KR101956097B1 - Tis21 유전자 발현을 이용한 적근 증진법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 근육 또는 근육아세포내 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 활성 또는 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 적근 증진법에 관한 것으로 상기 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 TIS21의 발현을 유지 또는 증진하나 TIS21의 발현을 저해시킨 경우 미오신중쇄(MyHC) 타입 Ι 단백질이 감소 된다. 그러나 TIS21 유전자를 과발현시킨 근육아세포에서는 MyHC 타입 Ι 단백질 양이 증가되는 것이 확인됨에 따라 TIS21 단백질 또는 이의 발현조절제를 유효성분으로 함유하는 적근증진용 조성물을 제공하여 적근감소 예방 또는 치료제 및 가축 육질 형성용 사료조성물로 사용할 수 있다.

Description

TIS21 유전자 발현을 이용한 적근 증진법{Increasing red muscle mass through TIS21 gene expression}
본 발명은 골격근 또는 골아세포내 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 활성 또는 발현을 조절하여 적근을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
골격근은 크게 적근과 백근으로 분류된다. 적근은 천천히 수축하며 지구력을 증진시키는 근육이고 백근은 재빠른 수축으로 순발력을 내는 근육이다. 나이가 들면 백근이 더 쉽게 퇴화하므로 움직임이 둔해진다. 사람에서 적근과 백근이 가장 활발하게 움직이는 나이는 20대 이며 퇴화하는 방식은 서로 다르다. 적근은 서서히 퇴화하여 70대가 되어도 오랜 시간 걷는데 무리가 없으나 백근은 30세가 넘으면 급격하게 퇴화한다. 전체적으로 백근이 줄어들면 체중이 감소하며 피로에 견디는 능력도 떨어지고 염증 및 일상생활에서 지장을 느끼게 된다. 암환자의 경우 근육량에 따라 항암효과와 사망률의 차이가 크다. 즉 근육양이 많으면 삶의 질이 향상되고 질환이나 병후에 경과가 좋다고 보고되어 있다.
먼 거리를 운동하는 마라토너의 경우 적근이 발달되는데 적근은 체지방을 에너지원으로 사용하므로 체형은 마르는 편이다. 같은 달리기 선수이지만 순간적인 힘을 요구하는 단거리 선수에서는 백근이 발달한다. 백근은 순간적인 에너지를 내기 위하여 근육 내 저장되어 있는 탄수화물을 이용한다. 근력운동을 통해 상대적으로 쉽게 부피를 증가시킬 수 있는 근육은 백근인데 동시에 또한 쉽게 근육 양이 감소되기도 한다. 근육에서 사용하는 에너지원이 다르므로 지방 감소를 희망하는 경우에는 적근 발달을 유도하여 지방소모를 증가시킬 수 있으므로 고칼로리 식사를 하는 현대인은 적근 증진을 시도하여야 한다. 근육에는 적근과 백근 사이 중간 형태의 근육이 있어서 어떤 운동을 하느냐에 따라 백근 또는 적근으로 발달 할 수 있다고 한다. 운동은 대사성 질환인 당뇨와 비만의 치료에 보조적인 역할을 할 수 있으나 운동을 할 수 없는 경우에는 성장호르몬(GH) 투여를 통하여 근육의 질량을 증진시키는 방법이 있기도 하다. 그러나 이러한 치료는 매우 고가일 뿐만 아니라 평균 수명을 단축시키는 부작용이 발생하므로 병상에 누워있는 환자에게 사용하기에는 매우 부적절한 방법으로 알려져 있다. 따라서 보다 안전하고 효과적인 근육 양 증진에 대한 연구가 필요한 것이 현실이다.
한국공개특허 제2010-0077160호(2010.07.07 공개)
상기 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 TIS21 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 인체 내 적근을 증진시키는 약학조성물로 제공하거나 가축의 단단하고 건강한 근육을 형성하기 위한 가축사료 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 근육 또는 근육아세포내 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 활성 또는 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 적근 증진법을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 적근증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 적근감소 예방 또는 치료를 위하여 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 적근 감소 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 가축 육질 형성용 사료조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 근육 또는 근육아세포에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 세포에서 TIS21 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 상기 TIS21 발현 또는 활성 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 근감소증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 적근에서 TIS21 발현이 백근보다 2배 이상 크고 활발하다는 것이 확인되었으며, TIS21의 발현을 저해시킨 경우 적근의 대표적인 미오신 중쇄 타입 Ι 단백질이 감소된 반면, TIS21이 과발현된 근육아세포에서는 미오신 중쇄 타입 Ι 단백질 양이 현저히 증가되는 것이 확인됨에 따라, TIS21 단백질 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여 적근 증진용 또는 적근 감소 시 치료제로 사용할 수 있으며, 가축 육질형성용 사료조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 정상 생쥐 뒷다리 종아리의 장지근(gastrocnemius; GA), 가자미근판(soleus; Sol), 앞정강근(tibialis anterior; TA), 장지신근(extensor digitorum longus; EDL)에서 TIS21 발현 수준을 확인한 실시간 PCR 결과이다.
도 2는 정상 생쥐와 TIS21 유전자 적중 생쥐의 가자미근판(soleus; Sol)에서 미오신 중쇄(myosin heavy chain; MyHC)들의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 정상 생쥐와 TIS21 유전자 적중 생쥐의 장지근(gastrocnemius; GA)에서 MyHC 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 아데노바이러스-TIS21-HA를 이용하여 TIS21 유전자가 과발현된 근육아세포 (C2C12)에서 TIS21 유전자과발현에 따른 MyHC 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
본 발명은 근육 또는 근육아세포내 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 활성 또는 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 적근 증진법을 제공할 수 있다.
상기 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 적근에서 많이 존재하는 미오신 중쇄(myosin heavy chain; MyHC) 타입 I 및 타입 IIa 근섬유 발현을 유지 및 증가시키는데 필수적이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 적근 증진용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 적근 감소 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 약학조성물은 미오신 MyHC 타입 I 및 타입 IIa 근섬유의 발현을 증가시켜 적근양을 증진 또는 유지시킬 수 있다.
상기 적근(red muscle, slow twitch muscle)은 마이오글로빈(myoglobin)과 미토콘드리아의 함량이 많아 적색을 나타내는 근육으로 백근보다 흥분성이나 수축속도는 낮으나 지속적으로 천천히 운동하여 지근(slow muscle)이라고 부른다.
적근은 모세혈관이 발달해 있고 미토콘드리아가 많이 분포되어 있어 에너지 소모율이 높다. 가벼운 동작의 반복을 통해 발달되며 유산소성 장거리 운동에 주로 사용되는 근육이다.
특히, 적근이 발달할 경우 체지방에서 에너지원을 얻어 사용하는 기능이 증가하므로 공복 시에도 혈당이 안정할 수 있으며 또한 지방소모가 크므로 고칼로리 식사를 하는 현대인이 꼭 발달시켜야 하는 근육이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 정상 생쥐와 TIS21 유전자 적중 생쥐의 뒷다리 종아리에서 각각 장지근(gastrocnemius; GA), 가자미근판(soleus; Sol), 앞정강근(tibialis anterior; TA), 장지신근(extensor digitorum longus; EDL)과 같은 4가지 종류의 근육을 채취하고, RNA를 수집한 후, Real-time PCR을 수행한 결과, 도 1과 같이 TIS21 발현이 4가지 정상 마우스의 근육 중 적근을 대표하는 가자미근판(Sol)에서 다른 근육들보다 2배 이상 높게 나타남을 발견하였다.
또한, 정상생쥐와 TIS21 유전자적중 생쥐의 가자미근판(Sol)에서 MyHC의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과, 도 2와 같이 TIS21 유전자적중 생쥐의 가자미근판에서 적근의 대표적인 MyHC 1, MyHC 2a, 및 미오글로빈(myoglobin), MEF2c의 mRNA 발현이 현저히 감소되는 것이 확인되었다.
또한, 근육아세포 (C2C12)와 TIS21-HA를 발현하는 아데노바이러스를 이용하여 TIS21 유전자 과발현을 시도하여 MyHC 단백질의 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 4와 같이 C2C12 세포에 아데노바이러스를 이용하여 TIS21을 과발현시키면 적근에서 발현되는 MyHC 타입 1 단백질양의 현저한 증가를 확인하였다.
상기 결과로부터 TIS21 유전자 발현이 적근형성에 중요한 역할을 하는 것이 확인됨에 따라, TIS21 유전자 발현 조절을 통하여 적근형성을 증진시켜, 근육 내 에너지대사의 변화 및 개체노화 시 발견되는 적근감소 현상을 예방 또는 치료할 수 있음이 확인되었다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 가축 육질형성용 사료조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 근육세포에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 세포에서 TIS21 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 상기 TIS21 발현 또는 활성 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 적근 감소 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시 예 1> 백근 및 적근에서 TIS21 유전자 발현 수준 확인
정상생쥐와 TIS21 유전자적중 생쥐의 뒷다리 종아리에서 각각 장지근(gastrocnemius; GA), 가자미근판(soleus; Sol), 앞정강근(tibialis anterior; TA), 장지신근(extensor digitorum longus; EDL)과 같은 4가지 종류의 근육을 채취하였다. 가자미근판(Sol)은 MyHC 타입 I 및 타입 IIa 근섬유가 주를 이루는 대표적인 적근이며, 장지신근(EDL)는 MyHC 타입 IIb가 많이 발현되는 대표적인 백색근이다.
생쥐에서 채취된 4종류의 근육에 각각 RNA 용해 용액을 넣고 bead beater을 이용하여 조직을 파쇄하였다. 그 후 이소프로판올(isopropanol)을 이용하여 RNA를 수집한 후 oligo-dT를 이용하여 cDNA를 합성하고, 각 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 Real-time PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 1과 같이 정상마우스의 4가지 근육 중 적근의 대표인 가자미근판(Sol)에서 TIS21 발현이 다른 근육들보다 2배 이상 높게 측정되었다.
또한, 정상생쥐와 TIS21 유전자적중 생쥐의 가자미근판(Sol)에서 MyHC 들의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과, 도 2와 같이 TIS21 유전자적중 생쥐의 가자미근판에서 MyHC-타입 1, 타입-2a, 및 미오글로빈(myoglobin), MEF2c의 mRNA 발현이 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다.
<실시 예 2> 백근 및 적근에서 TIS21 단백질 발현 수준 확인
정상생쥐 (19개월)와 TIS21 유전자적중 생쥐의 장지근(GA)에서 MyHC 들의 단백질 발현 변화를 확인하였다. 생쥐에서 채취된 4종류의 근육에 각각 RIPA 용액을 첨가하여 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과, 도 3과 같이 TIS21 유전자적중 생쥐의 GA에서 적근의 대표적인 MyHC 타입 1 단백질의 발현감소가 확인되었다.
<실시 예 3> TIS21 유전자 과발현에 따른 근섬유형성 효과 확인
근육아세포 (C2C12)와 아데노바이러스-TIS21-HA를 이용하여 TIS21 유전자 과발현에 따른 MyHC 단백질의 변화를 확인하였다. 한 세포에 아데노바이러스-TIS21-HA을 3, 6, 12, 24 moi씩 감염시키고 6시간 후에 바이러스를 제거한 후 24시간 배양하였다. 단백질 용해 용액을 이용하여 세포단백질을 추출하고 단백질을 변성시킨 후, 아크릴아마이드 젤에 전기영동하고 나이트로셀룰로오즈 막에 단백질들을 옮긴 후 각각 특이적인 항체를 이용하여 전형적인 웨스턴 블롯 방법을 수행하였다.
그 결과, 도 4와 같이 아데노바이러스에 의해 TIS21이 농도별로 과발현된 C2C12 세포에서는 MyHC 타입 1 단백질 양의 증가를 확인할 수 있었다. 이에 따라, TIS21 유전자발현이 적근을 형성하는 섬유형성에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 골격근 섬유인 백근과 적근 중 TIS21 유전자가 적근에서 2배 이상 많이 발현되는 현상을 발견하였으며 TIS21 발현은 적근형성이 감소된 조직 또는 세포에서 적근형성을 유도하는 것을 확인하였다. 따라서 TIS21 발현 조절을 통하여 근육 내 에너지 대사과정과 동시에 노화 시 발견되는 적근 감소를 예방하거나 치료할 수 있는 가능성이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Increasing red muscle mass through TIS21 gene expression <130> ADP-2017-0171 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> mouse TIS21 <400> 1 Met Ser His Gly Lys Arg Thr Asp Met Leu Pro Glu Ile Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Gly Phe Leu Ser Ser Leu Leu Arg Thr Arg Gly Cys Val Ser Glu 20 25 30 Gln Arg Leu Lys Val Phe Ser Arg Ala Leu Gln Asp Ala Leu Thr Asp 35 40 45 His Tyr Lys His His Trp Phe Pro Glu Lys Pro Ser Lys Gly Ser Gly 50 55 60 Tyr Arg Cys Ile Arg Ile Asn His Lys Met Asp Pro Ile Ile Ser Lys 65 70 75 80 Val Ala Ser Gln Ile Gly Leu Ser Gln Pro Gln Leu His Arg Leu Leu 85 90 95 Pro Ser Glu Leu Thr Leu Trp Val Asp Pro Tyr Glu Val Ser Tyr Arg 100 105 110 Ile Gly Glu Asp Gly Ser Ile Cys Val Leu Tyr Glu Glu Ala Pro Val 115 120 125 Ala Ala Ser Tyr Gly Leu Leu Thr Cys Lys Asn Gln Met Met Leu Gly 130 135 140 Arg Ser Ser Pro Ser Lys Asn Tyr Val Met Ala Val Ser Ser 145 150 155 <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> human BTG2 <400> 2 Met Ser His Gly Lys Gly Thr Asp Met Leu Pro Glu Ile Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Gly Phe Leu Ser Ser Leu Leu Arg Thr Arg Gly Cys Val Ser Glu 20 25 30 Gln Arg Leu Lys Val Phe Ser Gly Ala Leu Gln Glu Ala Leu Thr Glu 35 40 45 His Tyr Lys His His Trp Phe Pro Glu Lys Pro Ser Lys Gly Ser Gly 50 55 60 Tyr Arg Cys Ile Arg Ile Asn His Lys Met Asp Pro Ile Ile Ser Arg 65 70 75 80 Val Ala Ser Gln Ile Gly Leu Ser Gln Pro Gln Leu His Gln Leu Leu 85 90 95 Pro Ser Glu Leu Thr Leu Trp Val Asp Pro Tyr Glu Val Ser Tyr Arg 100 105 110 Ile Gly Glu Asp Gly Ser Ile Cys Val Leu Tyr Glu Glu Ala Pro Leu 115 120 125 Ala Ala Ser Cys Gly Leu Leu Thr Cys Lys Asn Gln Val Leu Leu Gly 130 135 140 Arg Ser Ser Pro Ser Lys Asn Tyr Val Met Ala Val Ser Ser 145 150 155

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 적근 증진용 조성물.
  4. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 적근감소 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 약학조성물은 미오신 중쇄(myosin heavy chain; MyHC) 타입 I 및 타입 IIa 근섬유의 발현을 증가시켜 적근 양을 유지 또는 증진시키는 것을 특징으로 하는 적근감소 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TIS21 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 적근 증진용 가축 사료조성물.
  7. 시험관 내에서 근육세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질이 처리된 세포에서 TIS21 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및
    상기 TIS21 발현 또는 활성 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 적근 감소 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
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