KR20170011382A

KR20170011382A - 근육 소모성 질환과 관련된 Prmt7 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170011382A
Application number: KR1020150103937A
Authority: KR
Inventors: 강종순; 이혜진; 정현주
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2017-02-02

Abstract

본 발명은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 근육 소모성 질환 치료용 및/또는 근 지구력 증진용 조성물에 관한 것이다. 상기 Prmt7 결손에 의한 근육량, 근육 재생력 및 근육 줄기세포 분화능의 감소, 및 산화성 근섬유량 감소에 의한 근 지구력 저하를 확인하였는바, 근육 소모성 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을뿐 아니라, 근 지구력 증진에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

근육 소모성 질환과 관련된 Prmt7 유전자 및 이의 용도 {Prmt7 Gene related to muscle wasting disease and use thereof}

본 발명은 근육 소모성 질환과 관련된 Prmt7 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 근육 소모성 질환 치료용 및/또는 근 지구력 증진용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 65-70세 인구 중 약 24%는 노화에 의한 근위축을 경험하고 있으며, 20% 정도는 근 기능 상실에 따른 어려움을 겪고 있는 것으로 알려져 있다. 신체 활동량 감소, 기능 장애, 암, 비만, 제2형 당뇨병, 및 노화 등이 진행될수록 근육량과 운동 능력은 감소하게 되며, 이로 인해 삶의 질은 현격히 저하된다. 특히, 우리나라는 급속한 경제 발전, 의료기술의 발달, 및 영양 상태의 개선과 함께 빠른 속도로 고령화 사회에 들어서고 있는바, 근위축증과 같은 근육 소모성 질환의 치료에 대한 관심이 증대되고 있다.

이에, 근육 소모성 질환을 효과적으로 치료하는 방법에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다(한국 특허공개번호 10-2012-0009726). 일례로서, 성장 호르몬(GH) 투여를 통한 근육의 질량을 증진시키는 방법이 있으나, 이러한 치료는 매우 고가이며 평균 수명의 단축 등과 같은 바람직하지 않은 몇몇 부작용을 발생시켰다. 또한, 병상에 누워있는 환자에게는 매우 부적절한 방법으로서, 근육 소모성 질환의 치료를 위한 다양한 접근이 필요한 실정이다.

인체 여러 기관들 중 근육은 외부자극 및 스트레스 상황에 자주 노출되는 기관으로서, 근육의 완벽한 재생 과정이 이루어진다면 효과적인 치료가 가능하다. 골격근의 재생과정은 근모세포 및 근육 위성세포가 증식, 분화가 일어나야 하고, 동시에 휴지기 상태의 줄기세포로 다시 돌아와 세포 수가 유지되어야 한다. 또한, 이러한 기능을 유지함에 있어서, 세포 내 신호전달 네트워크에 의한 타겟 유전자의 발현은 필수적인바, 상기 타겟 유전자를 표적으로 하는 치료법은 보다 근본적인 해법이 될 수 있을 것이다.

한편, Protein arginine methyltransferase(Prmts)는 히스톤(histone)과 비히스톤(non-histone)의 아르기닌(arginine) 잔기에 대칭 및 비대칭적으로 메틸화를 매개하는 효소로서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 특히, Prmt7은 아르기닌 잔기에 2개의 메틸기를 대칭적으로 붙일 수 있는 효소로서 damage agent에 의한 세포독성반응을 조절하는 유전자로써 처음에 알려졌다. 이후, NIH3T3 세포에서 Prmt7은 BRG1-hSWI/SNF 크로마틴 복합체와 결합함으로써 H2AR3 및 H3R3에 특이적으로 메틸화시키며, DNA 복구 유전자들을 조절한다고 알려진바 있으며, 유방암 세포의 metastasis를 증가시키고, 신경세포에서 Prmt7의 H4R3 이중메틸화로 인한 MLL의 H3K4 삼중메틸화의 저해가 신경 분화의 감소를 야기한다는 점 등이 추가적으로 보고된바 있다. 그러나 이러한 연구에도 불구하고, Prmt7의 in vivo 및 in vitro에서의 역할에 대한 연구는 아직 미비하다.

이에, 본 발명자들은 근육 소모성 질환의 치료를 위한 표적 유전자로서, Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)을 최초로 규명하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 결손 마우스에서 Prmt7 결손에 의한 근육량, 근육 재생력 감소 등의 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 소모성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근 지구력 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) in vitro 상에서 근육 세포에 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 후보물질을 처리한 근육 세포에서 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 Prmt7의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보물질을 근육 소모성 질환 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는 근육 소모성 질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 소모성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 Prmt7 단백질은 서열번호 1로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 Prmt7 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 근육 소모성 질환은 근위축증(muscular atrophy) 또는 근감소증(Sarcopenia)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 근육세포의 분화 또는 재생을 촉진할 수 있다.

본 발명은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근 지구력 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 산화성 근섬유의 함량을 증진시킬 수 있다.

본 발명은 a) in vitro 상에서 근육 세포에 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 후보물질을 처리한 근육 세포에서 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 Prmt7의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보물질을 근육 소모성 질환 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 근육 소모성 질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육 소모성 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 조성물의 근육 소모성 질환의 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 조성물은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하며, 상기 Prmt7 결손에 의한 근육량, 근육 재생력, 및 근육 줄기세포 분화능의 감소를 확인하였다. 또한, Prmt7 결손에 의한 산화성 근섬유량 감소 및 근 지구력 저하를 확인하였는바, 본 발명은 근육 소모성 질환의 치료 및 근 지구력 증진에 유용하게 사용될 수 있을 것을 기대된다. 또한, Prmt7 결손 생쥐에서의 조기 노화 관련 근육량 감소 및 근력 감소 효과에 미루어 볼 때, Prmt7이 근육의 노화 방지에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 다양한 장기에서 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)의 발현량을 확인한 결과이다.
도 2는 생체 조건에 따른 Prmt7의 발현량 변화를 확인한 것으로서, (A) 노화, (B) 활동 장애, (C) 당뇨 및 비만 질환 모델에서 Prmt7의 발현량을 나타낸 결과이다.
도 3은 Prmt7 결손 마우스(Prmt 7 (-/-)) 및 Prmt7 비 결손 마우스(Prmt 7 (+/+))간 근육의 무게를 비교한 것으로서, (A) 장딴지근(Gastrocnemius, Gas)) 및 앞정강이근(Tibialis Anterior, TA), (B) 장지신근(Extensor Digitorium Longus, EDL), 및 족저근(Soleus, Sol)의 무게를 나타낸 결과이다.
도 4는 prmt7 결손 마우스 및 Prmt7 비 결손 마우스간 근육의 단면적을 비교한 결과이다.
도 5는 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 근섬유(myofiber)의 수를 비교한 것으로서, (A) 6개월령 마우스의 근섬유 수, (B) 21개월령 마우스의 근섬유 수, (C) 평균 근섬유 수를 나타낸 결과이다.
도 6은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 근 재생력을 비교한 것으로서, (A) H&E(Hematoxillin & Eosin) 염색, (B) 형광 염색으로 확인한 결과이다.
도 7은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 골격근 재생 유도 후 7일째, Eosin 염색된 근섬유의 수를 비교한 결과이다.
도 8은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 근섬유의 수를 비교한 것으로서, (A) 골격근 재생 유도 후 7일째, (B) 골격근 재생 유도 후 14일째의 근섬유의 수를 나타낸 결과이다.
도 9는 Prmt7이 결손된 근육 줄기세포에서, (A) Prmt7의 발현 양상 및 (B) 미오신 중쇄 (myosin heavy chain, MHC)를 통해 분화능의 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 Prmt7이 결손된 근육 줄기세포 및 Prmt7이 결손되지 않은 근육 줄기세포간 근관세포(myotube)의 비율을 비교한 결과이다.
도 11은 Prmt7이 결손된 근육 줄기세포 및 Prmt7이 결손되지 않은 근육 줄기세포간 분화능을 비교한 것으로서, (A) 웨스턴 블롯(Western blot), (B) 형광 염색으로 확인한 결과이다.
도 12는 Prmt7이 결손된 근육 줄기세포 및 Prmt7이 결손되지 않은 근육 줄기세포간 증식능을 비교한 것으로서, (A) 세포의 수, (B) 시간의 경과에 따른 세포수 변화를 나타낸 결과이다.
도 13은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 근육 기능 조절 인자의 발현량을 비교한 것으로서, (A) 앞정강이근(TA), (B) 긴발가락폄근(EDL)에서의 발현량을 나타낸 결과이다.
도 14는 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 미토콘드리아 기능 조절 인자인 Pgc1α 및 이와 관련된 유전자의 발현량을 비교한 것으로서, (A) 앞정강이근(TA), (B) 긴발가락폄근(EDL)에서의 발현량을 나타낸 결과이다.
도 15는 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 미토콘드리아 양을 비교한 것으로서, (A) transmission electron microscopy, (B) qRT-PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 16은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 산화성 근섬유량을 육안으로 비교한 것으로서, (A) 마우스 외관 및 해부 전 다리 근육, (B) 다리 근육별로 확인한 결과이다.
도 17은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 미오신 중쇄 type Ⅰ, Ⅱa, Ⅱx, 및 Ⅱb의 발현량을 비교한 결과이다.
도 18은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 중쇄 type Ⅱa 및 Ⅱb의 발현량을 비교한 것으로서, (A) 형광 염색 결과, (B) qRT-PCR을 통한 미오신중쇄 type Ⅱa의 발현량, (C) RT-PCR을 통한 미오신중쇄 type Ⅱb의 발현량을 나타낸 결과이다.
도 19는 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 미토콘드리아 전자전달계의 활성을 비교한 것으로서, (A) Succinate dehydrogenase (SDH) 및 Nicotinamideadenine dinucleotide tetrazolium reductase (NADH-TR) 염색 결과, (B) NADH-TR 양성 근섬유량을 나타낸 결과이다.
도 20은 prmt7 결손 마우스 및 prmt7 비 결손 마우스간 근지구력을 비교한 것으로서, (A) Treadmill 활동량, (B) Grip test, (C) 운동 후 혈중 젖산 농도를 나타낸 결과이다.

본 발명자들은, 근육 소모성 질환의 치료를 위한 표적 유전자로서, Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)를 최초로 규명하였으며, Prmt7 결손 마우스를 이용하여, Prmt7 결손에 의한 근육량, 근육 재생력 및 근육 줄기세포 분화능의 감소, 및 산화성 근섬유량 감소에 의한 근 지구력 저하를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 소모성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "근육 소모성 질환"은 근육량의 점진적 손실 등의 증상을 수반하는 질환 또는 상태를 의미한다. 상기 질환은 유전적 소인, 고혈압, 내당능장애, 당뇨, 비만, 이상지질혈증, 아테롬성경화증 및 심혈관 질환과 같은 연령-관련 질환; 암, 자가면역질환, 감염성 질환, AIDS, 만성 염증질환, 관절염, 영양실조, 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 구루병, 만성 하부 척추통증, 말초신경손상, 중추신경손상 및 화학적 손상과 같은 질환 등의 만성 질환; 장기 고정과 같은 상태, 골절 또는 외상과 같은 무력감과 같은 상태, 수술 후 침상 요양; 및 노화과정에 따른 골격 근육량 및 강도의 진행성 감소 등의 다양한 원인에 기인할 수 있다. 근육 소모성 질환은 약화된 신체 상태를 유발하게 되어 건강상태의 악화 또는 무능한 신체 수행력의 건강 상태를 야기할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게 근위축증(muscular atrophy) 또는 근감소증(Sarcopenia)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 근육 소모성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 근육 소모성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서, Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)은 히스톤(histone)과 비히스톤(non-histone)의 아르기닌(arginine) 잔기에 대칭 및 비대칭적으로 메틸화를 매개하는 효소로서, damage agent에 의한 세포독성 반응 조절, 유방암 세포의 metastasis 증가, 신경 분화의 감소 유도 등의 기능이 알려져 있다. 구체적으로 본 발명자들은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)의 발현을 조절함으로서, 근육세포의 분화 또는 재생을 촉진하여 근위축증과 같은 근육 소모성 질환의 증상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다. 바람직하게 상기 Prmt7 단백질은 서열번호 1로, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어질 수 있으며, 상기 서열의 생물학적 균등물들을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근 지구력 증진용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 Prmt7의 발현을 조절하여 산화성 근섬유의 함량을 증진시킴으로써, 근 지구력을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "근섬유"는 근육 조직을 구성하는 수축성을 가진 섬유상 세포를 의미한다. 모든 근섬유는 동일한 대사 능력이나 기능을 갖는 것이 아니며, 크게 산화성 근섬유와 해당성 근섬유로 분류할 수 있다. 이 중에서 산화성 근섬유는 오랫동안 수축을 가능하게 하며, 피로가 느리게 오는 빨간 지근을 말하며, 미토콘드리아의 함량이 높고 지속력이 있는바, 상기 산화성 근섬유의 함량이 증진될수록 근 지구력은 향상될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 골격근, 심장, 및 갈색지방에서 Prmt7의 높은 발현을 확인하였고, 이러한 발현은 노화, 활동 장애, 당뇨, 및 비만이 진행될수록 감소함을 확인하였으며, prmt7 결손 마우스에서 근육의 무게 및 단면적이 감소함을 확인하였다(실시예 1 내지 2 참조). 또한, prmt7 결손 마우스에서 골격근 재생력의 감소, prmt7이 결손된 근육 줄기세포에서 증식력의 증가 및 분화능의 감소를 확인하였다(실시예 3 내지 4 참조). 아울러, prmt7 결손 마우스에서 미토콘드리아 조절인자의 감소, 산화성 근섬유량 감소, 및 이에 따른 근 지구력 감소를 확인하였는바, prmt7 유전자와 근육 소모성 질환 및/또는 근 지구력간 관련성을 실험적으로 확인하였다(실시예 5 내지 7 참조).

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육 소모성 질환 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, a) in vitro 상에서 근육 세포에 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 후보물질을 처리한 근육 세포에서 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 Prmt7의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보물질을 근육 소모성 질환 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 근육 소모성 질환 치료 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서, Prmt7의 발현 또는 활성을 측정하는 단계는 Prmt7 유전자의 발현에 의해 생성된 RNA 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 바람직하게 RNA의 발현량은 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting) 등을 통해 측정할 수 있고, 단백질의 발현량은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 또는 면역염색법(immunofluorescence) 등을 통해 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 다양한 장기 또는 생체 조건에서의 Prmt7의 발현 양상 확인

본 실시예에서는, 다양한 장기 또는 노화 등과 같은 생체 조건의 변화에 따른 Prmt7 mRNA발현을 qRT-PCR로 분석하였다. 구체적으로, 3개월령 마우스의 간, 소장, 위, 폐, 신장, 비장, 이자, 골격근, 심장, 백색지방, 및 갈색지방 등에서 Prmt7 발현을 비교하였으며, 5, 10, 28개월령 마우스를 이용하여 노화에 의한 대퇴사두근(Quadriceps)에서의 Prmt7 발현을 확인하였다. 또한, Hanging suspension 실험을 통해 생쥐의 다리 근육 사용을 제한시킨 활동 장애, 당뇨, 및 비만 질환 모델의 장딴지근(Gastrocnemius)에서 Prmt7의 발현을 확인하였다. 본 실험에서 대조군으로는 prmt7 비 결손 마우스(prmt 7 +/+)를 이용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 다른 장기와 비교하여 골격근(mu), 심장(he), 및 갈색지방(wa)에서 Prmt7의 높은 발현을 확인하였다. 또한, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 노화가 진행 될수록 Prmt7의 발현이 감소하였으며, 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, 활동 장애, 당뇨, 및 비만 질환 모델에서 Prmt7의 발현이 감소하였다. 상기 결과는, Prmt7는 골격근 또는 이를 포함하는 장기에서 높게 발현되는 경향을 보이며, 노화, 활동 장애 등과 같이 근육의 감소가 진행됨에 따라 Prmt7 발현 역시 감소함을 의미한다.

실시예 2. prmt7 결손 마우스에서 근육의 감소 확인

본 실시예에서는, 상기 실시예 1의 결과를 토대로, prmt7 결손 마우스를 이용하여 prmt7의 결손이 근육 감소에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 6개월령 또는 21개월령 prmt7 결손 마우스(prmt 7 (-/-))의 다리 근육(장딴지근(Gastrocnemius, Gas)), 앞정강이근(Tibialis Anterior, TA), 장지신근(Extensor Digitorium Longus, EDL), 족저근(Soleus, Sol))의 무게를 측정하여 비교하였으며, 근육의 단면적, 및 근섬유(myofiber)의 수를 측정하였다. 본 실험에서는 대조군으로는 6개월령 또는 21개월령 prmt7 비 결손 마우스(prmt 7 (+/+))를 이용하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 6개월령 prmt7 결손 마우스에서, 대조군과 비교하여 근육의 무게는 큰 차이가 없었으며, 단면적은 보다 증가하였던 반면, 21개월령 prmt7 결손 마우스에서는, 대조군과 비교하여 근육의 무게 및 단면적 모두 감소하였음을 확인하였다. 특히, 장딴지근(Gas), 장지신근(EDL), 및 족저근( Sol)의 무게 감소가 현저하였다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 근섬유의 수 역시 상기 근육의 무게 및 단면적의 결과와 일관성 있게 prmt7 결손 마우스에서 적은 수가 측정되었다. 상기 결과는 prmt7이 결손된 경우 이른 시기에 근육 감소가 진행되는바, 근 위축증, 근 감소증과 같은 근육 소모 관련 질환과 밀접한 관련이 있음을 나타낸다.

실시예 3. prmt7 결손 마우스에서 골격근 재생력 감소 확인

본 실시예에서는, prmt7 결손 마우스(prmt 7 (-/-))를 이용하여 prmt7의 결손이 골격근 재생능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로 prmt7 결손 마우스의 앞정강근(Tibialis anterior)에 20μM의 Cardiotoxin을 25μl씩 주입하여 인위적으로 재생을 유도하였다. 이 후, H&E(Hematoxillin & Eosin) 염색을 통해 시간의 경과(0일, 4일, 7일, 16일)에 따른 조직의 변화를 확인하였으며, Laminin(녹색)과 새롭게 형성되어 근섬유에 발현되는 embryonic myosin(적색)을 형광 염색을 통해 확인하였다. 또한, 골격근 재생 유도를 한 날로부터 7일 또는 14일 경과 후, 근섬유 수의 변화를 측정하였다. 본 실험에서는 대조군으로는 prmt7 비 결손 마우스(prmt7 (+/+))를 이용하였다.

그 결과, 도 6 내지 8에 나타낸 바와 같이, Prmt7 결손 마우스에서, 대조군과 비교하여 근 재생력이 감소하였고, 새로운 근섬유의 생성이 정상보다 지연되었으며, 재생된 근섬유의 단면적 및 수 역시 감소하였음을 확인하였다. 상기 결과는, Prmt7은 골격근의 재생 및 유지에 중요한 역할을 함을 의미한다.

실시예 4. prmt7이 결손된 근육 줄기세포에서 증식력 증가 및 분화능 감소 확인

본 실시예에서는, prmt7의 결손이 근육 줄기세포에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로 긴발가락폄근(Extensor digitorum longus)에 Collagenase를 이용하여 근섬유를 분리 배양하였으며, 형광 염색법을 통해 prmt7의 발현 양상을 확인하였다. 또한, Collagenase/Dispase를 이용하여 근육 줄기세포를 분리 배양 하였으며, Prmt7이 결손 된 근육 줄기세포(prmt7 (-/-))의 증식 및 분화를 형광 염색과 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 확인하였다. 대조군으로는 Prmt7이 결손되지 않은 근육줄기세포(prmt7 (+/+))를 이용하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, pax7이 발현되는 근육 줄기세포에서 Prmt7이 발현되는 것을 확인하였으며, Prmt7이 결손된 근육 줄기세포에서, 미오신 중쇄 (myosin heavy chain, MHC)의 감소를 통해 대조군과 비교하여 분화능이 감소되어 있음을 확인하였다. 또한, 도 10 내지 12에 나타낸 바와 같이, Prmt7이 결손된 근육 줄기세포에서, 대조군과 비교하여 줄기세포의 증식력은 증가한 반면, 분화능은 감소함을 확인하였다. 상기 결과는, Prmt7 결손 마우스의 골격근 재생력 감소는 근육줄기세포의 과도한 증식 및 분화능 저하로부터 비롯되며, 이에 따라 근위축증과 같은 근육소모질환이 조기에 발병하게 됨을 의미한다.

실시예 5. prmt7 결손 마우스에서 근육 또는 미토콘드리아 기능 조절인자의 감소 확인

본 실시예에서는, prmt7 결손 마우스(prmt 7 (-/-))를 이용하여 prmt7의 결손이 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로 prmt7 결손 마우스의 앞정강이근(TA)과 긴발가락폄근(EDL)에서 다양한 근육 기능 조절 인자(Mef2c, Fndc5, Myoglobin, Mcad, Mtco1, Sdhb, Cox7a1, Ucp2, Vegfa, Vegfb, Glut4, Pepck, aP2, Fabp3, VLDLR, 및 Cide A)의 발현을 확인하였으며, 특히, 미토콘드리아의 합성 및 기능을 조절하는 전사인자인 Pgc1α와 관련 유전자인 Pgc1β, PPARα, PPARγ의 발현을 qRT-PCR을 통해 분석하였다. 또한, transmission electron microscopy 분석 및 qRT-PCR을 통해 미토콘드리아 양의 변화를 확인하였다. 본 실험에서는 대조군으로는 prmt7 비 결손 마우스(prmt7 (+/+))를 이용하였다.

그 결과, 도 13 및 14에 나타낸 바와 같이, prmt7 결손 마우스에서, 대조군과 비교하여 다양한 근육 기능 조절 인자들이 감소하는 경향성을 보였으며, Pgc1α와 관련 유전자인 Pgc1β, PPARα, 및 PPARγ의 발현도 현저하게 감소함을 확인하였다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, prmt7 결손 마우스의 미토콘드리아의 양 역시 감소함을 실험적으로 확인하였다. 상기 결과는, Prmt7은 미토콘드리아의 기능 유지에 중요한 역할을 함을 의미한다.

실시예 6. prmt7 결손 마우스에서 산화성 근섬유량 감소 확인

본 실시예에서는, prmt7 결손 마우스(prmt 7 (-/-))를 이용하여 prmt7의 결손이 산화성 근섬유량에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 4개월령 Prmt7 결손 마우스의 외관 및 다리 근육의 변화(장딴지근(Gastrocnemius, Gas)), 앞정강이근(Tibialis Anterior, TA), 장지신근(Extensor Digitorium Longus, EDL), 족저근(Soleus, Sol))을 육안으로 확인하였으며, 산화성 근섬유인 미오신 중쇄 type Ⅰ, Ⅱa(Myh type Ⅰ, Ⅱa) 및 해당성 근섬유인 미오신 중쇄 type Ⅱx, Ⅱb(Myh type Ⅱx, Ⅱb)의 증감을 qRT-PCR 및 형광 염색법을 통해 확인하였다. 또한, Succinate dehydrogenase (SDH), Nicotinamideadenine dinucleotide tetrazolium reductase (NADH-TR) 조직염색을 통해 미토콘드리아 전자전달계의 활성도를 측정하였다. 본 실험에서는 대조군으로는 prmt7 비 결손 마우스(prmt7 (+/+))를 이용하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, prmt7 결손 마우스에서, 대조군과 비교하여 붉은색을 띄는 산화성 근섬유가 감소한 반면, 흰색을 띄는 해당성 근섬유는 증가함을 확인하였다. 또한, 도 17 내지 19에 나타낸 바와 같이, prmt7 결손 마우스에서, 미토콘드리아 양이 비교적 높고 지속력이 있는 산화성 근섬유인 미오신 중쇄 type Ⅰ, Ⅱa(Myh type Ⅰ, Ⅱa)의 비율이 줄어들고, 미토콘드리아 양이 낮고, 순간적인 힘을 내는 해당성 근섬유인 미오신 중쇄 type Ⅱx, Ⅱb(Myh type Ⅱx, Ⅱb)가 증가하였으며, 이에, 미토콘드리아 전자전달계의 활성이 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 prmt7은 미토콘드리아의 활성 및 산화성 근섬유량 유지에 중요한 역할을 함을 의미한다.

실시예 7. prmt7 결손 마우스에서 근 지구력 저하 확인

본 실시예에서는, 상기 실시예 5 및 6의 결과를 토대로 prmt7 결손 마우스(prmt 7 (-/-))의 근지구력 저하를 확인하고자 하였다. 구체적으로 골격근의 기능을 관찰하기 위해 Treadmill 및 Grip test를 실시하였으며, 운동 후 혈중 젖산 농도의 변화를 측정하였다. 본 실험에서는 대조군으로는 prmt7 비 결손 마우스(prmt7 (+/+))를 이용하였다.

그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, prmt7 결손 마우스에서, 대조군과 비교하여 시간의 경과에 따라 골격근의 지속력이 떨어짐을 확인하였으며, 운동 후 혈중 젖산 농도가 증가함을 확인하였다. 상기 결과는 prmt7의 결손은 미토콘드리아의 활성 및 산화성 근섬유량을 감소시킴으로써, 근 지구력을 저하시킴을 나타낸다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Prmt7 Gene related to muscle wasting disease and use thereof <130> R-2014-0697-KR-1_PB14-12395 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 692 <212> PRT <213> Prmt7 protein <400> 1 Met Lys Val Phe Cys Gly Arg Ala Asn Pro Thr Thr Gly Ser Leu Glu 1 5 10 15 Trp Leu Glu Glu Asp Glu His Tyr Asp Tyr His Gln Glu Ile Ala Arg 20 25 30 Ser Ser Tyr Ala Asp Met Leu His Asp Lys Asp Arg Asn Ile Lys Tyr 35 40 45 Tyr Gln Gly Ile Arg Ala Ala Val Ser Arg Val Lys Asp Arg Gly Gln 50 55 60 Lys Ala Leu Val Leu Asp Ile Gly Thr Gly Thr Gly Leu Leu Ser Met 65 70 75 80 Met Ala Val Thr Ala Gly Ala Asp Phe Cys Tyr Ala Ile Glu Val Phe 85 90 95 Lys Pro Met Ala Glu Ala Ala Val Lys Ile Val Glu Arg Asn Gly Phe 100 105 110 Ser Asp Lys Ile Lys Val Ile Asn Lys His Ser Thr Glu Val Thr Val 115 120 125 Gly Pro Asp Gly Asp Leu Pro Cys Arg Ala Asn Ile Leu Ile Thr Glu 130 135 140 Leu Phe Asp Thr Glu Leu Ile Gly Glu Gly Ala Leu Pro Ser Tyr Glu 145 150 155 160 His Ala His Lys His Leu Val Gln Glu Asp Cys Glu Ala Val Pro His 165 170 175 Arg Ala Thr Val Tyr Ala Gln Leu Val Glu Ser Arg Arg Met Trp Ser 180 185 190 Trp Asn Lys Leu Phe Pro Val Arg Val Arg Thr Ser Leu Gly Glu Gln 195 200 205 Val Ile Val Pro Pro Ser Glu Leu Glu Arg Cys Pro Gly Ala Pro Ser 210 215 220 Val Cys Asp Ile Gln Leu Asn Gln Val Ser Pro Ala Asp Phe Thr Val 225 230 235 240 Leu Ser Asp Val Leu Pro Met Phe Ser Val Asp Phe Ser Lys Gln Val 245 250 255 Ser Ser Ser Ala Ala Cys His Ser Arg Gln Phe Val Pro Leu Ala Ser 260 265 270 Gly Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Trp Trp Asp Ile Glu Met Asp Pro 275 280 285 Glu Gly Lys Ile Lys Cys Thr Met Ala Pro Phe Trp Ala Gln Thr Asp 290 295 300 Pro Gln Glu Leu Gln Trp Arg Asp His Trp Met Gln Cys Val Tyr Phe 305 310 315 320 Leu Pro Gln Glu Glu Pro Val Val Gln Gly Ser Pro Arg Cys Leu Val 325 330 335 Ala His His Asp Asp Tyr Cys Val Trp Tyr Ser Leu Gln Arg Thr Ser 340 345 350 Pro Asp Glu Asn Asp Ser Ala Tyr Gln Val Arg Pro Val Cys Asp Cys 355 360 365 Gln Ala His Leu Leu Trp Asn Arg Pro Arg Phe Gly Glu Ile Asn Asp 370 375 380 Gln Asp Arg Thr Asp His Tyr Ala Gln Ala Leu Arg Thr Val Leu Leu 385 390 395 400 Pro Gly Ser Val Cys Leu Cys Val Ser Asp Gly Ser Leu Leu Ser Met 405 410 415 Leu Ala His His Leu Gly Ala Glu Gln Val Phe Thr Val Glu Ser Ser 420 425 430 Val Ala Ser Tyr Arg Leu Met Lys Arg Ile Phe Lys Val Asn His Leu 435 440 445 Glu Asp Lys Ile Ser Val Ile Asn Lys Arg Pro Glu Leu Leu Thr Ala 450 455 460 Ala Asp Leu Glu Gly Lys Lys Val Ser Leu Leu Leu Gly Glu Pro Phe 465 470 475 480 Phe Thr Thr Ser Leu Leu Pro Trp His Asn Leu Tyr Phe Trp Tyr Val 485 490 495 Arg Thr Ser Val Asp Gln His Leu Ala Pro Gly Ala Val Val Met Pro 500 505 510 Gln Ala Ala Ser Leu His Ala Val Ile Val Glu Phe Arg Asp Leu Trp 515 520 525 Arg Ile Arg Ser Pro Cys Gly Asp Cys Glu Gly Phe Asp Val His Ile 530 535 540 Met Asp Asp Met Ile Lys His Ser Leu Asp Phe Arg Glu Ser Arg Glu 545 550 555 560 Ala Glu Pro His Pro Leu Trp Glu Tyr Pro Cys Arg Ser Leu Ser Lys 565 570 575 Pro Gln Glu Ile Leu Thr Phe Asp Phe Gln Gln Pro Ile Pro Gln Gln 580 585 590 Pro Met Gln Ser Lys Gly Thr Met Glu Leu Thr Arg Pro Gly Lys Ser 595 600 605 His Gly Ala Val Leu Trp Met Glu Tyr Gln Leu Thr Pro Asp Ser Thr 610 615 620 Ile Ser Thr Gly Leu Ile Asn Pro Ala Glu Asp Lys Gly Asp Cys Cys 625 630 635 640 Trp Asn Pro His Cys Lys Gln Ala Val Tyr Phe Leu Ser Thr Thr Leu 645 650 655 Asp Leu Arg Val Pro Leu Asn Gly Pro Arg Ser Val Ser Tyr Val Val 660 665 670 Glu Phe His Pro Leu Thr Gly Asp Ile Thr Met Glu Phe Arg Leu Ala 675 680 685 Asp Thr Leu Ser 690 <210> 2 <211> 2269 <212> DNA <213> Prmt7 gene <400> 2 ggcggcgagt ggatcgcttc ccacagcggg cattataatt gattaggttt ctgatatcaa 60 gatatcttcc taagaagtaa attaacaagc ctcacgtttc tgtgcaaaca ctgaggagcc 120 agttggcacc atgaaggtct tctgtggccg tgccaatcct accacgggat ccctggagtg 180 gctggaggag gatgaacact atgattacca ccaggagatt gccaggtcat cctatgccga 240 catgctacat gacaaagaca gaaatataaa atactaccag ggtatccggg cagctgtgag 300 cagggtgaaa gacagaggac agaaggcctt ggttcttgac attggcactg gcacaggcct 360 cttgtcaatg atggcagtta ctgcaggggc tgacttctgc tatgctatcg aggtttttaa 420 gcctatggct gaggctgctg tgaagattgt ggagaggaat ggcttcagtg ataagattaa 480 agtcattaac aagcactcca ctgaggtgac agtcggacca gatggtgact tgccgtgtcg 540 tgctaacatt ctgatcacgg agctgtttga cacagagctg attggggagg gagcgctgcc 600 ctcttatgag catgcacaca agcatcttgt ccaggaagac tgcgaggcag tgccacacag 660 ggcaactgtc tatgcccagc tggtggagtc ccgaaggatg tggtcctgga acaagctgtt 720 tcccgtccgt gtccggacga gtctaggcga gcaggtcatc gtccccccct cagaattgga 780 gaggtgtcct ggtgcgcctt cagtctgtga cattcagctg aaccaggtgt cgcctgctga 840 cttcactgtc ctcagtgatg tgctgccaat gttcagcgtg gacttcagca agcaagtcag 900 cagctcggca gcgtgccata gcaggcagtt tgtacctttg gcgtctggcc aagcacaggt 960 ggttctgtcc tggtgggaca ttgaaatgga ccctgagggc aagatcaagt gcaccatggc 1020 acccttttgg gcacagacag atccgcagga gcttcagtgg cgggaccact ggatgcagtg 1080 tgtgtacttc ctgccgcagg aggagcctgt tgtgcagggc tcaccccggt gcctggtagc 1140 ccaccatgat gactactgtg tgtggtacag ccttcagaga accagccctg atgagaacga 1200 cagcgcctac caagtgcgac ctgtgtgtga ctgtcaggct cacttgctct ggaaccggcc 1260 tcggtttgga gaaatcaatg atcaggacag aactgatcac tatgcccagg ccctgaggac 1320 tgtgctgctg ccaggtagcg tctgcctttg tgtgagtgat ggcagtctcc tctccatgct 1380 ggcccatcac ctcggagcgg agcaggtgtt tacagttgag agttcagtag cttcctatag 1440 actgatgaaa aggatcttca aggttaacca cttggaagat aaaatcagtg tcatcaataa 1500 acggcctgag ttgctgacag ctgcagacct ggagggcaag aaggtctccc tcctcctggg 1560 tgaacccttt ttcaccacca gcctgctgcc atggcacaac ctgtacttct ggtatgtccg 1620 tacctctgtg gaccagcacc tagcacctgg agctgtggtg atgcctcagg ctgcctcact 1680 gcatgccgtg attgtggagt tcagggacct gtggcggatc cggagtcctt gcggtgactg 1740 cgaaggtttt gatgtgcaca tcatggatga tatgatcaag cactccctgg atttccgaga 1800 gagcagagag gcagagccac acccactgtg ggaatacccc tgcagaagcc tctccaagcc 1860 tcaagagatc ctgacttttg atttccagca gcccatcccc caacagccta tgcaatccaa 1920 gggcacaatg gagctgacaa gacccgggaa gagccatggg gctgtcctgt ggatggagta 1980 tcagctcact ccagacagca cgatcagcac tggcctcata aaccctgcag aagacaaggg 2040 ggactgctgc tggaaccccc actgcaagca agctgtgtac ttcctcagca ccacgctgga 2100 tctcagagtg cctctgaatg gccctcggtc agtcagctat gttgtggagt ttcaccccct 2160 cactggagac atcaccatgg agtttaggct tgcagacacc ttgagctgat ctcttattga 2220 gaaataaaat ggccagcagg ctgcagactc tgaaaaaaaa aaaaaaaaa 2269

Claims

Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근육 소모성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 Prmt7 단백질은 서열번호 1로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 Prmt7 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 근육 소모성 질환은 근위축증(muscular atrophy) 또는 근감소증(Sarcopenia)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 근육세포의 분화 또는 재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 근 지구력 증진용 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 조성물은 산화성 근섬유의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
하기의 단계를 포함하는 근육 소모성 질환 치료 물질 스크리닝 방법:
a) in vitro 상에서 근육 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
b) 상기 후보물질을 처리한 근육 세포에서 Prmt7(Protein arginine methyltransferase 7)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
c) 비처리군과 비교하여 Prmt7의 발현 또는 활성을 증진시키는 후보물질을 근육 소모성 질환 치료 물질로 선정하는 단계.
제 8항에 있어서,
상기 근육 소모성 질환은 근위축증(muscular atrophy) 또는 근감소증(Sarcopenia)인 것을 특징으로 하는, 방법.