KR101913904B1

KR101913904B1 - 1차 아민 및 디오스제닌 컨쥬게이트, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR101913904B1
Application number: KR1020160054713A
Authority: KR
Inventors: 전창주; 채방영
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2016-05-03
Filing date: 2016-05-03
Publication date: 2018-10-31
Also published as: WO2017191893A1; KR20170124818A

Abstract

본 발명은 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 디오스제닌의 3-OH 위치에 친수성 선형의 1차 아민을 도입함에 따라서, 암세포막 투과도가 향상되어 항암활성이 디오스제닌 자체에 비해 현저히 향상되는 효과가 있다.

Description

1차 아민 및 디오스제닌 컨쥬게이트, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암용 조성물{Primary amine and diosgenin conjugates, preparation method thereof, and anti-cancer composition comprising the same}

암은 우리나라에서 순환기 질환과 함께 가장 많이 발생하는 질환이다. 정상적으로 세포는 세포내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하며 세포수의 균형을 유지하며 살아간다. 이러한 세포가 손상을 받는 경우, 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 되어 통제되지 못하고 과다하게 증식할 뿐만아니라, 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 경우가 있다. 이 상태를 암 또는 종양(cancer)이라 정의하고 있다.

종양에는 양성종양과 악성종양이 있으며, 양성종양은 비교적 서서히 성장하며, 신체 여러 부위에 확산, 전이하지 않으며 제거하여 치유시킬 수 있는 종양을 말하고 특이한 경우를 제외하고 대개의 양성종양은 생명에 위협을 초래하지는 않는다. 이와 달리 악성종양은 빠른 성장과 침윤성(파고들거나 퍼져 나감) 성장 및 체내 각 부위에 확산 전이(원래 장소에서 떨어진 곳까지 이동함)하여 생명에 위험을 초래하는 종양을 말한다.

암세포가 발생하는 기전은, 세포가 성장(Growth), 분화(Differentiation), 프로그램된 죽음(Apoptosis)의 과정을 밟거나 성장이 정지된 상태를 유지하고 있으나 세포의 유전자 중 일부에 이상이 발생하여 이들 유전자의 산물인 단백질의 특성이 바뀌게 되고 그 결과로 세포 성장 조절에 이상이 발생하여 암세포가 생기는 것으로 생각하고 있다.

신약 개발에 있어서, 천연 재료는 새로운 항암제의 주요 공급원이다. 2000-2013년 사이에 FDA에서 매년 승인하는 신약의 17%는 천연 재료 유래 신약이다.

천연 재료 형태로서 식물성 스테롤(Phytosterols)은 의약화학 및 생화학 분야에서 전세계적으로 관심을 받고 있는데, 이는 신약 개발을 위해 식물성 스테롤을 사용하면 생체적합성, 생분해성, 다양한 생리활성, 높은 세포막 투과력, 단순한 변형 과정을 통해 치료제로서의 높은 잠재력이라는 장점이 있기 때문이다.

디오스제닌(Diosgenin)은 천연적으로 형성되는 스테로이드성 사포닌으로서, 주로 콩류(legumes) 및 참마(yams)로부터 분리되고, 높은 생체적합성 및 다양한 약리학적 활성을 나타낸다.

수년 간, 디오스제닌은 암, 뇌졸중, 알츠하이머, 당뇨병, 골다공증, 항염증 등의 치료효과에 대해서 연구되어 왔다. 그러나, 임상결과 디오스제닌은 다양한 유익한 성질에도 불구하고, 약한 활성, 짧은 반감기 및 낮은 약물동력학을 보여 왔다. 또한, 디오스제닌은 내성암(resistant cancers) 치료에 무력한 결과를 나타냈는데, 이는 p-당단백질(p-glycoprotein, 장세포에서 약물을 밖으로 배출시킴)이 되는 것이 증명되었기 때문이다.

이에, 디오스제닌을 단순하면서도 효과적으로 개질하여, 활성을 높이는 연구가 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 디오스게닌(diosgenin, DG)의 3-OH 치환기 위치에 친수성 선형의 1차 아민을 도입한 컨쥬게이트가, 암세포막 투과도가 향상되어 항암활성이 디오스제닌 자체에 비해 현저히 향상되는 효과가 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

Nutrients 2015, 7, 4938-4954

본 발명의 목적은 디오스제닌에 비하여 항암활성이 현저히 향상된, 친수성 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 연결된 컨쥬게이트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 선형의 1차 아민 및 디오스제닌(Diosgenin)이 링커로 결합된 컨쥬게이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

상기 선형의 1차 아민 및 디오스제닌(Diosgenin)이 링커로 결합된 컨쥬게이트는 하기 화학식 4 또는 화학식 6으로 표시되는 것을 특징으로 한다.

[화학식 4]

상기 화학식 4에서,

n은 0-2의 정수이다.

[화학식 6]

상기 화학식 6에서,

R은

,

또는

이다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

디오스제닌 (DG)를 유기용매에서 p-4-톨루엔설포닐 클로라이드와 반응시켜 화합물 1을 얻는 단계(단계 1);

화합물 1을 유기용매에서 에틸렌글리콜과 반응시켜 화합물 2를 얻는 단계(단계 2);

화합물 2를 유기용매에서 p-4-톨루엔설포닐 클로라이드와 반응시켜 화합물 3을 얻는 단계(단계 3); 및

화합물 3을 유기용매에서 1차 아민과 반응시켜 화합물 4를 얻는 단계(단계 4);를 포함하는 화학식 4로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서, n은 0-2의 정수이다.

나아가, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,

디오스제닌을 유기용매에서 트라이포스젠과 반응시켜 화합물 5를 얻는 단계(단계 1); 및

화합물 5를 유기용매에서 1차 아민과 반응시켜 화합물 6을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하는 화학식 6으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.

[반응식 2]

상기 반응식 2에서,

R은

,

또는

이다.

또한, 본 발명은 상기 컨쥬게이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 친수성 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트는, 디오스제닌의 3-OH 위치에 친수성 선형의 1차 아민을 도입함에 따라서, 암세포막 투과도가 향상되어 항암활성이 디오스제닌 자체에 비해 현저히 향상되는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 선형의 1차 아민은 에틸렌다이아민(EDA), 다이에틸렌트라이아민(DETA), 아민, 2,2'-다이싸이오(에틸아민), 테트라메틸렌다이아민, N1,N2,N3-트리스(tert-부톡시카보닐)-트리에틸렌테트라아민, 트라이에틸렌테트라아민 (TETA) 등을 사용할 수 있다.

상기 링커는

또는

일 수 있고, 여기서 X는 선형의 1차 아민이고, DG는 디오스제닌이다.

바람직하게, 상기 선형의 1차 아민 및 디오스제닌(Diosgenin)이 링커로 결합된 컨쥬게이트는 하기 화학식 4 또는 화학식 6으로 표시되는 화합물이다.

[화학식 4]

상기 화학식 4에서,

n은 0-2의 정수이다.

[화학식 6]

상기 화학식 6에서,

R은

,

또는

이다.

본 발명에 따른 친수성 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트는, 디오스제닌의 3-OH 위치에 친수성 선형의 1차 아민을 도입함에 따라서, 암세포막 투과도가 향상되어 항암활성이 디오스제닌 자체에 비해 현저히 향상되는 효과가 있다(실험예 1 및 표 1).

본 발명의 상기 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.

이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다.

또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트를 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 선형의 1차 아민 및 디오스제닌이 링커로 결합된 컨쥬게이트 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체 등을 모두 포함한다.

제법 1

본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

[반응식 1]

상기 반응식 1에서,

n은 0-2의 정수이다.

본 발명에 따른 제법 1에 있어서, 상기 단계 1은 디오스제닌 (DG)를 유기용매에서 p-4-톨루엔설포닐 클로라이드와 반응시켜 화합물 1을 얻는 단계이다.

구체적으로, 단계 1에서 사용가능한 용매로는 피리딘, 다이클로로메탄(DCM), 1,4-다이옥산, 다이메틸포름아마이드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 피리딘 및 다이클로로메탄(DCM)을 혼합하여 사용할 수 있다. 반응온도는 -10 내지 25 ℃일 수 있고, 바람직하게는 0-5℃일 수 있다. 반응시간은 10분 내지 3시간일 수 있다.

본 발명에 따른 제법 1에 있어서, 상기 단계 2는 화합물 1을 유기용매에서 에틸렌글리콜과 반응시켜 화합물 2를 얻는 단계이다.

구체적으로, 단계 2에서 사용가능한 용매로는 피리딘, 다이클로로메탄(DCM), 1,4-다이옥산, 다이메틸포름아마이드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 1,4-다이옥산을 사용할 수 있다. 반응온도는 70-110℃일 수 있고, 바람직하게는 80-100℃일 수 있다. 반응시간은 1-5시간일 수 있고, 바람직하게는 2-4시간일 수 있다.

본 발명에 따른 제법 1에 있어서, 상기 단계 3은 화합물 2를 유기용매에서 p-4-톨루엔설포닐 클로라이드와 반응시켜 화합물 3을 얻는 단계로 상기 단계 1과 동일하게 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 제법 1에 있어서, 상기 단계 4는 화합물 3을 유기용매에서 1차 아민과 반응시켜 화합물 4를 얻는 단계이다.

구체적으로, 단계 4에서 사용가능한 용매로는 피리딘, 다이클로로메탄(DCM), 1,4-다이옥산, 다이메틸포름아마이드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 다이메틸포름아마이드(DMF)를 사용할 수 있다. 반응온도는 10-35℃일 수 있고, 바람직하게는 20-25℃일 수 있다. 반응시간은 10-30시간일 수 있고, 바람직하게는 20-26시간일 수 있다.

제법 2

본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,

[반응식 2]

상기 반응식 2에서,

R은

,

또는

이다.

본 발명에 따른 제법 2에 있어서, 상기 단계 1은 디오스제닌을 유기용매에서 트라이포스젠과 반응시켜 화합물 5를 얻는 단계이다.

구체적으로, 단계 1에서 사용가능한 용매로는 피리딘, 다이클로로메탄(DCM), 1,4-다이옥산, 다이메틸포름아마이드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF), 트리에틸렌아민(TEA) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 피리딘 및 테트라하이드로퓨란(THF)을 혼합하여 사용할 수 있다. 반응온도는 1-30 ℃일 수 있고, 바람직하게는 15-25 ℃일 수 있다. 반응시간은 10-24시간일 수 있고, 바람직하게는 14-18시간일 수 있다.

본 발명에 따른 제법 2에 있어서, 상기 단계 2는 화합물 5를 유기용매에서 1차 아민과 반응시켜 화합물 6을 제조하는 단계이다.

구체적으로, 단계 2에서 사용가능한 용매로는 피리딘, 다이클로로메탄(DCM), 1,4-다이옥산, 다이메틸포름아마이드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF), 트리에틸렌아민(TEA) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 다이클로로메탄(DCM)을 사용할 수 있다. 반응온도는 -10 내지 25 ℃일 수 있고, 바람직하게는 0-5℃일 수 있다. 반응시간은 0.5-5시간일 수 있고, 바람직하게는 1-2시간일 수 있다.

용도

본 발명은 상기 선형의 1차 아민 및 디오스제닌(Diosgenin)이 링커로 결합된 컨쥬게이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암은 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 결장암, 혈액암, 간암 등일 수 있다.

본 발명에 따른 컨쥬게이트는 디오스제닌의 3-OH 위치에 친수성 선형의 1차 아민을 도입함에 따라서, 암세포막 투과도가 향상되어 항암활성이 현저히 향상되는 효과가 있다.

본 발명에 따른 컨쥬게이트는 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001~100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01~35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07~7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7~2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1-3의 화합물은 하기의 반응식을 이용하여 제조하였다.

< 실시예 1> ( 3α , 25R)- 스파이로스트 -5-엔-3- 옥시에탄 - N1,N3 - 에틸렌다이아민 (4a)의 제조

단계 1: 화합물 1의 제조

디오스제닌 (200 mg, 0.48 mmol, 1 당량) 및 p-톨루엔설포닐클로라이드 (230 mg, 1.21mmol, 2.5 당량)이 용해된 무수 다이클로로메탄(DCM) 용액을 아이스 배스에 담긴 피리딘 (97 ul, 1.2 mmol, 2.5 당량) 용액에 15분간 천천히 첨가하였다. 피리딘에 첨가한 후 반응 혼합물을 상온까지 올리고, 차광하에 3시간 동안 교반하였다. 감압하에 용매를 제거하고 남은 혼합물은 5% HCl 용액을 첨가하여 침전시킨 다음, 여과하고 차가운 5% HCl 용액 (3 x 25 ml) 및 증류수 (2 x 50 ml)로 세척하였다. 얻어진 고체를 DCM에 용해시키고, MgSO₄로 건조시킨 후, 여과하고, 용매를 증발시킨 다음 화합물 1을 얻었고, 이를 다음 단계에 바로 사용하였다.

단계 2: 화합물 2의 제조

1,4-다이옥산 (2 ml)에 상기 단계 1에서 얻은 화합물 1 (200 mg, 0.48 mmol)을 첨가하고 교반한 용액을 무수 에틸렌글리콜 (0.65 ml, 12 mmol)로 처리하고, 질소 분위기 하에서 3시간 동안 환류시켰다. 반응 용액을 식히고 용매를 증발시켜 제거하였다. 연노랑색 고체가 얻어졌고, 이를 DCM에 용해시킨 다음, 순차적으로 NaHCO₃ 용액 (2 x10 ml), 물 (10 ml) 및 염수 (20 ml)로 세척하고, MgSO4로 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축하여 얻은 미정제된 생성물을 플래쉬크로마토그래피로 정제하여 화합물 2를 89% 수율로 얻었다.

단계 3: 화합물 3의 제조

상기 단계 1에서 출발물질인 디오스제닌 대신에 상기 단계 2에서 얻은 화합물 2를 출발물질로 한 것을 제외하고는 상기 단계 1과 동일하게 실시하여 화합물 3을 제조하였다.

단계 4: 목적 화합물 4a의 제조

수산화세슘 일수화물이 용해된 다이메틸포름아마이드(DMF) 용액을 건조 활성 분말 4 Å 분자체 (activated powdered dry 4 Å molecular sieves) 및 에틸렌다이아민(EDA)에 첨가한 다음, 상기 단계 3에서 얻은 화합물 3이 용해된 DMF 용액을 천천히 첨가하고, 상온에서 하룻밤 동안 강하게 교반하였다. 반응 혼합물에 1N NaOH 용액 (10 ml)를 첨가하여 반응을 종료하고, 고체를 제거하기 위해 여과하였다. 반응 용액은 감압하에 농축하여 고체를 얻었고, 이를 소량의 메탄올에 다시 용해하고, 무기염을 제거하기 위해 에틸에테르로 연마한(triturated) 다음, 여가하고 진공하에 건조하였다. 미정제 생성물을 플래쉬크로마토그래피로 정제하여 목적 화합물 4a를 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.33(1H, d, J = 5.03 Hz), 4.42 (1H, dd, J = 7.56, 14.52 Hz), 3.61 (1H, t, J = 5.59 Hz, 10.88 Hz), 3.49 (2H, dd, J = 4.71, 11.04 Hz), 3.37 (1H, t, J = 11.04 Hz,), 3.16 (1H, m), 2.84 (4H, m), 2.72 (2H, t, J = 6.05, 12.06 Hz), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J = 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 140.7, 121.5, 109.3, 80.8, 79.5, 77.4, 76.6, 69.6, 66.8, 65.4, 62.0, 56.5, 50.0, 41.6, 40.2, 39.7, 38.8, 37.0, 40.0, 32.0, 31.8, 31.4, 30.3, 28.8, 28.3, 20.8, 19.3, 17.1, 16.3, 14.5;

Calcd for formula: C₃₁H₅₂N₂O₃, 500.76.

< 실시예 2> ( 3α,25R )- 스파이로스트 -5-엔-3- 옥시에탄 - N1,N3,N6 - 다이에틸렌트라이아민 (4b)의 제조

상기 실시예 1의 단계 4에서 에틸렌다이아민(EDA) 대신에 다이에틸렌트라이아민(DETA)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 목적 화합물 4b를 제조하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.34(1H, d, J = 4.71 Hz), 4.67 (4H, s) 4.42 (1H, dd, J = 7.33, 14.42 Hz), 3.76 (2H, t), 3.48 (1H, dd, J = 4.71, 11.04 Hz), 3.37 (1H, t, J = 11.04 Hz,), 3.10 (1H, m), 2.95 (11H, m), 2.32 (1H, dd, J = 5.14, 13.03 Hz), 2.16 (1H, t), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J = 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 144.7, 140.5, 133.1, 129.7, 128, 121.5, 109.3, 80.8, 79.5, 77.4, 76.6, 69.6, 66.8, 65.4, 62.0, 56.5, 50.0, 41.6, 40.2, 39.7, 38.8, 37.0, 36.9, 32.0, 31.8, 31.4, 30.3, 28.8, 28.1, 21.6, 20.8, 19.3, 17.1, 16.2, 14.5;

Calcd for formula: C₃₃H₅₇N₃O₃, 543.82.

< 실시예 3> ( 3α,25R )- 스파이로스트 -5-엔-3- 옥시에탄아민 (4c)의 제조

상기 실시예 1의 단계 3에서 얻은 화합물 3 (200 mg, 0.33 mmol)이 용해된 무수 DMF 용액을 소듐아자이드 (31.82 mg, 0.49 mmol)에 첨가하고, 반응 용액을 50℃에서 14시간 동안 교반하였다. 아세틸아세테이트 (20 ml)로 희석한 후, 반응 혼합물을 증류수 (25 ml) 및 포화 염수 (2 x 20 ml)로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조하고, 여과한 다음 농축하여 (3α,25R)-스파이로스트-5-엔-3-옥시에탄나이트릴 화합물을 얻었다.

다음으로, 아자이드 중간체 (100 mg, 0.21 mmol)를 THF (10 ml)에 용해하고, 트라이페닐포스핀 (135.8mg, 0.52 mmol)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 상온에서 10시간 동안 교반하고, 증류수 (0.1 ml)로 처리하고, 48시간 후에 용매를 감압하에 제거하고 미정제 생성물을 플래쉬크로마토그래프리 정제하여 목적 화합물 4c를 백색 분말 형태로 94% 수율로 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.34(1H, d, J = 5.14 Hz), 4.40 (1H, dd, J = 7.41, 14.75 Hz), 3.64 (1H, t, J = 5.44 Hz), 3.59 (1H, dt, J = 1.14, 4.66 Hz), 3.43 (2H, dd, J = 4.71, 11.04 Hz), 3.37 (3H, t, J = 11.04 Hz,), 3.15 (1H, m), 2.88 (1H, t, J = 6.08, 11.82 Hz), 2.79 (1H, m), 2.39 (1H, dd, J= 5.14, 13.03 Hz), 2.20 (1H, dt), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J= 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 140.8, 121.3,109.2, 80.8, 79.2, 77.4, 76.8, 69.2, 66.8, 62.0, 56.5, 50.0, 41.6, 40.2, 39.7, 39.0, 37.1, 37.0, 32.1, 32.0, 31.4, 31.3, 30.3, 28.8, 28.3, 20.8, 19.4, 17.0, 16.3, 14.5;

Calcd for formula: C₂₉H₄₇NO₃, 457.69.

실시예 4-9의 화합물은 하기의 반응식을 이용하여 제조하였다.

< 실시예 4> ( 3α,25R )- 스파이로스트 -5-엔-3- 일옥시카보닐 -1,2- 다이아미노에탄 (6a)의 제조

단계 1: 화합물 5의 제조

무수 THF에 (5 mL) 트라이포스젠 (213.9 mg, 0.72 mmol)을 얼음조에 THF 8 mL의 diosgenin (600 mg, 1.44 mmol)을 첨가하여 실온(1-30 ℃)에서 하루를 반응시켰다. 다음으로, 무수 THF (2mL)로 희석된 무수피리딘 0.1 mL가 상기의 반응액에 1시간에 걸처서 한 방울씩 첨가하였다. 침전물은 필터과정으로 제거하였고, 상층액을 진공하에서 농축하여 흰색의 고체로 얻었다. 이물질 화합물 5는 정제과정 없이 바로 다음 단계의 반응에 사용하였다.

단계 2: 목적 화합물 6a의 제조

얼음조에서 질소 분위기하에 상기 단계 1에서 얻은 디오스제닐 클로로포르메이트 (화합물 5) (200mg, 0.419mmol, 1 당량)를 무수 DCM (5 ml)에 첨가하고 교반하여 얻은 용액을, 1,2-다이아미노에탄 (EDA) (4.19 mmol, 20 당량)이 용해된 무수 DCM (5 ml) 용액에 10시간 동안 천천히 첨가하여 얻은 반응 혼합물을 상온까지 따뜻해지도록 3시간 동안 상온에 두었다. 상기 결과의 혼합물을 DCM (15 m)으로 희석하고, 순차적으로 물, 포화 NaCl 수용액 (2 x 25 ml)으로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조하였다. 상기 결과의 혼합물을 여과하고 건조하여 미정제된 생성물을 백색의 고체로 얻었고, 이를 플래쉬크로마토그래프로 정제하여 목적 화합물 6a를 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.82 (1H, s), 5.35 (1H, d, J = 5.14 Hz, H-6), 4.42 (2H, m), 3.49-3.31 (4H, t, J = 4.66 Hz,), 3.12 (2H, dt), 2.31 (1H, dd, J = 5.14, 13.03 Hz), 2.20 (1H, dt), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz,), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J = 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 156.5, 153.7, 140.8, 139.7, 139.5, 122.2, 121.3, 109.7, 109.2, 80.7, 77.4, 77.2, 76.6, 74.3, 71.5, 66.8, 62.0, 56.4, 49.8, 45.8, 42.2, 41.6, 42.2, 40.2, 39.7, 38.5, 36.9, 36.6, 32.0, 31.8, 31.3, 30.2, 30.0, 29.6, 28.8, 28.1, 22.4, 20.8, 19.3, 17.1, 16.2, 14.5, 14.5;

Calcd for formula: C₃₀H4₈N₂O₄, 500.71.

< 실시예 5> ( 3α,25R )- 스파이로스트 -5-엔-3- 일옥시카보닐 -2,2'- 다이아미노 다이에틸아민 (6b)의 제조

상기 실시예 4의 단계 2에서 1,2-다이아미노에탄 (EDA) 대신에 2,2'-다이아미노다이에틸아민 (DETA)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하여 목적화합물 6b를 제조하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.35 (1H, d, J = 5.14 Hz), 5.13 (1H, s) 4.49 (1H, dd, J= 7.41, 14.75 Hz), 3.71 (2H, t, J = 4.66 Hz), 3.59 (2H, dt, J = 1.14, 4.66 Hz), 3.46 (1H, dd, J = 4.71, 11.04 Hz), 3.37 (1H, t, J= 11.04 Hz), 3.20 (1H, m), 2.39 (1H, dd, J= 5.14, 13.03 Hz), 2.20 (1H, dt, 2.62, 12.14 Hz), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J= 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 156.3, 139.8, 122.3, 109.2, 80.6, 77.4, 77.2, 76.5, 74.1, 66.8, 62.0, 56.4, 49.9, 48.8, 41.5, 40.2, 39.7, 36.7, 32.0, 31.8, 31.4, 30.3, 20.8, 19.3, 17.1, 16.3, 14.5;

Calcd for formula: C₃₂H₅₃N₃O₄, 543.78.

< 실시예 6> ( 3α,25R )- 스파이로스트 -5-엔-3- 일옥시카보닐 -2,2'- 다이싸이오 비스에탄아민 (6c)의 제조

상기 실시예 4의 단계 2에서 1,2-다이아미노에탄 (EDA) 대신에 2,2'-다이싸이오비스(에틸아민) (동의어 'cystamine')을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하여 목적화합물 6c를 제조하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.35(1H, s), 5.38 (1H, d, J = 3.91 Hz), 4.44-4.39 (2H, dd, J = 7.41, 14.75 Hz), 3.41-3.31 (6H, m), 3.12 (1H, bs), 2.87-2.46 (3H, m), 2.39 (1H, dd, J = 5.14, 13.03 Hz), 2.20 (1H, dt, 2.62, 12.14 Hz), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J= 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 155.9, 139.7, 122.2, 109.2, 80.7, 77.4, 76.6, 74.6, 66.8, 62.0, 60.3, 56.4, 49.8, 42.4, 41.5, 40.5, 40.2, 39.7, 39.5, 38.6, 38.1, 36.9, 36.6, 32.0, 31.8, 31.3, 28.7, 28.1, 21.0, 20.8, 19.3, 17.1, 16.2, 14.5, 14.2;

Calcd for formula: C₃₂H₅₂N₂O₄S₂ 592.90.

< 실시예 7> ( 3α , 25R)- 스파이로스트 -5-엔-3- 일옥시카보닐 -1,2- 다이아미노부탄 (6d)의 제조

상기 실시예 4의 단계 2에서 1,2-다이아미노에탄 (EDA) 대신에 테트라메틸렌다이아민 (동의어 'putrescine')을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하여 목적화합물 6d를 제조하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.38 (1H, d, J = 6.21 Hz), 4.79 (1H, s), 4.48 (1H, m), 4.48-4.45 (1H, m, J = 6.79, 14.71 Hz), 4.3-4.34 (1H, m), 3.19-3.17 (2H, m) 2.75-2.71 (2H, t), 2.38 (1H, dd, J = 5.14, 13.03 Hz), 2.20 (1H, dt), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J= 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 156.3, 140.1, 122.4, 109.5, 80.1, 77.7, 77.5, 76.6, 74.3, 71.5, 67.1, 62.3, 56.7, 50.2, 41.9, 40.5, 38.8, 37.2, 36.9, 32.3, 32.1, 31.6, 30.5, 30.0, 21.1, 19.6, 17.4, 16.5, 14.8;

Calcd for formula: C₃₂H₅₂N₂O₄, 528.77.

< 실시예 8> ( 3α,25R )- 스파이로스트 -5-엔-3- 일옥시카보닐 -( N1,N2,N3 - 트리 스 (tert-부톡시-카보닐)-트라이에틸렌테트라아민 (6e)의 제조

단계 1: 화합물 5의 제조

상기 실시예 4의 단계 1과 동일하게 실시하여 화합물 5를 제조하였다.

단계 2: 목적 화합물 6e의 제조

얼음조에서 질소 분위기하에 상기 단계 1에서 얻은 디오스제닐 클로로포르메이트 (화합물 5) (200 mg, 0.419 mmol, 1 당량) 및 트리에틸렌아민(TEA) (87.7 ml, 0.629 mmol, 1.5 당량)를 건조 DCM (5 ml)에 첨가하고 교반하여 얻은 혼합용액을 N1,N2,N3-트리스(tert-부톡시카보닐)-트리에틸렌테트라아민 (196.47 mg, 0.44 mmol, 1.05 당량)으로 처리한 다음 3시간 동안 상온에 두고 얻은 반응 혼합물을 DCM (20 ml)으로 희석하고, 포화 NaCl 수용액 (3 x 25 ml)으로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조하였다. 상기 결과의 혼합물을 여과하고 건조하여 목적 생성물 (300 mg, 0.338 mmol, 1 당량)을 건조 DCM (5 ml)에 용해하고, 얼음조에서 질소 분위기하에 과량의 트리플루오로아세트산으로 처리하였다. 상기 반응 혼합물을 4시간 동안 상온에 두고, 감압하에 용매를 제거한 다음, 잔류물을 건조 에테르로 두 번 세척하여 목적 화합물 6e를 연노랑색의 무정형 분말로 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.38 (1H, d, J = 5.21 Hz), 4.44-4.37 (2H, dd, J = 7.41, 14.75 Hz), 3.49-3.46 (2H, dd, J = 11.48, 4.59 Hz), 3.41-3.31 (14H, bs), 2.31 (1H, dt), 1.02 (3H, s), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J= 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 155.9, 133.7, 109.3, 80.8, 77.4, 76.6, 71.5, 67.1, 66.8, 62.1, 56.9, 56.4, 49.9, 45.5, 41.6, 40.2, 39.7, 38.5, 36.7, 32.0, 31.4, 30.3, 28.4, 27.6, 19.3, 17.1, 16.3, 14.5;

Calcd for formula: C₄₉H₈₂N₄O₁₀, 887.20.

< 실시예 9> ( 3α,25R )- 스파이로스트 -5-엔-3- 일옥시카보닐 - 트라이에틸렌테트라아민 (6f)의 제조

상기 실시예 8의 단계 2에서 N1,N2,N3-트리스(tert-부톡시카보닐)-트리에틸렌테트라아민 대신에 트라이에틸렌테트라아민 (TETA)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 8과 동일하게 실시하여 목적화합물 6f를 제조하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.38 (1H, d, J = 5.21 Hz), 4.89 (1H, bs), 3.65(2H,m), 3.45-3.21(12H m), 2.31 (1H, dt, 2.62, 12.14 Hz), 1.02 (3H, s, H-19), 0.97 (3H, d, J = 6.86 Hz), 0.78 (3H, s), 0.78 (3H, d, J = 6.28 Hz);

¹³C NMR( 300 MHz, CDCl₃) δ 156.6, 139.8, 122.2, 109.2, 80.8, 77.4, 77.5, 76.6, 74.3, 71.5, 66.8, 62.0, 56.4, 50.4, 49.9, 41.6, 40.2, 39.7, 36.7, 32.0, 31.8, 31.3, 30.2, 28.8, 20.8, 19.3, 17.1, 16.3, 14.5;

Calcd for formula: C₃₄H₅₈N₄O₄, 586.85.

< 실험예 1> 세포독성 평가

실시예 1-9에서 제조한 화합물의 항암활성을 알아보기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, HepG2(인간 간세포암종), Hela(인간 자궁경부암종), HT-29(인간 결장암종) 및 PC-3(전립선암종) 세포주들은 DMEM (10% FBS, 0.1 g/L 페니실린) 배양배지에서 습한 환경, 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 배양하여 사용하였다. MCF-7(인간 유방암종) 및 K562(T-림프모구성 백혈병, T-lymphoblastic leukemia) 세포주들은 RPMI-1640 배양배지에서 배양하여 사용하였다. 상기 세포주들을 96-웰플레이트에 분주하고(1.0 x 10⁵ cells/well), 실시예 1-9의 화하물들을 처리하고 48시간 후에, PBS 버퍼에 용해된 10 ㎕의 MTT 용액 (5 mg/ml)을 처리하고, 4시간 동안 배양한 후에 배지를 제거하고 100 ㎕의 이소프로판올로 상온에서 대체하였다. 각각의 웰에서 마이크로플레이트 리더기(570 nm 파장)를 사용하여 흡광을 정량하였고, 이를 이용하여 실시예 1-9 화합물의 IC₅₀ 값을 구하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

화합물	세포주에 대한 IC₅₀ (μM)
화합물	PC-3(전립선암종)	Hela(인간 자궁경부암종)	MCF-7(인간 유방암종)	HT-29(인간 결장암종)	K562(T-림프모구성 백혈병)	HepG2(인간 간세포암종)
실시예 1 (4a)	6.43	3.21	11.79	17.86	8.07	8.51
실시예 2 (4b)	14.63	13.48	13.17	15.52	8.76	7.29
실시예 3 (4c)	>50	>50	>50	>50	>50	>50
실시예 4 (6a)	>50	>50	>50	>50	>50	>50
실시예 5 (6b)	12.74	15.74	32.42	16.11	11.97	12.38
실시예 6 (6c)	>50	20.4	>50	>50	11.38	20.79
실시예 7 (6d)	20.89	7.4	>50	7.04	11.05	24.79
실시예 8 (6e)	>50	>50	>50	>50	>50	>50
실시예 9 (6f)	26.07	12.76	31.65	30.58	11.39	19.07
디오스제닌 (DG)	>50	>50	>50	>50	>50	>50
독소루비신 (Dox) 양성대조군	0.032	0.54	0.72	ND	0.28	0.43

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 디오스제닌 (DG) 자체는 항암활성이 매우 낮으나, 본 발명에 따라 1차 아민화된 디오스제닌 실시예 1-9의 화합물들은 항암활성이 현저히 증가하는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물들은 디오스제닌의 3-OH기에 친수성의 선형 폴리아민 모이어티를 도입함에 따라서, 디오스제닌 자체에 비해 항암활성이 현저히 향상되는 효과가 있으므로, 항암용 조성물로 유용할 수 있다.

<제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

화학식 4 또는 6의 컨쥬게이트 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

화학식 4 또는 6의 컨쥬게이트 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

화학식 4 또는 6의 컨쥬게이트 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

화학식 4 또는 6의 컨쥬게이트 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브로 살균하여 주사액제를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 4 또는 화학식 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 4]

(상기 화학식 4에서,
n은 0-2의 정수이다);

[화학식 6]

(상기 화학식 6에서,
R은
,
,
,
,
또는
이다).
삭제
삭제
삭제
하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
디오스제닌 (DG)를 유기용매에서 p-4-톨루엔설포닐 클로라이드와 반응시켜 화합물 1을 얻는 단계(단계 1);
화합물 1을 유기용매에서 에틸렌글리콜과 반응시켜 화합물 2를 얻는 단계(단계 2);
화합물 2를 유기용매에서 p-4-톨루엔설포닐 클로라이드와 반응시켜 화합물 3을 얻는 단계(단계 3); 및
화합물 3을 유기용매에서 1차 아민과 반응시켜 화합물 4를 얻는 단계(단계 4);를 포함하고,
상기 단계 1 내지 단계 4의 유기용매는 각각 피리딘, 다이클로로메탄(DCM), 1,4-다이옥산, 다이메틸포름아마이드(DMF) 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이고,
상기 단계 4의 1차 아민은
,
또는 NaN₃인 것을 특징으로 하는,
화학식 4로 표시되는 화합물의 제조방법:
[반응식 1]

(상기 반응식 1에서,
n은 0-2의 정수이다).
삭제
하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,
디오스제닌을 유기용매에서 트라이포스젠과 반응시켜 화합물 5를 얻는 단계(단계 1); 및
화합물 5를 유기용매에서 1차 아민과 반응시켜 화합물 6을 제조하는 단계(단계 2);를 포함하고,
상기 단계 1 내지 단계 2의 유기용매는 각각 피리딘, 다이클로로메탄(DCM), 테트라하이드로퓨란(THF) 및 트리에틸렌아민(TEA)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이고,
상기 단계 2의 1차 아민은
,
,
,
,
또는
인 것을 특징으로 하는,
화학식 6으로 표시되는 화합물의 제조방법:
[반응식 2]

(상기 반응식 2에서,
R은
,
,
,
,
또는
이다).
삭제
제1항의 컨쥬게이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 암은 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 결장암, 혈액암 또는 간암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.