexâmeros randômicos ou iniciadores oligo-dT, dependendo das circunstâncias e da meta do perfil de expressão. Por exemplo, RNA extraído pode ser transcrito reversamente usando um kit GeneAmp® RNA PCR (Perkin Elmer, CA, USA), após as instruções do fabricante. O cDNA derivado então pode ser usado como um molde na reação de PCR subsequente.
[098] Embora a etapa de PCR possa usar uma variedade de DNA polimerases dependentes de DNA termoestável, tipicamente emprega a Taq DNA polimerase, que tem uma atividade de nuclease 5’-3’ mas sem uma atividade de endonuclease de revisão 3-5’. Dessa forma, TaqMan® qPCR (uma marca comercial registrada de Roche Molecular Systems, Inc., Califórnia, Estados Unidos) tipicamente utiliza atividade de nuclease 5’ da Taq ou Tth polimerase para hidrolisar uma sonda de hibridização ligada ao seu amplicon alvo, mas qualquer enzima com atividade de nuclease 5’ equivalente pode ser usada.
[099] Dois iniciadores oligonucleotídicos são usados para gerar um amplicon típico para uma reação de PCR. Um terceiro oligonucleo- tídeo ou sonda, é projetado para detectar a sequência nucleotídica localizada entre dois iniciadores de PCR. A sonda não é extensível pela enzima Taq DNA polimerase e é marcada com um corante fluorescente repórter e um corante fluorescente supressor. Qualquer emissão induzida por laser do corante repórter é extinta pelo corante de extinção quando os dois corantes estão localizados perto um do outro como estão na sonda. Durante a reação de amplificação, a enzima Taq DNA polimerase cliva a sonda de uma maneira dependente do molde. Os fragmentos de sonda resultantes desassociam-se em solução, e o sinal do corante repórter liberado é livre do efeito de extinção do segundo fluoróforo. Uma molécula do corante repórter é liberada para cada nova molécula sintetizada, e a detecção do corante repórter não extinto fornece a base da interpretação quantitativa dos dados.
[0100] TaqMan® RT-PCR (uma marca comercial registrada de Roche Molecular Systems, Inc., Califórnia, Estados Unidos) pode ser realizada usando o equipamento comercialmente disponível, tal como, por exemplo, o Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7700™ (uma marca comercial de Applera Corporation, Connecticut, Estados Unidos) (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ou Lightcycler™ (uma marca comercial registrada de Roche Molecular Systems, Inc., Califórnia, Estados Unidos ((Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha). Em uma modalidade preferencial, o procedimento de nuclease 5’ é executado em um dispositivo de PCR quantitativa em tempo real como o Sistema de Detecção de Sequência PRISM ABI 7700™ "uma marca comercial de Applera Corporation, Connecticut, Estados Unidos". O sistema consiste de um ter- mociclador, laser, dispositivo de carga acoplada (CCD), câmera e computador. O sistema amplifica amostras em um formato de 96 poços em um termociclador. Durante a amplificação, o sinal fluorescente induzido por laser é coletado em tempo real através dos cabos de fibra ótica para todos os 96 poços e detectado no CCD. O sistema inclui o programa para executar o instrumento e para analisar os dados.
[0101] Dados de ensaio de nuclease 5’ são inicialmente expressos como Cp ou ciclo limiar. Como discutido acima, os valores de fluorescência são registrados durante cada ciclo e representam a quantidade do produto amplificado àquele ponto na reação de amplificação. O ponto quando o sinal fluorescente é primeiro registrado como estatisticamente significante é o ciclo limiar. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
[0102] Uma variação mais recente da técnica RT-PCR é a PCR quantitativa em tempo real, que mede o acúmulo de produto de PCR por meio de uma sonda fluorigênica marcada de maneira dual (isto é, sonda TaqMan® (uma marca comercial registrada de Roche Molecular Systems, Inc., Califórnia, Estados Unidos)). PCR em tempo real é compatível tanto com PCR competitiva quantitativa como com PCR comparativa quantitativa. A primeira usa um competidor interno para cada sequência alvo para normalização, enquanto a última usa um gene de normalização contido dentro da amostra ou gene acessório de RT-PCR. Detalhes adicionais são fornecidos, por exemplo, por Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996).
[0103] Os níveis de expressão podem ser determinados usando tecidos fixados, embebidos em parafina, como a fonte de RNA. De acordo com um aspecto da presente invenção, os iniciadores de PCR são projetados para flanquear as sequências de íntrons presentes no gene a serem amplificadas. Nesta modalidade, a primeira etapa no desenho de iniciador/sonda é o delineamento de sequências de ín- trons dentro dos genes. Isto pode ser feito pelo programa publicamente disponível, como o programa DNA BLAT desenvolvido por Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002), ou pelo programa BLAST incluindo suas variações. As etapas subsequentes seguem métodos bem estabelecidos do iniciador de PCR e desenho de sonda.
[0104] A fim de evitar sinais não específicos, é útil mascarar se quências repetitivas dentro dos íntrons ao projetar os iniciadores e sondas. Isto pode ser facilmente realizado usando o programa Repeat Masker disponível online pela Escola Superior de Medicina de Baylor, que rastreia sequências de DNA contra uma biblioteca de elementos repetitivos e devolve uma sequência de questionamento na qual os elementos repetitivos são mascarados. As sequências mascaradas então podem ser usadas para projetar sequências de iniciadores e sondas usando quaisquer pacotes de desenho de iniciadores/sondas comercialmente disponíveis ou publicamente de outra maneira, como Primer Express (Applied Biosystems); ensaio por desenho MGB (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen e Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 no VIMNV para usuários em geral e para programadores biólogos em: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386).
[0105] Os fatores mais importantes considerados no desenho de iniciadores de PCR incluem o comprimento do iniciador, temperatura de fusão (Tm), e conteúdo G/C, especificidade, sequências de iniciadores complementares e sequência de extremidade 3’. Em geral, iniciadores ótimos de PCR têm geralmente 1.730 bases de comprimento e contêm aproximadamente bases G+C de 20-80%, tal como, por exemplo, aproximadamente 50-60%. Temperaturas de fusão entre 50 e 80°C, por exemplo, aproximadamente 50 a 70°C, são tipicamente preferenciais. Para referências adicionais de desenho de iniciadores e sondas de PCR ver, por exemplo, Dieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design em: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133155; Innis e Gelfand, Optimizations of PCRs em: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, Londres, 1994, pp. 511; e Plasterer, T. N. Primerselect: Prime and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997), as revelações inteiras dos quais são por meio deste expressamente incorporadas por referência. Análise de Microarranjo
[0106] A expressão diferencial também pode ser identificada ou confirmada usando a técnica de microarranjo. Dessa forma, o perfil de expressão de marcadores específicos da doença pode ser medido no tecido fresco de tumor ou embebido em parafina, usando a tecnologia de microarranjo. Neste método, as sequências polinucleotídicas de interesse (incluindo cDNAs e oligonucleotídeos) são plaqueadas ou ordenadas, em um substrato de microchip. As sequências ordenadas (isto é, sondas de captura) então são hibridizadas com polinucleotí- deos específicos de células ou tecidos de interesse (isto é, alvos). Tal como no método de RT-PCR, a fonte de RNA tipicamente é RNA total isolado de tumores humanos ou linhagens celulares de tumor, e tecidos ou linhagens celulares normais correspondentes. Dessa forma, RNA pode ser isolado de uma variedade de tumores primários ou linhagens celulares de tumor. Se a fonte de RNA for um tumor primário, RNA pode ser extraído, por exemplo, de amostras de tecido congeladas ou embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE) arquivadas e amostras de tecido fixadas (por exemplo, fixadas em formalina), que são rotineiramente preparadas e conservadas na prática clínica diária.
[0107] Em uma modalidade específica da técnica de microarranjo, os insertos amplificados de PCR de clones de cDNA são aplicados a um substrato. O substrato pode incluir até 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou 75 sequências nucleotídicas. Em outros aspectos, o substrato pode incluir pelo menos 10.000 sequências nucleotídicas. As sequências em microarranjo, imobilizadas no microchip, são adequadas para a hibridização sob condições estringentes. Como em outras modalidades, os alvos dos microarranjos podem ter pelo menos 50, 100, 200, 400, 500, 1000, ou 2.000 bases de comprimento; ou 50-100, 100-200, 100-500, 100-1000, 100-2000, ou 500-5000 bases de comprimento. Como modalidades adicionais, as sondas de captura dos microarranjos podem ter pelo menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 80, ou 100 bases de comprimento; ou 10-15, 10-20, 10-25, 10-50, 10-75, 10-80, ou 20-80 bases de comprimento.
[0108] As sondas de cDNA marcadas fluorescentemente podem ser geradas por meio da incorporação de nucleotídeos fluorescentes pela transcrição reversa de RNA extraído de tecidos de interesse. As sondas de cDNA marcadas aplicadas ao chip hibridizam com especificidade a cada ponto de DNA na tabela. Após lavagem estringente para remover sondas não especificamente ligadas, o chip é esquadrinhado pela microscopia a laser confocal ou por outro método de detecção, como uma câmera com CCD. A quantificação da hibridização de cada elemento ordenado permite à avaliação da abundância de mRNA cor-respondente. Com fluorescência em duas cores, as sondas de cDNA marcadas separadamente geradas de duas fontes de RNA são hibridi- zadas aos pares ao arranjo. A abundância relativa dos transcritos das duas fontes que correspondem a cada gene especificado é dessa forma determinada simultaneamente.
[0109] A escala miniaturizada da hibridização permite uma avalia ção adequada e rápida do padrão de expressão para grandes números de genes. Tais métodos têm mostrado ter a sensibilidade requerida para detectar transcritos raros, que são expressos em algumas cópias por célula, e detectar de forma reprodutível diferenças pelo menos aproximadamente duas vezes nos níveis de expressão (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)). A análise de mi- croarranjo pode ser realizada por equipamento comercialmente disponível, após protocolos de fabricante, tal como usando a tecnologia GenChip Affymetrix, a tecnologia de microarranjo lllumina ou tecnologia de microarranjo Incyte. O desenvolvimento de métodos de microar- ranjo para análise de larga escala da expressão gênica permite procurar sistematicamente marcadores moleculares de classificação de câncer e predição de resultado em uma variedade de tipos de tumor. Isolamento, purificação e amplificação de RNA
[0110] Os métodos gerais da extração de mRNA são bem conhe cidos na técnica e são descritos em manuais padrão da biologia mole- cular, incluindo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Os métodos da extração de RNA de tecidos embebidos em parafina são descritos, por exemplo, em Rupp e Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), e De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995). Especialmente, o isolamento de RNA pode ser realizado usando kit de purificação, conjunto de tampões e protease de fabricantes comerciais, como Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, RNA total de células na cultura pode ser isolado usando minicolunas Qiagen RNeasy® "uma marca comercial registrada de Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha". Outros kits de isolamento de RNA comercialmente disponíveis incluem Kit de Purificação de DNA e RNA MasterPure Complete (EPICENTRE (D, Madison, Wl), e Kit de Isolamento de RNA de Bloco de Parafina (Ambion, Inc.). RNA total de amostras de tecido pode ser isolado usando RNA Stat-60 (teste Tel). RNA preparado do tumor pode ser isolado, por exemplo, pela centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio.
[0111] As etapas de um protocolo representativo para definir o perfil da expressão gênica usando tecidos fixados, embebidos em parafina como a fonte de RNA, incluindo isolamento de mRNA, purificação, extensão de iniciador e amplificação são dadas em vários artigos de periódicos publicados (por exemplo: T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Resumidamente, um processo representativo começa com o corte de seções de aproximadamente 10 mícrons de espessura de amostras de tecido de tumor embebidas em parafina. RNA então é extraído, e a proteína e o DNA são removidos. Após análise da concentração de RNA, etapas de reparo de RNA e/ou de amplificação podem ser incluídas, se necessárias, e o RNA é transcrito reversamente usando promotores específicos para o gene seguido por RT-PCR. Finalmente, os dados são analisados para identificar a melhor opção(ões) de tratamento disponí- vel para o paciente com base no modelo de expressão gênica característico identificado na amostra de tumor examinada. Imuno-histoquímica e Proteômica
[0112] Os métodos de imuno-histoquímica também são adequa dos para detectar os níveis de expressão dos marcadores de proliferação da presente invenção. Dessa forma, anticorpos ou antissoros, preferencialmente antissoros policlonais, e ainda mais preferencialmente anticorpos monoclonais específicos para cada marcador, são usados para detectar a expressão. Os anticorpos podem ser detectados pela marcação direta dos próprios anticorpos, por exemplo, com marcadores radioativos, marcadores fluorescentes, marcadores de hapteno tais como biotina ou enzimas tais como peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina. Alternativamente, o anticorpo primário não marcado é usado em conjunto com um anticorpo secundário marcado, compreendendo antissoros, antissoros policlonais ou um anticorpo monoclonal específico para o anticorpo primário. Os protocolos e os kits de imuno-histoquímica são bem conhecidos na técnica e estão comerci-almente disponíveis.
[0113] Proteômica pode ser usada para analisar os polipeptídeos presentes em uma amostra (por exemplo, tecido, organismo ou cultura de células) em certo ponto de tempo. Especialmente, as técnicas de proteômica podem ser usadas para avaliar as modificações globais da expressão de polipeptídeo em uma amostra (também referida como proteômica da expressão). A análise proteômica tipicamente inclui: (1) separação de polipeptídeos individuais em uma amostra por eletroforese 2D em gel (2D PAGE); (2) identificação dos polipeptídeos individuais recuperados do gel, por exemplo, por espectrometria de massa ou sequenciamento N-terminal, e (3) análise dos dados usando bioin- formática. Os métodos de proteômica são suplementos valiosos a outros métodos de perfil da expressão gênica, e podem ser usados, so- zinhos ou em combinação com outros métodos, para detectar os produtos dos marcadores de proliferação da presente invenção. Métodos de hibridização usando sondas de ácido nucleico seletivas para um marcador
[0114] Estes métodos envolvem a ligação da sonda de ácido nu- cleico a um suporte, e hibridizar sob condições apropriadas com RNA ou cDNA derivado da amostra teste (Sambrook, J., E Fritsch, E. e T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)). Estes métodos podem ser aplicados a marcadores derivados de um tecido de tumor ou amostra de fluido. As preparações de RNA ou cDNA são tipicamente marcadas com uma molécula fluorescente ou radioativa para permitir a detecção e a quantificação. Em algumas aplicações, DNA de hi- bridização pode ser marcado com uma estrutura ramificada, marcada fluorescentemente, para aumentar a intensidade do sinal (Nolte, F.S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201-35 (1998)). O marcador não hibridizado é removido pela lavagem extensa em soluções de baixo teor salino como SSC 0,1x, SDS 0,5% antes de quantificar a quantidade da hibridização por detecção de fluorescência ou densitometria de imagens de gel. Os suportes podem ser sólidos, como membranas de náilon ou nitrocelulose, ou consistindo de micro- esferas ou contas que são hibridizadas quando em suspensão líquida. Para permitir lavagem e purificação, as contas podem ser magnéticas (Haukanes, B-1 e Kvam, C., Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993)) ou marcadas fluorescentemente para permitir a citometria de fluxo (por exemplo, ver: Spiro, A., Lowe, M. e Brown, D., Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 4258-4265 (2000)).
[0115] Uma variação da tecnologia de hibridização é o ensaio de QuantiGene Plex® (uma marca comercial registrada de Panomics, Califórnia, Estados Unidos) (Genospectra, Fremont) que combina um suporte de contas fluorescentes com a amplificação de sinal de DNA ramificado. Ainda outra variação na tecnologia de hibridização é o ensaio de mRNA Quantikine® (R&D Systems, Minneapolis). A metodologia é como descrita nas instruções do fabricante. Resumidamente o ensaio usa sondas de hibridização de oligonucleotídeos conjugadas à Digoxi- genina. A hibridização é detectada usando anticorpos de antidigoxige- nina acoplados à fosfatase alcalina em ensaios de colorimétricos.
[0116] Métodos adicionais são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos ainda neste pedido. Ensaios imunológicos ligados à enzima (ELISA)
[0117] Resumidamente, nos ensaios sanduíche de ELISA, um an ticorpo policlonal ou monoclonal contra o marcador está ligado a um suporte sólido (Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. e Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)) ou contas de suspensão. Outros métodos são conhecidos na técnica e não precisam ser mais descritos neste pedido. Os anticorpos monoclonais podem ser derivados do hibridoma ou selecionados a partir de bibliotecas de anticorpo de fago (Hust M. e Dubel S., Phage display vector for the in vitro generation of human antibody. Methods Mol Biol. 295:71-96 (2005)). Os sítios de ligação não específicos são bloqueados com preparações de proteína não alvo e detergentes. O anticorpo de captura então é incubado com uma preparação de amostra ou tecido do paciente contendo o antígeno. A mistura é lavada antes que o complexo de anticorpo/antígeno seja incubado com um segundo anticorpo que detecta o marcador alvo. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado a uma molécula fluorescente ou outra molécula repórter que pode ser detectada em uma reação enzimática ou com um terceiro anticorpo conjugado a um repórter (Crowther, Idaho). Al-ternativamente, em ELISAs diretos, a preparação contendo o marcador pode estar ligada ao suporte ou conta e o antígeno alvo detectado diretamente com um conjugado anticorpo-repórter (Crowther, Idaho).
[0118] Os métodos para produção de anticorpos monoclonais e antissoros policlonais são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos neste pedido ainda. Imunodetecção
[0119] Os métodos também podem ser usados para a imunodetec- ção de membros da família do marcador em soros ou plasma de pacientes com câncer de bexiga tomados antes e após cirurgia para remover o tumor, imunodetecção de membros da família de marcador em pacientes com outros cânceres, incluindo, mas não limitados a, colorre- tal, pancreático, ovariano, melanoma, de fígado, de esôfago, de estômago, endometrial e de cérebro e imunodetecção de membros da família de marcador em urina e fezes de pacientes com câncer de bexiga.
[0120] Os marcadores de doença também podem ser detectados em tecidos ou amostras usando outras técnicas de imunodetecção padrão como immunoblotting ou imunoprecipitação (Harlow, E. e Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). Em immunoblotting, as preparações proteicas de tecido ou fluido contendo o marcador sofrem eletroforese através de géis de poliacrilamida sob condições desnaturan- tes ou não desnaturantes. As proteínas então são transferidas para um suporte de membrana como náilon. O marcador então é reagido diretamente ou indiretamente com anticorpos monoclonais ou policlonais como descrito para a imuno-histoquímica. Alternativamente, em algumas preparações, as proteínas podem ser notadas diretamente para membranas sem separação eletroforética prévia. O sinal pode ser quantificado pela densitometria.
[0121] Na imunoprecipitação, uma preparação solúvel contendo o marcador é incubada com um anticorpo monoclonal ou policlonal contra o marcador. A reação então é incubada com contas inertes feitas de agarose ou poliacrilamida com proteína A ou proteína G covalentemente ligada. As contas de proteína A ou G interagem especificamente com os anticorpos que formam um complexo imobilizado anticorpo-marcador- antígeno ligado à conta. A lavagem seguinte do marcador ligado pode ser detectada e quantificada por immunoblotting ou ELISA.
Estabelecimento de um diagnóstico
[0122] Uma vez que o nível da expressão de IL8Rb, e opcional mente um ou mais marcadores de câncer adicionais, foram então obtidos, um diagnóstico daquele indivíduo pode ser estabelecido. Se a expressão de IL8Rb estiver acima da expressão vista em indivíduos que não têm uma doença inflamatória da bexiga, e/ou é compatível com o nível da expressão em indivíduos conhecidos por ter uma doença inflamatória da bexiga, então o indivíduo será diagnosticado como tendo uma doença inflamatória da bexiga. Alternativamente, se a expressão não estiver acima da expressão vista em indivíduos que não têm uma doença inflamatória da bexiga, e/ou está abaixo dos níveis da expressão em indivíduos conhecidos por ter uma doença inflamatória da bexiga, então o indivíduo será diagnosticado como não tendo uma doença inflamatória da bexiga.
[0123] Na situação onde IL8Rb é usado em conjunto com um ou mais marcadores para o câncer de Bexiga, então o nível de expressão de IL8Rb será comparado com o nível da expressão de indivíduos sem uma doença inflamatória da bexiga e/ou indivíduos conhecidos por ter uma doença inflamatória da bexiga. Um ou mais marcadores de câncer são comparados ao nível de expressão em indivíduos sem câncer de bexiga e/ou indivíduos conhecidos por ter o câncer de bexiga. Se o ní- vel de expressão de IL8Rb for compatível com um indivíduo que não tem uma doença inflamatória da bexiga (menos que um indivíduo tendo uma doença inflamatória da bexiga) e o nível de expressão de um ou mais marcadores de câncer de bexiga é compatível com um indivíduo tendo câncer de bexiga (diferencial para um indivíduo que não tem câncer de bexiga), então o indivíduo é diagnosticado como te câncer de bexiga. Se o nível de expressão do IL8Rb for maior do que um indivíduo que não tem uma doença inflamatória da bexiga (compatível com um indivíduo que tem uma doença inflamatória da bexiga) e o nível de expressão de um ou mais marcadores de câncer de bexiga são compatíveis com um indivíduo que tem câncer de bexiga (diferencial para um indivíduo que não tem câncer de bexiga), então o indivíduo é diagnosticado como tendo uma doença inflamatória da bexiga. Se o nível de expressão do IL8Rb for compatível com um indivíduo que não tem uma doença inflamatória da bexiga (menos que um indivíduo tendo uma do-ença inflamatória da bexiga) e o nível de expressão de um ou mais marcadores de câncer de bexiga são compatíveis com um indivíduo que não tem câncer de bexiga (diferencial para um indivíduo que realmente tem câncer de bexiga), então o indivíduo é diagnosticado como não tendo nenhum câncer de bexiga ou uma doença inflamatória da bexiga.
[0124] Como muitas vezes há uma sobreposição em níveis de ex pressão entre a expressão normal e a expressão de doença de um marcador diagnóstico, a fim de estabelecer um diagnóstico para um indivíduo, é típico estabelecer um limiar de classificação. Um limiar de classificação é um valor ou limiar que distingue indivíduos em categorias de doença ou não doença. Um limiar é comumente avaliado com o uso de uma curva de Característica Operacional de Receptor (ROC), que traça a sensibilidade contra especificidade de todos os limiares possíveis. Determinação de limiar diagnóstico
[0125] Para testes usando marcadores de doença, os limiares di- agnósticos são derivados que permitem uma amostra ser chamada positiva ou negativa para a doença, por exemplo, câncer de bexiga. Estes limiares diagnósticos são determinados pela análise de coortes de pacientes que são investigados para a presença de câncer de bexiga ou doença inflamatória da bexiga. Os limiares diagnósticos podem variar para aplicações de teste diferentes; por exemplo, os limiares diagnósticos para uso do teste no rastreamento de população são determinados usando coortes de pacientes que são basicamente sem sintomas uroló- gicos, e estes limiares diagnósticos podem ser diferentes pelos usados em testes de pacientes que estão sob vigilância da recidiva de câncer de bexiga. Um limiar diagnóstico é selecionado para fornecer um nível prático da especificidade de teste no ambiente clínico necessário; isto é, uma especificidade que permite sensibilidade razoável sem números excessivos de pacientes que recebem resultados falsos-positivos. Esta especificidade pode estar dentro da faixa de 80-100%.
[0126] Um limiar diagnóstico é determinado aplicando os algorit mos que combinam os níveis de expressão gênica de cada marcador a cada amostra de uma pesquisa clínica em perspectiva. As amostras usadas são de pacientes com câncer de bexiga e uma faixa de distúrbios urológicos não malignos. Um limiar diagnóstico é selecionado determinando o escore do algoritmo que resultou na especificidade desejada. Por exemplo, em algumas aplicações uma especificidade de 85% é desejada. Um limiar diagnóstico então é definido selecionando um escore de algoritmo que resulta em 85% de pacientes sem câncer de bexiga que é corretamente classificado como negativo para o câncer. Em outras aplicações (como rastreamento de população), a especificidade mais alta, como 90%, é favorecida. Para definir um limiar desta aplicação, um escore de algoritmo que resulta em 90% de pacientes sem câncer de bexiga que é corretamente classificado como negativo para o câncer é selecionado. Exemplos do uso de um algoritmo são delineados nos Exemplos.
[0127] Como uma alternativa para limiares únicos, o teste pode usar intervalos de teste que fornecem graus diferentes da probabilidade de presença da doença e que têm consequências clínicas diferentes associadas a eles. Por exemplo, um teste pode ter três intervalos; um associado a um alto (por exemplo, 90%) risco da presença do câncer de bexiga, um segundo associado a um baixo risco do câncer de bexiga e um terceiro considerado como sendo suspeito da doença. O intervalo "suspeito" pode estar associado a uma recomendação de um teste repetido em um período de tempo definido. Análise de dados
[0128] Uma vez que o método para testar para a quantidade de RNA e/ou proteína foi completado, os dados então têm que ser analisados a fim de determinar a distribuição de valores de biomarcadores associados ao tumor e amostras normais. Isto tipicamente envolve a normalização dos dados brutos, isto é remoção do "ruído" de fundo etc. e calcular a média de quaisquer duplicados (ou mais), comparação com padrões e estabelecer cortes ou limiares para separar otimamente duas classes de amostras. Conhece-se que muitos métodos fazem isto, e o método exato dependerá do método específico para determinar a quantidade de RNA e/ou proteína usada.
[0129] Abaixo está um exemplo de como a análise de dados pode ser pré-formada ao usar qRT-PCR. Entretanto, será apreciado que o processo geral pode ser adaptado para ser usado para outros métodos de estabelecimento de conteúdo de RNA e/ou de proteína, ou outros métodos podem ser estabelecidos por um versado na técnica para alcançar o mesmo resultado. Dados
[0130] As medidas da fluorescência são tomadas em comprimen tos de onda wi i=1,2 em cada ciclo de PCR. Dessa forma, para cada um dos poços, observamos um par de curvas de fluorescência, denotadas por ft (wi), onde t=1, ..., k denota o número de ciclos e i = 1,2 indexa os comprimentos de onda.
[0131] As curvas de fluorescência têm uma forma sigmoidal inici ando próxima a uma base horizontal e aumenta facilmente a uma as- síntota superior. A localização de um ponto Cp onde a curva de fluorescência parte da base linear será usada para caracterizar a concentração do gene alvo. Uma definição exata de Cp segue depois.
[0132] A seguir é um exemplo de um esquema para processar es tes dados. • Compensar a sobreposição de fluorescência entre bandas de frequência, • Estimar um modelo regular para cada curva de fluorescência a fim de estimar Cp • Combinar dados de poços replicados. • Estimar curvas padrão • Computar uma concentração em relação ao padrão.
[0133] Cada amostra biológica produz concentrações relativas de 5 genes, que são as entradas à função discriminante.
Compensação de cor
[0134] Denotar o nível da fluorescência do corante j em ciclo t e frequência w por Wtj(w). Em um ensaio multiplexado, a resposta medida em qualquer frequência w é a soma de contribuições de todos os corantes naquela frequência, portanto para cada ciclo
Figure img0002
[0135] O objetivo da compensação em cor é extrair as contribui ções individuais Wtj(w), das misturas observados ft (w).
[0136] Na situação ideal, Wtj(wo) de fluorescência, devido ao co rante j em uma frequência w é proporcional à sua Wtj(wo) de fluorescência na frequência de referência wo, apesar do nível de Wtj(wo). Isto sugere a relação linear
Figure img0003
para algumas constantes de proporcionalidade A12 e A21 que devem ser determinadas. Na verdade, há efeitos adicionais, que são efetivamente modelados introduzindo termos lineares neste sistema, portanto
Figure img0004
[0137] Após estimar os parâmetros de "compensação de cor" A12 e A21, podemos recuperar Wti(wi) e Wt2(^2), embora alterado por uma base linear, pela multiplicação da matriz:
Figure img0005
[0138] Wti(wi) e Wt2(W2) serão chamados de dados "de cor com pensados". As distorções lineares ai*+ bi*t no último termo desta expressão serão acomodadas na estimativa de base ao estimar que um modelo para os dados de cor compensados 2 abaixo. Não tem influência na estimativa de Cp.
[0139] A estimativa dos coeficientes de compensação de cor re quer um ensaio separado usando sondas únicas (ao contrário de dú- plex). Então Wt2(W2) = 0 dando
Figure img0006
[0140] Dessa forma
Figure img0007
[0141] Agora o coeficiente A21 pode ser estimado pela regressão linear ordinária de ft(w2) em ft(w1 )e o ciclo de PCR t para t = 1,..., - k. Estimativa de modelamento
[0142] Nesta seção, deixar ytt = 1, ..., - k denota que uma curva de fluorescência de cor compensada.
Amplificação
[0143] Os modelos somente são estimados para curvas de fluo rescência que mostram a amplificação não trivial. Definimos o termo "amplificação" como um afastamento não trivial da base linear de curva de fluorescência de cor compensada. Usar a proporção sinal-ruído (SNR) para quantificar a amplificação. Neste pedido, SNR é definida como a proporção da variação de sinal à variação de ruído. A variação de ruído é estabelecida como parte da calibração do procedimento de ensaio e permanece inalterada: para esta finalidade, usar a variação residual de um modelo linear da linha base dos poços que não podem ter amplificação, isto é, poços sem RNA. Para cada curva de fluorescência, estimar a variação de sinal como a variação residual da linha reta de melhor ajuste (Aqui "melhor" entende-se sentido de mínimos quadrados.) • Se SNR for menor que um limiar especificado, a curva de fluorescência está perto de linear e nenhuma amplificação está presente. Então não há ponto de afastamento da linha base e a concentração na amostra pode ser declarada como zero. • Se SNR estiver acima do limiar, amplificação está presente e uma concentração pode ser estimada.
[0144] Os limiares para a SNR (sem dimensão) são selecionados para fornecer discriminação clara entre curvas "amplificadas" e "não amplificadas". Por exemplo, as seguintes faixas de limiares são eficazes para os marcadores.
Figure img0008
Modelo
[0145] Estimar um modelo sigmoidal de cada curva de fluorescên cia. Qualquer forma paramétrica adequada de modelo pode ser usada, mas deve ser capaz de modelar os seguintes atributos: • Linha base linear que pode ter uma inclinação não zero, • Assimetrias perto do ponto central. • Assíntotas em níveis mais baixos e superiores • Aumento suave da linha base à assíntota superior
[0146] Um exemplo de um modelo que alcança estas exigências é
Figure img0009
[0147] Chamamos isto de "modelo 6PL". O vetor do parâmetro θ = [A, As, D, B, E, F] é sujeito às seguintes restrições para assegurar que gt (θ) é uma função crescente de t e tem as propriedades empíricas de uma curva de fluorescência. D > 0,B > 0,E < 0,F <0
[0148] Outros dois parâmetros determinam a linha base A + Ast, e estes parâmetros não precisam de restrições explícitas embora A sempre seja positivo e o parâmetro da inclinação As é sempre pequeno.
[0149] O parâmetro D determina o nível da amplificação acima da linha base. Os parâmetros restantes B.E.F não têm interpretação intrínseca em si mesmos mas controlam a forma da curva. Estes parâmetros também são os únicos parâmetros que influenciam na estimativa de Cp. Quando As = 0, isto é, conhecido como a função logística de cinco parâmetros (5PL) e se, além disso, F = 1 este modelo se reduz ao modelo logístico de quatro parâmetros (4PL), Gottschalk e Dunn (2005), Spiess et al. (2008).
Inicialização
[0150] Os valores iniciais da estimativa não linear são estabeleci dos como • ^ = 0, F = 1 • A = média (y, ..., y5) • D = faixa (y1, ..., yk) • B = ciclo que corresponde à metade da altura • E é inicializado por conversão de gt (θ) em uma forma linear tendo configurado os valores dos parâmetros restantes aos seus valores iniciais definidos acima. A linearização obtém
Figure img0010
[0151] Agora estimar E pela regressão de
Figure img0011
ra t selecionado de forma que
Figure img0012
[0152] Uma forma alternativa deste modelo que leva a uma análise quase idêntica (com sua própria inicialização) é
Figure img0013
[0153] Quando As = 0 isto é às vezes conhecido como a equação de Richards, Richards (1959) Critério de estimativa
[0154] Estimar parâmetros para minimizar uma soma penalidade de critério de quadrados
Figure img0014
[0155] Aqui À( θ) é uma função não negativa que penaliza grandes valores de alguns (ou todos) dos parâmetros em θ. Este método é co-nhecido como regularização ou regressão de ridge (Hoerl, 1962) e pode ser derivado de um ponto de vista bayesiano estabelecendo uma distribuição prévia adequada do vetor de parâmetro θ. Uma escolha satisfatória da penalidade é
Figure img0015
[0156] Os grandes valores de À influenciam as estimativas de pa râmetro em direção ao zero e reduzem a variação das estimativas de parâmetro. De modo inverso, pequeno À (ou zero) leva a estimativas de parâmetro instáveis e dificuldades de convergência em algoritmos de redução ao mínimo. A escolha de À é um compromisso entre viés e variação ou estabilidade. A evidência empírica mostra que um com-promisso satisfatório entre viés e variação pode ser alcançado se À for escolhido na faixa 0,01> À > 0,0001.
[0157] Esta escolha também assegura a convergência do algorit mo de otimização. Escolha de algoritmo
[0158] Para qualquer escolha de À na faixa acima mencionada, a descrição no parágrafo prévio define completamente as estimativas de parâmetro. Um procedimento de mínimos quadrados não linear baseado no procedimento de Gauss-Newton clássico (tal como o algoritmo de Levenberg-Marquardt como implementado em More, 1978) foi usado com sucesso e é uma abordagem adequada. Algoritmos de otimização alvo gerais como o algoritmo de Nelder e Mead, 1965, ou de Broyden-Fletcher como implementado por Byrd, et al., 1995) também foram testados com sucesso neste contexto. Estimativa de Cp
[0159] Cp é o ponto t que maximiza a segunda derivada de gt (θ). Cada curva de fluorescência produz Cp que caracteriza a concentração do gene alvo.
[0160] A média de Cp’s estimada para cada conjunto de replicados técnicos é computada e usada na análise subsequente.
1. Curvas padrão
[0161] Concentrações absolutas ou relativas são derivadas de uma comparação com curvas padrão na mesma placa de PCR.
[0162] Série de diluição de modelamento usando modelar linear
Figure img0016
onde Conc é uma concentração absoluta ou relativa do padrão. Os parâmetros de intercepção e inclinação são específicos para a placa. Modelar a variabilidade entre as placas nos parâmetros da intercepção e inclinação estabelecendo modelos de população
Figure img0017
onde os parâmetros
Figure img0018
são definidos com base em dados prévios como descrito abaixo. Então para uma placa dada, R e S podem ser interpretados como observação destas populações.
[0163] Para replicar i do padrão no momento da concentração Concj do modelo seguinte pode ser usado
Figure img0019
onde
Figure img0020
Observar que a variação dos residuais
Figure img0021
depende de Cp. Estimativas empíricas de são dadas na Tabe la 2. Estimar os parâmetros R e S usando por maximização da função de probabilidade. Interpretar o parâmetro de inclinação em termos da eficiência do processo de PCR através de
Figure img0022
[0164] Este modelo tem uma interpretação bayesiana: Dar distri buições prévias vagas (não informativas) aos parâmetros
Figure img0023
Então os modelos de população de R e S e de Cp (i, j) totalmente determinam um modelo de probabilidade dos dados prévios. Uma algoritmo da cadeia de Markov de Monte Carlo (MCMC) (Lunn et al., 2009) permite a estimativa
Figure img0024
de Se a distribuição prévia for omiti da, resulta uma interpretação frequentista tradicional. Depois deste procedimento de estimativa, é possível obter as estimativas de parâmetro de população dependentes do gene na Tabela 3. Tabela 2: Variação de residuais
Figure img0025
Tabela 3 Parâmetros de população para inclinações e interceptações de curvas padrão. μR o2 μs o2
Figure img0026
[0165] As estimativas de interceptação e inclinação da curva pa drão são denotadas por R e S.
2. Concentrações relativas ΔCp
[0166] Usar a curva padrão para computar Cp(REF) na concentração
Figure img0027
[0167] A concentração relativa de uma amostra é dada por
Figure img0028
[0168] Alternativamente S pode ser aproximado a um nível fixo que corresponde a uma eficiência de PCR de 2. Então S = -1/log10(2) = -3,32. Usar a mesma notação ΔCp para qualquer escolha.
[0169] As estimativas de ΔCp resultantes, uma para cada gene, são entradas para função discriminante na seguinte etapa.
3. Função Discriminante
[0170] Os valores de ΔCp correspondem a um valor de biomarca- dor relativo à variação de placa a placa removida. O exame dos 5 valores de ΔCp em comparação entre si (por exemplo, ver a Figura 2), mostra como as amostras tumorais tipicamente têm valores de bio- marcadores diferentes do que amostras não tumorais. Além disso, enquanto há sobreposição nas áreas para tumor e normal, um grande número de amostras são efetivamente bem separadas. Nestas circunstâncias, muitos classificadores estatísticos diferentes podem ser usados para separar amostras normais das tumorais. Mostramos neste pedido que uma amostra de vários classificadores realmente trabalham para separar estas amostras. Usamos 5 métodos de classificação diferentes: 1) Análise Discriminante Linear (LDA), 2) Regressão Logística (LogReg); 3) Máquinas de Vetor de Suporte (SVM); 4) K- vizinho mais próximo (KNN) baseado em 5 vizinhos (KN5N); e 5) Árvores de Partição Recursivo (TREE) (Citar: Venables & Ripley e Dal- gaard).
[0171] A criação de um classificador requer um conjunto de dados que contém os valores de biomarcadores de um grande número de amostras que devem representar a última população a ser testada pelo classificador. Por exemplo, se um classificador deve ser usado para rastrear uma população em risco (por exemplo, 50 anos de idade e mais velhos, fumantes), então o conjunto de dados necessário para criar o classificador (chamado de "conjunto de treino") deve refletir aquela população e somente conter amostras de pessoas mais velhas do que 50 anos que fumam. Tipicamente para obter precisão de medida menor que o erro de 10% para os parâmetros como sensibilidade e especificidade, o conjunto de treino tem de ser maior do que 300 amostras.
[0172] A estimativa da eficácia de um classificador pode ser feita usando a validação cruzada. Em validação cruzada (Wikipedia: validação cruzada), o conjunto de dados é dividido em um pequeno número de partições igualmente classificadas (tipicamente 3 a 10). Uma seção é omitida e as seções restantes usadas para construir um classificador; então a seção omitida é testada pelo novo classificador e suas predições observadas. Isto é feito para cada seção por sua vez e todas as predições combinadas e analisadas para computar as características do classificador: Sensibilidade, Especificidade, etc. Se a validação cruzada for realizada particionando os dados em 10 partes, é chamada de validação cruzada de 10 vezes; similarmente 3 partes seria validação cruzada de 3 vezes. Se os dados forem particionados em muitas classes são como existem amostras, isto é chamados de "deixando um fora da validação cruzada". Testando em dados não usados para construir o classificador, este método fornece uma estimativa do desempenho de classificador na ausência de amostras adicionais.
[0173] Construímos classificadores usando todas as 15 combina ções dos 4 biomarcadores, MDK, IGFBP5, CDC2, e HOXA13, todos com e sem o biomarcador IL8Rb, usando o conjunto de dados de pesquisa clínica descrito em outro local neste documento (Exemplo 1) e testamos aqueles 30 classificadores usando validação cruzada de 10 vezes. Isto foi feito para cada um dos 5 tipos de classificadores listados acima e as curvas ROC computadas. Todo o trabalho foi realizado usando o Ambiente de Programação Estatístico R (CITE). Estes resultados (Figura 14) mostram que na maioria dos casos, o classificador com IL8Rb é mais sensível para valores de especificidade que são úteis diagnosticamente (Taxa de falsos-positivos de 0 a 20%; Especificidade de 100 a 80%). A Área Sob a Curva (AUC) para a região com utilidade diagnóstica de especificidades é usada para quantificar bem como os classificadores executam com maiores valores que indicam melhor desempenho do classificador. A Figura 15a tabula a AUC para cada classificador e combinação de biomarcadores, enquanto a Figura 15b mostra a quantidade do aumento em AUC de cada condição quando IL8Rb é adicionado. Na maioria dos casos, a adição de IL8Rb melhora a capacidade de tornar valores de sensibilidade específicos de diagnóstico exatos para valores de especificidade diagnosticamente úteis são tabulados para todos os classificadores na Figura 16. Além disso, a Figura 17 tabula a quantidade do ganho em sensibilidade ou especificidade que a adição de IL8Rb fornece.
[0174] A utilidade do classificador é criada quando, sendo criada e testada, é usado para testar uma nova amostra. Simplificar a interpretação de resultados, um escore de corte ou limiar é estabelecido; as amostras em um lado do corte são consideradas positivas e por outro lado, negativas para tumores. Cortes adicionais podem ser, por exemplo, estabelecidos para indicar níveis crescentes da certeza de resultados. Neste caso, estabelecemos um corte que fornece uma taxa de falsos-positivos de 15% no nosso conjunto de treino. Usando as nossas curvas ROC validadas de forma cruzada, então podemos estimar a nossa sensibilidade. Tipicamente, também estabelecemos um corte por um valor preditivo positivo de 75%. Para usar estes cortes, estabelecemos um resultado "negativo" para escore menor que o corte estabelecido pela especificidade de 85%. O escore maior do que PPV de 75% é chamado de "positivo" e escores entre os dois são chamados "indeterminados" ou "suspeitos". Anticorpos para marcador de IL8Rb
[0175] Em aspectos adicionais, esta invenção inclui a produção de anticorpos contra IL8Rb. O marcador de IL8Rb pode ser produzido em quantidade suficiente para ser adequado para provocar uma resposta imunológica. Em alguns casos, um IL8Rb completo pode ser usado, e em outros, um fragmento de peptídeo de um IL8Rb pode ser suficiente como um imunógeno. O imunógeno pode ser injetado em um hospedeiro adequado (por exemplo, camundongo, coelho, etc.) e se desejado, um adjuvante, como o adjuvante completo de Freund ou adjuvante incompleto de Freund pode ser injetado para aumentar a resposta imunológica. Pode ser apreciado que a criação de anticorpos é regular nas técnicas imunológicas e não tem que ser ainda descrita neste pedido. Como resultado, pode-se produzir anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais ou de exibição do fago, contra IL8Rb.
[0176] Ainda em outras modalidades, os anticorpos podem ser fei tos contra a proteína ou o núcleo da proteína dos marcadores de tumor identificados neste pedido ou contra uma sequência oligonucleotí- dica única para um IL8Rb. Embora certas proteínas possam ser glico- siladas, as variações no modelo de glicosilação, em certas circunstâncias, podem levar à detecção incorreta de formas de IL8Rb que não têm modelos habituais de glicosilação. Dessa forma, em certos aspectos desta invenção, os imunógenos de IL8Rb podem incluir IL8Rb desglicosilado ou fragmentos de IL8Rb desglicosilado. Desglicosilação pode ser realizada usando uma ou mais glicosidases conhecidas na técnica. Alternativamente, cDNA de IL8Rb pode ser expresso em linhagens celulares deficientes em glicosilação, como linhagens de células procarióticas, incluindo E. coli e similares.
[0177] Os vetores podem ser feitos tendo oligonucleotídeos que codificam IL8Rb nestes. Muitos tais vetores podem ser baseados em vetores padrão conhecidos na técnica. Os vetores podem ser usados para transfectar uma variedade de linhagens celulares para produzir linhagens celulares produtoras de IL8Rb, que podem ser usadas para produzir quantidades desejadas de IL8Rb para o desenvolvimento de anticorpos específicos ou outros reagentes para detecção de IL8Rb ou padronizar ensaios desenvolvidos de IL8Rb.
Kits
[0178] Baseado nas constatações desta invenção, vários tipos de kits de teste podem ser idealizados e produzidos. Em primeiro lugar, os kits podem ser feitos tendo um dispositivo de detecção pré- carregado com uma molécula de detecção (ou "reagente de captura"). Em modalidades para detecção de mRNA de IL8Rb, tais dispositivos podem compreender um substrato (por exemplo, vidro, silício, quartzo, metal, etc.) em que oligonucleotídeos como reagentes de captura que hibridizam com o mRNA a ser detectado estão ligados. Em algumas modalidades, a detecção direta do mRNA pode ser realizada hibridi- zando o mRNA (marcado com cy3, cy5, radiomarcador ou outro marcador) aos oligonucleotídeos no substrato. Em outras modalidades, a detecção do mRNA pode ser realizada por primeiro DNA complementar que faz (cDNA) ao mRNA desejado. Então, o cDNA marcado pode ser hibridizado aos oligonucleotídeos no substrato e detectado.
[0179] Os anticorpos também podem ser usados em kits como re agentes de captura. Em algumas modalidades, um substrato (por exemplo, placa multipoço) pode ter um IL8Rb específico e reagentes de captura de BTM ligados a este. Em algumas modalidades, um kit pode ter um reagente de bloqueio incluído. Reagentes de bloqueio podem ser usados para reduzir a ligação não específica. Por exemplo, a ligação oligonucleotídica não específica pode ser reduzida usando DNA em excesso de qualquer fonte adequada que não contenha oli- gonucleotídeos de IL8Rb e BTM, como DNA de esperma de salmão. A ligação de anticorpo não específica pode ser reduzida usando um excesso de uma proteína de bloqueio como albumina sérica. Pode ser apreciado que numerosos métodos para detectar oligonucleotídeos e proteínas são conhecidos na técnica, e qualquer estratégia que pode detectar especificamente moléculas associadas ao marcador pode ser usada e considerada dentro do escopo desta invenção.
[0180] Os anticorpos também podem ser usados quando ligados a um suporte sólido, por exemplo, usando um chip de anticorpo, que permitiria detecção de múltiplos marcadores com um chip único.
[0181] Além de um substrato, um kit teste pode compreender rea gentes de captura (como sondas), soluções de lavagem (por exemplo, SSC, outros sais, tampões, detergentes e similares), bem como porções de detecção (por exemplo, cy3, cy5, radiomarcadores e similares). Os kits também podem incluir instruções de uso e uma embalagem.
[0182] A detecção de IL8Rb e BTMs em uma amostra pode ser pré-formada usando qualquer técnica adequada, e pode incluir, mas não é limitada a sondas oligonucleotídicas, qPCR ou anticorpos originados contra marcadores de câncer.
[0183] Será apreciado que a amostra a ser testada não é restringi da a uma amostra do tecido suspeito em ser uma doença inflamatória ou tumor. O marcador pode ser secretado no soro ou outro fluido corporal. Por isso, uma amostra pode incluir qualquer amostra corporal e inclui biópsias, sangue, soro, lavados peritoneais, fluido cerebrospinal, urina e amostras de fezes.
[0184] Também será apreciado que a presente invenção não é restringida à detecção do câncer em seres humanos, mas é adequada para a detecção de câncer em qualquer animal, incluindo, mas não limitada a cães, gatos, cavalos, gado, ovelhas, cervos, porcos e qualquer outro animal conhecido por pegar o câncer.
Testes Gerais para Doença Inflamatórios ou Marcadores de Câncer em Fluidos Corporais
[0185] Em geral, os métodos para analisar para oligonucleotídeos, proteínas e peptídeos nestes fluidos são conhecidos na técnica. A de-tecção de oligonucleotídeos pode ser realizada usando métodos de hibridização como Northern blots, Southern blots ou métodos de mi- croarranjo ou qPCR. Os métodos para detecção de proteínas incluem tais como os ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA), chips proteicos tendo anticorpos, radioimunoensaio de contas em suspensão cobre (RIA), Western blotting e ligação de lectina. Entretanto, para fins de ilustração, os níveis de fluidos de marcadores de doença podem ser quantificados usando ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) tipo sanduíche. Para ensaios plasmáticos, uma alíquota de 5 uL de uma amostra apropriadamente diluída ou marcador padrão em série diluído e 75 uL de anticorpo anti-marcador humano conjugado peroxidase são adicionados a fontes de uma placa de microtítulo. Após um período de incubação de 30 minutos a 30°C, os poços são lavados com Tween 20 0,05% em salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o anticorpo não ligado. Os complexos ligados de marcador e anticorpo anti-marcador então são incubados com o- fenilendiamina contendo H2O2 por 15 minutos a 30°C. A reação é parada adicionando H2SO4 1 M, e a absorvância em 492 nm é medida com um leitor de placa de microtítulo.
[0186] Pode ser apreciado que os anticorpos anti-IL8Rb podem ser anticorpos monoclonais ou antissoros policlonais. Também pode ser apreciado que qualquer outro fluido corporal pode ser apropriadamente estudado.
[0187] Não é necessário para um marcador ser secretado, em um sentido fisiológico, para ser útil. Ao invés disso, qualquer mecanismo pelo qual uma proteína ou gene do marcador entram no soro pode ser eficaz na produção de um nível detectável, quantificável, do marcador. Dessa forma, a secreção normal de proteínas solúveis de células, destruição de proteínas de membrana de membranas plasmáticas, secreção de formas com splicing alternativo de mRNA ou proteínas expressas deste, morte celular (ou apoptótica) podem produzir níveis sufici- entes do marcador para serem úteis.
[0188] Está aumentando o apoio para o uso de marcadores de so ro como instrumentos para diagnosticar e/ou avaliar a eficácia da terapia de uma variedade de tipos de câncer.
[0189] Yoshikawa et al., (Cancer Letters, 151: 81-86 (2000) des crevem o inibidor de tecido da metaloproteinase de matriz 1 no plasma de pacientes com câncer gástrico.
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[0202] Leman et al., (Urology, 69(4) 714-20 (2007) (Resumo) des crevem mEPCA-2 como um marcador sérico de câncer de próstata.
[0203] Tsigkou et al., (I Clin Endocrinol Metab, 92 (7) 2526-31 (2007) (Resumo) descrevem inibina total como um marcador sérico potencial do câncer ovariano.
[0204] Marchi et al., (Cancer 112, 1313-1324 (2008) (Resumo) descrevem Pró-Apolipoproteína Al como um marcador sérico de me- tástases cerebrais em pacientes de câncer de pulmão.
EXEMPLOS
[0205] Os exemplos descritos neste pedido são para fins de ilus trar modalidades da invenção. Outras modalidades, métodos e tipos de análises estão dentro do escopo de versados ordinários nas técnicas de diagnóstico molecular e não têm que ser descritos detalhadamente para isto. Considera-se que outras modalidades dentro do es- copo da técnica são parte desta invenção.
Exemplo 1: Métodos
[0206] Pacientes: Entre abril de 2008 e setembro de 2009, 471 pa cientes que apresentaram hematúria macroscópica, mas nenhuma história prévia de malignidade de aparelho urinário, foram recrutados em onze clínicas de urologia na Nova Zelândia e Austrália. Cada paciente forneceu uma amostra de urina imediatamente antes de passar pela cistoscopia e qualquer procedimento diagnóstico adicional. Um diagnóstico foi feito por três meses após inscrição no estudo. Destes 471 pacientes, os dados de expressão gênica sobre os cinco genes de estudo foram obtidos com sucesso para 442 pacientes que usam os métodos descritos abaixo. As características destes pacientes são mostradas na Tabela 4.
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Tabela 4. Características da populaçã io de estudo. A tabela mostra o número de pacientes em cada uma das categorias de diagnósticos principais em três meses após apresentação inicial do paciente com hematúria macroscópica.
[0207] Análise de urina: as amostras de urina foram analisadas pela citologia de revisão central (Southern Community Laboratories, Dunedin, Nova Zelândia). Os testes diagnósticos NMP22 BladderChek (Matritech) e ELISA NMP22 (Matritech) foram realizados de acordo com as instruções do fabricante no sítio clínico (BladderChek) ou por Southern Community Laboratories (NMP22 ELISA).
[0208] Quantificação de RNA: 2 mL de urina de cada paciente fo ram misturados com tampão de extração de RNA contendo tiocianato de guanidina 5,64 M, sarcosil 0,5% e NaoAc 50 mM pH 6,5. RNA total então foi extraído por extração com Trizol (Invitrogen) e o procedimento de RNeasy (Qiagen), como anteriormente descrito. RNA foi eluído das colunas em 35 μL de água e 3 μL foram usados em cada ensaio de reação de polimerase em cadeia de transcrição reversa quantitativa monoplex ou dúplex subsequente (qRT-PCR). Cada 16 μL de reação de qRT-PCR continha 0,3 U de RNASE-OUT (Invitrogen), 0,225 uM de cada sonda Taqman, 1,25 U de SuperScript III (Invitrogen), 0,275 uM de cada iniciador, 1,5 U de Taq polimerase Fast Start (Roche), DTT 10 mM, dNTPs 0,375 mM, MgSO4 4,5 mM, 1,6 μL de tampão de PCR Fast Start 10x (Roche) e 2,6 μL de solução rica em GC (Roche). Iniciadores e sondas fluorescentemente marcadas de maneira dual foram obtidos de Integrated DNA Technologies (Coralville EUA) para cada um dos cinco genes de estudo: MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 e IL8Rb. As sequências de iniciador/sonda são mostradas na Tabela 2. As reações foram configuradas em placas de 96 poços e cicladas como se segue no Roche Light Cycler® 480: 50°C, 15 minutos; 95°C 8 minutos; 10 ciclos de 95°C 15 segundos, 60°C 2 minutos e 30 ciclos de 95°C 15 segundos, 60°C 1 min. Curvas padrão de diluições seriais 1/16 de RNA de referência (derivado de RNAs de linhagem celular agrupados) foram incluídas em cada placa para gerar a faixa de 0,3 pg/μL a 20 ng/μL. Os dados foram coletados na fase de extensão dos 30 termociclos finais e exportados como um arquivo de texto bruto.
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Tabela 5: Sequências de iniciadores e sondas usados para a quantifi- cação com qRT-PCR dos cinco marcadores de RNA.
[0209] Análise de dados de qRT-PCR: os dados de fluorescência brutos foram exportados de Roche LightCycler® 480 como um arquivo delimitado por tabulação contendo número de ciclo versus dois canais de dados de fluorescência de todos os poços na placa. Os dados foram pro-cessados usando um programa R que aplicou compensação em cor ([Bernard1999]) aos dados para corrigir para o vazamento de um canal fluorescente no outro. Então ajustou um modelo logístico de 5 pontos para estimar Cp usando a derivada segunda máxima ([Spiess2008]).
[0210] Todas amostras e controles foram aplicados em duplicata às placas de PCR. A média dos valores de Cp dos poços em duplicata foi calculada antes do uso. Se a diferença entre os dois valores de Cp excedeu 3 unidades, aquela amostra foi repetida. Para fornecer a pa-dronização através de placas de PCR, Cp foi expresso como ΔCp’s re-lativos ao RNA de referência (derivado da linhagem celular agrupada ΔCp = Cp (amostra) - Cp (RNA de referência)
[0211] Análise estatística: valores de ΔCp da qRT-PCR de MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 e IL8Rb foram usados para gerar classificadores para separar amostras contendo TCCs de amostras que não contêm nenhum TCC, baseado em Análise Discriminante Linear ou Regressão Logística ([Venables2002]). Em ambos os casos, as interações entre genes foram permitidas nos modelos de classificadores. A geração do LDA seguiu procedimentos ordinários, como descrito, por exemplo, em "Modern Applied Statistics with S, 4th edition" de W.N. Venables e B.D. Ripley (2002), Springer. O conjunto de dados do estudo foi limpo de quaisquer dados incompletos então R Statistical Environment (R Development Core Team (2009) e a função "Ida" do pacote MASS (Venables e Ripley (2002)) foram usados para gerar e testar a discriminante linear nos dados de pesquisa clínica.
[0212] A geração do classificador de Regressão Logística foi reali zada de uma maneira similar à geração de LDA. Novamente, os dados de estudo foram limpos dos dados incompletos. Um classificador de regressão logística foi criado usando R; nenhum pacote adicional foi necessário. A regressão logística foi realizada como descrito por Dal- gaard (2008). A comparação entre classificadores foi feita usando curvas ROC, usando o pacote R, ROCR (Sing et al. 2009). Os intervalos de confiança de curvas ROC foram gerados usando os métodos de Macskassy et al. ([Macskassy2005]).
[0213] Os seguintes algoritmos foram gerados: Classificador Discriminante linear
[0214] O primeiro classificador, discriminante linear, (chamado de LDA-3), é baseado em cinco valores gênicos (normalizado a um valor de referência subtraindo o valor de referência) permitindo interações de múltiplos caminhos entre os genes. O classificador foi construído em R usando a função ‘lda ()’ do pacote chamado "MASS". (R versão 2.9.1; MASS versão 7.2-49). O classificador foi construído usando a seguinte equação: Ida3 <-lda (TCC.YN ~ MDK * IGF * CDC * HOXA * IL8R, data=uRNA.Trial)
[0215] Onde Ida3 é o modelo criado; TCC.YN é o valor verdadeiro para "presença de TCC na urina" como determinado pelo nosso padrão ouro, cistoscopia; MDK, IGF, CDC, HOXA e IL8R são o valor de Cp do gene normalizado; e uRNA.Trial é uma estrutura de dados contendo os valores dos genes e TCC.YN da pesquisa clínica. O uso de ASTERISCO (*), na fórmula não significa multiplicação, mas significa "termos que interagem" no classificador.
[0216] A avaliação do escore de classificador toma como entrada uma nova estrutura de dados que contém os cinco valores gênicos bem como o classificador, Ida3, para a produção um escore de classificador: score <-c (predict(lda3, new.data)$x)
[0217] Onde o escore é a saída usada do classificador para predi zer a presença de TCCs; Ida3 é o classificador criado acima e new.data é uma estrutura de dados que contém os valores medidos dos cinco genes chamados pelos mesmos nomes que os usados na criação de classificador. A sintaxe, ‘$x’ e c(), está presente para extrair o escore especificamente da grande quantidade da informação devolvida pela função predição.
[0218] Configurando o corte de escore para 0,112 e acima, esta belece a nossa especificidade em 85% da presença de TCCs na amostra de urina.
[0219] Os coeficientes de LDA-3 são:
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Classificador de regressão logística
[0220] Um segundo classificador baseado na Regressão Logística foi derivado do mesmo conjunto de dados limpo que LDA-3. Em vez de usar a função lda (), entretanto, usamos a função glm () do pacote stats (incluído com uma instalação base de R) como mostrado abaixo: Ir1 <-glm (TCC.YN ~ CDC * IGF * HOXA * IL8R * MDK, fa- mily=binomial ("logit"), data=uRNA.Trial)
[0221] Onde Ir1 é o classificador criado e outros parâmetros são como descritos para a discriminante linear. Mais uma vez, a interação completa é especificada usando o operador. A classificação é realiza- da de uma maneira muito similar a esta para LDA-3: score <-predict (lr1, new.data, type = ‘response’)
[0222] Onde o escore é o valor usado para classificar amostras de urina baseadas na medida dos cinco genes em new.data, como acima. O corte de para Ir1 é feito em 0,102 para alcançar uma especificidade de 85%; considera-se que os valores sobre o corte são positivos para TCCs. Os coeficientes do classificador são: -103.0819143 + 3.9043769 * CDC.d.RlOO + 13.1120675 * IGF.d.RlOO + 17.4771819 * HOXA.d.RlOO + -10.7711519 * ILθR.d.RlOO + 21.1027595 * MDK.d.RlOO +
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Resultados Análise de qRT-PCR de amostras de urina
[0223] Para obter um resumo do efeito de IL8Rb na detecção de TCC, dois gráficos de dispersão dimensionais foram construídos usando dados de qRT-PCR obtidos da urina de pacientes com TCC (n = 56) ou condições de urolitíase não malignas (n=25), infecção do aparelho urinário (n=18) ou cistite (n=18). Os gráficos de dispersão foram construídos usando pares de genes de uma assinatura de quatro ge- nes (MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5). IL8Rb então foi substituído por um gene de cada par e os dados retraçados. Estes gráficos são mostrados na Figura 2a-f. Substituição de IL8Rb por IGFBP5 e HOXA13 em gráficos com MDK (Figura 2a-c) mostrou a separação melhorada entre amostras de pacientes com TCC e aqueles com condições não malignas. A mesma tendência foi observada em gráficos com CDC2 no qual IL8Rb foi substituído por IGFBP5 e HOXA13 (Figura. 2d-f).
[0224] A contribuição de IL8Rb para o diagnóstico correto de TCC em pacientes que apresentam hematúria macroscópica então foi quan-tificada pela análise de curva ROC. Os dados de qRT-PCR de cada gene na assinatura (MDK, CDC2, IGFBP5 e HOXA13) e IL8Rb foram usados para desenvolver algoritmos discriminantes lineares que maximizaram a discriminação entre os pacientes com TCC e aqueles sem. Dois algoritmos discriminantes lineares foram desenvolvidos usando a coorte inteira de 442 amostras: LD1, que usou os dados de qRT-PCR de MDK, CDC2, HOXA13 e IGFBP5 e LD2, que usou MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 e IL8Rb. LD1 e LD2 então foram usados para gerar curvas ROC mostrando a sensibilidade e a especificidade para a detecção de TCC no grupo de pacientes com TCC confirmado (n=56) ou condições de urolitíase não malignas (n=25), infecção do aparelho urinário (n=18) ou cistite (n=18). A Figura 3a mostra as curvas ROC de LD1 e LD2. A área sob a curva ROC de LD1 foi 78% em comparação com 84% de LD2.
[0225] Como uma alternativa para análise discriminante linear, a regressão logística foi usada como um método independente para de-senvolver um algoritmo para a discriminação entre pacientes com TCC e aqueles com doença não maligna. Quanto à análise discriminante linear, os algoritmos de regressão logística foram desenvolvidos usando a coorte inteira das 442 amostras. As curvas ROC obtidas usando a regressão logística e as 56 amostras de TCC e 61 não malignas des- critas acima são mostradas na Figura 3b. A área sob a curva ROC de LR1 (obtida usando dados de qRT-PCR de MDK, CDC2, HoxA13 e IGFBP5) foi 80% comparado com 86% de LR2 (obtida usando dados de qRT-PCR de MDK, CDC2, HOXA13, IGFBP5 e IL8Rb). Estes dados claramente ilustram que a inclusão de IL8Rb nos métodos da detecção de TCC usando amostras de urina pode levar à discriminação melhorada entre pacientes com TCC e doenças não malignas como cistite, infecção do aparelho urinário e urolitíase.
[0226] Confirmar a exatidão melhorada permitida por IL8Rb para a discriminação entre pacientes com TCC e urolitíase, infecção do aparelho urinário ou cistite foi mantido em uma coorte não selecionada a partir de pacientes que compreendem um maior número e diversidade de pacientes não malignos, as análises de curva ROC foram repetidas com a coorte inteira de 442 amostras descritas na Tabela 1. Nesta análise, a área sob a curva de LD1 e LD2 foi 86 e 89%, respectivamente (Figura. 4a). Similarmente a área sob a curva de LR1 foi 87% e de 91% LR2 (Figura. 4b). Este resultado confirma que IL8Rb leva à exatidão melhorada na detecção de TCC usando amostras de urina.
[0227] Esta melhora na detecção de câncer devido à inclusão de IL8Rb foi ainda ilustrada aplicando LD1/LD2 e LR1/LR2 à coorte de 442 paciente e em seguida determinando a sensibilidade da detecção do estágio Ta de TCC somente. Os tumores em estágio Ta são tumores menores, mais diferenciados que são tipicamente mais difíceis de detectar do que tumores em estágio mais altos. LD1 detectou 18/31 (58%) dos tumores em Ta comparado com 19/31 (61%) de LD2 em uma especificidade de 85%. LR1 detectou 21/31 (68%) comparado com 24/31 (77%) de LR2 (especificidade de 85%). Estes dados mostram que a inclusão de IL8Rb nos algoritmos LD e LR aumentou a sensibilidade da detecção de tumores em estágio Ta em até 9%. Em comparação com estes testes de RNA, três outros testes de câncer de bexiga neste estudo mostraram exatidão acentuadamente mais baixa para a detecção de tumores em Ta: citologia de urina (sensibilidade de 39%, especificidade de 94%), ELISA NMP22 (sensibilidade de 35%, especificidade de 88%) e NMP22 (BladderChek® "uma marca comercial registrada de Matritech, Inc. de Massachusetts, Estados Unidos") (sensibilidade de 39%, especificidade de 96%).
IL8Rb como um auxílio no diagnóstico de inflamação do aparelho urinário.
[0228] Para determinar a capacidade de IL8Rb para ser usado no diagnóstico de pacientes com a inflamação do aparelho urinário devido a causas como cistite ou infecções de aparelho urinário, os níveis na urina de mRNA de IL8Rb em pacientes com hematúria diagnosticados com hiperplasia de próstata benigna, doença de próstata não específica, prós-tata vascular, hematúria secundária ao uso de warfarina e cistite/infecção de aparelho urinário foram determinados por qRT-PCR. Os níveis de ΔCT de IL8Rb médios de cada uma destas condições foram -3,12, -3,10, -2,84, -1,98 e -5,27, respectivamente. A diferença entre a média do nível de IL8Rb em pacientes com cistite/infecção de aparelho urinário e outros estados não malignos combinados foi determinada sendo significante (p=0,001) usando o teste de soma de postos de Wilcoxon. Os gráficos de caixa que retratam estes dados são mostrados na Figura 5. Estes dados mostram uma elevação de níveis de IL8Rb na maioria dos pacientes di-agnosticados com cistite ou com infecção do aparelho urinário em com-paração com outras condições não malignas examinadas. A sobreposição entre gráficos será provavelmente explicada por uma combinação de três fatores: (i) incapacidade da prática clínica padrão de diagnosticar corretamente cada condição, (ii) co-morbidade (por exemplo, infecção e hiperplasia benigna de próstata), e (iii) associação normal de altas conta-gens de neutrófilo de urina inclui um subconjunto de pacientes com hi- perplasia de próstata benigna, doença de próstata não específica, prósta- ta vascular ou hematúria secundária ao uso de warfarina. Independente-mente, considerando a associação estrita entre inflamação e números de neutrófilos, a quantificação de IL8Rb na urina fornece um método exato de detectar a inflamação do aparelho urinário, sendo ele como consequência da infecção ou em associação com outras condições não malignas.
Exemplo 2 Métodos População de estudo
[0229] Uma série consecutiva de pacientes sem uma história pré via de TCC foi recrutada prospectivamente de nove clínicas de urologia na Nova Zelândia e duas na Austrália entre 28 de abril de 2008 e 11 de agosto de 2009. O conjunto de pacientes incluiu os pacientes usados no exemplo 1, mas incluiu 46 pacientes adicionais, cujos dados não estavam disponíveis para a primeira análise. Estudos adicionais também incluíram análise adicional dos resultados obtidos.
[0230] As amostras foram coletadas e RNA coletado e testado como descrito no Exemplo 1. Desenvolvimento de teste de RNA
[0231] uRNA® consiste de quatro marcadores de mRNA, CDC2, HOXA13, MDK e IGFBP5. Estes marcadores foram selecionados com base na sua baixa expressão em sangue e células inflamatórias e su- perexpressão em TCC.2 Neste estudo de coorte, especificamos pros- pectivamente que um algoritmo discriminante linear (uRNA-D) que combinou os quatro marcadores em um escore único. O uRNA-D foi independente, sendo desenvolvido em um conjunto de dados mais adiantado. Não foi entretanto, derivado usando um grupo de pacientes estritamente caraterizado que representa a população alvo desejada do teste. Por conseguinte, o protocolo de estudo também definiu o de-senvolvimento de um novo algoritmo (Classificador-D) para o uso dos cinco marcadores CDC2, HOXA13, MDK, IGFBP5 e IL8Rb usando dados obtidos dos pacientes recrutados ao estudo de coorte atual.
[0232] Além do Classificador-D, um segundo algoritmo (Classifica- dor-S) foi derivado usando os dados de estudo de coorte para permitir a identificação de tumores que estavam no estágio avançado (> estágio 1) ou grau maior (classificação WHO/ISUP 1998). Os algoritmos compreenderam os cinco marcadores, incluindo CDC2 e HOXA13 que tinham sido anteriormente mostrados ser diferencialmente expressos entre tumores em Estágio Ta e aqueles > estágio 1. Desenvolvimento de classificador
[0233] O desenvolvimento de dois classificadores para o uso dos cinco marcadores CDC2, HOXA13, MDK, IGFBP5 e IL8Rb (Classifica- dor-D e Classificador-S) foi baseado em dados obtidos neste estudo, conforme os métodos delineados neste relatório descritivo. Resumi-damente, os modelos de regressão logística foram feitos usando o ambiente de programação estatístico R (R Development Core Team (2011). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria. ISBN 3-90005107-0, URL http:// www.R-project.org/). Os modelos feitos usando valores de ΔCp de cada um dos cinco marcadores e suas interações de duas vias (por exemplo, MDK x CDC2, MDK x IGFBP5, etc.) foram avaliados para sua capacidade de classificar; aqueles com os valores de AIC mais baixos foram avaliados em um procedimento de validação cruzada "deixa aquele fora" para sua sensibilidade quando a especificidade foi estabelecida em 85%. Vários modelos demonstraram o desempenho comparável de cada um de Classificador-D e Classificador- S, com o modelo com os menores números de parâmetros que são selecionados. Métodos estatísticos
[0234] Onde um teste diagnóstico foi especificado no protocolo, as proporções e os intervalos de confiança de 95% foram calculados para sensibilidade e especificidade. As curvas de característica operacional recebida (ROC) foram traçadas e comparadas usando comandos de Stata roctab e roccomp (Statacorp e Delong). Para o Classificador-D, os intervalos de confiança não são apropriados, mas testes exatos de Fisher ou Chi quadrado (onde os tamanhos de amostra permitem) foram usados para testar para uma associação entre TCC ou características de pacientes e possibilidades de resultados verdadeiros-positivos ou falsos-positivos. Os modelos de regressão logística foram usados para explorar fatores associados com resultados falsos-positivos e falsos-negativos. Todas as análises foram realizadas na versão 11.2 de Stata. RESULTADOS
[0235] Um total de 517 pacientes foram inicialmente recrutados ao estudo; 4% dos pacientes foram excluídos porque foram verificados ser inelegíveis (n=10), não sofreram cistoscopia (n=9), o status de TCC não foi afirmado (n=2) ou não forneceram uma amostra de urina aceitável (n=2) (Figura 8). 10 pacientes adicionais foram excluídos da análise porque não tiveram resultados de um ou mais dos testes de urina. A linha base de características demográficas e clínicas de 485 pacientes restantes é mostrada na Figura 9.
[0236] A prevalência de TCC na coorte foi 13,6%. Dois estavam faltando um estágio de revisão (ambos eram Ta pela revisão local) e dois não foram dados um grau de revisão (cada um foi classe 1 pelo patologista local, o outro menos). Dos 66 tumores, 55 eram superficiais (estágio Ta, T1 ou Tis) e 11 eram invasivos no músculo (T2). Nenhum paciente tinha metástases detectáveis ou envolvimento de linfonodos regionais. Usando o sistema de classificação de 1973, 24 foram classi-ficados como classe 3, 38 classe 2, três classe 1 e um desconhecido. Com o sistema WH098, 29 foram classificados como alto grau, quatro mistos, 32 de baixo grau e um desconhecido. Além de TCCs, dois pa-cientes foram diagnosticados com um papiloma, e sete com outros ne-oplasmas (cinco destes urológicos).
[0237] O corte do teste de uRNA-D foi determinado na coorte de estudo, com o conjunto de especificidade em 85%. Com este corte, o uRNA-D detectou 41 de 66 casos de TCC (sensibilidade de 62%), comparado com ELISA NMP22™ (50%), Bladderchek™ (38%) e citologia (56%). O teste de RNA desenvolvido no Classificador-D de dados de coorte detectou 54 dos casos de TCC (82%) em uma especificidade de 85% e 48 (73%) em uma especificidade de 90%. Os valores de uRNA-D e ELISA NMP22™ podem ser diretamente comparados como ambos os testes foram totalmente especificados antes do estudo. A Figura 2a mostra as curvas ROC; as áreas sob a curva (AUCs) são 0,81 e 0,73, respectivamente (p=0,03). A curva ROC do Classificador- D foi 0,87 (Figura 11b), e a melhora no desempenho quanto a uRNA-D parece estar na maior parte na faixa de especificidades clinicamente relevantes (acima de 80%).
[0238] Além de tudo, o Classificador-D detectou 97% dos tumores alto/grau 3, em comparação com o uRNA-D (83%), citologia (83%), ELISA NMP22 (69%) e Bladderchek (38%). O classificador-D também foi mais sensível para a detecção de tumores de classe baixa (69%), com outros testes nos limites de 28 - 41% (Figura 12). O classificador- D foi positivo para todos os casos de TCC de Estágio > 1 mais ambos Ti, mas a sensibilidade foi 68% para o estágio Ta (p=0,016, Figura 12). Isto ainda foi substancialmente mais alto do que outros testes, com uRNA-D sendo o seguinte mais alto em 41%. Os pacientes de TCC com micro-hematúria aparente na sua amostra de urina com maior probabilidade de ter seu TCC detectado pela inclusão de IL8Rb do que aqueles sem micro-hematúria (p <0,0005), embora isto provavelmente seja pelo menos parcialmente um resultado da proporção mais alta de TCCs em alto estágio e grau entre aqueles com micro-hematúria. Os números foram insuficientes para explorar mais isto em análises de regressão.
[0239] Dos 12 casos perdidos pelo Classificador-D, todos estavam em estágio Ta e todos exceto um era de grau baixo (WHO ISUP 1998). Somente dois dos doze (ambos de grau baixo, estágio Ta de TCC) foram capturados por outro teste (um tanto por ELISA NMP22™ como por BladderChek™ e um por uRNA-D). Dos 12 casos perdidos pelo Classificador-D, todos eram de estágio Ta e todos exceto um era de grau baixo (WHO ISUP 1998). Somente dois dos doze (ambos de grau baixo, estágio Ta de TCC) foram capturados por outro teste (um tanto por ELISA NMP22™ como por BladderChek™ e um por uRNA- D). A citologia não apanhou nenhum TCC aquele Classificador-D perdido.
[0240] Paciente A: tumor T2 pélvico renal de alto grau, nenhum Ti simultâneo, nenhum tamanho dado.
[0241] Paciente B: T3a de bexiga de Alto Grau sem Ti simultâneo, 2 x 3 cm
[0242] Paciente C: um tumor de alto grau que mede 4,8 x 5,6 cm com invasão estromal extensa e muscular própria, estendendo-se à gordura perivesical sem evidência de metástase.
[0243] A especificidade dos testes de urina entre aqueles com di agnósticos alternativos e de acordo com as características de amostra de urina é mostrada na Figura 13. Os pacientes controle com micro- hematúria com maior probabilidade teriam testes falsos-positivos do que aqueles sem micro-hematúria (p=0,002), e houve uma sugestão que os pacientes com cálculos podem também, embora as diferenças na especificidade pelo diagnóstico não fossem estatisticamente signifi- cantes total (p=0,12). Houve cinco pacientes com outros cânceres uro- lógicos; somente um destes deu um resultado de prova de Classifica- dor-D positivo. Resulta da prova de modelos de regressão logística foram similares. Em um modelo de regressão logística com diagnóstico e micro-hematúria, a associação com o status de micro-hematúria permaneceu significante (p=0,006) e, quando comparado diretamente àqueles sem diagnóstico com cálculos tinham aumentado de 2,7 vezes de um teste falso-positivo (Cl de 95% (1,1 a 6,4), p=0,03). A idade não afetou a especificidade do teste.
[0244] A micro-hematúria detectada na amostra de urina foi o úni co fator claramente associado com a sensibilidade de teste. O valor preditivo de um teste positivo nesta coorte foi 63% para aqueles com micro-hematúria e 24% para aqueles sem, basicamente refletindo a maior prevalência de TCC nos pacientes com micro-hematúria (39% contra 6%).
[0245] Houve 54 pacientes com TCC em que o teste de Classifi- cador-D foi positivo. Estes pacientes foram classificados em TCC severo e menos severo usando Classificador-S. TCC severo foi definido como o estágio S1 ou grau 3 em qualquer estágio. Em uma especificidade de 90%, o Classificador-S corretamente classificou 32/35 (91%) dos casos de TCC severo.

Claims (10)

1. Método para detecção do câncer de bexiga, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) fornecer uma amostra de urina; (ii) detectar os níveis do receptor B de interleucina 8 mar-cador de neutrófilo humano (IL8Rb) em associação com um ou mais genes marcadores de tumor de bexiga (BTM) na dita amostra, em que os genes BTM compreendem o ciclo de divisão celular 2, G1 a S e G2 a M (CDC2), midkine (fator de promoção de crescimento de neurita 2) (MDK), Homeo Box A13 (HOXA13) e proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 5 ( IGFBP5); e (iii) em que a presença do câncer é estabelecida por com-paração dos níveis de IL8Rb e dos genes BTM com os níveis em paci-entes normais e/ou pacientes apresentando câncer de bexiga e/ou pa-cientes apresentando uma condição inflamatória da bexiga e estabele-cendo se o paciente possui câncer de bexiga, em que um aumento nos níveis dos genes BTM, na ausência de um aumento no nível de IL8Rb, é indicativo de que o paciente apresenta câncer de bexiga, e em que um aumento no nível de IL8Rb é indicativo de que o paciente apresenta uma condição inflamatória da bexiga.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) a probabilidade da presença do câncer é determinada estabelecendo um limiar diagnóstico baseado nos níveis de expressão conhecidos de IL8Rb e de genes BTM com os níveis em pacientes normais e/ou pacientes apresentando câncer de bexiga e/ou pacientes apresentando uma condição inflamatória da bexiga, opcionalmente em que o limiar é estabelecido usando um método estatístico e opcional-mente em que o método estatístico é qualquer um de Análise Discri- minante Linear (LDA), Regressão Logística (LogReg), Máquina de Vetor de Suporte (SVM), 5 K-vizinhos mais próximos (KN5N) e Classificador de Árvore de Partição (TREE), e/ou ( (b) os genes BTM incluem, pelo menos, um marcador adicional selecionado a partir da Figura 6 ou 7.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zado pelo fato de que: (a) a dita etapa de detecção é realizada por detecção dos níveis de mRNA, ou (b) a dita etapa de detecção é realizada por detecção dos níveis de cDNA, opcionalmente usando um oligonucleotídeo comple-mentar para pelo menos uma porção do dito cDNA ou usando qRT- PCR, o método usando um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso.
4. Dispositivo para detecção de um câncer de bexiga em uma amostra de urina, caracterizado pelo fato de que compreende: um substrato apresentando um reagente de captura de gene de receptor B de interleucina 8 marcador de neutrófilos humano (IL8Rb) e o reagente de captura para genes de marcadores de tumor de bexiga (BTM) no mesmo, em que os genes BTM compreendem o ciclo de divisão celular 2, G1 a S e G2 a M (CDC2), midkine (fator de promoção de crescimento de neurita 2) (MDK), Homeo Box A13 (HOXA13) e proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 5 ( IGFBP5); e um detector associado ao dito substrato, o dito detector ca-paz de detectar a expressão associada ao dito reagente de captura, em que um aumento nos níveis dos genes BTM, na ausência de um aumento no nível de IL8Rb, é indicativo de que o paciente apresenta câncer de bexiga, e em que um aumento no nível de IL8Rb é indicativo de que o paciente apresenta uma condição inflamatória da bexiga.
5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zado pelo fato de que os genes BTM incluem pelo menos um marcador adicional selecionado a partir da Figura 6 ou 7.
6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, carac-terizado pelo fato de que: (a) o dito reagente de captura é um oligonucleotídeo, ou (b) o dito reagente de captura é um anticorpo específico para um oligonucleotídeo, uma proteína ou um peptídeo.
7. Kit para detecção do câncer de bexiga em uma amostra de urina, caracterizado pelo fato de que compreende: um substrato apresentando um reagente de captura de gene de receptor B de interleucina 8 marcador de neutrófilos humano (IL8Rb) e um reagente de captura para genes marcadores de tumor de bexiga (BTM) no mesmo, em que os genes BTM compreendem o ciclo de divisão celular 2, G1 a S e G2 a M (CDC2), midkine (fator de promoção de crescimento de neurita 2) (MDK), Homeo Box A13 (HOXA13) e proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 5 ( IGFBP5); um meio para visualização de um complexo do dito agente de captura e um marcador; reagentes; e instruções de uso.
8. Kit, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: (a) o dito reagente de captura é um oligonucleotídeo ou (b) o dito reagente de captura é um anticorpo seletivo para um oligonucleotídeo, uma proteína ou um peptídeo.
9. Método para rastreamento de câncer de bexiga, caracte-rizado pelo fato de que compreende: fornecer uma amostra de urina teste de um paciente teste; medir da presença de proteína de receptor B de interleucina 8 marcador de neutrófilos humano (IL8Rb) e de genes de marcador de tumor de bexiga (BTM) na dita amostra de urina teste, em que os genes BTM compreendem o ciclo de divisão celular 2, G1 a S e G2 a M (CDC2), midkine (fator de promoção de crescimento de neurita 2) (MDK), Homeo Box A13 (HOXA13) e proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 5 ( IGFBP5); e comparar a quantidade de marcadores presentes na dita amostra de urina teste com um valor obtido de uma amostra de urina controle de um indivíduo não apresentando câncer de bexiga, e/ou com uma amostra urina controle de um indivíduo apresentando uma condição inflamatória da bexiga, e estabelecer se o câncer de bexiga está presente, em que um aumento nos níveis dos genes BTM, n ausência de um aumento no nível de IL8Rb, é indicativo da presença de câncer de bexiga, e em que um aumento no nível de IL8Rb é indicativo da presença de uma condição inflamatória da bexiga.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que: (a) o dito marcador detectado é um oligonucleotídeo, opci-onalmente DNA ou RNA, e/ou (b) a dita etapa de medida usa um ensaio ELISA.
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