KR101919240B1 - 간 섬유화 유도 벡터 및 이를 이용한 동물모델 제조방법 - Google Patents
간 섬유화 유도 벡터 및 이를 이용한 동물모델 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 간 섬유화 유도 벡터 및 이를 이용한 동물모델 제조방법에 관한 것에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면, 특정시점에 타목시펜(Tamoxifen)을 처리함으로써 Cas9-ERT2 단백질 복합체를 세포질에서 핵 내로 이동시킬 수 있는데, 이처럼 핵 내로 이동한 상기 단백질 복합체는 guide RNA (gRNA)를 통해 원하는 시점에 원하는 부분에서 보다 정교하게 특정 DNA를 변형시킬 수 있다. 특히, 간 섬유화 억제 유전자인 TIF1γ의 gRNA 및 간성상세포 특이적 프로모터와 융합된 Cas9-ERT2 복합체에 타목시펜을 처리하면, 상기 TIF1γ 유전자를 넉아웃 시켜 간 섬유화를 유발시킬 수 있다. TIF1γ는 간 섬유화 또는 간경화 예방 및 치료에 있어서 매우 중요한 인자인바, 따라서 본 발명은 간 섬유화 질환을 분석하는 기술을 개발하는데 이용될 수 있으며, 나아가 간 섬유화 치료를 위한 후보약물 스크리닝 등의 임상적 연구에 있어서도 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 신약개발의 표적이 될 수 있는 신규한 단백질들을 동정하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 간 섬유화 유도 벡터 및 이를 이용한 동물모델 제조방법에 관한 것이다.
특정한 시기에, 원하는 부분에서 원하는 DNA를 변형 (modification) 시키기 위하여 현재 Cre-Lox 재조합 (Cre-Lox recombination), TET시스템 (TET system) 등에 조직 특이적 프로모터를 이용하는 방법이 존재한다.
이 중 TET시스템 (TET system)은 대장균의 전이인자 (transposon) Tn10에 있는 테트라사이클린 (Tc) 내성발현조절계를 사용한 포유류배양세포, 동물 개체에서의 유전자발현유도시스템을 말하며, 2개의 요소로 구성되어 있다. 첫째는 tTA (tetracyclin-controled transactivator) 인데, 이는 Tc억제인자(tetR)에 단순헤르페스바이러스 VP16인 전사활성화 영역을 결합한 단백질이고, 둘째는 tetR와 결합할 수 있는 작동유전자 (operator) (tetO)와 사람세포거대바이러스 (CMV) 촉진체의 하류에 목적유전자를 배치한 것이다. 상기 Tc존재 하에서는 그와 결합한 tTA는 tetO와 결합하지 못하지만, Tc를 제거하면 tTA가 tetO와 결합하여 표적유전자의 발현을 유도하게 된다(TET-OFF시스템). 역으로 tetO와 결합하여 표적유전자의 발현유도를 하는 rtTA (reverse tetracyclin- controlled ransactivator)를 사용한 TET-ON시스템의 구축을 위한 연구도 계속 되고 있다.
다만, 현재 DNA 변형 방법들은 그 절차가 복잡하고, 과정에 긴 시간이 소요되며, 이를 통하여 제조된 동물모델에서 원하는 부분의 DNA 변형을 위하여 약물을 처리한 경우, 정밀한 작업이 이루어지지 않아, 그 결과를 신뢰할 수 없는 경우가 많다는 점에서 한계가 있으며, 그 중, Cas9 system은 상대적으로 짧은 시간에 저비용으로 동물모델을 제조할 수 있고, DNA상에서 정교한 작업이 용이하다는 장점이 있지만, 특정 시기에 원하는 부분에서의 DNA 변형을 유도하기 위하기에는 아직 미흡한 상황이다.
한편, 간 섬유화(liver fibrosis)는 만성염증상태에 있는 간 조직이 손상과 재생을 반복하여, 조직 중에 콜라겐 등과 같은 결합조직이 과도하게 축적됨으로써, 간 조직에 흉터(scar)가 생기는 질환으로서, 간경화와는 달리 가역적(reversible)이고, 얇은 원섬유 (thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule)형성이 없는 바, 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있다. 그러나 이러한 간 섬유화 기작이 반복적으로 지속되면, 결합조직 간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)가 축적되며, 간소엽의 정상구조를 상실하여 결절을 형성하는 것을 특징으로 하는 비가역적인(irreversible) 간경화로 진행된다.
최근의 간 섬유화 치료 연구는 간 섬유화를 줄이거나 간 기능을 회복하여 간 이식에 대한 수요를 감소시킬 수 있도록 세포 및 분자 메커니즘에 관한 정보를 제공함으로써, 간세포 치료를 위한 유망한 접근법을 제공하려는 노력이 진행되고 있으며, 높은 증식능력을 갖는 줄기세포에서 분화시킨 간세포를 간 이식 대신 사용할 수 있을 것이라고 기대되고 있지만, 이 또한 생체 내에서의 생존율이 낮고 면역거부반응을 일으킬 수 있는 위험이 있어서 아직까지는 큰 치료효과를 기대하기 어렵다.
현재 유의성 있는 간 섬유화 진단을 위한 분석방법(한국 특허등록번호 10-1018960)에 대해서는 알려져 있으나, 간 섬유화의 메커니즘 및 치료법 연구를 위해 생체 시료를 개발하기에 적합한 동물모델이 필수적인데도 불구하고, 아직 이에 대한 연구가 미비한 실정이다.
본 발명자는 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, Cas9을 이용해 원하는 시기에 원하는 특정 부분에서 DNA 변형(modification)을 유도할 수 있는 방법에 관하여 예의 연구한 결과, Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜(Tamoxifen)을 처리함으로써 특정시점에 상기 Cas9-ERT2를 세포질에서 핵 내로 이동시킬 수 있으며, 이처럼 핵 내로 이동된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 guide RNA를 통해 특정 DNA를 변형 (modification) 시킬 수 있다는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma)의 gRNA (guide RNA) 및 Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터(vector)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 간 섬유화 동물 모델의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 간 섬유화 동물 모델을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma)의 gRNA (guide RNA) 및 Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터(vector)를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 재조합 벡터는 U6 프로모터 및 간성상세포 특이적 프로모터를 각 암호화하는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 유전자를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 복합체는 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9 (CRISPR associated protein 9)의 N-말단 및 C-말단에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 것 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 TIF1γ는 간 섬유화 억제 유전자일 수 있다.
또한, 본 발명은 a) Cas9-ERT2 단백질 복합체, TIF1γ gRNA, U6 프로모터, 및 LRAT (Lecithin retinol acyltransferase) 프로모터를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터(vector)를 제조하는 단계; b) 상기 재조합 벡터를 대리모 동물의 배아에 미세주입 하는 단계; 및 c) 상기 배아를 대리모 동물의 난관에 외과적 방법으로 이식하는 단계를 포함하는, 간 섬유화 동물 모델의 제조방법 및 이를 통해서 제조된 간 섬유화 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 Cas9-ERT2 단백질 복합체는 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9 (CRISPR associated protein 9)의 N-말단 및 C-말단에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 특정시점에 타목시펜(Tamoxifen)을 처리함으로써 Cas9-ERT2 단백질 복합체를 세포질에서 핵 내로 이동시킬 수 있는데, 이처럼 핵 내로 이동한 상기 단백질 복합체는 guide RNA (gRNA)를 통해 원하는 시점에 원하는 부분에서 보다 정교하게 특정 DNA를 변형시킬 수 있다. 특히, 간 섬유화 억제 유전자인 TIF1γ의 gRNA 및 간성상세포 특이적 프로모터와 융합된 Cas9-ERT2 복합체에 타목시펜(Tamoxifen)을 처리하면, 상기 복합체가 핵 내로 이동하여, TIF1γ 유전자를 넉아웃 시켜 간 섬유화를 유발시킬 수 있다. TIF1γ는 간 섬유화 또는 간경화 예방 및 치료에 있어서 매우 중요한 인자인바, 따라서 본 발명은 간 섬유화 질환을 분석하는 기술을 개발하는데 이용될 수 있으며, 나아가 간 섬유화 치료를 위한 후보약물 스크리닝 등의 임상적 연구에 있어서도 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 신약개발의 표적이 될 수 있는 신규한 단백질들을 동정하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 세포질에 존재하는 Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜 (Tamoxifen; TMX)을 처리함으로써 상기 단백질 복합체가 핵 내로 이동하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 nuclear localization signal (NLS)이 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 ERT2를 융합시킨 Cas9-ERT2 단백질 복합체 구조를 나타낸 것이고, 도 2b는 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 의 gRNA (guide RNA), U6 프로모터, 간성상세포 특이적 프로모터 (LRAT 프로모터), 및 Cas9-ERT2를 연결한 구조를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 단백질 복합체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 맵을 나타낸 것이고, 도 3b는 본 발명의 재조합 벡터를 제조하기 위한 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 재조합 벡터를 배아에 미세주입하기 위하여 제작된 미세주입 (microinjection) 용 DNA를 나타낸 것이다.
도 5는 TIF1γ 유전자의 넉아웃을 유발할 수 있도록 형질전환(transgenic; TG)된 생쥐에 타목시펜을 주입한 다음 간 조직을 회수하여, TIF1γ 유전자의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 타목시펜(Tamoxifen; TMX)을 처리하지 않았을 때, Cas9-ERT2 단백질 복합체의 발현양상을 확인한 것이고, 도 6b는 TMX를 처리하였을 때, Cas9-ERT2 단백질 복합체의 발현양상을 확인한 것이다.
도 7은 ROI 1 (up cell)과 벡터의 transfection이 이루어지지 않은 세포인 ROI 2 (down cell)을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 타목시펜을 처리하였을 때, ROI 1과 ROI 2의 발현양상을 Intensity에 따라 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 nuclear localization signal (NLS)이 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 ERT2를 융합시킨 Cas9-ERT2 단백질 복합체 구조를 나타낸 것이고, 도 2b는 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 의 gRNA (guide RNA), U6 프로모터, 간성상세포 특이적 프로모터 (LRAT 프로모터), 및 Cas9-ERT2를 연결한 구조를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 단백질 복합체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 맵을 나타낸 것이고, 도 3b는 본 발명의 재조합 벡터를 제조하기 위한 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 재조합 벡터를 배아에 미세주입하기 위하여 제작된 미세주입 (microinjection) 용 DNA를 나타낸 것이다.
도 5는 TIF1γ 유전자의 넉아웃을 유발할 수 있도록 형질전환(transgenic; TG)된 생쥐에 타목시펜을 주입한 다음 간 조직을 회수하여, TIF1γ 유전자의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 타목시펜(Tamoxifen; TMX)을 처리하지 않았을 때, Cas9-ERT2 단백질 복합체의 발현양상을 확인한 것이고, 도 6b는 TMX를 처리하였을 때, Cas9-ERT2 단백질 복합체의 발현양상을 확인한 것이다.
도 7은 ROI 1 (up cell)과 벡터의 transfection이 이루어지지 않은 세포인 ROI 2 (down cell)을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 타목시펜을 처리하였을 때, ROI 1과 ROI 2의 발현양상을 Intensity에 따라 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자는 Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜(Tamoxifen)을 처리함으로써 특정시점에 상기 Cas9-ERT2를 세포질에서 핵 내로 이동시킬 수 있으며, 이처럼 핵 내로 이동된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 guide RNA를 인지하여 DNA를 변형 (modification) 시킬 수 있다는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma)의 gRNA (guide RNA) 및 Cas9 (CRISPR associated protein 9)에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터(vector)를 제공한다.
본 발명에서 "Cas9"는 "CRISPR associated protein 9"의 약자로, "CRISPR-CAS9"을 지칭하는데, CRISPR-CAS9는 3세대 유전자가위로서, 이용하고자 하는 특정 염기서열을 인식하여 절단하고 편집하며, 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 조작을 간단하고 신속하고 효율성 있게 실시하는데 유용하다.
본 발명에서 "ERT2"는 "Estrogen receptor 2"의 약자로, 에스트로겐 수용체를 지칭하는데, 에스트로겐 수용체는 표적유전자 촉진자에 존재하는 에스트로겐응답 증폭자배열(공통배열: 5′-AGGTCANNNTGACCT-3′)에 호모이합체로서 결합하여 호르몬 의존적으로 전사를 촉진하는 전사조절인자로서 작용한다.
본 발명에서 "gRNA"는 "guide RNA"의 약자로, RNA를 편집할 때 수식반응의 주형이 되는 염기순서정보를 갖는 45~70뉴클레오티드가량의 작은 RNA를 지칭하는데, gRNA의 5′측 영역은 RNA 편집되는 mRNA의 일부와 상보적 순서로 되어 있고, 이 영역을 매개로 하여 mRNA에 결합되며, 3′측 영역에는 편집 후의 최종적 mRNA의 순서에 상보적 염기순서가 존재하고, 그 순서정보에 따라 우리딘 (uridine) 염기의 삽입이나 결실이라는 RNA수식반응이 일어난다.
본 발명의 일 실시예에서는, Cas9을 이용하여 원하는 시기에 특정 부분에서 DNA 변형 (modification)을 유도할 수 있는 단백질 복합체를 제조하기 위하여, Cas9과 ERT2를 연결하는 구조를 구상하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, TIF1γ 유전자 넉아웃(knockout)을 위한 벡터를 제조하였으며(실시예 2 참조), 상기 벡터를 이용해 형질전환 된 생쥐 배아를 생성하여, TIF1γ 유전자의 넉아웃을 유발할 수 있는 생쥐를 생산하였다(실시예 3 참조).
이에, 본 발명은 간 섬유화 동물 모델의 제조방법 및 이를 통해서 제조된 간 섬유화 동물 모델을 제공한다.
보다 구체적으로 상기 제조방법은 a) Cas9-ERT2 단백질 복합체, TIF1γ gRNA, U6 프로모터, 및 LRAT 프로모터를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터(vector)를 제조하는 단계; b) 상기 재조합 벡터를 대리모 동물의 배아에 미세주입 하는 단계; 및 c) 상기 배아를 대리모 동물의 난관에 외과적 방법으로 이식하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 TIF1γ 유전자 넉아웃 생쥐를 간 섬유화의 치료 및 연구에 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명에서 "TIF1γ(transcriptional intermediary factor 1 gamma)"는 세포의 분화(cell differentiation) 및 발달(development)에 관여하는 전사 인자로, Tripartite motif-containing 33(TRIM33)으로도 알려진 유전자로서, 간성상세포(hepatic stellate cell; HSC)의 활성을 억제하고, 평활근 액틴(α-smooth muscle actin; α-SMA) 단백질의 발현 또는 collagen Type I의 분비를 감소시킴으로써, 궁극적으로 간 섬유화 예방 또는 치료에 영향을 미친다.
본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃(knockout)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 결실, 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절(down-regulation)을 의미하는바, 타목시펜 처리에 의해서 TIF1γ 유전자가 넉아웃 된 돌연변이체는 헤테로 돌연변이체(+/-) 역시 포함하며, 이를 통하여 간 섬유화를 유발할 수 있는 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 유발되는 질병인 "간 섬유화(liver fibrosis)"는 만성염증상태에 있는 간 조직이 손상과 재생을 반복하여, 조직 중에 콜라겐 등과 같은 결합조직이 과도하게 축적됨으로써, 간 조직에 흉터(scar)가 생기는 질환을 의미한다. 일반적으로 간 섬유화는 간경화와는 달리 가역적(reversible)이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule)형성이 없다. 또한, 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있다. 그러나 이러한 간 섬유화 기작이 반복적으로 지속되면, 결합조직 간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)가 축적되며, 간소엽의 정상구조를 상실하여 결절을 형성하는 것을 특징으로 하는 비가역적인(irreversible) 간경화로 진행된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 단백질 복합체의 발현양상을 확인하기 위하여 면역염색법을 수행하였다(실시예 5 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. DNA 변형 유도 단백질 복합체의 제조
본 발명자는, DNA 변형 유도 단백질 복합체를 제조하기 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이, 발현 시에 핵 내로 이동하는 Cas9을 보다 정교하게 조절하고자, Cas9의 nuclear localization signal (NLS)을 제거하여 세포질 (cytoplasm)에 존재하도록 하였고, 상기 NLS이 제거된 Cas9의 N-말단 및 C-말단에 ERT2를 융합시켜 제조한 Cas9-ERT2 단백질 복합체에 타목시펜 (tamoxifen; TMX)을 처리하여 특정시점에 핵 (nucleus) 내로 이동시킬 수 있는 Cas9-ERT2 단백질 복합체(ERT2-Cas9-ERT2)의 구조를 구상하였다(도 2a 참조).
특히, 원하는 시점에 특정한 유전자를 변형시킬 수 있도록 DNA 변형 유도 단백질 복합체를 설계하고, 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 의 gRNA (guide RNA), U6 프로모터, 간성상세포 특이적 프로모터 (LRAT 프로모터), 및 Cas9-ERT2를 연결한 구조를 구상하였다(도 2b 참조).
실시예 2. 재조합 벡터의 제조
본 발명의 일 실시예로, 본 발명의 단백질 복합체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하였다(도 3a 및 도 3b 참조). 구체적으로, Addgene으로부터 pCAG-ERT2CreERT2 (#13777)와 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (#42230) 플라스미드를 구매하였고, Santa Cruz로부터 mouse TIF1γ CRISPR/Cas9 knockout (KO) 플라스미드 (sc-430111)를 구매하였다. mouse LRAT (Lecithin retinol acyltransferase) 프로모터 시퀀스 (promoter sequence)는 promoter prediction (http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)를 사용해 높은 활성이 예측되는 시퀀스 (-5,500 to + 72 bps)를 선택하였고, 보통의 mouse DNA (C57BL/6N)를 사용하여 하기 표 1과 같은 특이적 프라이머와 함께 PCR을 수행해 LRAT 프로모터를 획득하였다.
| Primer sequence (5'-3') | |
| Forward | GACATTGATTATTGACTAGTCCTTAAAGAGAGGCATCCGGGGTC |
| Reverse | GTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATGACGCTCACGCTAAAGAGCTTGAAG |
상기 LRAT 프로모터에 의존적이면서, 타목시펜으로 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 발현 조절이 유발되는 플라스미드를 생성하기 위해, CAG 프로모터와 pCAG-ERT2CreERT2의 Cre는 LRAT 프로모터와 SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9)으로 각각 대체하였다.
그 다음, U6 프로모터를 갖는 하기 표 2의 TIF1γ gRNA 3개를 상기 플라스미드에 삽입하였다.
| gRNA sequence (5'-3') | |
| gRNA 1 | GGTGCGGCTGGGCCCGACGA |
| gRNA 2 | CTACATTCTTGACGACATAC |
| gRNA 3 | GAAGATAATGCAAGTGCAGT |
이렇게 제조된 pLrat-ERT2Cas9ERT2-TIF1γ gRNA 플라스미드는 생어 염기서열 분석 (Sanger Sequencing)에 의하여 확인되었다.
실시예 3. 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 발현 조절 형질전환 생쥐의 생산
특정시점에, 타목시펜으로 TIF1γ 유전자의 넉아웃(knockout)이 유발되어 유전자의 발현이 조절되는 형질전환(transgenic; TG) 생쥐를 생산하기 위하여, 5 내지 8주령의 C57BL/6N 암컷 생쥐에 임마혈청성 생식샘자극호르몬(pregnant mare serum gonadotrophin; PMSG) (7.5IU) 및 인간융모막성 생식샘자극호르몬(human chorionic gonadotropin; hCG) (5IU) 을 각 48시간 간격으로 복강내(Intraperitoneal; IP) 주사하여 과배란을 유발시켰으며, hCG을 주사한 후, 상기 암컷 생쥐를 C57BL/6N 번식용 수컷 생쥐와 교배시켰다. virginal plug를 통해 암컷 생쥐의 임신여부를 확인하고, 암컷 생쥐로부터 수정된 배아를 수확하였다.
상기 배아에, 도 4에 나타낸 바와 같이, 타목시펜을 통한 TIF1γ 유전자의 넉아웃을 유발하는 DNA (pLrat-ERT2Cas9ERT2-TIF1γ gRNA) 3개를 AvrII/PvuI으로 이중 절단(double cut)하여 선형화 해 미세주입(microinjection)용으로 준비하였고, 1-세포기 배아(one cell staged embryo)에 상기 DNA 3개를 같은 농도로 미세 주입하였다. 이와 같은 형질전환 생쥐의 생산에 표준 미세주입 절차가 사용되었다(마크로젠, 서울, 대한민국).
상기 3개의 DNA 혼합물 총 4ng/ul을 접합자(zygote)의 전핵(pronucleus)에 미세조작기(micromanipulator)를 사용하여 직접적으로 주입하였고, 이처럼 DNA 혼합물을 미세주입 한 배아를 37℃에서 1-2시간 동안 배양하였다. 상기 배아 중 14 내지 16개를 가상 임신한 대리모(pseudo-pregnant recipient) 생쥐(ICR)의 난관에 외과적 방법을 사용하여 이식하였다.
이와 같은 방법으로 생산되는 형질전환 생쥐는 ㈜마크로젠(서울, 대한민국)에서 병원체가 없는 조건 하에 교배되었으며, 모든 조작은 ㈜마크로젠의 실험동물운영위원회의 승인을 받아 수행되었다.
실시예 4. 간 섬유화 억제 유전자 (TIF1γ) 발현 조절 형질전환 생쥐의 분석
4-1. PCR 분석(PCR analysis)
실시예 3의 방법으로 생산된 TIF1γ 유전자 발현 조절 형질전환 생쥐의 pLrat-Cas9ERT2-TIF1γ gRNA를 확인하기 위하여 DNA 게놈 꼬리(genomic tail)에서 PCR 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.
| Primer sequence (5'-3') | ||
| Cas9-ERT2 | Forward | TGCTACAGAACAGTTGCAGCC |
| Reverse | ACCTTGTACTCGTCGGTGATC | |
| TIF1γ gRNA |
U6-F | GTCGACGAGGGCCTATTTCCCATGATT |
| gRNA1-R | TCGTCGGGCCCAGCCGCACC | |
| gRNA2-R | GTATGTCGTCAAGAATGTAG | |
| gRNA3-R | ACTGCACTTGCATTATCTTC | |
4-2.
웨스턴
블롯
분석(Western blot assay)
실시예 3의 방법으로 생산된 TIF1γ 유전자 발현 조절 형질전환(transgenic; TG) 생쥐의 타목시펜(Tamoxifen; TMX) 처리에 따른 TIF1γ 발현 조절 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 상기 형질전환 생쥐에 타목시펜을 주입하여 간 섬유화 억제 유전자인 TIF1γ를 in vivo에서 넉아웃 시킨 다음, 간 조직을 회수해 TIF1γ 단백질의 발현 여부를 확인하였다. 평활근 액틴(α-smooth muscle actin; α-SMA)은 일반적으로 활성화된 간성상세포에서 유발되는 간 섬유화 표지자로서, 상기 α-SMA 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯으로 분석해 간 섬유화 정도를 평가하였다. 글리세르알데하이드-3-인산 수소 이탈 효소(GAPDH)는 유전자 발현에 있어 상대적인 변화를 계산하기 위해 내부 대조군(internal control)으로 사용되었다.
구체적으로, 배양한 세포 또는 조직 샘플은 protein lysis buffer(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5% deoxycholate, 1% NP40 및 protease inhibitor cocktail [Roche, Indianapolis, IN, USA]가 포함된 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS])에 용해시켰다. 전체 단백질 추출물 (2530μg)을 5분 동안 95℃에서 끓인 후, SDS-PAGE로 분리한 후, BioRad transfer unit(BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 polyvinylidene fluoride membranes(PVDF; Millipore, Darmstadt, Germany)으로 옮겼다. PVDF는 0.1% Tween-20를 포함하는 Tris-buffered saline (TBS)으로 희석한 5% skim milk로 차단하고, 1차 항체로 α-SMA(1:3000, Abcam) 또는 TIF1γ 항체(1:1000, Abcam)를 사용하여 배양하였으며, anti-α-tubulin antibody (1:5000, Sigma-Aldrich) 또는 anti-GAPDH antibody (1:30,000, Sigma-Aldrich)를 내부 대조군으로 사용하였다. 이후 PVDF를 세척한 후 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies로 배양하였고, 세척한 다음 면역 반응을 확인하여 TINA 2.0 (RayTest) 또는 ImageJ (National Institutes of Health) 프로그램을 이용하여 정량화하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, pLrat-ERT2Cas9ERT2-TIF1γ gRNA 형질전환 생쥐의 경우, TIF1γ 유전자가 넉아웃 되었고, α-SMA 단백질이 발현되어 간 섬유화가 유도되었음을 관찰 할 수 있었다. 이는 상기 형질전환 생쥐를 간 섬유화의 치료 및 연구에 유용하게 사용할 수 있음을 시사한다.
실시예 5. DNA 변형 유도 단백질 복합체의 발현 분석
실시예 2의 방법으로 제조 된 DNA 변형 유도 단백질 복합체의 발현양상을 확인하기 위하여 면역염색법을 수행하였다. 이를 위하여, LX2 Cell (Human hepatic stellate cell lines)에 transfection 후, 타목시펜(Tamoxifen; TMX) 1nM을 처리한 다음, 4시간 후 상기 TMX의 처리 유무에 따른 Target 유전자 (TIF1 gamma; TIF1γ)의 감소와 반대적 유전자(alpha SMA; α-SMA)의 증가 양상을 확인하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, TMX를 처리하지 않았을 때, 세포질 (cytosol)에 발현된 Cas9-ERT2 단백질 복합체의 핵 내로 이동이 억제되었고, α-SMA는 낮았으며, TIF1γ는 핵 내에 높게 발현되었다(도 6a 참조). 반면, TMX 처리 시 세포질에 발현된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 핵 내 이동함을 확인할 수 있었으며, α-SMA는 높았고, TIF1γ는 핵 내 발현이 감소되었다(도 6b 참조).
또한, 소프트웨어를 이용하여 Intensity에 따라 분석한 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, ROI 1 (up cell)과 벡터의 transfection이 이루어지지 않은 세포인 ROI 2 (down cell)을 비교하였을 때(도 7 참조), 세포질에 발현된 Cas9-ERT2 단백질 복합체가 TMX 처리로 핵 내 이동함을 확인할 수 있었고, ROI 1이 ROI 2보다 핵 내의 Cas9이 높았으며, 세포질에서 α-SMA이 높고, 핵 내 TIF1γ 발현이 감소하였다(도 8 참조).
참고로, 본 발명의 서열목록 리스트는 하기 표4와 같다.
| 서열목록 1 | Forward Primer |
| 서열목록 2 | Reverse Primer |
| 서열목록 3 | transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA 1 |
| 서열목록 4 | transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA 2 |
| 서열목록 5 | transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA 3 |
| 서열목록 6 | Cas9-ERT2 Forward Primer |
| 서열목록 7 | Cas9-ERT2 Reverse Primer |
| 서열목록 8 | transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA U6-F |
| 서열목록 9 | transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA gRNA1-R |
| 서열목록 10 | transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA gRNA2-R |
| 서열목록 11 | transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA gRNA3-R |
| 서열목록 12 | ERT2-Cas9-ERT2 |
| 서열목록 13 | RNA polymerase III promoter for human U6 snRNA |
| 서열목록 14 | LRAT promoter |
| 서열목록 15 | Cas9 (Csn1) endonuclease from the Streptococcus pyogenes Type II CRISPR/Cas system |
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL
<120> Liver fibrosis inducible recombinant vector and the method for
producing animal model using thereof
<130> MP17-072
<160> 15
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 1
gacattgatt attgactagt ccttaaagag aggcatccgg ggtc 44
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 2
gttcttctcc tttgctagcc atgacgctca cgctaaagag cttgaag 47
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA 1
<400> 3
ggtgcggctg ggcccgacga 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA 2
<400> 4
ctacattctt gacgacatac 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA 3
<400> 5
gaagataatg caagtgcagt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas9-ERT2 Forward Primer
<400> 6
tgctacagaa cagttgcagc c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas9-ERT2 Reverse Primer
<400> 7
accttgtact cgtcggtgat c 21
<210> 8
<211> 27
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA U6-F
<400> 8
gtcgacgagg gcctatttcc catgatt 27
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA gRNA1-R
<400> 9
tcgtcgggcc cagccgcacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA gRNA2-R
<400> 10
gtatgtcgtc aagaatgtag 20
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> transcriptional intermediary factor 1 gamma gRNA gRNA3-R
<400> 11
actgcacttg cattatcttc 20
<210> 12
<211> 6006
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERT2-Cas9-ERT2
<400> 12
atggctggag acatgagagc tgccaacctt tggccaagcc cgctcatgat caaacgctct 60
aagaagaaca gcctggcctt gtccctgacg gccgaccaga tggtcagtgc cttgttggat 120
gctgagcccc ccatactcta ttccgagtat gatcctacca gacccttcag tgaagcttcg 180
atgatgggct tactgaccaa cctggcagac agggagctgg ttcacatgat caactgggcg 240
aagagggtgc caggctttgt ggatttgacc ctccatgatc aggtccacct tctagaatgt 300
gcctggctag agatcctgat gattggtctc gtctggcgct ccatggagca cccagtgaag 360
ctactgtttg ctcctaactt gctcttggac aggaaccagg gaaaatgtgt agagggcatg 420
gtggagatct tcgacatgct gctggctaca tcatctcggt tccgcatgat gaatctgcag 480
ggagaggagt ttgtgtgcct caaatctatt attttgctta attctggagt gtacacattt 540
ctgtccagca ccctgaagtc tctggaagag aaggaccata tccaccgagt cctggacaag 600
atcacagaca ctttgatcca cctgatggcc aaggcaggcc tgaccctgca gcagcagcac 660
cagcggctgg cccagctcct cctcatcctc tcccacatca ggcacatgag taacaaaggc 720
atggagcatc tgtacagcat gaagtgcaag aacgtggtgc ccctctatga cctgctgctg 780
gaggcggcgg acgcccaccg cctacatgcg cccactagcc gtggaggggc atccgtggag 840
gagacggacc aaagccactt ggccactgcg ggctctactt catcgcattc cttgcaaaag 900
tattacatca cgggggaggc agagggtttc cctgccacag atctcgacat ggacaagaag 960
tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 1020
tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag 1080
aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 1140
aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 1200
atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 1260
ttcctggtgg aagaggataa gaagcacgag cggcacccca tcttcggcaa catcgtggac 1320
gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 1380
agcaccgaca aggccgacct gcggctgatc tatctggccc tggcccacat gatcaagttc 1440
cggggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 1500
ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 1560
ggcgtggacg ccaaggccat cctgtctgcc agactgagca agagcagacg gctggaaaat 1620
ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggaaacct gattgccctg 1680
agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 1740
cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 1800
cagtacgccg acctgtttct ggccgccaag aacctgtccg acgccatcct gctgagcgac 1860
atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga 1920
tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1980
gagaagtaca aagagatttt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacattgac 2040
ggcggagcca gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 2100
ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgcggaa gcagcggacc 2160
ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc cattctgcgg 2220
cggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 2280
accttccgca tcccctacta cgtgggccct ctggccaggg gaaacagcag attcgcctgg 2340
atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 2400
ggcgcttccg cccagagctt catcgagcgg atgaccaact tcgataagaa cctgcccaac 2460
gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta taacgagctg 2520
accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 2580
aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaaccgga aagtgaccgt gaagcagctg 2640
aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 2700
gatcggttca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 2760
gacttcctgg acaatgagga aaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 2820
ctgtttgagg acagagagat gatcgaggaa cggctgaaaa cctatgccca cctgttcgac 2880
gacaaagtga tgaagcagct gaagcggcgg agatacaccg gctggggcag gctgagccgg 2940
aagctgatca acggcatccg ggacaagcag tccggcaaga caatcctgga tttcctgaag 3000
tccgacggct tcgccaacag aaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgaccttt 3060
aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg atagcctgca cgagcacatt 3120
gccaatctgg ccggcagccc cgccattaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 3180
gacgagctcg tgaaagtgat gggccggcac aagcccgaga acatcgtgat cgaaatggcc 3240
agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaacagcc gcgagagaat gaagcggatc 3300
gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 3360
cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atgggcggga tatgtacgtg 3420
gaccaggaac tggacatcaa ccggctgtcc gactacgatg tggaccatat cgtgcctcag 3480
agctttctga aggacgactc catcgacaac aaggtgctga ccagaagcga caagaaccgg 3540
ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgg 3600
cagctgctga acgccaagct gattacccag agaaagttcg acaatctgac caaggccgag 3660
agaggcggcc tgagcgaact ggataaggcc ggcttcatca agagacagct ggtggaaacc 3720
cggcagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 3780
gagaatgaca agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 3840
gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc 3900
cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3960
gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 4020
agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 4080
tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 4140
acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 4200
aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 4260
ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 4320
gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 4380
gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 4440
gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 4500
aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 4560
gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 4620
gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 4680
ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcacaagcac 4740
tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 4800
gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc catcagagag 4860
caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4920
aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4980
gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga cacggatcga cctgagccag 5040
ctgggcggcg acctcgagcc atctgctgga gacatgagag ctgccaacct ttggccaagc 5100
ccgctcatga tcaaacgctc taagaagaac agcctggcct tgtccctgac ggccgaccag 5160
atggtcagtg ccttgttgga tgctgagccc cccatactct attccgagta tgatcctacc 5220
agacccttca gtgaagcttc gatgatgggc ttactgacca acctggcaga cagggagctg 5280
gttcacatga tcaactgggc gaagagggtg ccaggctttg tggatttgac cctccatgat 5340
caggtccacc ttctagaatg tgcctggcta gagatcctga tgattggtct cgtctggcgc 5400
tccatggagc acccagtgaa gctactgttt gctcctaact tgctcttgga caggaaccag 5460
ggaaaatgtg tagagggcat ggtggagatc ttcgacatgc tgctggctac atcatctcgg 5520
ttccgcatga tgaatctgca gggagaggag tttgtgtgcc tcaaatctat tattttgctt 5580
aattctggag tgtacacatt tctgtccagc accctgaagt ctctggaaga gaaggaccat 5640
atccaccgag tcctggacaa gatcacagac actttgatcc acctgatggc caaggcaggc 5700
ctgaccctgc agcagcagca ccagcggctg gcccagctcc tcctcatcct ctcccacatc 5760
aggcacatga gtaacaaagg catggagcat ctgtacagca tgaagtgcaa gaacgtggtg 5820
cccctctatg acctgctgct ggaggcggcg gacgcccacc gcctacatgc gcccactagc 5880
cgtggagggg catccgtgga ggagacggac caaagccact tggccactgc gggctctact 5940
tcatcgcatt ccttgcaaaa gtattacatc acgggggagg cagagggttt ccctgccaca 6000
gcttga 6006
<210> 13
<211> 241
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNA polymerase III promoter for human U6 snRNA
<400> 13
gtcctttcca caagatatat aaagccaaga aatcgaaata ctttcaagtt acggtaagca 60
tatgatagtc cattttaaaa cataatttta aaactgcaaa ctacccaaga aattattact 120
ttctacgtca cgtattttgt actaatatct ttgtgtttac agtcaaatta attccaatta 180
tctctctaac agccttgtat cgtatatgca aatatgaagg aatcatggga aataggccct 240
c 241
<210> 14
<211> 5546
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LRAT promoter
<400> 14
ccttaaagag aggcatccgg ggtctgactg agagtgccaa tcccgtcttg gtgactccaa 60
ggcactgata ttttctcaga tcttggatgt caggaaatat caacatctac agctaacaca 120
cattcaaaag gacatgcaag cactcctgtg gaattcctga caaaaagtac tacctgaagg 180
tctgcatgaa taaacatcaa acccacactg atgtgtgttt gaaaaatcaa gttttgtttt 240
gctccgggag aaaataccat gacaaaggca gaggacatca gctatgtaac aatggatggg 300
caaggcgcca ttcagattgt ttcctgtaat ggccattact acaacaatca ggaaattctg 360
aggaagcctg aagtttacat gataatactg ctgatagttc tttgactttg ataattataa 420
aagtgtgatt atatacagag cagggttgag ggacaagtgg acatcaaagc tacaacttgc 480
taactggttg gaaaaatgtg tgtgcacaca tgtgtccata tatacaggtg aagggtaaag 540
tgtgggaatt ctttggacat ttttttttca gatatttaag agatctatta tgaaaattaa 600
ggactaaaaa agtgtcttcc tttctctatt gattgggtcc tttccatttt agggttgaac 660
atcttgagtg agttcagctt tgacattcac ttcatgtgct ttgtttctga gttaagtatt 720
tagatgctac actggccaga atattggaaa aatggtctat ctagagatcc tcagtggcct 780
cttctagcaa gtctcagaag gagacagccc atagctaata tactttaaga aacagagagg 840
gcaacagaaa ccaaagaatt gcacacccat ctaacacaca caagagctga tatcagcatc 900
tagacttata atcagcccaa atacacatgt ctattcgcct ggactttgtg tagaatcaaa 960
ataacagcca ggacattata tctctattag agcaaaacaa tccttctaca gtggaccctg 1020
aaaaatgcaa cttagccaaa gcccatgcca gggacgtcaa aatagctgta ataaatatgc 1080
tatatgtatt taaagatgat atgaataaat ccattaattt atggaacaca aagcatagaa 1140
tgaaatttaa aaaatgttca agacatggcg gtgaaaaaag aatcaatgaa gaaaccccaa 1200
actgatggaa aacaaaatga aaactgtagg aagtcaaacg ggatcctcag aggcgagtct 1260
cagtaacaga agacaagaga aggaagagag aatcttacac agtgaagata agataaaaga 1320
aatgctgata cctcagtcaa agaaaatctg agctctggag cagacccaat ttaagaataa 1380
taggaacaaa ggatgcatga gaaactcagg tcaaaggtac taggtatcta catagaaatc 1440
aaaaacaagc aaacaagcag acgtcttatt aggaacttaa tagaactgaa agctctaggg 1500
taaaaagaaa tagcacccaa aaggagaagg tggcaataaa taatcaagct cagggttgaa 1560
atcagtaaaa tagaaacaaa atatttacaa agaatcaata ggacaaagaa ctggttcttt 1620
gagaaaatca gttaagactg acaaaccctt agccaattga ctaagagaca gcctaagcag 1680
acccacacta gcaatccctg tacccaggag taggaccaac acaaaaccaa ctcaatgcag 1740
ttttggacgt actttatctc aatgttttgt gacagcattt tttttaactt tacaaatctt 1800
tgaggaaata ttacatagtt tgtgttttta taggattcct gtatataaaa ggtacatgtc 1860
tctatattta tatatgtgtc ttgtgctttt tatttgactc tttttcttct gctttctaag 1920
gaagacagta gggtgtggat cttagtagaa gggtagatgg ggaggagctt gttaggggag 1980
gggaactgaa atcagaatgt atgaaatcag tattgtatga aaaatttgtt ttcaataaaa 2040
acaatgaaat atatattgaa aaatttgttt tcaatataag catgtttata tttccattta 2100
gtgctccatc atgaggctga gtgtgggctt ccttgaagat aagactaaat agtcctttta 2160
gttggcaaaa tttgcaattc aggttttgtc tcttaaggtg attgatgaat tagctgctca 2220
gtatttaata ttacatgggt ttaaatgata catagaaatc tacttttaat tatattttaa 2280
tctatagtta agtatcacaa taaaacagtg attttgtata ataatttttg tttaaaactt 2340
tgctggtcat ggtgctatat gcctttaatg ttagcatctg agagtctgaa gcaagcagat 2400
ctctgtggct tcaaggccag ggctacaagt gaggccctgt ctctaagtaa ataaatacat 2460
tttgacttgg ggtccaactt ttctatattt ttttatcatt aatatgattc tcccactcac 2520
acctcaccat caaactcatt tagtcctaaa gactgtcaac caacaacgaa agagcttata 2580
aaggccgttc taatagatgt ggacaagtgc tctcaagaca tggctcaggg gtctctcact 2640
tttctgttag catggcgatc aggcctctgc accctagtgg atggcaccac tcagcaggtt 2700
tggtagcttc ttcagaagct gcaggacaag atgggggtgg gtatcttctg ttttgttttt 2760
ctagtactag ggacagaacc cagatcctca cacatgtgct ccagtgagct acacgtccag 2820
ttccagactc tttccaccca cagccttaca cgttgtatct actccctctg ttcctggcag 2880
gggaacaaaa ccctgcctgc ccttagccgt gattctacct tggtctatgg tttcgaaccc 2940
actgcttccc actggttttc tttctttttt cctatttctg agacagggcc tcaacatgtc 3000
gtcctggctg acctgggtct caggatgtgg cctctcactc acagagatct gcctgcctct 3060
gctttctgag tgccgggatt aaagacacaa gtcaccatgc ccagcactta aggtgttttt 3120
cactgtcgtg tggcttttgt ctccccatct cacccccttt attgttcata aaaccgcgta 3180
gaatccccac ttaaaataac ttccattcga gcctatttct tttttgcaaa gtttcttgaa 3240
atagtataaa cttttattac tgtgtttgca tgtgagggcc cgtagcaccc aagtggagct 3300
cagagaacct cctgccggtg gctctcgcct accatggact cttcagatgg aacttgggcg 3360
gcttcctaat aatctgtgta cctctcctag cccttcctcc ctataccagt aagaacaatg 3420
tgttgaaaga ggaccactgg ccttaagaca agtagaaaaa gcactacaag tgacaatggt 3480
gtgggaaaga agtactggtt gattttgttg aacttccagg aaggggacag tgcatggcag 3540
agcaggtaga cggtaaggaa aaagatgatt gtggatgggt tgatgaaaga tcatgcctac 3600
ttcttctttc tatccatttg aggcagtggg gagatgtggg gtgtgctgca gtgagattta 3660
caatcatctg tgaagtgaac gaatgaccaa aagtgcagcg acatggacag attgcttata 3720
gcagtcaggg ggcaaaggct caggcctcca aagaggggtg gcctcaggcc tcagcctggt 3780
ctaggttcca tcatggcaga gatctcagcc gggcagtggt gatgcatgcc tgtaatccca 3840
gcacttggga ggcagaggca ggtggatttc tgagttcgag gccagcctgg tctacagagt 3900
gagttccagg acagccagga ctgcagagaa accctgtctc aaagagagag gagaggagag 3960
agagagagag aggagaggga gagagaggga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 4020
gagagagaga gagagagaga aaagagatag gagagagaga gagagagaaa agagataggg 4080
gagagagaga agagatagga gagagagaga gagaaaagag ataggagaga gagagagaga 4140
aaagagatag gggagagaga gagagaagag ataggagaga gagagagaga gagagagaga 4200
gagagagaga gagagagaga gagagaagag ataggagaga gagagagaga gagagagaga 4260
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaaa agatagcctg gagcttaagc 4320
tttcttagtt ttgtggcgct tgtggccttt gtctggggga atttactcat ttacataatg 4380
aattagcaca gaaattcagg cgggtctgag cacccaaagc ccagccctgc agagccccag 4440
cagcctcctt aggcagctcc cccaccccct tcgactgtgc ctgggttctg ctgcaagcgt 4500
gcaccgcctt gcagaaccat aacgttctct ttccttaagt ctccctggac ggcagggagc 4560
tctttaccaa aagctaccag tcgttgtgtg aagcgaagct gggacctgac atcaaagaaa 4620
cttggcttga ctcctgcttt gctggagggc gttggggttt ttttgatgac cgttggaagg 4680
cgcgcgctca acaggcactg gagccttgga gcgtccagac tgttgggttc cgatcctccg 4740
cgctggggca ctggacgaac agagagccat tccacttctc cgcgtgccac ctgagagctc 4800
atggatgctt gcgtgtttaa aacgacaaag atcagtttaa gtaggatctg caggaattcg 4860
cggagccggc actttggcga atcaaagcaa attctttagt aagctgaggg ccacggtatt 4920
attatcggtt agagcgggtc ccataccgaa attttacaga aggcgcttct caccgccaag 4980
aaaggtgctc cattcctggc aggtgcagga tctttcgcgc ggccacgcct ctggcatctc 5040
tcctacgctg gctgtttaaa ggtctcccta gtgaagcaga gcgctcgagg agaagtcagg 5100
gtgcagaacg cccgtgccca atccgtgttc tccggcctgt gaccgcattc ggcccgccct 5160
ctgcacctct ataagagcca cagcgaagag cgcacccaga gcaccgcccc caggcacact 5220
acctcttcag ctcctcaagc gcgggtgcca ctgttcccac agccgaccga cactacttcc 5280
tttctttgac cccctgcact gggtggctga gccaagcact ttggcttctc ctctgatctc 5340
ttgctctcct ggctctgggc agccgcagcg gtgctccgca ggtgagcagc gctgcagcgc 5400
ggcgatccgg agagctcacc tcgtacagaa cagttgcagc cagtggttgg ttgccttagg 5460
atgaagaacc caatgctgga agctgcgtcc ctcctcctgg agaaactgct ccttatttcc 5520
aacttcaagc tctttagcgt gagcgt 5546
<210> 15
<211> 4104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas9 (Csn1) endonuclease from the Streptococcus pyogenes Type II
CRISPR/Cas system
<400> 15
atggacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120
cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180
gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240
tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300
ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360
aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420
aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480
atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540
gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600
atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660
cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac 720
ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780
gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840
cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900
ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960
atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020
cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080
ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140
gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200
aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260
gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320
gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380
agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440
gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500
aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560
tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620
agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680
gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740
tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800
atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860
ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920
cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980
aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040
gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100
agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160
cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220
gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280
atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340
atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400
gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460
gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520
atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580
gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640
aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700
accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760
ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820
actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880
aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940
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gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300
cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360
gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420
tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480
aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540
tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600
tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660
cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720
cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780
cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840
atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900
cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960
cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020
gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080
gacctgagcc agctgggcgg cgac 4104
Claims (7)
- (a) 제1의 프로모터, 및 이와 작동가능하게 연결된 TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma)의 gRNA(guide RNA); 및
(b) LRAT (Lecithin retinol acyltransferase) 프로모터, 및 이와 작동가능하게 연결된 Cas9 (CRISPR associated protein 9)의 N-말단 및 C-말단에 ERT2 (Estrogen receptor 2)가 융합된 단백질 복합체를 암호화하는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는, 간 섬유화 동물 모델 제조용 재조합 벡터로서,
상기 Cas9은 NLS (nuclear localization sequence)가 제거된 Cas9이고,
상기 LRAT 프로모터는 서열번호 14의 염기서열로 표시되고,
상기 TIF1γ의 gRNA는 서열번호 9 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 제1의 프로모터는 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 U6 프로모터인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 TIF1γ는 간 섬유화 억제 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
- a) 제1항의 재조합 벡터를 제조하는 단계:
b) 상기 재조합 벡터를 대리모 동물의 배아에 미세주입 하는 단계; 및
c) 상기 배아를 대리모 동물의 난관에 외과적 방법으로 이식하는 단계를 포함하는 간 섬유화 동물 모델의 제조방법으로서,
상기 대리모 동물은 인간을 제외한 동물인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 삭제
- 제5항의 방법으로 제조된 간 섬유화 동물 모델.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170077215A KR101919240B1 (ko) | 2017-06-19 | 2017-06-19 | 간 섬유화 유도 벡터 및 이를 이용한 동물모델 제조방법 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR101919240B1 true KR101919240B1 (ko) | 2018-11-15 |
Family
ID=64363468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170077215A KR101919240B1 (ko) | 2017-06-19 | 2017-06-19 | 간 섬유화 유도 벡터 및 이를 이용한 동물모델 제조방법 |
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|---|---|
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| WO (1) | WO2018236079A1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103668472B (zh) * | 2013-12-31 | 2014-12-24 | 北京大学 | 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法 |
-
2017
- 2017-06-19 KR KR1020170077215A patent/KR101919240B1/ko active IP Right Grant
-
2018
- 2018-06-07 WO PCT/KR2018/006451 patent/WO2018236079A1/ko active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Herquel, B. et al., PNAS, 2011, 108(20):8212-8217 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018236079A1 (ko) | 2018-12-27 |
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