KR101919575B1 - 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단 방법, 및 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물 - Google Patents

참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단 방법, 및 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

일 양상에 다른 신규한 병원성 관련 단백질은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 진단하기 위해 이용될 수 있다. 상기 단백질은 한국의 우점종인 신갈나무의 주요 알레르겐이므로, 상기 단백질을 이용하여 참나무목의 꽃가루에 대한 알레르기를 진단한 결과는 신뢰도 및 타당도가 높다. 또한, 상기 단백질을 참나무목의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 이용할 수 있다.

Description

참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단 방법, 및 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물 {Compositions for diagnosis of allergy to Fagales plant pollen, methods for diagnosing of allergy to Fagales plant pollen, and composition for prevention or treatment of allergy to Fagales plant pollen}
신규한 병원성 관련 단백질, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물 및 키트, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단 방법, 및 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
21세기에 들어오면서 우리나라도 알레르기 비염과 알레르기 결막염 등의 알레르기 환자가 증가되면서 꽃가루에 감작된 환자가 증가하고 있다. 과거 30년간의 꽃가루 감작률 변화에 대한 연구 보고에 따르면 나무 꽃가루에 대한 감작률이 증가되었으며 목초 꽃가루와 잡초 꽃가루에 대해서는 변화가 없거나 감소되는 경향을 나타내었다.
많은 사람에게 꽃가루에 의한 질환을 일으키는 것은 바람으로 수분 작용 (pollination)하는 풍매화 (anemophilous) 식물의 꽃가루이다. 우리나라에서 대표적인 것은 참나무, 자작나무 등의 나무 꽃가루와 쑥, 돼지풀, 환삼덩굴 등의 잡초 꽃가루이다.
우리나라는 산림의 약 40%가 참나무속 나무로 이루어져 있다. 우리나라에서 참나무속의 개화기는 4 내지 5월이다. 참나무는 상당히 많은 양의 꽃가루를 생산하며 꽃가루에 의한 질환을 잘 일으킨다. 참나무 개화기에는 어떤 다른 나무보다 많은 양의 꽃가루를 비산한다. 우리나라 호흡기 알레르기 환자는 참나무 꽃가루에 알레르기 피부 시험 양성률이 14.4%로 나무 꽃가루 중에 가장 높다. 이처럼 참나무목에 속하는 참나무의 꽃가루는 봄철 꽃가루 알레르기의 주요한 원인이 되고 있다. 현재 국내에서 봄철 꽃가루 알레르기의 진단 및 치료에 백참나무 (White oak)의 꽃가루를 이용하고 있지만, 이는 국내 고유종이 아니므로, 정확한 진단이 어려운 실정이다.
일 양상은 신규한 병원성 관련 단백질을 제공한다.
다른 양상은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
일 양상은 신규한 병원성 관련 단백질-10 (pathogenesis related protein-10: PR-10)을 제공한다. 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 것일 수 있다.
상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 핵산 서열 간 또는 폴리펩티드 아미노산 서열 사이의 동일성의 퍼센트를 의미한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 분야의 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다.
상기 "단편 (fragment)"은 폴리펩티드 전체가 아니라 폴리펩티드의 일부분으로서, IgE 항체와 반응하여 항원-항체 반응을 유발할 수 있는 부분을 의미한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 단백질은 참나무목 (Fagales) 식물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 참나무목 식물은 참나무과 (Fagaceae) 및 자작나무과 (Betulaceae) 식물 등을 포함하는 것일 수 있다. 참나무과 식물은, 참나무속 (Quercus), 예를 들면, 상수리나무 (Quercus. accutisima), 감찰나무 (Q. aliena), 떡갈나무 (Q. dentata), 신갈나무 (Q. mongolica , Mongolian oak), 졸참나무 (Q. serrata), 굴참나무 (Q. variabilis) 등, 너도밤나무속 (Fagus), 예를 들면, 너도밤나무 (F. engleriana), 미국너도밤나무 (F. grandifolia) 등), 및 밤나무속 (Castanea), 예를 들면, 밤나무 (C. crenata), 약밤나무 (C. bungeana) 등의 식물 등을 포함하는 것일 수 있다. 자작나무과 식물은 오리나무속 (Alnus), 예를 들면, 오리나무 (A. japonica), 물오리나무 (A. sibilica) 등, 자작나무속 (Betula), 예를 들면, 자작나무 (B. platyphylla var. japonica), 만주자작나무 (B. platyphylla), 박달나무 (B. schmidtii), 물박달나무 (B. davurica) 등, 개암나무속 (Corylus), 예를 들면, 병개암나무 (C. hallaisanensis), 개암나무 (C. heterophylla), 물개암나무 (C. sieboldiana var. manshurica) 등, 및 서어나무속 (Carpinus) 식물, 예를 들면, 서어나무 (C. laxiflora), 까치박달 (C. cordata), 소사나무 (C. turczaninowii) 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 참나무목 식물은 한국에 자생하는 참나무목 식물인 것일 수 있다.
상기 단백질은 병원성 관련 단백질 (pathogenesis related protein: PR)-10과 유사한 서열 구조 및 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 "PR"은 식물이 생물학적 및 비생물학적 스트레스를 받으면 발현하는 단백질로서 방어반응을 유발하는 신호이며, Van Loon (1994)에 의해 11종류로 분류되었다가, 최근 그 종류가 차츰 늘어나고 있다. 상기 PR은 병원체로부터 공격을 받으면 농도가 급격히 높아지고, 항균 활성, 스트레스 내성 활성, RNase 활성 등을 갖는 단백질을 의미하는 것일 수 있다. 그 중 PR-10은 파슬리 (parsley), 완두, 감자, 대두, 아스파라거스 및 고추 등에서 발현되는 것으로 알려져 있고, Bet v 1 관련 단백질 (Bet v 1-related proteins) 동족체, 리보뉴클레아제 (ribonucleases) 등이 상기 분류에 속한다.
상기 단백질은 참나무목 식물의 꽃가루로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 단백질은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 유발하는 알레르겐인 것일 수 있다.
상기 "알레르겐 (allergen)"은 알레르기를 유발하는 항원, 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원을 의미하는 것일 수 있다. 알레르겐 물질을 포함하는 어떠한 종류의 물질의 섭취 또는 접촉으로 인하여 생체 내에서 항체가 만들어지면, 같은 물질의 재섭취 또는 재접촉이 일어날 경우에 항원-항체 반응이 일어날 수 있다.
상기 폴리펩티드의 분자량은 약 15 내지 19kDa, 약 15.5 내지 18.5kDa, 약 16 내지 18kDa, 약 16.5 내지 17.5kDa, 또는 약 17.0 내지 17.5kDa인 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드의 등전점은 약 4.5 내지 6.0, 약 4.7 내지 5.7, 또는 약 5.0 내지 5.5인 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 단백질을 포함하는 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물을 제공한다.
상기 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 단편, 참나무목 식물, 알레르기 진단 등에 대하여는 전술한 바와 같다.
상기 조성물에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편, 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 참나무목 식물로부터 직접 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편 등을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물에 있어서, 상기 단백질은 동물 세포를 이용하여 재조합적으로 제조되고 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 박테리아를 이용하여 재조합적으로 제조되고 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단백질은 추가적인 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 그의 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 추가적인 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 추가적인 아미노산 서열은 재조합적으로 제조된 단백질을 정제하기 위해, 예를 들면 친화성 컬럼 크로마토그래피에 적용하기 위해, 추가되는 것일 수 있다. 상기 추가적인 아미노산 서열은 히스티딘을 포함하는 것일 수 있다. 상기 추가적인 아미노산 서열은, 예를 들면, 2 내지 18개, 3 내지 12개, 4 내지 9개, 또는 6개 내지 8개의 히스티딘을 포함하는 것일 수 있다. 또는 예를 들면, 10 내지 40개, 15 내지 30개, 18 내지 25, 또는 22개의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 박테리아는 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물인 것일 수 있으며, 예를 들면 대장균 (E. coli)인 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, 상기 단백질을 박테리아에서 재조합적으로 제조 및 발현시키는 경우, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 박테리아에 도입하여 수득할 수 있다. 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 박테리아에 코돈 최적화한 후, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 박테리아에 도입하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 대장균에 코돈 최적화한 후, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 대장균에 도입하여, 수득된 재조합 단백질인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 박테리아에 도입하는 것은 예를 들면 발현 카세트 (expression cassette) 형태로의 도입, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 자체의 도입인 것일 수 있다. 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오티드가 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 것일 수 있다. 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오티드에, 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사 종결 신호, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결신호 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터의 형태인 것일 수 있다. 상기 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터를 이용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 자체의 도입은 도입된 숙주 세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 박테리아는 형질도입된 박테리아인 것일 수 있다.
상기 재조합 단백질을 생산하기 위한 박테리아의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 미생물의 다양한 배양 방법이 예를 들면 Biochemical Engineering, James M. Lee, Prentice-Hall International Editions에 개시되어 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 미생물 배양용 배지에 이용 가능한 탄소원은, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 미생물 배양용 배지에 이용 가능한 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 미생물 배양용 배지는 인의 공급원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하는 것일 수 있다. 이 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 미생물 배양용 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 단백질은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 유발하는 원인인 알레르겐이므로, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, IgE 항체와 상기 단백질 사이의 항원-항체 반응을 확인함으로써 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 진단할 수 있다.
상기 "진단 (diagnosis)"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단이란, 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 가지는지 여부 또는 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 가질 가능성을 확인하거나 그를 예측하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
상기 "항체 (antibody)"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 폴리펩티드 또는 그의 단편을 의미한다. 상기 IgE 항체는 감작 항체로서, 알레르겐에 의해 생성되며, 형질세포에 의해 만들어지고, 비만세포 또는 호염기구 표면에 있는 수용체에 붙는다. IgE 항체는 아나필락시스 (anaphylaxis, 과민증, 항원-항체 반응으로 생기는 특이적인 증상)을 일으키는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 조성물 또는 단백질을 포함하는 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 키트를 제공한다.
상기 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 단편, 조성물, 참나무목 식물, 알레르기 진단 등에 대하여는 전술한 바와 같다.
상기 키트는 공지된 다양한 종류의 키트로 제작될 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 상기 단백질과 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 IgE 항체 사이의 반응성을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있는 면역분석 (immunoassay)용 키트인 것일 수 있다.
상기 키트는 상기 단백질이 코팅된 고체 기질과, 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 IgE 항체에 결합할 수 있고 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지가 결합되어 있는 항-IgE 항체 및 기타 항원 (알레르겐)-항체 (IgE) 반응을 검출하는데 필요한 시약을 포함하는 것일 수 있다. 상기 고체 기질은 탄화수소 폴리머 (예를 들면, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌 등), 유리, 금속 또는 겔인 것일 수 있고, 마이크로타이터 플레이트인 것 일 수 있다. 상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지는, 화학 물질 (예를 들면, 비오틴 등), 효소 (예를 들면, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 페옥시다아제 및 시토크롬 P450 등), 방사능 물질, 형광 물질 (예를 들면, 플루오레신 등), 발광 물질, 화학발광 물질 (chemiluminescent) 및 형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer: FRET)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 표지 및 표지 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 상기 키트는 상기한 성분들을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작된 것일 수 있다.
다른 양상은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, IgE 항체와 상기 단백질의 결합을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 단편, 조성물, 참나무목 식물, 알레르기 진단 등에 대하여는 전술한 바와 같다.
상기 "개체"는 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 가지는지 여부 또는 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 가질 가능성을 확인하거나 그를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물인 것일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 포유동물인 것일 수 있고, 예를 들면 인간 (Homo sapiens)일 수 있다. 상기 인간은 한국인인 것일 수 있다.
상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 면역분석 (항원-항체 반응) 방법에 의해 실시될 수 있다. 상기 면역분석 방법은 방사능 면역분석, 방사능 면역침전, 면역침전, 효소결합 면역 흡착분석 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석 (flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 이를 참조할 수 있다.
예를 들면, 상기 방법이 방사능 면역분석으로 실시되는 경우, 방사능 동위원소 (예를 들면, C14, I125, P32 및 S35 등)로 표지된 항체 (IgE에 특이적으로 결합하는 항체)가 이용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 상술한 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지가 결합되어 있는 항체를 이용할 수 있다. 또는 예를 들면, 상기 방법이 ELISA로 실시되는 경우, (i) 동정한 상기 단백질을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 코팅 처리된 상기 고체 기질에 첨가하는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 항-IgE 이차 항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색 반응, 형광 반응, 발광 반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들면, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 시토크롬 P450을 포함하는 것일 수 있다. 상기 이차 항체에 결합된 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트, 니트로 블루 테트라졸리움, 나프톨-AS-B1-포스페이트 또는 증강된 화학형광 (enhanced chemifluorescence: ECF)와 같은 발색 반응 기질이 이용되고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), p-페닐렌디아민-HCl 및 피로카테콜 (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol: HYR), 테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine: TMB), 2,2'-아진-디[3-에틸벤조티아졸린 설포네이트] (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]: ABTS), o-페닐렌디아민, 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-니트로블루 테트라졸리움 (t-nitroblue tetrazolium: t-NBT) 또는 m-펜나진 메토설포네이트 (m-phenazine methosulfate: m-PMS)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하는 것은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기의 상대적인 위험을 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 상기 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 신호의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 신호의 검출은 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 IgE가 상기 단백질과 결합하였음을 보여주는 것이며, 이러한 정보를 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 진단에 활용할 수 있다.
다른 양상은 상기 단백질을 포함하는 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 면역치료용 조성물인 것일 수 있다.
상기 "면역치료 (allergen immunotherapy)"란 알레르기 질환을 일으키는 원인 물질인 알레르겐을 소량부터 서서히 증량하여 일정 기간 동안 개체에 주사로 투여함으로써, 특정 알레르겐에 대한 감수성 및 과민성을 저하시키는 치료법을 의미한다. 즉, 원인 알레르겐에 대한 경감작 요법을 의미한다. 상기 면역치료는 피하 및/또는 설하에 투여되는 것일 수 있다. 이러한 면역치료는 저농도에서 시작하여 알레르겐의 양을 서서히 증가해 유지 용량에 이르게 하는 초기 치료 (initial therapy)와 이후 3 내지 5년간 지속하는 유지 치료 (maintenance therapy) 등 두 단계로 이루어진 것, 계절 직전에 1일 내지 1주 동안 고농도의 알레르겐을 투여하는 것, 또는 수년간 저농도로 알레르겐을 투여하는 것일 수 있다. 상기 단백질, 또는 조성물을 투여하는 면역치료를 통하여, 추후 알레르겐에 노출시에 항원-항체 반응에 의한 증상의 발현을 예방 또는 억제하는 효과를 얻을 수 있다. 즉, 상기 단백질은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기의 원인 물질이므로, 이를 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 면역치료제로서 활용할 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물인 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효 성분인, 상기 알레르겐을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조되는 것일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 기재되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구, 국소, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여시 비내, 설하, 복강내 주사, 직장내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다. 상기 투여 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 또는 실험 동물, 예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 기니아피그, 또는 햄스터인 것일 수 있다. 사용되는 조성물의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 투여 방식 또는 치료 기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 배설율 및 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기 증상의 중증도 등에 따라 그 범위가 조절될 수 있다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 또는 0.001 내지 10 ㎎/㎏, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여될 수 있다.
일 양상에 다른 신규한 병원성 관련 단백질은 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 진단하기 위해 이용될 수 있다. 상기 단백질은 한국의 우점종인 신갈나무의 주요 알레르겐이므로, 상기 단백질을 이용하여 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 진단한 결과는 신뢰도 및 타당도가 높다. 또한, 상기 단백질을 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 이용할 수 있다.
도 1은 신갈나무로의 꽃가루로부터 분리된 Que m 1의 아미노산 서열 (서열번호 1) 및 뉴클레오티드 서열 (서열번호 2)이다.
도 2는 Que m 1의 아미노산 서열과 다른 식물 유래의 PR-10 유사 알레르겐의 아미노산 서열의 상동성을 나타낸 결과이다 (Que m 1 (신갈나무, Quercus mongolica, Mongolian oak 유래), Que a 1 (백참나무, Quercus alba, white oak, ABZ81046 유래), Que r 1 (루브라참나무, Quercus rubra, northern red oak, AFF59686 유래), Que s 1 (코르크참나무, Quercus suber, cork oak, AFF59689 유래), Bet v 1 (자작나무, Betula verrucosa, common silver birch, P15494 유래), Cas s 1 (유럽밤나무, Castanea sativa, European chestnut, ACJ23861 유래), Fag s 1 (유럽너도밤나무, Fagus sylvatica, European beech, ACJ23865 유래), Cor a 1 (개암나무, Corylus avellana, European hazelnut, CAA96549 유래), Mal d 1 (사과나무, Malus domestica, apple, CAA96535 유래), Pru av 1 (양벚나무, Prunus avium, sweet cherry, O24348 유래), Pru ar 1 (살구나무, Prunus armeniaca, Apricot, O50001 유래). 상기 사과나무, 양벚나무 및 살구나무는 과일 알레르겐을 의미한다.
도 3은 재조합 단백질, Que m 1, Que a 1 및 Bet v 1을 SDS-PAGE하여, 단백질의 크기를 확인한 결과이다. M은 분자량 기준, Qm은 재조합 Que m 1, Qa는 Que a 1, Bu는 재조합 Bet v 1을 나타낸다.
도 4a는 참나무목 꽃가루에 알레르기 반응을 보이는 (pollinosis), 50명의 알레르기 환자로부터 수득한 혈청 시료에 대하여, 재조합 PR-10 단백질과 그에 특이적인 IgE 항체와의 반응성을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸다. 점선은 컷오프 수치를 나타낸다. 도 4b는 50명의 알레르기 중에서 Que m 1, Que a 1 및 Bet v 1에 대한 양성 반응을 나타낸 환자의 수를 나타낸다.
도 5는 PR-10 단백질인, Que m 1, Que a 1 및 Bet v 1 사이의 IgE 반응성에 대한 피어슨 상관 계수를 나타낸다. 좌측부터 Que m 1과 Que a 1, Que m 1과 Bet v 1, 및 Que a 1과 Bet v 1의 상관 계수를 나타낸다.
도 6은 참나무목 꽃가루에 알레르기 반응을 보이는, 알레르기 환자에서 재조합 Que m 1, 및 Que a 1에 대한 IgE를 측정하기 위한 ELISA 결과의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 7은 억제 면역 블롯 분석 이미지를 나타낸다. M은 분자량 기준, E는 코마시 블루 (Coomassie blue)로 염색된 신갈나무 추출물, A는 억제제 없이 알레르기 환자 유래 혈청과 탐침된 IgE-반응성 성분을 의미한다. B, C 및 D는 각각 신갈나무 꽃가루 추출물, 재조합 Que m 1, 및 재조합 Que a 1과 미리 인큐베이션된 알레르기 환자 유래 혈청과 탐침된 IgE-반응성 성분을 의미한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 참나무목 식물에서 신규한 병원성 관련 단백질 분자의 규명 및 알레르기 환자에서의 반응성 분석
1. 혈청 시료 수집
서울 세브란스병원의 알레르기-천식 (Allergy-Asthma) 센터에서, 백참나무 (white oak) (t7)에 대한 ImmunoCAP (ThermoFisher scientific, Uppsala, Sweden) 분석에서 0.7 kUA/L 이상의 수치를 나타내는 50명의 환자 (이하, 알레르기 환자라 함) (남성 31명 및 여성 19명, 평균 23세, 6세 내지 66세)를 선별하고, 상기 알레르기 환자의 동의를 얻은 후, 혈청을 수득하였다. 알레르기 반응의 병력이 없고, ImmunoCAP 분석에서 참나무 (oak) 및 자작나무 (birch) 모두에 대하여 음성 반응은 보인 12명의 환자의 혈청은 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 연구는 본 기관의 심의위원회로부터 승인받았다 (4-2013-0397).
50명의 환자는 참나무와 자작나무에 대하여 양성 반응을 보였으며, 임상적인 특징은 하기 표 1,2 및 3과 같다.
환자 성/연령 진단 동시 감작 프로파일
( Cosensitization profile)		 자작나무에 대한 IgE 참나무에 대한 IgE 총 IgE
(kUA/L)
S01 M/10 AR d2, w1 12.00 12.70 220
S02 F/7 AR w1, d2, f13, f256 26.50 18.70 ND
S03 F/13 AR e5 61.70 67.50 498
S04 M/38 AR t2, d2, g5, g6 18.00 3.59 166
S05 M/6 AR d2, f1, f11, f13, f14,
f20, f24, f253, f256		 0.97 2.06 427
S06 M/16 AR w1, m6, d2, e5 71.00 30.70 ND
S07 F/13 AR w1, m6, d2, i6, e5 19.90 16.90 456
S08 M/9 AR d2 0.80 0.94 462
S09 M/13 AR w1, e5 39.50 19.70 492
S10 M/16 AR g6, d2, e1 4.01 3.80 38
S11 M/9 AR w1, f13 3.34 1.27 52.4
S12 M/13 AR w1 25.10 20.80 53.5
S13 M/8 AR w1, i6 0.83 1.12 ND
S14 M/8 AR w1 1.89 1.83 ND
S15 F/45 AR, AS d2, e1, e5 25.00 10.90 ND
S16 F/7 AR w1, d2 2.63 5.22 2059
S17 M/14 AR d2, e5 3.60 7.29 ND
S18 M/17 AR d2, e1, e5 1.49 0.88 ND
S19 M/8 AR w1, d2 1.86 3.80 ND
S20 M/6 AR w1, d2 0.76 1.33 ND
S21 M/8 AR w1, d2 2.38 3.07 ND
S22 M/7 AR w1, m6, d2, e4 54.10 35.10 ND
S23 F/8 AR i6, f1, d2, f1, f2, f95 1.21 3.03 681
S24 M/11 AR g6, w1, w22, d2, f13 22.80 33.20 ND
S25 F/20 AR d2, e5 2.06 1.97 ND
S26 M/11 AR w1, d2, f13 15.70 19.50 ND
S27 M/25 AR d2 5.46 4.09 ND
S28 M/15 AR m6, d2 9.83 5.30 203
S29 M/17 AR d2, e5 66.30 39.60 ND
S30 F/66 AR t2 16.50 6.21 59
S31 M/16 AR w1 14.70 16.70 ND
S32 M/23 AR w1, d2 19.80 35.00 ND
S33 F/61 AR w1, w6, e1, e2 4.28 4.56 ND
S34 M/28 AR w1, w6, w22, d2, i6 15.90 50.60 ND
S35 M/38 AR d2 9.40 1.71 35.1
S36 M/30 AR w1, d2 79.20 62.00 871
S37 M/21 AR, CU f4 5.97 5.31 ND
S38 F/46 AR i6 16.70 12.70 306
S39 F/54 AR - 19.10 3.24 42.6
S40 F/26 AR, CU f44, f84, f95, f242 37.40 13.10 ND
S41 F/26 AR, AC, OAS e1, e5, g6, w1, w6, w22 34.40 15.50 240
S42 M/39 AR, OAS e1, e5, d2 12.40 9.71 248
S43 F/29 AR, AC e5, d2, i6 2.14 2.71 715
S44 F/35 AR d2, e5 20.00 11.70 ND
S45 M/44 AR, AS w6, d2 4.29 11.20 ND
S46 F/31 AR, AS t2 36.80 21.80 179
S47 M/30 AR d2, e5 0.42 9.90 ND
S48 F/54 AR, AC - 32.80 6.36 ND
S49 M/34 AR, AC t1, g5, d2 4.94 3.29 ND
S50 F/21 AR, OAS d2 5.41 1.03 351
알레르기성 비염 (allergic rhinitis: AR), 구강 알레르기 증후군 (oral allergy syndrome: OAS), 천식 (asthma: AS), 알레르기성 결막염 (allergic conjunctivitis: AC), 만성 두드러기 (chronic urticarial: CU),
d2: D. farinae , w1: 돼지풀 (ragweed), w6: 쑥 (sagebrush), w22: 국화 (chrysanthemum), e1: 고양이 비듬 (cat dander), e2: 개 상피 (dog epithelium), e4: 소 비듬 (cow dander), e5: 개 비듬 (dog dander), t1: 네군도단풍나무 (Acer), t2: 오리나무 (alder), f1: 계란 흰자 (egg white), f2: 우유 (milk), f4: 밀 (wheat), f11: 메밀 (buckwheat), f13: 땅콩 (peanut), f14: 콩 (soya bean), f20: 아몬드 (almond), f24: 새우 (shrimp), f44: 딸기 (strawberry), f84: 키위 (kiwi), f95: 복숭아 (peach), f242: 체리 (cherry), f253: 작 (pine nut), f256: 호두 (walnut), g5: 라이그라스 (rye grass), g6: 티머시그라스 (timothy grass), i6: 독일바퀴 (cockroach), m6: 알타나리아 알타나타 (Alternaria alternata).
2. 참나무목 식물의 꽃가루에서 알레르겐 추출
신갈나무 (Mongolian oak) 꽃가루를 수집하여 그늘에서 건조시키고, 체질하여 오염 물질을 제거한 후, 냉동 보관하였다. 알레르겐을 추출하기 위하여, 꽃가루를 에틸에테르 (ethyl ether)로 탈지시킨 후, 인산염완충식염수 (phosphate buffered saline: PBS)에서 초음파 (sonication) 처리하였다. 이어서, 4℃에서 15분 동안 13,000g로 원심분리하였다. 그 후, 물에 투석시키고, 0.22㎛의 폴리염화비닐리덴 (polyvinylidene fluoride: PVDF) 시린지 필터 (filter)를 이용하여 여과하였다. 여과된 시료를 동결 건조 (freeze-dried)시키고, 냉동 보관하였다. 상기 추출물은 사용하기 전에 PBS에 용해시키고, Bradford 분석 (Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다.
3. Que m 1 분자의 클로닝 (cloning)
TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 꽃가루에서 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA와 하기 표 4의 프라이머 세트를 시용하여 역전사-중합효소 연쇄반응 (Reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR)을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 프라이머 서열은 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)에 개시된 정보를 기반으로 제작하였다.
5`-> 3` 서열번호
PR-10F1 (정방향 프라이머) 5'-ATgggWgTTDTYRVWYAYgA-3' 서열번호 3
PR-10R1 (역방향 프라이머) 5'-BTHRTAKDSAKCDgDRTKTgMC-3' 서열번호 4
여기서, B는 C, G, 또는 T를 나타내고, D는 A, G 또는 T를 나타내고, H는 A, C, 또는 T를 나타내고, K는 G 또는 T를 나타내고, M는 A 또는 C를 나타내고, R는 A 또는 G를 나타내고, S는 C 또는 G를 나타내고, V는 A, C, 또는 G를 나타내고, W는 A 또는 T를 나타내고, 및 Y는 C 또는 T를 나타낸다.
DNA를 pCR4-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하고, DNA 서열을 분석하였다 (솔젠트 (Solgent) (Daegeon, Korea)). 서열 정렬 (alignment)은 CLUSTAL X 프로그램을 이용하여 수행하였다. 분석 결과, 신규한 단백질을 확인하였고, 상기 단백질을 Que m 1으로 명명하였다.
4. Que m 1과 다른 식물 유래 알레르겐 PR-10 분자와의 상동성 분석
클로닝된 서열은, 분자량 (molecular weight: MW)이 약 17.3kDa이며, 등전점은 약 5.232인 160개의 아미노산을 코딩하였다. 도 1은 신갈나무로의 꽃가루로부터 분리된 Que m 1의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이다. 도 2는 Que m 1의 아미노산 서열과 다른 식물 유래의 PR-10 유사 알레르겐의 아미노산 서열의 상동성을 나타낸 결과이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 번역된 Que m 1의 서열은 다양한 식물 유래의 알레르겐 PR-10 분자와 55% 내지 95.6%의 상동성을 보였다. 구체적으로, 번역된 Que m 1의 서열은 Que a 1와 95.6%의 높은 상동성을 보였으며, 북부 적참나무 (northern red oak)와는 74.2%, 코르크참나무 (cork oak)와는 73.2%의 상동성을 보였다. 특히, Que m 1은 Bet v 1과 57.5%의 상동성, 사과 알레르겐인 Mal d 1와 63.1%의 상동성을 보였다. 즉, Que m 1은 다른 참나무 또는 자작나무의 알레르겐 PR-10 분자들과 강한 교차 반응 능력을 가지를 것으로 예상된다.
5. 재조합 알레르겐 발현, 정제 및 크기 분석
수득된 cDNA를 주형으로 하고, Que m 1에 특이적인 하기 표 5의 프라이머 세트를 이용하여, PCR을 수행하였다.
5`-> 3` 서열번호
정방향 프라이머 5'-ATGGGAGTTGTTGCTTATGAA-3' 서열번호 5
역방향 프라이머 5'-TTAGTAGTATCCATCGGGATG-3' 서열번호 6
PCR의 산물을 겔에 로딩하고, 전기영동하였다. 겔을 정제하고, pEXP5NT/TOPO 벡터 (Invitrogen)에 서브클로닝하였다. DNA 서열이 벡터에 삽입되었는지 여부는 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 상기 벡터를 E. coli 로제타 2 (DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 형질도입하였다.
Que a 1은 백참나무 (Quercus alba) 유래의 주요 알레르겐이며, 재조합 Bet v 1은 자작나무 (Betula verrucosa) 유래의 주요 알레르겐이다. Bet v 1은 Indoor biotechnologies Inc. (Charlottesville, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 코돈 최적화된 Que a 1의 개방형 해독틀 (open reading frame: ORF)이 pET28a 벡터의 Nco I 및 Xho I 부위에 클로닝된 벡터를 Bioclone Inc. (CA, USA)로부터 수득하고, E. coli BL21 StarTM (DE3)에 형질도입하였다. 상기 클로닝된 벡터를 E. coli BL21 StarTM (DE3)에 형질도입하였다.
그 후, 형질도입된 E. coli에 1 mM의 이소프로필-1-티오-β-D-피라노시드 (isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside: IPTG)를 첨가하여 재조합 단백질을 발현시켰다. 이어서, 상기 재조합 단백질을 Ni-친화성 컬럼 크로마토그래피 (affinity column chromatography) (Ni-affinity column chromatography) (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여, 6M의 우레아를 포함하는 환원 조건하에서 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 (SDS-polyacrylamide) 겔을 이용하여 분석하였다.
E. coli에서 재조합 단백질을 생산한 결과, Que m 1 및 Que a 1의 수율은 약 2.715 및 1.876 mg/L이었다. 도 3은 재조합 단백질, Que m 1, Que a 1 및 Bet v 1을 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE)하여, 단백질의 크기를 확인한 결과이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 재조합 Que m 1 단백질은 태깅된 22개의 추가 아미노산으로 인하여, 분자량이 약 19.76kDa이며, 등전점은 약 5.90이었다.
6. 알레르겐에 대한 IgE 반응성 분석
재조합 알레르겐에 대한 IgE의 반응성을 효소결합면역흡착분석 (enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay: ELISA)으로 확인하였다.
마이크로타이터 플레이트 (microtiter plates)를 2 ㎍/mL의 재조합 단백질을 포함하는 pH 9.6 및 50 mM의 탄산나트륨 (sodium carbonate)을 이용하여, 하룻밤 동안 4℃에서 코팅하였다. 그 후, 3%의 탈지유를 포함하는 0.05%의 Tween 20를 함유하는 PBS (PBST)를 이용하여, 비특이적인 결합을 차단 (blocking)하였다. 이어서, 혈청 시료와 1%의 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin: BSA)을 포함하는 PBST를, 1:4로 희석한 용액을 상기 플레이트에 분주하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. IgE 항체를 비오틴화된 (biotinylated) 염소 항-인간 IgE (1:1,000) (Vector, Burlingame, CA, USA) 및 스트렙타비딘 페록시다제 (1:1,000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검출하였다. 이 때, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) (Kirgegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)를 첨가하여 발색 반응을 유도하였다. 이어서, 0.5 M의 H2SO4를 첨가한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군의 평균 흡광도와 이중 표준 편차를 컷오프 (cutoff) 수치로 결정하였다. Que m 1 및 Que a 1에 대하여 양성인 비율에 대한 컷오프 수치를 곡선 아래 면적 (area under the curves : AUC)에 따른 수용자 반응 특성 (receiver operating characteristics: ROC)으로 비교하였다.
도 4a는 참나무목 꽃가루에 알레르기 반응을 보이는 (pollinosis), 50명의 알레르기 환자로부터 수득한 혈청 시료에 대하여, 재조합 PR-10 단백질과 그에 특이적인 IgE 항체와의 반응성을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸다. 재조합 단백질 Que m 1, Que a 1 및 Bet v 1 각각은 50명의 알레르기 환자 중 46명 (92.0%), 37명 (74.0%) 및 19명 (38.0%)로부터 수득한 혈청 시료의 IgE 항체와 반응하였다. Que m 1에 대한 IgE 반응성은 Que a 1 에 대한 반응성과 높은 상관 계수를 보였다 (피어슨 (Pearson) 상관계수 = 0.84). 반면, Que a 1 및 Bet v 1 간에는 높은 상관 계수를 보이지 않았다 (상관계수 = 0.28). 도 5는 PR-10 단백질인, Que m 1, Que a 1 및 Bet v 1 사이의 IgE 반응성에 대한 피어슨 상관 계수를 나타낸다.
도 6은 참나무목 꽃가루에 알레르기 반응을 보이는, 알레르기 환자에서 재조합 Que m 1, 및 Que a 1에 대한 IgE를 측정하기 위한 ELISA 결과의 ROC 곡선을 나타낸다. 재조합 Que m 1 또는 Que a 1 sIgE를 사용하여 참나무목 꽃가루에 알레르기 반응을 보이는 환자에 대하여 ROC 곡선 분석을 수행한 결과, Que m 1에 대한 민감도 (sensitivity)는 0.96, 특이도 (specificity)는 1.00이고, 반면 Que a 1에 대한 민감도는 0.84, 특이도는 0.83이었다. Que m 1에 대한 AUC 수치는 0.980 (95% CI: 95-100%), Que a 1에 대한 AUC 수치는 0.92 (95% CI, 86-99%)로, Que m 1이 Que a 1 보다 높은 AUC 수치를 나타내었다.
즉, Que m 1은 Que a 1와 일부 아미노산 서열을 공유하고 있으나, 한국인 가운데 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 가지는 환자에서 Que m 1은 Que a 1 보다 특이적으로 IgE와 반응하여, 알레르기 유발 활성을 보이는 것을 알 수 있다.
7. IgE 억제의 면역 블롯 ( immunoblotting ) 분석
10㎍의 신갈나무 꽃가루 추출물을 환원 조건하에서 15%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하여, 단백질을 분리시켰다. 분리된 단백질을 PVDF 막 (0.45 ㎛, GE Water & Process Technologies, Trevose, PA, USA) 상에 이동시켰다. 3%의 탈지유를 이용하여 비특이적인 결합을 차단하고, 상기 PVDF 막을 40 ㎍의 재조합 단백질과 미리 인큐베이션된 혈청 시료와 면역탐침하였다. 상기 혈청은 재조합 Que m 1에 대하여 양성 반응을 보인 4명의 환자로부터 혈청 시료를 수득하여 풀링 (pooling)하고, 1:4로 희석된 것을 사용하였다. 이어서, IgE-반응성 성분을 알칼린 포스페이트-결합된 염소 항-인간 IgE (1:1,000) (Sigma-Aldrich)를 이용하여 검출하였다. 이 때, 니트로 블루 (nitro blue) 및 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-포스페이트 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) (Promega, Madison, WI, USA)를 첨가하여 발색 반응을 유도하였다.
도 7은 억제 면역 블롯 분석 이미지를 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 재조합 Que m 1 또는 신갈나무의 꽃가루 추출물과 미리 인큐베이션된 경우, 약 17kDa에서 밴드가 보이지 않았다. 반면, Que a 1와 미리 인큐베이션된 경우, 약 17kDa에서 밴드가 희미하게 나타났다. 억제제가 없는 경우, Que m 1 또는 Que a 1와 미리 인큐베이션되지 않은 경우, 약 12kDa에서 밴드가 희미하게 나타났다. 이로부터, Que m 1은 신갈나무 추출물의 약 17kDa 알레르겐의 IgE 반응을 완벽하게 억제하였지만, Que a 1는 부분적으로 이를 억제한 것을 알 수 있다. 따라서, Que m 1은 한국 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기의 주요한 원인이며, 한국 참나무목 식물의 꽃가루에 대한 알레르기를 진단하는데 있어서, Que a 1 보다 유의미하다.
8. 호염기구 활성화 ( Basophil activation) 분석
참나무 알레르기 환자 및 건강한 개체로부터 혈액을 수득하여 EDTA 진공채혈관 (vacutainer tube) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 수집하고, 제조사의 지시에 따라 FlowCAST® 키트 (BUHLMANN, Schonenbuch, Switzerland)를 이용하여 호염기구 활성화 분석을 수행하였다. 전혈구세포를 1 내지 100 ㎍/mL의 다양한 농도의 알레르겐을 함유하는 자극 버퍼와 반응시키고, 수조 (waterbath)에서 15분 동안 시약으로 염색시켰다. 적혈구 (erythrocyte)를 용해시키기 위해, 용해 시약을 첨가하고 10분 동안 인큐베이션 시킨 후, 원심분리하고, 세척 버퍼에서 재현탁하였다. 유세포 분석은 FACS Verse (BD Biosciences)를 이용하여 수행하고, 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar, Ashland, Ore)를 이용하여 분석하였다.
호염기구는 CD63, CD13, CD44, CD203c 등을 표면에 발현할 수 있으며, 호염기구가 활성화되면 CD63, CD203c 등이 표면에 드러난다. 하기 표 7은 호염기구 활성화 분석 결과, 호염기구가 50% 활성화되기 위하여 필요한 알레르겐의 농도를 나타낸다. CD63가 50% 발현하도록 유도하는데 필요한 단백질의 농도는 ng/mL로 표시하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 호염기구가 50% 활성화되기 위하여 필요한 Que m 1의 농도는 호염기구가 50% 활성화되기 위하여 필요한 Bet v 1의 농도에 비하여, 약 15배 적은 수치를 나타내었다. 즉, Que m 1은 Bet v 1에 비하여 소량으로도 알레르기 유발 활성을 나타낼 수 있다.
알레르겐 P1 P2 P3 평균
Bet v 1 46.98* 116.46 116.54 93.33
Que m 1 17.15 1.71 0.13 6.33
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Compositions for diagnosis of allergy to Fagales plant pollen, methods for diagnosing of allergy to Fagales plant pollen, and composition for prevention or treatment of allergy to Fagales plant pollen <130> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Quercus mongolica <400> 1 Met Gly Val Val Ala Tyr Glu Ser Glu Asp Ala Ser Val Ile Pro Pro 1 5 10 15 Ala Arg Leu Phe Lys Ala Phe Val Leu Asp Ser Asp Asn Leu Ile Pro 20 25 30 Lys Val Val Pro Gln Ala Leu Lys Ser Thr Glu Ile Ile Glu Gly Asn 35 40 45 Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Gly Glu Gly Ser His 50 55 60 Leu Lys His Ala Lys His Arg Ile Asp Val Ile Asp Pro Glu Asn Phe 65 70 75 80 Thr Phe Ser Phe Ser Val Ile Glu Gly Asp Ala Leu Phe Asp Lys Leu 85 90 95 Glu Asn Val Ser Thr Glu Thr Lys Ile Val Ala Ser Pro Asp Gly Gly 100 105 110 Ser Ile Val Lys Ser Thr Cys Lys Tyr Gln Thr Lys Gly Asp Phe Gln 115 120 125 Leu Thr Asp Glu Leu Ile Arg Gly Gly Lys Glu Lys Ala Ser Gly Val 130 135 140 Phe Lys Ala Val Glu Ala Tyr Leu Val Ala His Pro Asp Glu Tyr Tyr 145 150 155 160 <210> 2 <211> 480 <212> DNA <213> Quercus mongolica <400> 2 atgggagttg ttgcttatga atctgaggat gcctctgtta tccccccagc taggcttttc 60 aaggcctttg tccttgattc tgacaacctc atcccaaagg tcgtaccaca ggcccttaag 120 tccactgaaa taattgaagg aaatggagga cctggaacca tcaagaagat tacctttggc 180 gaaggcagcc atttgaaaca tgcaaagcac aggattgatg tgattgaccc tgaaaacttt 240 acatttagct ttagtgtgat tgaaggtgat gctttgtttg acaagctaga aaatgtttct 300 actgagacca agattgtggc aagccctgat ggaggatcca tcgtgaaaag cacctgcaag 360 taccagacaa agggtgactt tcaactcacg gatgagctaa tccggggagg taaagaaaag 420 gcctctggag ttttcaaggc tgttgaggcc tacctcgtgg cacatcccga tggatactac 480 480 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Que m 1 cloning primer <400> 3 atgggwgttd tyrvwyayga 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Que m 1 cloning primer <400> 4 bthrtakdsa kcdgdrtktg mc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Que m 1 primer <400> 5 atgggagttg ttgcttatga a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Que m 1 primer <400> 6 ttagtagtat ccatcgggat g 21

Claims (12)

  1. 신갈나무 (Mongolian oak)로부터 유래된, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 신갈나무의 꽃가루로부터 유래된 것인 폴리펩티드.
  5. 삭제
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 신갈나무 (Mongolian oak)의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 박테리아에 코돈 최적화한 후, 상기 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 박테리아에 도입하여 수득된 재조합 단백질인 것인 조성물.
  10. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 신갈나무 (Mongolian oak)의 꽃가루에 대한 알레르기 진단용 키트.
  11. 신갈나무 (Mongolian oak)의 꽃가루에 대한 알레르기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, IgE 항체와 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 결합을 검출하는 방법.
  12. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 신갈나무 (Mongolian oak)의 꽃가루에 대한 알레르기를 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
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