KR101886114B1 - 조작된 구조체의 신경분포 - Google Patents

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Abstract

신경분포된 근육 구조체와 조직 복원 및 재생을 위한 생체조작된 구조체를 발생시키는 방법이 개시되었다.
이 방법은 평활근 세포 와 뉴런 전구 세포의 개체군을 수득하고, 세포들을 함께 매트릭스 물질에 심은 후 방향성있게 지향된 평활근세포의 신경분포된 평활근세포 구조체를 형성하기 위해 심어진 세포를 배양하는 단계들을 포함한다.
하나의 실시예에서, 신경 전구세포는 우선 신경구로서 생체적합성 용액( 콜라겐/라미닌용액)에 심어지고 젤에도 허용된다.
다음, 두번째 평활근 세포의 현탁액은 분리된 층으로서 증착될 수 있다.
다중층 구조 교착근육 또는 신경 구성요소의 다중충 구조물은 이러한 방식으로 제조될 수 있다. 신경 전구세포의 분화는 뉴로베이살 A 배지(Neurobasal A medium) 에 대한 노출 및 또는 분화제 (B-27 보조제)에 대한 노출에 의해 유발될 수 있다.
신경배치된 근육구조체는 원형 스캐폴드주위(예를 들면 키토산을 포함하는 튜브) 배치될 수 있고, 더 배양되어 튜브모양의, 생체조작 구조체를 형성할 수 있다. 두개 또는 그 이상의 신경분포된 근육 구조체는 연장된 합성 구조체를 형성하기 위해 서로 연결될 수 있다.

Description

조작된 구조체의 신경분포{INNERVATION OF ENGINEERED STRUCTURES}
본 발명은 조직공학, 특히 조직이 조작된 구조체의 신경분포에 대한 것이다.
관련출원에 대한 참조
본 출원은 본원에서 인용문헌에 의해 전체가 인용되고 있는 미국연방특허출원 No. 61/592,890 "조작된 구조체의 신경분포"와 2012년 1월 31일에 제출된 미국 가출원 출원번호 No. 61/592,871 "튜브모양의 생체조작된 평활근 구조체"의 우선권 주장을 기초로 한다.
발명의 배경
신경분포는 인체의 거의 모든 부분의 기능성 유지를 위해 매우 중요하다. 위창자의 신경분포는 평활근이 표현형을 유지하고 그들의 운동기능을 수행하기 위해 매우 중요하다.
신경이 손상된 경우, 근육 위축증이 일반적으로 관찰된다. 노환 또는 당뇨(gastroparesis)때문이든 서로 다른 정도의 위장마비로 고생하는 환자는 신경요소 (neural elements)가 부족할 뿐만 아니라 근육 위축을 보인다. 마찬가지로 신경절결손 위장질환(aganglionic gut disorders) (예를들면,히르슈스프롱병 (Hirschsprung's disease))를 가지고 태어난 아이들은 신경퇴화를 보인다.
조직공학은 퇴화된 근육을 새로운 근육 구조체로 교체하여 질병을 앓거나 손상된 위창자 도관 구성요소들의 기능을 회복시키는 방법을 연구해왔다. 그러나 근육 또는 근육전구세포가 심어진 세포외 매트릭스를 사용하여 근육을 재생하는 것은 손실된 근육량의 최대 약 10% 정도를 교체할 수 있다. 고된 재활에도 불구하고 함께 일반적으로 단지 약 30% 완력이 회복된다.
예를 들면, 기능성 위 점막은 쥐의 타고난 위를 대체하기 위해 합성PLGA 메쉬상에 심어진 위 상피조직 기관 유닛을 사용했다는 것이 보고되었다.
그러나 적당한 방향으로 펼쳐진 평활근육층의 재생은 도전과제로 남아있다. 게다가 기능적 운동성의 회복은 위창자 신경근계의 조직공학분야에서 거대 도전과제로 부각되고 있으나, 종래 논문에서 아직 입증된바 없다.
조직공학에 의한 위 재건도 역시 도전과제이다. 방광 조직 공학분야는 위의 근육조직을 재조작하기 위한 주형으로 제안되어왔으며 같은방식으로 새로운 방광 주머니가 다양한 생체물질을 가지고 제조되고 있다.
위장 재건에서, 이식가능한 위 자극 유닛은 비만수술과 소장뉴런을 자극하거나 위 전기리듬을 자극하기 위한 위 마비술에서 이미 일반적으로 사용된다. Micci 등의 리포트는 CNS 유래의 뉴런 전구세포의 이식은 질소활성뉴런(nitrergic neurons)을 재증식할 수 있고, 위마비 설치류 모델의 유문 장기능을 향상시킬 수 있다.
조직공학은 또한 짧은 창자 증후군에서 일반적으로 실시되는 장 연장 수술에 대해 가능성 있는 발전을 제공하였다. 자가 평활근 세포가 자리잡은 콜라겐 스폰지 스캐폴드는 개모델에서 첩부 이식편으로서 성공적으로 이식된바 있다. 이러한 첩부 이식편은 융모 구조를 따라서 위점막과 내장상피세포층을 재생하였다. 그러나 이러한 이식편이 마주친 주요문제는 수축이었다. Dunn 등은 장 평활근세포가 자리잡은 콜라겐 스폰지 스캐폴드로부터 형성된 유사 튜브모양 구조체를 사용하였다. 이 튜브모양 구조체는 그물망의 사전신생혈관 (prevascularization) 이후 한달만에 새롭게 혈관신생되었다. 불행하게도 이러한 기술은 소장의 뉴런층을 재생시키지 않고 평활근 세포는 그들의 비수축형태로의 표현형전환을 증명하였다.
비슷하게도, 조직공학된 작은 창자 구성체는 평활근세포의 정렬 또는 영양흡수를 수행하기 위한 적당한 근력과 활동성을 발생시키기 위해 필수적인 신경분포를 이루지 못했다.
대장 부분의 재생은 마찬가지로 난해하다. 대장은 물의 흡수와 대변배출을 수행하면서 작은창자와 인접해있다. 예를 들면 무신경결정증 (예를 들면 히르슈스프롱병 Hirschsprung's disease) 또는 염증을 치료하기 위한 절단수술은 대장운동성을 심각하게 변형시킨다. 대장 운동성의 장애는 이동시간을 변화시키고, 변비나 설사를 유발한다. 이러한 일부 질환상태의 특발적 특성은 대장의 생체외(in vitro)조직공학 모델을 위한 강한 수요를 제기하며, 여기서 병리생태학적 상태의 변화를 이해하기 위해 개별 장기 (평활근, 소장 신경, 간질세포, 점막)에 대해 조사가 실시되었다. 게다가 연동운동에서의 변형과 대장의 부분 수축은 개인의 삶의 질에 직접적인 영향을 준다.
최근에 Vacanti 등은 구불결장으로부터 분리된 기관유닛(organoid units)이 심어진 합성 폴리락틱산과 글리콜릭산 중합체를 사용한 조직공학된 대장 구성체를 발표하였다. 그들은 조직공학된 통로는 동물로 이식되었을때 상당한 흡수능력을 가지고 있음을 입증하였다. 그러나 꿈틀운동이나 활동성에 직접적인 측정은 없었다.
위창자관의 위상성의 신경근계 구조체는 평활근의 직각층을 가지고 있으며 내장 뉴런 망상조직과 얽혀 있다. 또한 그것은 카할 간질세포(ICC) 및 전문화된 점막층과 서로 연관되어 있다. 전파되는 꿈틀운동 파장은 신경근계의 위상성을 정의한다. 꿈틀운동 파장은 원형및 세로 평활근층 모두의 위축과 이완을 포함한다. 뉴런 구성요소와 ICC는 꿈틀운동의 조절을 위해 전기적 활동을 발생시킨다. 이러한 활동은 위장 운동성을 조절하기 위해 평활근층에서의 세포내 생화학적 반응과 연계된다. 이러한 메커니즘은 추가적으로 창자 신경 망상조직에서의 다양한 신경전이물질의 배출과 ICC로부터 배출된 전기적 활성에 의해 부분적으로 조절된다.
Pan 등의 최근 연구에서 쥐신생아로부터 분리된 신경능선 전구세포가 히르슈스프롱병 (Hirschsprung's Disease) 쥐 모델의 말단 대장으로 이식되었다. 이러한 세포는 숙주의 대장에서 뉴런과 교세포로 분화되었다. 이들은 또한 신경절결여 숙주 대장안에서 뉴런 중재 운동성의 복구를 입증하였다. Metzger 등은 성인 인간 위장 유래 소장 전구세포가 기관형 배양액에서 배양된 인간 신경절 결손 대장의 일부를 재증식 가능함을 입증하였다.
위상 신경근계구조체의 조직공학에서 비록 중대한 발전이 이미 이루어졌지만, 기능성 평활근과 소장 뉴런 망상구조의 재생을 위해 제안된 기술에는 많은 격차가 존재한다. 신경분포된 조작 조직을 위한 더 나은 기술을 위한 요구도 마찬가지로 존재한다.
조직회복이나 재생을 위한 생체조작된 구조체 뿐만 아니라 신경분포된 근육 구조체의 발생을 위한 방법이 제공된다. 그 방법은 평활근 세포와 뉴런 전구세포의 개체군을 수득하고 세포를 매트릭스 물질과 파종하고 파종된 세포를 배양하여 방향성있게 지향된 평활근세포의 신경분포된 평활근 세포 구성체를 형성하도록 배양하는 단계를 포함한다.
실시예로서, 뉴런 전구세포는 우선 신경구체로서 생체적합성 용액 (예를 들면 피브린, 콜라겐, 콜라겐/피브린 용액, 및 허용되는 젤)안에 심어질 수 있다. 다음에, 두번째 평활근 세포의 현탁액은 뉴런 전구세포층으로부터 분리된 층으로 증착될 수 있다. 이와 달리, 근육세포는 먼저 심어질수 있고 이후 뉴런 전구 세포를 심을 수 있다. 교차 근육의 다중층 구조 또는 뉴런성분도 또한 같은 방법으로 형성될 수 있다. 상기 평활근과 뉴런 전구 현탁액은 튜브모양의 신경분포된 평활근 세포 구성체의 형성을 유도하기 위해, 각각 또는 함께 중앙 기둥 주변에 증착될 수 있다. 상기 신경분포된 평활근 구성체는 튜브모양의 스캐폴드 (예를 들면 키토산을 포함하는 튜브) 주변에 배치될 수 있다.
뉴런 전구세포는 배아뿐만 아니라 출산후 설치류 및 인간의 중추신경시스템과 소장 신경시스템안에 있는 것으로 확인되어왔다. 신경능선 유래의 줄기세포는 성체 발달을 통해 지속되는 것으로 보여졌고 내장 신경근체의 재조작을 위한 자가 뉴런 세포의 잠재적인 공급원이다. 세포배양기술의 발달은 많은 수의 성숙한 소장 뉴런 아형으로 분화시키는 능력을 입증한 Ret 및 p75 마커들을 발현하는 소장 뉴런과 교세포 전구세포의 분리를 입증하였다. Kulkarni 등에 의한 최근 연구는 내장 유래된 용해성 요소의 존재하에 배양하여 중추신경유래의 뉴런 전구세포를 소장 표현형으로 밀어내는 것에 집중하였다.또한 Metzger 등은 84세이하 성인 인간 위장으로부터 소장뉴런전구세포의 믿을만하고 재생가능한 분리를 입증하였다.
뉴런 전구세포는 또한 분화하도록 유도될 수 있다. 뉴런 전구세포는 뉴로베이살 A 배지(Neurobasal A medium ) 같은 분화배지에서 배양될 수 있고 또는 B-27보충제와 같은 분화제에 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 개별 신경분포된 튜브 근육 구조체를 통해 수축의 이동 파장을 생성하도록 자극될 수 있는 신장된 합성 구조체를 형성하기 위해 신경분포된 근육을 서로 묶어서 튜브, 생체공학된 구조체를 제조하기 위한 두개 또는 그 이상의 신경분포된 근육 구조체를 연결하는 것을 포함할 수 있다.
발명의 또 다른 일면은, 생체조작된 3차원 피브린-기반 대장 모델은 특허 내강주변 집중적으로 원형 평활근 층의 자기 정렬을 허용한다. 이러한 생체조작된 조직은 원래의 평활근 정렬을 흉내내고 대장의 꿈틀운동, 수축, 이완 같은 대장 생리학 측면을 유지한다.
조직회복이나 재생을 위한 생체조작된 구조체 뿐만 아니라 신경분포된 근육 구조체의 발생을 위한 방법이 제공된다.
그림1은 완전히 형성된 생체조작된 신경분포 대장 평활근 구성체이다.
그림2는 신경분포된 평활근 구성체에서 전자기기적 결합 무결성(coupling integrity )를 보여주는 그래프이다
그림3은 신경분포되지 않은 평활근 구성체의 전자기기적 결합 무결성 (coupling integrity)를 보여주는 그래프이다.
그림4는 본질적으로 신경분포된 구성체에 있어서 아세틸콜린을 사용한 콜린성 수축(cholinergic contraction)(검은 선)과 뉴런 차단제 테트로도톡신 존재시의 수축(회색선)을 보여주는 그래프이다.
그림5는 초기에 신경분포되지 않은 구성체에 있어서 아세틸콜린을 사용한 콜린성 수축(검은 선)과 뉴런 차단제 테트로도톡신 존재시의 수축(회색선)을 보여주는 그래프이다.
그림 6은 신경분포된 구성체에 있어서 혈관수축성 내장 펩타이드 (VIP) 처치에 의한 이완과 뉴런 차단제 테트로도톡신 (회색선) 존재시의 이완을 보여주는 그래프이다.
그림7은 신경분포되지 않은 구성체에 있어서 혈관수축성 내장 펩타이드 (VIP) 처치에 의한 이완(검은 선)과 뉴런 차단제 테트로도톡신 존재시의 이완(회색 선)을 보여주는 그래프이다.
그림8은 신경분포된 구성체에 있어서 기초력(basal force)의 빠른 이완 이후의 기준치까지의 회복을 유도하기 위한 전기 자극(검은 선)과 신경 차단제 TTX 존재시의 자극(회색 선)을 보여주는 그래프이다.
그림 9는 기초력(basal force)의 빠른 이완이후 기준치까지의 회복을 유도하기 위한 전기자극(검은 선)과 뉴런 차단제 TTX 존재시의 자극(회색 선)을 표시하는 그래프이다.
위창자 구성요소의 교체를 고안하는 과정에서, 비록 부분적이지만 위창자의 운동성 패턴은 본질적으로 또다른 하나와 연결되어 있고 매우 협조적인 방법으로 작동한다. 이러한 현상의 예는 위장으로 음식이 통과하도록 하부식도괄약근 (LES)의 이완을 유도하는 유문으로의 음식섭취이다. 조직 공학된 LES 구성체는 반드시 근원성 기초장력을 생성하는 능력을 가져야만 한다. 이것은 또한 반드시 매우 생체적합적이어야 하고 식도유동운동을 따라 유문에서 위로 음식이 통과하도록 일시적으로 이완되는 기존의 뉴런연결망과 통합적이어야 한다.
특정 실시예들은 본 명세서에서 공개된 구조, 기능, 제법 그리고 장치의 사용 및 방법의 이론에 대한 전체적인 이해를 제공하기 위해 설명될 것이다. 기술분야에서의 당업자들은 본원에서 자세히 설명된 장치와 방법은 비제한적인 실시예이며, 본 발명의 범위는 청구항에 의하여 단독으로 정의된다는 것을 이해할 것이다. 하나의 실시예와 연계되어 설명되거나 예시된 특징은 다른 실시예의 특징과 결합될 수 있다. 이러한 수정과 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되도록 의도된 것이다.
여기에서 인용된 모든 출판물, 특허, 특허출원은 이전이든 또는 이후이던, 그 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되어 포함된다. 본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형은 만약 내용이 명확한 다른 것을 묘사하지 않는 한 복수를 포함한다. 본 발명에서 사용된 용어는 일반적으로 기술분야에서 통상의 기술을 가지고 있는 사람들에 의하여 승인된 일반적인 정의를 고수한다. 추가 설명이 요구되어지는 상황에서, 일부 용어는 아래에서 보다 더 설명하도록 한다.
여기에서 사용된 용어 "대상(subject)"는 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 농장동물; 개와 고양이와 같은 가축; 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험실 동물, 인간, 침팬지, 다른 유인원 및 원숭이와 같은 비인간 영장류를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 살아있는 유기체를 언급하는 것이다. 용어는 특정 나이 또는 성별을 지칭하지 않는다. 특정 실시예에서 "대상"은 인간이다.
치료, 처치, 그리고 개입은 하나 또는 그 이상의 치료제를 투약하거나 예방하거나 경감시키거나 완화시키거나 바꾸거나, 치료하거나, 약화시키거나, 호전시키거나, 영향을 주거나, 진행을 느리게 또는 멈추게 하거나, 질병의 악화를 멈추거나 늦추거나, 적어도 하나 이상의 질병과 증상, 질병과 증상에 대한 소인, 질병의 악화를 멈추거나 늦추려는 목적을 가지고 증상이나 질병에 대한 소인 또는 증상, 질환을 가지고 있는 대상에 대한 절차를 의미한다.
평활근 세포(Smooth Muscle Cells)
한 측면은 평활근 고리와 함께 생체조작된 튜브모양 조직을 발생시키는 것을 포함한다. 자연적으로 존재하는 평활근 조직과 기능적으로 유사한 평활근 조직으로부터 튜브구조의 생리학 모델이 만들어진다. 원형 평활근을 포함하는 기관과 조직은 공개된 배양시스템을 사용하여 설계될 수 있다. 그러한 기관과 조직은 위창자 도관(예를 들면 유문,위, 십이지장,공장, 회장 및 대장) 의 구성요소를 포함한다. 본 발명의 방법과 조성물은 또한 다른 기관, 기관지(bronchial tubes), 자궁(uterus), 혈관(blood vessels), 림프관(lymphatic vessels), 요도, 선모양(glandular) 도관, 눈섬모근육(ciliary muscles of the eye)와 같은 관강(luminal) 구조체의 재건에 유용하다.
용어 "기능적으로 유사한"은 생체조작된 튜브모양 조직 또는 천연 튜브조직으로서 수축 등척성 근력에서의 비슷한 변화 또는 유사한 수축력을 갖는 생체조작된 평활근 고리를 포함하는 튜브 조직을 가리킨다. 수축력은 연동운동력 또는 튜브 구조체의 평활근의 파동 같은 수축/이완으로 측정된다. 작용제는 평활근세포의 수축반응을 유도하기 위해 유용할 수 있으며, 평활근 세포에서의 전기적 자극을 유발할 수 있다. 수축반응은 평활근세포 또는 평활근 조직의 평균길이의 감소로 정의될 수 있다. 수축 작용제는 아세틸콜린(acetycholine), 봄베신(bombesin), 서브스텐스 P(substance P), 프로틴 카이네이즈 C (protein kinase C ,PKC), 엔도세린(endothelins), 다른 신경전달물질과 펩타이드를 포함한다.
평활근은 중공 기관의 대다수의 지지부를 둘러싸고 있다. 예를 들면, 내장에서, 평활근은 위와 내장관을 감싼다. 이러한 근육의 수축은 음식을 혼합하고 소화관을 따라 음식을 밀어낸다. 심혈관시스템에서, 평활근은 동맥벽과 거대 정맥을 감싸고 혈관의 직경을 조정하는 작용을 한다. 평활근은 단일형태의 세포모양과 골격과 심장근육세포의 격자형 분포를 거의 가지고 있지 않다. 그러나 평활근 세포는 연장된 양극성 세포모양을 보여준다. 개체군으로서, 평활근 세포는 일련의 중첩되는 세포층에서 유사한 축을 따라서 조직된다. 이러한 조직화 패턴은 평활근이 복잡한 패턴으로 수축력을 발산하게 한다.
분리된 1차 평활근세포 또는 그런 1차 세포, 종양 및 유사체로부터 유래된 세포주를 사용하면서 본 발명이 활용될 수 있다. 그 사용된 세포는 내부 소장 또는 항문 괄약근 평활근세포주, 기도 평활근 세포주 및 다른 상업적으로 가능한 평활근 세포주와 같은 사용가능한 평활근 세포주이다.
예를 들면, 근육으로부터 유래된 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Md.)과 같은 세포주 보관소로부터 얻을 수 있다. 그러한 평활근세포주는 인간 엉덩정맥 평활근 세포 (HIVS-125; ATCC accession no. CRL-2482), 시리안황금햄스터 수정관 평활근 세포 (DDT1; CRL-1701), 인간 탯줄정맥 평활근 세포 (HUVS-112D: CRL-2481), 쥐 대동맥 평활근 세포(Hep-Sa; CRL-2018), 인간 대동맥 평활근세포 (T/G HA-VSMC; CRL-2498)를 포함한다. 구입한 특정 세포주(cell line)의 성장조건은 생물학적 공급원에 의존적이며 일반적으로 세포성장 지침은 ATCC의 세포주에 따르도록 만들어져 있다. 다른 응용에 있어서 평활근 세포들은 조직공학구조체를 수여받을 환자로부터 얻을 수 있다. 이러한 자가 세포들은 외과수술 또는 조직검사로부터 얻을 수 있으며, 이 기술분야에서 알려진 다양한 기법들에 의해 분리, 배양, 확장 또는 강화될 수 있다.
또 다른 면에서, 분리된 세포 또는 세포주는 (분리 또는 농축 또는 유도된 분화를 통해서 얻을 수 있는) 다관능일 수 있다. 그리고 수축기능을 갖는 세포로 분화될 수 있다. 세포는 어떠한 척추동물 또는 무척추동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면 동물공급원은 인간 원숭이 또는 다른 영장류, 생쥐, 쥐, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 소, 물고기, 또는 그러한 세포들이 수확될 수 있는 다른 동물이 될 수 있다. 한가지 면에서, 3차원 배양액에서 사용된 평활근 세포는 포유류 세포이다. 특정 실시예에서, 세포는 인간 또는 영장류세포일 수 있다. 그러나 쥐 및 토끼세포도 또한 유용하게 사용될 수 있다. 일단 확보된 경우, 세포는 배양될 수 있으며, 적당한 성장요소들이 배양액에 추가될 수 있다. 배양액에서의 그러한 요소의 농도는 모니터링될 수 있으며 성장을 최적화하기 위해 조절된다. 이러한 방법으로 배양된 세포는 이식이나 삽입을 위해 사용될 수 있다. 이미 언급된 바와 같이, 종종 환자의 고유의 세포(자가 세포)로부터 근육세포를 얻는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 평활근 및 /또는 원형 평활근을 포함하는 다양한 기관으로부터 분리된 일차 평활근육세포를 가지고 수행될 수 있다. 평활근을 포함하는 기관은 식도(esophagus), 위(stomach), 십이지장(duodenum), 빈창자(jejunum), 회장(ileum), 결장(colon), 기도(trachea), 기관지(bronchial tubes), 자궁(uterus), 혈관(blood vessels), 림프관(lymphatic vessels), 요도(urethra), 선관(glandular ducts) 및 눈의 모양체근(ciliary muscle)을 포함한다. 예를 들면, 평활근세포는 이미 언급한 바와 같이 뉴질랜드 흰 토끼의 내부 항문괄약근에서 분리될 수 있다 (Bitar 등, Am J Physiol 260: G537-G542, 1991; Bitar 등, Am J Physiol 242: G400-G407, 1982).
1차 세포는 해당기술분야의 숙련자에게 알려진 일반적인 기술을 사용하여 세포의 공급으로서 수행할 수 있는 적합한 기관 또는 조직의 해리를 통하여 이미 분리된 것일 수 있다.
예를 들면, 조직이나 기관은 기계적으로 분리될 수 있고 또는 소화효소 및 또는 또는 두드러진 세포 파괴없이 이웃하는 세포사이의 연결을 약화시켜 조직을 개별세포 현탁액으로 분산시킬 수 있는 킬레이팅 제제로 처리될 수 있다.
효소적 분리반응은 조직 잘게 썰기 및 잘게 썰린 조직을 많은 수의 소화효소 단독 또는 조합으로 처리하는 것을 수반할 수 있다. 그 소화효소는 트립신, 키모트립신, 콜라기나제(collagenase), 엘라스타제(elastase),및/또는 히알루로니다제(hyaluronidase), DN아제(DNase)와 프로나아제(pronase)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 기계적 분해는 파쇄기, 혼합기, 체, 동질화기, 세포 압력기, 초음파기를 포함하는 많은 수의 방법이 수반될 수 있다. 조직 분해기술의 점검을 위해 Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, pp. 107-126을 보면 된다.
일단 조직이 개별세포의 현탁액으로 환원되었다면, 현탁액은 근육세포 (myocyte) 및/또는 섬유아세포(fibroblast) 가 얻어질 수 있는 부분모집단으로 분획될 수 있다.
분획은 또한 세포 분리 복제, 특정한 세포 타입의 선별, 불필요한 세포의 선택적인 파괴, 혼합된 개체군에서 차별적인 세포 응집성을 기반한 분리, 동결해동 절차, 혼합된 개체군에서 차별적인 부착성을 기반으로 하는 분리,필터링, 사업적이고 부분적인 원심분리,원심분리 추출(counter-streaming centrifugation), 유닛 중력 분리, 향류분배(counter current distribution), 전기영동, 형광 활성 세포 분리를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
복제 선택 및 세포분리를 검토하기 위해서는 Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137-168을 보면 된다.
뉴런 세포(Neuronal Cells)
본 방법에서 사용하기 적합한 줄기세포는 뉴런세포, 성상세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)로 분화할 수 있는 다관능 세포이다. (Eriksson, P. S. 등, Nature Med. 4:1313-1317 (1998); Palmer, T. D.등, Mol. Cell Neurosci., 8:389-404 1997).
알려진 방법에서 사용하기 적합할 수 있는 다른 세포의 제한되지 않는 예는 전구세포를 포함하고 그것은 신경계로 제한된 계통에 전념한다. 그것은 희돌기교세포(oligodendrocytes) 및 성상세포(astrocytes)로 진행할 수 있는 신경교 세포 전구; 그리고 뉴런으로 진행될 수 있는 뉴런 전구를 발생시킬 수 있다. 다른 위임 전구세포는 신경교(glial ) 세포, 뉴런(neuronal)세포, 성상세포(astrocytes) 및 희돌기교세포(oligodendrocytes)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
성숙한 뉴런세포 및 또는 미분화 줄기세포 및 전구 뉴런 세포를 포함하는 뉴런세포는 다양한 조직타입으로부터 얻어지거나 분리될 수 있다. 약간 비 제한적인 예들은 소장의 신경시스템을 포함한다, 그것은 1차 구심뉴런, 연합뉴런, 원심뉴런과 같은 수많은 다른 뉴런 개체군과 뇌, 척추와 같은 중추신경계의 조직과 기관을 포함한다. 게다가 특정예에서, 뉴런전구 세포는 신경분포된 구성체의 수여자가 될 수 있는 환자로부터 얻어진 자가세포이다.
뉴런 세포는 조직의 접합 세포외 기질로부터 개별 세포의 분리를 통해서 얻어질 수 있다. 예를 들면, 개별 신경부로부터 조직이 무균절차를 통해 기증자로부터 제거될 수 있으며, 트립신, 콜라겐나제 등과 같은 효소처리를 포함하는 해당 기술분야에 알려진 방법 또는 뭉뚝한 도구를 이용하여 분리하는 물리적 방법을 사용하면서 세포가 해리된다.
일례로, 세포의 해리는 조직 배양 배지에서 수행될 수 있다. 해리된 세포는 200 rpm~2000 rpm 사이의 저속에서 대게는 400rpm~ 800rpm 사이에서 원심분리될 수 있으며, 그리고 다시 배양배지에서 재현탁시킨다.
뉴런 세포는 현액액이나 또는 고정된 기질에서 배양될 수 있다. 세포 현탁액은 특별히 배양 플라스크, 배양 플레이트 또는 회전병(roller bottles), 그리고 보다 특별하게 작은 배양 플라스크등, 세포현탁이 가능한 어떠한 용기에라도 파종될 수 있을 것이다. 현탁액에서 배양된 세포들은 바람직한 농도에서 다시 재현탁될 수 있다
실시예에서, 해리된 뉴런세포들은 해리된 세포를 신경구 형성촉진이 가능한 이미 알려진 배양 배지로 배치하여 신경구를 형성하기 위해 배양될 수 있다. 그러한 배양 배지는 예를들면 HEM, DMEM, RPMI, F-12 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
배양 배지는 글루타민, 그리고 다른 아미노산, 비타민, 미네랄 및 트랜스페린과 유사체와 같은 유용 단백질과 같은 세포의 대사작용을 위해 필요한 보충제를 포함할 수 있다.
배양 배지는 또한 효모, 박테리아, 곰팡이의 오염을 방지할 수 있는 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 및 유사체 등과 같은 항생제를 포함할 수 있다. 어떤 예에서는 배지는 소, 말, 가금류 및 유사체로부터 유래된 혈청을 포함할 수 있다.
그러나, 신경구를 형성 촉진을 위한 배지는 전형적으로 무혈청 배양이다. 혈정은 분화를 유도하고 알 수 없는 구성요소를 포함하는 경향이 있기 때문이다. 정의된 배양 배지는 또한 만약 세포가 이식목적을 위해 사용되는 것이라면 정의된 배양 배지가 사용될 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 DMEM, F12, 및 정의된 호르몬 및 염 혼합물의 혼합물을 포함할 수 있다.
배양 배지는 성장요소 및 또는 화합물을 유발하는 적어도 하나의 세포구가 보충될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 성장요소는 뉴런 줄기세포 및/ 또는 신경줄기세포자손에 대한 성장, 증식, 영향효과를 갖는 단백질, 펩타이드, 또는 다른 분자 또는 화합물을 지칭한다.
성장인자의 예는 예를 들면, 뼈형성(bone morphogenetic) 단백질 (BMPs), 혈소판유래(platelet-derived) 성장인자 (PDGF), 소니헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh), 인슐린 유사 성장인자 1 (IGF-1), 표피(epidermal) 성장인자 (EGF), 암피레균린(amphiregulin), 산성섬유아세포(acidic fibroblast) 성장인자 (aFGF or FGF-1), 염기성섬유세포(basic fibroblast) 성장인자 (bFGF or FGF-2), 형질전환(transforming) 성장인자 알파(TGFα, 신경 성장인자 (NGF), N2 (Invitrogen), 호르몬을 분비하는 갑상선자극호르몬(thyrotropin) (TRH), 형질전환(transforming) 성장인자 베타 (TGFβ), 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 배양배지에 포함되어 있는 성장인자는 EGF 및 FGF를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예로, 줄기세포를 뉴런 계통의 세포로 분화를 유도할 수 있는 화학적 바이오 인자와 같은 뉴런 분화 인자는 미분화줄기세포와 전구 뉴런세포를 뉴런으로 분화시키는데 사용될 수 있다.
뉴런 분화 인자는 배양액에서의 줄기세포의 뉴런 분화를 조절할 수 있는, 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor), 섬유아세포 성장인자-8(fibroblast growth factor-8), 뇌 유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor), 소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog), N2 첨가제™(N2 supplement™) 및 이들의 조합을 포함하며 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 의하여 분화된 뉴런세포는 성숙 표현형을 가지고 뉴런 기능을 나타낸다. 예를 들면, 뉴런 분화의 과정을 관찰하는 것은 뉴런 분화의 유전적 마커 발현을 위한 스크리닝을 포함할 수 있다.
예를 들면 mRNA for c-Ret, sox1, otx2, otx1, pax2, pax5, 및 Nurr1, 네스틴(nestin), GFAP, MBP, NF200, 도파민, TH, GABA, TrH, 및 DBH 를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신경외배엽 전사체의 수준을 측정함으로서 배양액에서의 세포의 발달과정은 관찰될 수 있다. 유전자 발현 관찰을 위한 분석은 해당기술분야 (예를 들면, RT_PCR)에 이미 잘 알려져 있고 일반적인 방법론을 사용하여 수행될 수 있다
성상세포(astrocytes) 및/또는 희돌기교세포(oligodendrocytes) 상의 세포 단백질을 탐지할 수 있는 항체와 면역세포화학 (예를 들면 이중라벨(dual-label) 면역형광검사(immunofluorescence) 및 면역페록시다아제 기법(immunoperoxidase methods)을 이용하는 것과 같이 표현형 성질 또는 세포적 성질을 발현하는 세포를 선별하는 것에 의한 뉴런 세포의 분리. 특히 뉴런세포를 위한 세포적 마커는 NSE, NF, MAP-2; 그리고 교질(glia)에 대해서는, GFAP (성상세포식별자), 갈락토세레브로사이드(galactocerebroside,GalC), 희돌기교세포(oligodendrocytes)의 미엘린 당지질 식별자 (myelin glycolipid identifier) )등을 포함한다.
면역세포화학은 또한 신경전달물질 또는 신경전달물질의 합성을 책임지는 효소의 발현을 탐지하기 위해 사용될 수 있다.
뉴런 세포의 확인을 위해, 항체가 사용될 수 있으며 아세틸클로린(ACh), 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린, 히스타민, 세로토닌 또는 5-하이드록시트립타민 (5-HT), 물질 P와 같은 신경펩타이드, 향부신피질호르몬 호르몬, 바소프레신 또는 향이뇨호르몬, 옥시토신, 소마토스타틴, 엔지오텐신 II, 뉴로스텐신, 및 봄베신, TRH와 같은 호르몬을 배출하는 시상하부 및 호르몬을 배출하는 황체형성호르몬, 혈관작동성장펩타이드(VIP)와 같은 위장펩타이드 및 콜레키스토키닌(CCK) 및 CCK-같은 펩타이드, 엔돌핀과 닮은 베타-엔돌핀 같은 오피오이드 펩타이드 및 메트- 및 루엔-케팔린과 같은 엔케팔린, 프로스타그란딘, GABA와 같은 아미노산, 글리신, 글루타메이트, 시스테인, 타우린 및 아스파르트산 및 카르노신과 같은 디펩타이드의 존재를 탐지한다.
GABA 의 합성에 관여하는 글루탐산 디카르복실라아제 (GAD), 도파민을 위한 도파 디카르복실라제 (DDC), 노르피네프린을 위한 도파민-베타-하드록실라아제 (DBH), 5-HT를 위한 아미노산 디카르복실라아제와 같은 신경전달물질 합성 효소에 대한 항체가 또한 사용될 수 있다.
Ach를 비활성화하는 아세틸 콜린에스터라제 (AChE)와 같이 신경전달물질의 비활성화와 관여된 효소에 대한 항체는 또한 유용할 수 있다. 도파민을 위한 모노아민 옥시데이즈와 카테콜-o- 메틸 트렌스퍼라제, 5-HT를 위한, GABA를 위한 GAA 트렌스퍼라제와 같은 신경전달물질의 뉴런말단으로의 재흡수에 관여하는 효소에 대한 항체도 또한 뉴런을 확인할 수 있다. 뉴런을 위한 다른 마커는 AChE 니코틴과 무스카린성 수용체(muscarinic receptors), 아드네날린성 수용체(adrenergic receptors)α1,α2,β1 및 β2 ,도파민 수용체 등과 같은 신경전달물질 수용체에 대한 항체를 포함할 수 있다.
근육과 뉴런 조직 구성체(Muscle and Neuronal Tissue Constructs)
본 발명의 일면에서, 교체 구조들은 다양한 근육 및 뉴런세포 구성체으로부터 생체조작된다. 배양액에서 근육 및 뉴런 구성체들을 발생시키기 위해, 평활근세포 및 뉴런세포들은 적당한 영양 배지에서 배양된다. DMEM, RPMI 1640, Fisher's Iscove's, McCoy's, 등과 같은 상업적으로 이용이 가능한 많은 배지들이 사용에 적합하다. 게다가 그 구조체들은 소모된 배지를 제거하고 배출된 세포들을 억제하기 위해 정기적으로 공급되어야 한다.
이러한 절차들은 근육세포가 접종된 3차원 구조를 가진 폐쇄 시스템인 생물반응기를 사용하면서 수행될 때 훌륭하게 활용되고 있다. 생물반응기는 오염의 가능성을 줄이고, 대류에 의해 연골조직 구성체를 가로질러 평활근세포에 대한 영양분의 적절한 공급이 유지되는 환경조건을 만들기 위한 간헐적이고 주기적인 가압 환경에서 배양액을 유지한다.
각각의 근육 및 뉴런 세포 구성체를 발생시키기 위해, 균일한 평활근세포 개체군 및 뉴런세포 개체군은 하나 또는 그 이상의 세포외 매트릭스 단백질을 포함하는 세포 배양 용기안에서 개별적으로 또는 함께 배양될 수 있다. 세포외 매트릭스 단백질의 예는 젤라틴, 아라빅검, 콜라겐 (콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 콜라겐 VI, 콜라겐 VII, 콜라겐 VIII, 콜라겐 IX, and 콜라겐 X), 피브로넥틴, 라미닌, 글라이코사미노글리칸, 이들의 혼합물 및 세포배양 기술분야에서 숙련된 기술자에게 알려진 생물학적 매트릭스 분자와 유사한 성질을 갖는 다른 물질을 포함한다.
일반적으로, 피브린 젤은 본발명의 구성체를 형성하는데 사용될 수 있다. 피브린은 피브린 단일체를 서로 반응하게 하여 피브릴을 형성하게 하는 세린 프로티나제 트롬빈에 의한 피브리노겐의 효소분해를 통해 얻을 수 있다. 피브린 매트릭스내에서, 세포는 피브린을 그들 고유의 세포외 매트릭스로 맞바꾸면서 피브린을 신속하게 이동, 증식, 분해한다. Grassl et al., Journal of Biomedical Material Research 60: 607-612, 2002. Grassl et al., Journal of Biomedical Materials Research 66A: 550-561, 2003. Neidert et al., Biomaterials 17: 3717-3731, 2002. Ross & Tranquillo Matrix Biology 22: 477-490, 2003).
실시예에서, 뉴런 세포는 또한 피브린겔 또는 콜라겐 또는 콜라겐/라미닌 매크릭스내에서 성장할 수 있다. 매트릭스 물질과 혼합한 후, 뉴런세포 개체군은 배양되어 뉴런 세포층을 형성할 수 있다. 뉴런세포 개체군은 또한 배양되어 원통형태의 고리를 뒤덮을 수 있다. 실시예에서, 원통형 고리는 상표명 Sylgard으로 판매되고 있는 것과 같은 실리콘으로 제작될 수 있다. 게다가 뉴런 세포 개체군은 실리콘으로 표면처리된 면에서 배양될 수 있다.
평활근세포는 일시적인 3차원 매트릭스를 생산하기 위해 피브린겔상에서 배양될 수 있다. 추가적으로, 평활근세포는 일시적인 3차 매트릭스를 생산하기 위해 콜라겐 또는 콜라겐/라미닌 매트릭스 에서 배양될 수 있다. 평활근세포/매트릭스 혼합체는 뉴런세포 개체군위에 증착될 수 있다. 그렇지 않으면, 평활근세포/매트릭스 혼합물은 평활근 세포/ 매트릭스 혼합물의 위에 증착된 뉴런 세포/매트릭스 혼합물과 함께 첫번째 층으로써 배양될 수 있다.
예를 들면 피브린, 콜라겐 및/또는 라미닌과 같은 매트릭스 단백질은 기능성 평활근 세포 구성체를 형성하기 위해 배양액에서 평활근 세포를 단일방향성 형태로 안내한다. 세포 배양 용기를 뒤덮을 수 있는 매트릭스 형태 및 본 발명의 세포배양 용기는 사실상 제한이 없으며 생물학적 매트릭스및 인조 매트릭스들을 포함할 수 있다. 매트릭스는 일반적으로 포유류 숙주에 적용되었을 때, 부정적 반응, 알러지 반응, 또는 다른 부작용을 생산하지 않는 형태인 생체적합성인 것과 관련되는 모든 특징들을 가지고 있다.
발명의 또 다른 면에서, 원동형 틀은 구성체를 안내하고 모양형성에 사용될 수 있다. 그러한 틀은 상표명 Sylgard™으로 판매되는 것과 같은 실리콘으로 제작될 수 있다. 또 다른 면에서, 비 원통형 틀은 구조체를 안내하고 모양형성에 사용될 수 있다. 그 구조체는 사실상 제한이 없는 형태와 크기로 형성될 수 있다.
조직 구조체( Tissue Structures)
개별 평활근 세포/뉴런세포 구성체는 조직 구조를 형성하기 위해 조합될 수 있다. 평활근 세포/ 뉴런 세포 구성체는 심사숙고된 조직에 적합한 공간을 가진 스캐폴드에 자리잡을 수 있다. 조직 구조에 사용되는 많은 수의 평활근 세포/뉴런 세포 구성체는 생체조작될 조직 구조의 공간 및 크기에 따라 다양하다. 바람직한 실시예에서, 평활근 세포/ 뉴런세포 구성체는 뉴런세포 또는 충분한 신경분포가 결여된 인접한 평활근 세포 구성체들 또는 조직과 연결된다.
실시예에서, 구성체들은 증착 또는 봉합술, 가열, 스테이플링, 및 생물학적/수술용 접착제로 접착하는 것 또는 이들의 조합들과 같은 일반적인 기술을 사용하는 다양한 수축 평활근세포 구성체의 결합에 의하여 조직 구조를 구성체하기 위해 연결될 수 있다.
접착제 및 세포 밀봉제는 해당기술분야에서 잘 알려져 있으며 10년 이상 미국외에서 시판되고 있다. 포름알데히드와 가교결합된 젤라틴기반의 접착제는 1964년 이래로 실험적으로 ,주로 유럽에서 사용되었다. 여러 제형들이 제안되어졌으며 "GRF(젤라틴(gelatin), 레조시놀(resorcinol), 포몰(formol))"가장 잘 알려져 있다. 선택된 젤라틴의 뜨거운 용액이 제자리에서 주로 포름알데히드 용액으로 구성된 경화제와 혼합된다. 그 혼합은 조직에 붙어있는 고체로 빠르게 굳어진다.
피브린 접착제는 접착 또는 밀봉 조성물을 생성하기 위해 혈전 형성의 자연적인 과정을 활용한다. 하나의 상업적 상품은 "Tussicol"® Rugis, 프랑스 이다. 또 다른 하나는 Immuno AG 의 자회사Osterreiehisehes 연구소, GMBH, 비엔나, 오스트리아로부터 얻을 수 있는 "Fibrin Sealant Kit 1.0"이다. 두 가자의 구성요소는 인공 혈전을 생성하기 위해 결합될 수 있다. 구성요소중 하나는 피브리노겐의 용액과 Factor XIII 와 같은 혈전 요소이며, 또 다른 하나는 주로 토롬빈과 칼슘이온의 용액이다.
또 다른 실시예로, 상기 구성체들은 충분한 신경분포가 결여된 조직 또는 기관 구조체와 구성체를 서로 결합하여 신경패치로서 작용이 가능하다. 상기 신경 패치는 봉합, 가열, 스테플링(stapling), 생물학용/수술용 풀을 이용한 풀칠(gluing ) 또는 상기 방법들의 조합등 일반적인 기술을 사용하여 조직과 연결될 수 있다. 상기 구성체들은 또한 조직과 결합하기전에 스캐폴드와 결합되거나 접착될 수 있다. 한 개 또는 그 이상의 신경 패치는 조직 구조체를 강화하기 위해 풀칠, 증착, 또는 접착을 통해 서로 결합될 수 있고, 추가적인 신경 원천을 제공할 수 있다.
조직 배양 용기(Tissue Culture Vessels)
당해 기술분야에서의 당업자는 이미 언급된 세포 배양 및 생체조작 방법론은 다양한 환경에서 수행될 수 있음을 손쉽게 이해할 수 있다. 평활근 세포들은 부착의존이며 그러므로 배양액에서 배양하기 위해서는, 이러한 세포들은 세포가 부착할 수 있고 성장을 위해 이동할 수 있는 비독성, 생물학적 불활성, 광학적 투명 표면을 필요로 한다. 조직 배양 용기 또는 플레이트는 무균처리되어 있고 1회용인 특별 처리된 폴리스티렌 플라스틱을 포함한다. 이것들은 페트리 접시, 멀티-웰 플레이트, 미량 역가판, 회전병, 스크류캡 플라스크 (플라스크 (T-25, T-75, T-150 cm2표면적)), 배양 주머니 또는 셀을 보관할 수 있는 어떠한 용기, 보다 바람직하게는 무균환경을 포함한다.
본 발명의 실시예로서, 생물반응기는 또한 생체조작 조직구조와 평활근 배양에 유용하다. 예를 들면, 여러 제조사들은 세포를 키우기 위해 사용될 수 있고 본 발명의 방법과 결합하여 사용될 수 있는 장비를 현재 제조하고 있다.예를 들면, Celdyne Corp., Houston, Tex.; Unisyn Technologies, Hopkinton, Mass.; Synthecon, Inc. Houston, Tex.; Aastrom Biosciences, Inc. Ann Arbor, Mich.; Wave Biotech LLC, Bedminster, N.J. 게다가 이러한 생물반응기를 포함하는 특허들은 U.S. Pat. Nos. 6,096,532; 6,001,642, 5,985,653; 5,888,807; 5,688,687, 5,605,835, 5,190,878 이며 이것들은 여기서 참고문헌으로서 포함되어 있다.
낮은 엇갈림, 높은 영양 관류 환경을 제공하도록 구성된 장비이며, 시장에서 시판중인 많은 수의 다양한 종류의 생물반응기가 존재한다. 예를 들면, 본 발명은 더 커다란 외부 원통형안에 위치하는, 작은 내부 원통 및 튜브 구조로 구성된 회전 벽 생물반응기안에서 수행될 수 있다.
비록 본 발명의 튜브 구조체는 내부 원통위에서 제작될 수 있지만, 생물반응기안의 다른 부위는 또한 구성체의 배치를 위해 사용될 수 있다. 내부 원통과 외부원통 사이의 간격은 세포를 위한 배양 용기 공간으로 사용된다. 배양 배지는 외부 소수성 멤브레인을 통해 산화될 수 있다. 회전 생물반응기의 낮은 엇갈림 환경은 능동적 교반에서 발생할 수 있는 손상이나 영양분의 씻김없이 세포-세포 및 세포-세포외 기질(ECM) 상호작용을 촉진한다.
3차원 배양 시스템(Three-Dimensional Culture System)
본 발명의3차원 배양 시스템은 다양한 적용예에서 사용된다. 실시예에서, 3차원 배양시스템은 환자내 이식 또는 삽입전에 체외 개별 평활근 세포/ 뉴런 세포 구성체 또는 생체조작된 조직 구조체를 유지하는데 사용될 수 있다.
3차원 조직 구조체를 배양액내에서 발생시키기 위해서는, 평활근 세포/뉴런 세포 구성체 또는 생체조작된 조직 구조체내에서의 세포는 RPMI 1640, Fisher's Iscove's, McCoy's 및 유사체와 같이 시판중인 배지와 같은 적당한 영양배지에서 배양되어야 한다. 게다가 3차원 배양액은 소모된 배지와 방출된 세포의 억제를 위해 주기적으로 공급되어야 한다.
당해 기술분야의 통상적인 기술을 가진 자들은 이미 언급된 세포 배양과 생체조작된 방법론은 다양한 환경에서 실시될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
평활근 세포들은 부착의존성이며 그러므로 배양액에서 배양하기 위해서는, 이러한 세포들은 세포가 부착할 수 있고 성장을 위해 이동할 수 있는 비독성이고 생물학적 불활성이며 광학적 투명한 표면을 필요로 한다. 조직 배양 용기 또는 플레이트는 무균처리되어 있고 1회용인 특별 처리된 폴리스티렌 플라스틱을 포함한다. 이것들은 페트리 접시, 멀티-웰 플레이트, 미량 역가판, 회전병, 스크류캡 플라스크 (T-25, T-75, T-150 cm2 표면적), 배양 주머니 또는 셀을 보관할 수 있는 용기, 보다 바람직하게는 무균환경을 포함한다.
이러한 절차들은 근육세포가 접종된 3차원 구조를 가진 폐쇄 시스템인 생물반응기를 사용하면서 수행될 때 훌륭하게 활용되고 있다. 생물반응기는 오염의 가능성을 줄이고, 대류에 의해 연골조직 구성체를 가로질러 평활근세포에 대한 영양분의 적절한 공급이 유지되는 환경조건을 만들기 위한 간헐적이고 주기적인 가압 환경에서 배양액을 유지한다.
본 발명의 실시예에서, 생물반응기는 또한 평활근 세포및/ 또는 뉴런 세포배양을 통한 조직 구조체의 구성체들의 생체조작에 유용하다. 예를 들어, 몇몇 제조사들이 최근에 세포성장에 사용할 수 있으며 본 발명의 방법들과 조합하여 사용할 수 있는 장치들을 만들고 있다.
이러한 방법들은 평활근 / 뉴런 세포 구성체 또는 생체조작된 구조체 발생에 유용할 것이며, 생체조작된 조직 구조가 자연적으로 발생한 포유류 조직과 기능적으로 유사한지 여부를 판단하는데 사용될 것이다. 게다가 평활근 세포 기능은 Gorenne등, Amer. J. Physiol. 5:H131-H138, 1998에서 언급된 바와 같이 혈관 근육에서 측정될 수 있을 것이다.
매트릭스/스캐폴드 물질 (Matrix/Scaffold Materials)
각각의 생체조작된 평활근/뉴런세포 구성체가 현존하는 기관을 대체하기 위해 더 큰 조직 구조에 대한 구성요소로 작용할 수 있다. 생체조작된 조직 구조의 형성에 사용된 스캐폴드는 환자내 이식 또는 삽입전에 제거되거나 스캐폴드는 생체조작된 조직구조의 일부분으로서 삽입될 수 있다.
필요에 따라 포유류안으로 생체조작된 조직 구조의 삽입을 위해, 평활근/뉴런세포 구성체의 형성에 사용된 매트릭스 및/또는 생체조작된 조직 구조의 형성에 사용된 스캐폴드는 완전한 자연 조직을 생산하기 위해 신체내에서 시간에 따라 부식되는 생분해가능한 물질로 제조될 수 있다. 이러한 매트릭스와 스캐폴드는 어떠한 만성 감염 반응을 유발하지 않고 감염을 위한 장기 부위로 작용될 수 없다. 생분해폴리머는 구조적으로 숙주 조직에 삽입될 수 있는 조직을 조작하는데 활용될 수 있다. 대다수의 자연유래 매트릭스-유사 물질이 사용될 수 있고 결국에는 생체내 환경에서 분해가능하게 될 것이다. 게다가 그런 인조 물질의 분해시간이 배양된 세포로부터의 새로운 조직의 형성과 일치하도록 구성체될 수 있기 때문에 인조, 생분해성 매트릭스 및 스캐폴드는 종종 유리하다.
매트릭스/스캐폴드 물질의 선택은 개별 환경과 사용된 세포(평활근 및 또는 뉴런세포)의 타입 또는 생체조작될 조직의 타입에 따라서 달라질 수 있다. 해당 기술분야에서 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 생체적합성, 생분해성, 힘, 단단함, 접촉 성질 그리고 외관적 모습과 같은 물리적 화학적 특징들은 매트릭스를 선택하는데 있어서 고려되어야 할 것이다. 적당한 매트릭스는 제자리에서 포유류 복구 세포가 이동할 수 있는 스캐폴드로서 작용한다.매트릭스/스캐폴드 물질은 한가지 물질 이상의 혼합물, 합성 물질의 혼합물, 합성물질과 천연재료의 혼합물 또는 천연물질의 혼합물중 어느 하나일 수 있다.
피브린 젤은 장기 교체를 위해 사용될 수 있는 적합한 물질이다. 피브린 젤은 트롬빈에 의한 피브리노겐의 활성화에 의해 발생되는 단위체 피브린 분자로 구성된 연결망이다. 이런 생체중합체는 지혈과 상처치료에 관여하는 것으로 알려져 있다. 피브린은 일시적인 조직 교체 및 흡수성 삽입 물질로서 사용될 수 있는 생분해성 물질이다.
적합한 물질의 또 다른 예는 섬유상 콜라겐이며 동결건조 후 추출 및 조직으로부터의 부분적 정제 그리고 무균화될 수 있다. 또한 매트릭스는 시그마 및 콜라겐 회사와 같은 다양한 상업적 공급처로부터 얻을 수 있는 힘줄 또는 진피 콜라겐으로부터 제조될 수 있다.
다양한 콜라겐 매트릭스는 미네랄화된 콜라겐 형태일 수 있다. 예를 들면, Norian Corp., (1025 Terra Bella Ave., Mountain View, Calif., 94043) 로부터 구할 수 있는 , UltraFiber™으로 지칭되는 섬유모양의 콜라겐 삽입 물질은 매트릭스의 형성을 위해 사용될 수 있다. 참고문헌으로 본문에 삽입된 미국 특허 No. 5,231,169 는 분산된 콜라겐 피브릴이 있는 데서 그자리에 온화한 교반하에 칼슘 포스페이트 미네랄 형성을 통해 미네랄화된 콜라겐의 제조를 기술하고 있다.
사용될 수 있는 또 다른 형태의 생체물질은 작은 창자 점막하조직샘(SIS)이다. 그 SIS 이식 물질은 성체 돼지의 공장의 일부분으로부터 제조될 수 있다. 조직샘플의 분리는 Badybak 등, (J. Surg. Res. 47:74-80, 1989). 에 기술된 것과 같은 일반적인 조직 배양 기술을 사용하여 수행될 수 있다. SIS 물질은 소장 조직의 제거, 그 일부분의 반전, 이후의 기계적 마모 기술에 의한 점막과 표피 점막하조직샘의 제거에 의해 제조된다. 그 일부분을 그것의 원래 방향으로 되돌린 이후, 장막과 근육층은 씻어 내지고 나중 사용을 위해 보관된다.
라미닌은 대부분의 세포와 기관을 위한 단백질 연결망 토대인 기초층(basal lamina)의 주요 단백질이다. 라미닌은 중요하고 세포 분화, 이동, 접착뿐만 아니라 표현형 및 생존에 영향을 미치는 기초층의 생물학적 활성 부위이다.
매트릭스와 스캐폴드는 또한 키틴에서 유래한다. 여기서 사용되는 키틴은 곤충, 특히 갑각류 또는 벌레의 껍질로부터 제조된 폴리사카라이드 조성물을 지칭한다. 그것은 생체적합성이고 자연적으로 신체에 재흡수된다. 그리고 전에 지속성 약물 방출, 골격 유도 및 지혈을 위해 사용된 바 있다. (예를 들어 Chandy and Sharma, Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. (1991) 19:745-760, Hou등, Chem. Pharm. Bull. (1985) 33 (9):3986-3992, and Klokkevold, P. J. Oral Maxillofac. Sur. (1992) 50:41-45 을 참조할 수 있고, 상기 공개된 부분은 참고문헌으로서 본문에 삽입되어 있다).
"키토산"은 키틴의 변형된 형태이며 적합한 폴리사카라이드 스캐폴드의 일예를 제공한다. 여기서 사용된 "키토산"은 키틴내의 N-아세틸 글루코산의 아세트아미노 그룹의 가수분해에 의해 제조된 폴리사카라이드를 포함한다. 또한 포함된 것은 생체의료적 수준의 키토산의 카복시메틸화를 통해 제조된 수용성 키틴 유도체, NOC-키토산에서 유래된 스캐폴드다.
본문에 참고문헌으로 삽입되어있는 미국 특허 No. 4,619,995는 NOC-키토산의 조성물과 제법을 제시한다. 키틴과 그것의 유도체는 동결 또는 바람건조 키틴, 또는 원래 제작되었던 가루로 만든 키틴으로부터 파우더나 고형물 형태로 제조될 수 있다. 또한 포함된 것은 교차 결합된 키틴 유도체로부터 유래된 스캐폴드들이다. (예를 들면 참고문헌으로 본문에 삽입된 Adekogbe, I. "Fabrication and characterization of DTBP-crosslinked chitosan scaffolds for skin tissue engineering" Biomaterials (2005) 26 (35):7241-50을 참고.) 그외 제한하지 않는 키틴 스캐폴드들의 사례와 그들의 제조 방법에 대해서는 명세서가 본문에 참조된 (키틴 및 키토산 하이드로겔에 대해 개시하고 있는) 미국특허 6,124,273 미국특허 6,699,287 및 6,642,213을 참고할 수 있다.
다양한 실시예에서, 스캐폴드들은 다양한 폴리머 조성물로부터 제작될 수 있다. 임의의 농도 및 임의의 비율에서의 키토산, 키닌, 셀룰로오스, 알지네이트, 아가, 젤라틴, 콩 단백질, 히알루온산 콜라겐, 엘라스틴, 실크 단독 또는 다른 중합체 조성물과의 조합을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시예에서, 스캐폴드는 키토산 단독적으로 또는 하나 이상의 다른 물질과의 조합으로 구성된다. 또 다른 실시예에서 키토산은 젤라틴 또는 알지네이트와 같은 다른 물질과의 조합에서 사용될 수 있다.
가능한 비-생체분해성 매트릭스/ 스캐폴드들은 폴리(아크릴로니트릴-중합-염화비닐), 폴리리신, 셀룰로즈 아세테이트, 및 폴리설폰과 같은 반투과성 중합체 비-생체분해성 중합체를 포함한다. 비록 일반적으로 고정된 세포들의 사용을 위해 의도되었으나, 본 발명의 내용에서 그러한 중합체의 사용이 분명하게 배제되는 것은 아니다. 이러한 중합체들은 또한 알지네이트와 폴리포스파젠(polyphosphazenes )을 포함하는 다양한 젤과 함께 사용될 수 있다.
폴리포스파젠(polyphosphazenes)들은 인조 중합체이며, 폴리포스파젠들의 수용성 용액은 특정 이온이 있는 데서 젤이 된다. 이러한 중합체들은 알지네이트처럼 같은 방식으로 사용될 수 있다. 이러한 인조 중합체의 극도로 안정한 뼈대는 부드럽고 생리학적 젤화 조건을 상실하지 않고 가용화 측기의 기능성의 상당한 변형을 가능하게 한다.
예를 들면 콜라겐 같은 천연물질과 예를 들면 폴리글리코릭산과 같은 인조물질 둘다 이로운 점과 불리한 점이 존재한다. 디자인 개념 또는 천연물질의 특별한 생물학적 활성을 포함하는 인조 물질들은 양쪽 타입의 물질의 이로운 점을 결합할 수 있다. 합성 중합체의 재생산성,거대한 규모의 합성 및 유연한 성질은 천연물질의 생체적합성 및 생물학적 활성과 결합될 수 있다.
매트릭스와 스캐폴드 물질들은 같은 물질 또는 다른 물질로부터 구성체될 수 있다. 한가지 예에서, 매트릭스 물질은 콜라겔일 수 있고, 콜라겐/라미닌 혼합물일 수 있다. 또 다른 실시예에서 스캐폴드 물질은 키토산일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 알지네이트는 독립적으로 또는 한 개 또는 그 이상의 물질과 조합하여 스캐폴드 물질로 사용될 수 있다. 알지네이트는 쉽게 처리될 수 있으며, 수용성이고 비-면역성이다. 알지네이트는 손쉬운 젤화를 제공하는 자유 수산화기 그룹들을 가진 생체분해성 음이온성 폴리사카라이드 이다. 알지네이트는 치과학의 인상주조부터 의학적 붕대까지 다양한 의학적 용도를 위해 사용되는 갈조류 유도체이다. 쉽게 주조될 수 있는 능력과 생체적합성의 증거는 알지네이트를 본 발명에서 사용을 위한 바람직한 물질로 만든다.알지네이트는 물을 흡수하고 잘 보관하며 이는 치유를 위해 습기가 있는 환경이 이상적인 상처치료에 이상적이다.
평활근 세포 기능 측정 분석 (Assays for Measuring smooth muscle Cell Function)
위내장 평활근대들(smooth muscle strips )의 시험과 정의를 위해 생체내 일반적인 프로토콜(수축, 이완, 자발적 긴장(spontaneous tone))를 Glavind 등, Am. J. of Physiol. 265: G792-G798, 1993, Glavind등, Glavind 등, American Journal of Physiology 272: G1075-G1082, 1997, Chakder & Rattan, Am J. Physiol 264: G702-G707, 1993, Knudsen등, Amer. J. of Physiol. 269: G232-G239, 1995. 에서 알 수 있다.
근육대(muscle strip)의 신장및 평형기이후, 자발적 긴장은, 만약 방해되지 않는다면 적당한 자극과 함께 수축과 이완할 수 있는 능력이 수반되는, 확장기동안 일정한 긴장 진동(tension oscillations) 또는 안정한 긴장으로서 기술되어왔다. 본 발명의 생체조작된 구조체는 자발적 긴장을 보여준다. 신장 및 기준선(baseline) 긴장의 안정화 다음에, 생체조작된 고리는 일정기간에 걸쳐 일정하고 안정적인 긴장(tension/tone)을 보이며, 기준선 긴장(baseline tension)의 변화는 오로지 작용제-유발성 자극에 기인한다. 그 고리에 의해 발생한 안정한 긴장은 일정한 힘 측정을 위해 임의적으로 제로값으로 맞췄다.
이러한 방법들은 원형 평활근 세포를 사용하여 발생시킨 신경분포된 튜브모양의 조직 구조체를 위해 사용될 수 있으며 생체조작된 구조가 다른 자연적으로 발생한 포유류 구조체 또는 분리된 평활근 세포와 기능적으로 유사한지를 판단하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 생체조작된 구조의 실험적 설계는 다음과 같다. 1) 생체조작된 튜브 조직 구조는 자발적 기초 긴장을 발생시킨다. 2) 이완제 전달물질인 8-br-AMP, 8-br-Camp를 첨가한 경우, 그 생체조작된 구조체는 힘발생에서의 감소로 표현되고 측정되는, 기초 긴장(basal tension/basal tone)(이완)에서의 빠르고 현격한 감소를 유발한다. 3) 아세틸콜린이 첨가되면, 아세틸콜린은 거대하고 즉각적인 측정힘발생(수축)을 유도한다. 4) 8-br-cAMP의 추가는 생체조작된 구조체의 아세틸콜린 유발 수축 및 힘발생에서의 재빠른 이완을 유도한다.
신경분포된 튜브조직구조들의 연동운동력 또는 추진 성질은 기술분야에서 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 다른 한쪽 끝은 단단히 막은 상태에서 스캐폴드 끝 부분의 액체주입은 신경분포된 튜브 조직구조 중간부분을 확장시킬 것이고 단일방향성 흐름을 허용할 것이다. 생체조작된 튜브 조직 구조의 연동운동 동작에서, 액체가 삽입된 반대쪽 끝에서 액체가 비워질 것이고, 그 결과 중간부를 이완시킨다. 신경분포된 튜브 조직 구조가 흘림이나 역류의 징후없이 밀어낼 수 있는 액체의 최대 부피가 또한 측정될 수 있다. 추가적으로 유압은 흘림과 역류의 존재를 측정하기 위해 여러 번 적용될 수 있다.
게다가 평활근 세포 기능은 Gorenne 등, Amer. J. Physiol. 5:H131-H138, 1998에서 설명된 바와 같이 혈관근육에서 측정될 수 있다. 같은 크기의 힘을 특정하기 위해, 동맥은 과다 연결성 조직이 제거될 수 있고, 내피세포는 면 면봉으로 내막을 부드럽게 문질러서 제거될 수 있다. 돼지 경동맥의 중앙띠 (0.537 mm)는 상온에서 Muscle Research Station에 설치되고, PSS에서 90분동안 평형화하였다. 100mg 의 능동력이 모든 조직에 적용된다. 평형화후, 조직은 작용제(50μm) 로 최대한 수축시키고, 기초력(basal force)이 회복될 때까지 PSS로 세척한다. 그 조직은 2시간동안 PSS 또는 PSS를 포함하는 길항제에서 배양된다. 배양기간이후, 작용제에 대한 누적 농도-반응 곡선이 수행된다.
몇몇의 실시예에서, 평활근세포 기능은 서로 다른 신경분포된 튜브 근육 구조체에서 최소한 두개이상의 유발 수축을 포함하는 패턴 동작이다. 선택적으로 서로 다른 신경분포된 튜브 조직 구조체는 인접한 튜브 근육 구조체 및/또는 떨어진 신경분포된 튜브 조직 구조체를 포함한다. 일부 실시예에서, 최소한 두개의 유발 수축은 미리 정해진 순서에 따라서 연속적으로 및/또는 시기적절하게 발생된다. 몇몇의 실시예에서 평활근 세포운동은 선택적으로 반드시 연동운동을 포함하지는 않지만, 말단으로 전진하는 수축 파동을 포함한다. 일부 실시예에서 이러한 시스템 및/또는 평활근 세포 자극 방법의 사용은 역행흐름을 감소시킨다. 일부의 경우, 그러한 방법은 자연 연동운동을 모의실험하는, 말단 진행 수축파동을 생산하기 위한 신경분포된 튜브 근육 구조체의 자극에 의해서 이러한 결과를 달성한다.
뉴런 세포 기능 측정을 위한 분석 (Assays for Measuring Neuronal Cell Function)
뉴런 세포 기능은 기술분야에서 알려진 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들면, 신경 차단제가 있는 데서, 약물의 효과가 연구될 수 있다. 신경전달물질 또는 전기흐름과 같은 자극기에 대한 대응으로 기초 긴장을 이완시키는 능력에 따른 자발적 기초 긴장의 생리학 비교. 기초 긴장은 외부자극이 없거나 거의 없는 상태에서 자발적으로, 조직 구조체의 삽입 이전 및 이후에 측정될 수 있다. 기초 긴장의 유형은 조직구조체의 삽입 이전 및 삽입 이후 사이에서 자발적으로 측정될 수 있다.
기초 긴장은 신경전달물질 또는 다른 자극과 같은 약품 또는 외부 제제에 의해 영향받을 수 있다. 이런 방식으로 N-Nitro-L-아르기닌 메틸 에스터 염산염, 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, 에피네프린, 히스타민, 세로토닌 아데노신, 아난다미드, 산화질소, 감마-아미노부트릭산(aminobutric acid), 글루타메이트, 및 혈관작동성펩타이드(VIP) 수용체 효능약(receptor agonists)과 같은 nNOS-차단제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 니페디핀과 같이 기초 긴장을 억제할 수 있는 저해제는 자발적으로 조직 구조체 삽입전과 삽입후에 기초 긴장을 비교하는데 사용될 수 있다.
수용체 무결성 및 세포내 신호는 조직구조체 삽입 전 및 삽입 후 자발적으로 측정되는 콜린성 자극에 대응하여 관찰될 수 있다. 기초 긴장의 감소 또는 이완은 기능성 칼슘 채널 및 VIP 수용체와 같은 평활근의 세포 내 신호 메커니즘이 유지되고 있음을 나타낸다.
실시예
생체조작되고 신경분포된 그리고 신경분포되지않은 내부 항문 괄약근 (IAS) 구성체는 자가 토끼 IAS 평활근 및 소장 뉴런 전구세포를 사용하여 만들어진다. 배양액에서 4일 경과후, 구성체는 생분해성 합성 키토산 튜브모양 스캐폴드 주변에 놓여졌다. 신경분포가 되지 않은 근육 구성체 (뉴런 세포가 결여된)은 신경분포된 구성체 (뉴런세포를 포함하는 평활근세포) 한쪽에 인접하게 놓여진다. 또 다른 신경분포되지 않은 근육 구성체는 다른 한쪽에 신경분포된 구성체으로부터 1mm 떨어져 놓여진다. 구성체들의 생리학적 기능성은 생체외 분석된다.생체조작된 신경분포된 구성체의 양성 NADPH 디아포라제 염색은 질소활성뉴런(nitrergic neurons)의 존재를 증명한다. 현미경 이미지는 스캐폴드에 구성체체가 놓여진 이후 4일만에 신경분포된 것과 신경분포되지 않은 구성체 사이의 간격을 잇는 세포 처리과정을 보여준다. 10일째에, 분화된 신경연결망이 현미경으로 관찰되었다.
20일에 그 구성체들은 스캐폴드로부터 제거되고 생리학적 활성이 평가된다. (a) 처음에 본질적으로 신경분포된 구성체: (i) 아세틸콜린 (1 μM )은 153 μN의 근력발생을 유도하며, 그것은 콜린성 수축의 근육과 뉴런 구성요소의 무결성을 나타내면서 TTX(58%) 와 아트로핀 (90%) 전처리에 의해 저해된다. (ii) EFS 는 60μN의 이완을 유발하며, 그것은 이완 뉴런 구성요소의 무결성을 나타내면서 TTX 전처리에 의해 완벽하게 저해된다. (b) 초기에 신경분포되지 않은 구성체는 신경분포된 구성체으로부터 1mm 떨어져 놓여졌다. (i) 아세틸콜린 (1μM) 은 80μM의 완력생성을 유발하며, 이것은 근육 구성요소의 무결성과 콜린성 수축의 새로운 뉴런 구성요소의 등장을 의미하면서 TTX (40%) 및 아트로핀 (75%) 전처리에 의해 저해된다. (ii) EFS는 88 μM의 이완을 유발하며, 그것은 새롭게 형성된 기능성 억제 운동 뉴런의 등장을 나타내면서 TTX 전처리에 의해 완벽하게 저해된다.
이것은 신경분포되지 않은 근육의 신경분포를 위해 사용된 신경근 이식편의 첫번째 사례이다. 이것은 창자의 신경근질환의 재생성 의약 치료제에 대한 새로운 길을 제공한다.
실시예2
이번 실시예에서, 본질적으로 신경분포된 3차원 토끼 대장 구성체들은 생체조작되었고 특징적이다.
평활근 세포들은 트립신처리되고 신경구는 어큐테이즈(accutase)처리한다. 500k 평활근 세포와 200k 소장 뉴런 전구세포들은 원심분리되어 세포 펠렛을 구성한다. 소장 뉴런 전구세포들은 0.4mg/ml 콜라겐(타입 I 쥐 꼬리) 과 라미닌 (5ug/ml) 용액에 재현탁된다. 용액은 중앙기둥 주변에 Sylgard로 코팅된 35mm 접시로 피펫한다. 37C 배양기에 놓여지면, 용액은 15분 내지 30분내에 젤화된다.
평활근 세포 펠렛은 0.4mg/ml 콜라젠 용액안에 재현탁되고, 첫번째 젤층위에 피펫하고 배양기로 반환된다.2~4시간후, 젤은 멸균처리된 22g 바늘을 사용하여 접시의 가장자리부터 분리된다. 뉴런 분화 배지(뉴로베이살 A 배지(Neurobasal A medium )+ B27) 1ml가 추가되고 접시는 분화를 위한 37C/7% CO2 배양기로 반환된다.
시약: 성장 배지 및 보충제를 포함하는 모든 세포 배양 시약은 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 구입했다. 평활근을 위한 성장 배지는 10% 태아 소 혈청(FBS), 1.5% 항생제-안티마이코틱 및 0.6% 1-글루타민으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 로 구성된다. 신경 전구 세포를 위한 성장 배지는 뉴로베이살(neurobasal), N2첨가제, 항생제-항진균제(antimycotic)으로 구성되어 있다. 신경분화 배지는 태아 소 혈청, B27 공급 및 항생제-항진균제로 보충된 뉴로베이살 A 배지(Neurobasal A medium )로 구성되어 있다. 콜라게나제(Collagenase)타입 II는 Worthington Biochemicals (Lakewood, NJ)로부터 구입가능하다. 타입 I 쥐 꼬리 콜라겐은 BD Biosciences (Bedford, MA)으로부터 구매하였고 Hank's balanced salt solution (HBSS) 은 Hyclone (Logan, UT)로부터 구매하였다.
중간 분자량 키토산(75-85% 탈아세틸화), 글리코사미노글리칸 헤파란 설페이트(glycosaminoglycan heparan sulfate),1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide , EDC), 아세틸콜린(ACh), 혈관성 내장 펩타이드 (vasoactive intestinal peptide ,VIP) 및 테트로도톡신(tetrodotoxin , TTX)는 Sigma (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. Sylgard [poly(dimethylsiloxane); PDMS]는 세계정밀기구 (World Precision Instruments )(Sarasota, FL)로부터 구입될 수 있다.
토끼 대장 원형 평활근 세포의 분리: 토끼 내장 원형 평활근 세포 (RCSMCs)는 토끼 결장 대장으로부터 분리되었다. 요약하자면, 대장 조직이 얼음처럼 차가운 HBSS안에서 씻겨졌다. 장막,종방향의 평활근 및 점막은 제거되었다. 원형 평활근은 매우 짤게 잘려지고. 타입 II 콜라게나제(Worthington)으로 두번 소화되었고 세포 잔해들을 제거하기 위해 필터처리된다. 소화된 세포들은 씻겨지고, 성장배지안에서 재현탁되며, 조직배양 플라스크에 놓여진다. 세포들은 실험에서 사용되기 전까지 성장하여 합류된다.
토끼 신경 전구 세포들의 분리: 뉴런 전구 세포들은 토끼 공장(jejunum)으로부터 분리된다. 요약하자면, 토끼 공장의 생검은 HBSS를 사용하여 모든 물질이 세척된다. 조직은 잘게 잘려지고 콜라제나게(collagenase)/디스파제(dispase) 혼합물안에서 소화되었다. 세포 현탁액은 40μm mesh를 통해 걸러졌고 페트리접시에 놓여졌다.
합성 키토산 스캐폴드의 제작: 합성 키토산 스캐폴드는 타입 I 콜라겐 (0.1mg/ml)와 부피비 1:1로 혼합한 중량대비부피 2% 키토산 용액으로 제조되었다. 그 혼합물은 가운데가 비어있는 튜브형 틀에 붓고, -80 ℃, 3시간동안 얼린다. 그리고 24시간동안 동결건조한다. 스캐폴드는 0.2m NaOH 에서 중성화하고 카보디이미드(carbodiimide)를 사용하여 헤파린 설페이트와 가교 공유결합시킨다. 스캐폴드들은 PBS 와 증류수로 여러 번에 걸쳐 세척한다. 스캐폴드는 UV 멸균화하고 그 다음 신경이동(neural migration )을 향상시키기 위해 상온에서 2시간동안 라미닌(0.05mg/ml)으로 코팅한다.
본질적으로 신경분포된 3차원 원형 평활근 구성체는 생체조작된 것이다. 2 x 105 토끼 신경 전구 세포를 포함하는 콜라겐/라미닌 젤이 중앙 원통형 기둥과 함께 Sylgard-코팅 플레이트위에 놓여진다. 5 x 105 토끼 대장 원형 평활근 세포를 포함하는 두번째 콜라겐층은 첫번째 젤 층위에 놓여진다. 겔화이후, 신경 분화 배지가 플레이트에 놓여지고 370C 에서 배양된다. 중앙기둥과 함께 콜라겐 젤의 5 x 105 토끼 대장 원형 평활근 세포를 Sylgard-코팅 플레이트상에 내려놓으면서 비-신경분포된 토끼 대장의 구성체들이 생체조작된다. 겔화(gelation) 이후, 동일한 신경 분화 배지가 플레이트에 더해진다. 신경분포된 평활근 구성체는 고정되고 파라핀-내장화(paraffin-embedded )된다. α-평활근 액틴(F3777; Sigma) 및 평활근 특이적 칼데스몬(Caldesmon )(c-4562; Sigma)에 대한 면역염색분석이 수행된다.
4일째, 신경분포된 평활근 조직 구성체는 동일한 튜브모양의 합성 키토산 스캐폴드 주변에 있는 비-신경분포된 평활근 구성체 옆에 놓여진다.구성체들을 포함한 스캐폴드들은 18-20일동안 신경분화배지에 놓여졌다.
현미경 분석: 스캐폴드 주변에 구성체들을 배치한 후 5일째, 신경분포된 것과 비-신경분포된 생체조작 평활근 구성체사이의 접합에 대한 현미경 분석이 실시된다. 현미경 분석은 신경전구 세포가 분화를 시작했는지 여부와 붙어있는 비-신경분포된 구성체를 따라 뉴런 연결망이 형성되었는지 여부를 판단하기 위해 수행된다. 스캐폴드주변에 그것들을 배치한후 18일내지 20일째, 구성체는 분리되고 현미경 분석이 각각의 구성체에 대해 실시된다.
생리학적 기능: 생리학적 기능성을 위한 프로토콜은 이미 기술된 바 있다. 등척성 힘 변환기 (isometric force transducer) (Harvard Apparatus, Holliston, MA )는 구성체들에 의한 실시간 생성되는 힘을 기록하기 위해 사용된다. 구성체들은 조직 샘플을 37℃ ±1 조건에서 유지시켜주는 따뜻한 조직 욕조(bath)에서 배양된다. 15일째, 신경분포된 것과 비-신경분포된 구성체인 생체조작된 조직 구성체는 힘생성측정을 위해 스캐폴드로부터 분리된다. 조직구성체의 일면은 변환기의 측정팔(measuring arm)에 고리로 묶고, 다른 한면은 고정된 레퍼런스 핀에 고정된다. 조직 구성체는 새 배지를 포함하는 조직 욕조안에서 평형(equilibrate)화된다. 보고되는 모든 힘값은 조직의 결과물로서 생성된 활성 장력을 표시한다. 기준선(baseline)의 설정이후,미세조작기를 이용하여 10%~15% 연신이 조직에 가해진다. 조직 샘플에 의해 설정된 연신 기준선(stretch baseline)은 임의로 제로값으로 설정되고 그 값들은 힘생성에서의 변화를 나타낸다.
시험 프로토콜은 스캐폴드 주변에서 신경분포된 구성체에 붙어있는 신-신경분포(neo-innervating ) 평활근 구성체의 가능성을 판단하기 위해 설계된다. 이완은 신경 차단제인 테트로독신 (TTX) 의 존재여부조건에서 혈관성 내장 펩타이드(VIP) 효과와 전기장 모의실험을 연구하여 측정된다. 전기기계적 결합은 칼슘 채널 차단제인 니페디파인(nifedipine)의 존재하에 염화칼륨(KCl)을 사용하여 테스트된다. 콜린성 긴장은 TTX의 존재여부조건에서 아세틸콜린을 사용하여 연구될 수 있다. 그 조직은 각각의 실험사이마다 새로운 버퍼로 세척된다
면역형광법: 18~20일에 신경분포된 것과 비-신경분포된 구성체가 스캐폴드로부터 분리되고 3.7% 포름알데히드에 밤새도록 고정하였다. 구성체는 파라핀 -내장된 상태이고 6 μm 두께의 단면을 얻었다. α- 평활근 액틴 (F3777; Sigma), 평활근 특이적 칼데스몬 (c-4562; Sigma) 및 뉴런 특이적 β-III 튜블린 (ab25770, Abcam)를 위한 면역형광염색을 수행하였다. 니콘 Ti-E 형광 현미경을 사용하여 형광-공여된 이차 항체가 면역형광을 검출하는데 사용되었다.
세포 침윤: 구성체를 분리한 후, 스캐폴드는 3.7%의 포름 알데히드에서 고정되었으며 조직학적 분석을 위해 파라핀에 내장되었다. 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(eosin )(H & E)염색이 구성체로부터 스캐폴드로의 평활근 세포 침윤여부를 결정하는 데 사용되었다.
데이터 분석: 그래프패드 프리즘 5.01 (그래프패드 소프트웨어, 샌 디에고 CA)는 수집된 데이터를 분석하는데 사용하였다. 모든 값은 수단 및 3-6 실험의 SEM으로 표현되었다. 이차 Savitzky- Golay 평활화가 원시 데이터에 적용하였다. P-값이 0.05보다 작을 때 유의미하다고 정의하였다.
현미경 분석: 토끼 결장 원형 평활근 세포는 토끼 소장의 콜라겐/라미닌 젤의 신경 전구 세포와 함께 놓아 두었다. 신경 분화 배지는 구성체에 격일마다 공급되었다. 그림 1은 완전히 형성된 생체 조작 신경 분포된 대장 평활근의 구성체를 보여준다. 4일에, 신경분포된 구성체의 현미경 평가는 소장의 신경 전구 세포가 그 구성체의 주변으로 배치되었음을 보여준다. 초기 분화와 축삭 돌기 구조가 그 구성체에서 관찰되었다.
면역형광분석은 평활근 표현형을 나타내는, α-평활근 액틴과 평활근 특정 칼데스몬(Caldesmon)의 양성 염색을 보여준다.
형성후(post-forming) 4일에, 생체조작된 구성체들이 사용되었다. 신경 전구 세포를 포함하는 평활근 구성체는 동일한 합성 키토산 스캐폴드 주변에서 뉴런 전구 세포가 결여된 평활근 구성체에 부착된다. 구성체과 함께 그 스캐폴드는 뉴런 분화 배지에서 배양된다. 스캐폴드 주변에 구성체를 배치한 후 5일에, 2개 구성체사이의 접합에 대한 현미경 평가는 구성체를 연결하고 연속적인 연결망을 형성하는 신장 세포 처리과정을 보여준다.
16~18일에, 양쪽 조직 구성체는 스캐폴드로부터 분리되었고, 현미경 분석은 그 구성체가 구성체안에서 형성된 축삭돌기 신경 전구세포를 포함한다는 사실을 보여준다. 축삭돌기는 또한 초기에 모든 뉴런 구성요소가 결여된 평활근 구성체안에서 시각화되었으며 이는 새로운 뉴런 구성요소의 출현을 나타낸다.
생리적 기능: 합성 키토산 스캐폴드 주변에 그것들을 배치한후 18~20일에, 구성체는 스캐폴드로부터 분리되고 그들의 생리학적 기능은 실시간 힘재생을 사용하여 평가되었다.
평활근의 전기 기계 결합 무결성을 테스트하기 위해, 구성체는 60 mM의 KCl을 처리 하였다. 급발성 수축이 본질적으로 신경 분포 된 것(그림 2)과 비-신경분포된 구성체(그림 3) 모두에서 생성되었다. 300±24μN의 평균 수축이 신경 분포된 구성체에서 관찰되었으며 비-신경 분포된 구성체에서 224±42μN의 평균 수축이 관찰되었다. 칼슘 채널 차단제인 니페디핀의 존재하에서, KCl의 동일한 농도는 이러한 구성체에서의 칼슘 채널의 존재와 유지를 나타내는, 양쪽 구성체 에서의 수축(녹색 트레이싱)을 유발하지 않았다. KCl에 대한 응답은 평활근 구성요소의 무결성의 유지를 나타낸다.
콜린성 수축은 아세틸콜린 (Ach)를 사용하여 연구되었다. 처음에 양 구성체의 1μM 아세틸콜린 처리는 본질적으로 신경분포된 구성체(그림 4. 검은 선)과 초기에 비-신경분포된 구성체(그림 5, 검은 선)의 즉각적인 수축을 유도한다. 평균 수축은 신경분포된 조직의 경우 150±24μN, 비-신경분포된 조직의 경우 130±28μN 이다. 본질적으로 신경분포된 구성체에서의 피크 최대 수축은 뉴런 차단제 TTX(그림 4, 회색선)의 존재하에서 50-60% 감소되었다. 마찬가지로, TTX는 초기에 비-신경분포된 구성체(도면 5. 회색선)안에서 최대 수축을 감소시켰다. 구성체는 또한 나머지 기초력(basal force)으로 되돌릴 수 있었다. 양쪽 구성체에서, 흥분성 신경전달물질 아세틸콜린에 의해 유발된 수축반응은 뉴런뿐만 아니라 근육조직 특징을 표시할 수 있었다.
구성체들의 이완은 VIP 처리에 의해 연구되었다. 1μM VIP의 첨가는 신경분포된 구성체 (그림6, 검은 선)의 최대 이완 평균값 145±15μN 과 비-신경분포된 구성체(그림 7, 검은 선)의 최대 이완 평균값 120±18μN 함께 기준선의 급격한 감소를 유발한다. TTX의 존재 하에, 동일한 VIP 농도는 본질적으로 신경분포된 구성체(그림 6. 회색선)의 감소된 이완을 유발한다. TTX는 또한 초기에 비-신경분포된 구성체(그림7. 회색선)에서 VIP에 대한 반응으로 이완을 저해한다(50%). VIP와 TTX에 대한 두 구성체의 생리학은 근육과 뉴런 구성요소의 존재를 나타낸다.
생체조작되고 본질적으로 신경분포된 평활근 구조의 8 Hz, 시간당 0.9ms 전기자극 (Electric stimulation) (EFS)은 기초력(basal force)의 빠른 이완 이후 기준선으로 빠른 회복 복구를 유발한다.(그림8. 검은 선) 본질적으로 신경분포된 구성체에서 291±13μN 의 평균 이완이 측정되었다. 구성체의 TTX 사전 배양은 이완이 완전히 분화된 진성 뉴런(그림 8, 회색 선)의 자극으로부터 유래되었다라는 것을 의미하면서 EFS에 대한 반응을 완전히 소멸시킨다.
비-신경분포된 구성체에 초기에 적용된 동일한 EFS 파라미터는 평균 125±15μN 의 이완(그림 9, 검은 선)을 유발한다. 이완은 TTX(도면9, 회색 선)의 존재하에서 완전히 차단된다. 이는 이완이 구성체에서 뉴런적으로 매개되었음을 표시한다.
신경분포된 것과 비-신경분포된 생체조작 평활근 구성체는 스캐폴드로부터 분리되어 3.7% 포름알데히드에 고정된다. 조직 샘플은 탈수되고 파라핀에 내장된다. 본질적으로 신경분포된 구성체의 단면은 조직의 신경분포를 확증하면서, 뉴런 특이적 마커 β-III 튜블린에 대해 양성으로 염색된다. 초기에 비-신경분포된 구성체의 신-신경분포는 β-III 튜블린의 양성 염색으로 설명된다. 면역형광은 양 구성체에서 완전히 분화된 뉴런의 존재를 입증한다.
조직학적 분석은 스캐폴드의 기공을 통해 구성체으로부터 평활근 세포의 침윤여부에 대한 통찰력을 제공한다. H&E 염색은 구성체를 분리한 후 스캐폴드상에서 단독으로 수행되었다. 염색들은 그 구성체가 스캐폴드상으로 세포를 유실함이 없이 무결성을 유지하고 있음을 제시하며, 스캐폴드안에 세포적 내용물이 존재하지 않음을 보여준다.
다른 실시 예와 용도는 여기에 개시된 방법들 및 구성체의 상세한 설명 및 실시의 고려 사항으로부터 당업자에게 명백 할 것이다. 어떠한 이유로든 여기에서 지적된 모든 미국 특허 및 기타 참고 문헌은 특별히 참고 문헌으로 포함된다. 상세한 설명및 실시예는 다음 청구항에 의해 표시되는 본 발명의 진정한 범위 및 사상에 대한 예시로 간주되어야한다.

Claims (20)

  1. 복합 신경분포된 평활근 세포 구조체(composite innervated smooth muscle cell structure)의 제조 방법으로서,
    평활근 세포(smooth muscle cells)를 수득하는 단계;
    뉴런 전구 세포(neuronal progenitor cells)를 수득하는 단계;
    피브린 또는 콜라겐을 포함하는 제1 매트릭스 물질에 뉴런 전구 세포를 현탁시키는 단계;
    피브린 또는 콜라겐을 포함하는 제2 매트릭스 물질에 평활근 세포를 현탁시키는 단계;
    세포가 심어진 상기 제1 및 제2 매트릭스 물질을 서로 접촉시켜 중앙 기둥을 갖는 배양 플레이트 상에 침착(deposition)시켜 평활근 세포 및 뉴런 전구 세포의 구성체를 심는 단계;
    상기 심어진 세포를 배양하여 방향성있게 배향된 평활근 세포의 신경분포된 평활근 세포 구성체(innervated smooth muscle cell construct)를 형성하는 단계;
    중앙 기둥을 갖는 배양 플레이트로부터 신경분포된 평활근 세포 구성체를 제거하고, 튜브모양의 스캐폴드 주변에 상기 신경분포된 평활근 세포 구성체를 배치하는 단계;
    상기 신경분포된 평활근 세포 구성체를 비-신경분포된 근육 세포 구성체와 연결하여 상기 튜브모양의 스캐폴드 주변에 신장된 복합 구조체를 형성하는 단계; 및
    상기 비-신경분포된 근육 세포 구성체에 상기 신경분포된 평활근 세포 구성체로부터의 신경세포를 침윤(infiltrate)시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 평활근 세포 및 뉴런 전구 세포의 구성체를 심는 단계는 콜라겐 용액 또는 콜라겐 및 라미닌 용액 중 적어도 1개의 생체적합성 용액에서 신경구(neurospheres)로서 뉴런 전구 세포를 심는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 뉴런 전구 세포 용액을 젤이 되게 한 후 평활근 세포의 제2 현탁액을 침착(deposition)시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 평활근 세포의 제2 현탁액은 콜라겐 용액을 더 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 뉴로베이살(Neurobasal) A 배지 또는 B-27 보충제 중 적어도 1개에 노출시켜 상기 뉴런 전구 세포의 분화를 유도하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 튜브모양의 스캐폴드는 키토산을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 두개 이상의 신경분포된 평활근 세포 구성체를 서로 연결하여 신장된 복합 구조체를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 복합 신경분포된 평활근 세포 구조체는 튜브모양이며,
    상기 방법은 상기 복합 신경분포된 평활근 세포 구조체를 자극하여 상기 튜브모양의 구조체를 따라서 진행하는 수축 파동을 생성하는 단계를 더 포함하는 방법.
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