KR101885135B1 - 퇴행성뇌질환의 생지표인 세포내 응집체 기반 나노신경독성 생지표 조성물 - Google Patents

퇴행성뇌질환의 생지표인 세포내 응집체 기반 나노신경독성 생지표 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, MNPs@SiO2(RITC)와 같은 나노입자는 세포내 폴리아민 대사체, 예를들어 푸트레신은 증가시키고 스페르미딘과 스페르민은 감소시키며, 또한 폴리아민의 대사와 관련된 유전자인 ODC1, SAT1, PAOX 및 SRM1의 발현을 증가시켜 봉입체 형성을 증가시키고 신경 부전을 야기할 수 있는 바, 나노입자에 의한 세포내 응집체 형성을 통한 나노신경독성을 판단하는 지표로서 폴리아민 대사체 및 폴리아민 대사와 관련된 유전자를 이용하여 나노 신경독성 생지표를 제공할 수 있다.

Description

퇴행성뇌질환의 생지표인 세포내 응집체 기반 나노신경독성 생지표 조성물{Biomarker Composition for Diagnosing Nanoparticles Neurotoxicity by Increasing Cytoplasmic Inclusion Bodies in vitro}
본 발명은 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 나노입자 신경독성 여부 진단용 마이크로어레이 칩, 이를 이용한 나노입자의 신경독성 평가방법에 관한 것이다.
나노 기술의 발달은 나노 물질의 산업적 이용뿐만 아니라, 의료와 연구를 목적으로 하는 분야에 이르기까지 이용성이 다양해 지고 있다. 이에 따라, 나노 물질을 생산하는 노동자뿐만 아니라 일반인들도 나노 물질에 대한 빈번한 노출과 접촉이 증가하고 있다.
하지만, 나노기술은 산업분야 전반에 걸쳐 새로운 기술혁명이라 인식될 정도로 많은 이로움과 유익함을 제공하는 것이기는 하나, 그 반면에 잠재적 위험성을 지니고 있는 것 또한 주지의 사실인 바, 이러한 잠재적 위험성은 바로 나노기술의 특성에 기인한다고 볼 수 있다.
즉, 작은 입자일수록 비표면적비는 넓어지고, 이와 같이 비표면적비가 넓어진 작은 입자는 생체조직과 반응시 독성이 증가하게 되는데, 그 일 예로서 이산화티타늄, 탄소분말, 디젤입자 등과 같은 몇 가지 나노입자는 크기가 줄어들수록 염증을 유발하는 등 독성이 강해진다는 것이 그동안의 학문적 실험을 통해 이미 밝혀진 사실이다. 또한, 초미세 나노입자는 기도나 점막에 걸러지지 않고 폐포 깊숙이 박히거나 뇌로 이동할 수도 있고, 더욱이 최근 여러 연구에 의하면 나노입자가 체내에 축적될 경우 질병이나 중추신경 장애를 일으킨다는 이론들이 보고되고 있다.
그러나 아직 나노입자에 의한 나노신경독성에 대해서는 연구가 초보적인 단계이자만 사회적으로 나노신경독성에 대한 잠재적 독성에 대한 위험성 증가되고 있다고 예측되고 있다. 나노입자는 작은 입자일수록 비표면적비는 넓어지고, 이와 같이 비표면적비가 넓어진 작은 입자는 생체조직과 반응시 독성이 증가하게 되는데, 아직 신경세포에서는 그 유해성이 잘 규명되지 않고 있다.
현재 국제적으로 나노독성 평가 지표를 구축하려는 노력들이 있으나, 아직 종래의 화학적 독성법에 머물고 있지만 앞으로 나노신경독성 생지표 개발이 활발할 것으로 예상된다.
한국 등록특허공보 제10-0798149호
본 발명의 목적은 나노물질 신경독성에 있어 대사체 전사체를 접목한 통합오믹스적 분석 방법을 세포내 응집체 형성 세포주에 적용하여 실리카 코팅 자성나노입자에 의한 나노신경독성 생지표를 제공하는 데에 있다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 폴리아민 대사체를 포함하는 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리아민 대사체를 검출하는 제제를 포함하는 나노입자 신경독성 여부 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 푸트레신, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민 및 스페르민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리아민 대사체의 유전자의 핵산서열의 전부; 또는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 나노입자 신경독성 여부 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플 내에서 푸트레신, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민 및 스페르민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리아민 대사체를 분석하는 단계; 및 상기 폴리아민 대사체의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 신경독성 평가방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는, 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 나노입자 신경독성 여부 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 핵산서열의 전부; 또는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 나노입자 신경독성 여부 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플 내에서 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 분석하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 신경독성 평가방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, MNPs@SiO2(RITC)와 같은 나노입자는 세포내 폴리아민 대사체, 예를들어 푸트레신은 증가시키고 스페르미딘과 스페르민은 감소시키며, 또한 폴리아민의 대사와 관련된 유전자인 ODC1, SAT1, PAOX 및 SRM1의 발현을 증가시켜 봉입체 형성을 증가시키고 신경 부전을 야기할 수 있는 바, 나노입자에 의한 세포내 응집체 형성을 통한 나노신경독성을 판단하는 지표로서 폴리아민 대사체 및 폴리아민 대사와 관련된 유전자를 이용하여 나노신경독성 생지표를 제공할 수 있다.
도 1은 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 신경세포주 SH-SY5Y 세포에서 GC/MS로 폴리아민을 정량 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 신경세포주 SH-SY5Y 세포에서 폴리아민 대사체 관련 유전자 발현 분석 결과로서, a는 RT-PCR, b는 real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 발명자들은 나노입자의 노출에 의한 신경독성을 평가하기 위해 연구하던 중, 일정 농도 이상의 나노입자 처리시 신경세포 내에서 폴리아민 대사체 및 관련 유전자 발현이 변화함을 확인하고, 이를 나노입자의 신경독성 평가 지표로 사용할 수 있음을 확인한 후 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 폴리아민 대사체를 포함하는 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리아민 대사체를 검출하는 제제를 포함하는 나노입자 신경독성 여부 진단용 조성물을 제공한다.
상기 폴리아민 대사체는 푸트레신, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민 및 스페르민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 푸트레신, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민 및 스페르민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리아민 대사체의 유전자의 핵산서열의 전부; 또는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 나노입자 신경독성 여부 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플 내에서 푸트레신, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민 및 스페르민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리아민 대사체를 분석하는 단계; 및 상기 폴리아민 대사체의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 신경독성 평가방법을 제공한다.
상기 분석은 GC/MS 분석 등의 방법으로 정량적으로 폴리아민 대사체를 분석하는 것이며, 푸트레신의 발현이 증가하고, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민 및 스페르민의 발현이 감소할 경우 나노입자가 신경세포내 봉입체 형성을 증가시켜 신경독성을 유발한 것으로 판단할 수 있다. 특히, 이러한 대사체의 증가는 나노입자를 처리하지 않은 대조군의 통상 발현량의 2배 이상인 상태를 의미하며, 대사체의 감소는 나노입자를 처리하지 않은 대조군의 통상 발현량의 1/2배 이하인 상태를 의미할 수 있다.
또한, 본 발명은 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는, 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 나노입자 신경독성 여부 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 핵산서열의 전부; 또는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드; 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 나노입자 신경독성 여부 진단용 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플 내에서 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 분석하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 신경독성 평가방법을 제공한다.
상기 분석은 RT-PCR 또는 real-time PCR 등의 방법으로 유전자의 발현 양을 분석하는 것이며, ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)의 발현이 증가할 경우 나노입자가 신경세포내 봉입체 형성을 증가시켜 신경독성을 유발한 것으로 판단할 수 있다. 특히, 이러한 유전자 발현 증가는 나노입자를 처리하지 않은 대조군의 통상 발현량의 2배 이상인 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 나노입자는 생체조직과 반응시 신경독성이 증가하는 나노입자는 모두 해당될 수 있으며, 보다 구체적으로 대기중의 나노입자, 화장료 조성물로 포함된 나노입자, 의약 조성물에 포함된 나노입자, 반도체 나노입자 등이 이에 해당할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 나노입자는 코어-쉘 형태일 수 있으며, 쉘은 실리카를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 단백질이나 유전자 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글라스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 마이크로어레이 칩을 포함하는 나노입자 신경독성 여부 진단용 키트를 제공한다.
또한, 상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 바이오마커 유전자에 상보적이고, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 나노입자 신경독성 여부 진단용 키트를 제공한다.
상기 프라이머 쌍은 바이오마커 유전자의 증폭 산물이 100 내지 300 bp가 되도록 설계된 15 내지 50머 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다. 또한 아울러, 상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 RT-PCR 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 1) 실험군으로서 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계; 3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 본 발명에 따른 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 4) 단계 3)에서 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및 5) 단계 4)에서 분석한 데이터에서 실험군의 마커 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 거쳐 나노입자의 신경독성을 평가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 1) 실험군으로서 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플에서 RNA를 분리하는 단계; 2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 대상으로, 본 발명의 바이오마커 유전자에 상보적이고 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 3) 단계 2)의 유전자 산물의 양을 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 거쳐 나노입자의 신경독성을 평가할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 세포 배양 및 MNPs@SiO 2 (RITC) 처리
1. 세포 배양
인간 신경세포 SH-SY5Y 세포는 ATCC로부터 구매하였고, 10% 우태혈청(FBS, Gibco, USA), 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco, USA)을 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s 배지(DMEM, Gibco, USA)에서 배양하였다. 세포는 37℃에서 5% 습도, CO2 대기조건 하에서 배양되었다.
2. MNPs@SiO 2 (RITC) 입자 준비 및 세포 처리
MNPs@SiO2(RITC) 입자는 종래 알려진 방법(Angew Chem Int Ed Engl 44, 1068-1071, 2005)에 따라 CoFe2O3를 코어로 하고 실리카를 쉘로 하고, 로다민 이소티오시아네이트 염료와 화학적으로 결합시켜 준비하였다.
SH-SY5Y 세포에 0.1 및 1.0 ㎍/㎕의 MNPs@SiO2(RITC)를 각각 12시간 동안 처리하여 배양하였다.
<실시예 2> 가스 크로마토그래피-질량 분석(GC/MS 분석)
MNPs@SiO2(RITC)로 처리된 세포에서의 폴리아민 분석을 위해 GC/MS 분석을 수행하였다. 즉, GC-MS 분석은 Agilent 6890 가스 그로마토그래프와 인터페이스로 Agilent 5973 mass-selective detector (70 eV, electron impact mode)를 사용하고, Ultra-2 (5% phenyl-95% methylpolysiloxane bonded phase; 25 m x 0.20 mm i.d., 0.11 μm 필름두께) 교차결합된 모세관 컬럼(Agilent Technologies, USA)을 사용하여 수행하였다. 주입기, 인터페이스 및 이온 원료는 각각 260, 300, 및 230 ℃였다. 지속적인 이동속도 0.5 mL/min 의 헬륨이 이동가스로 사용되었고, 샘플은 나눔-주입모드(10:1)로 주입하였다.
폴리아민(putrescine, spermidine, spermine, N 1 -acetylputrescine, N 1 -acetylcadaverine, N 1 -acetylspermidine, N 8 -acetylspermidine, N 1 -acetylspermine, and cadaverine) 분석을 위한 온도는 초기 2분간 140℃로 설정되었고, 240℃로 5℃/분 속도로 승온된 후 30℃/분 속도 300℃로 승온시켜 3분간 유지하였다. 질량 범위는 50-600u 이며 스캔속도는 0.99 scans/s 로 설정하였다.
도 1과 같이, 나노입자를 고농도 (1.0 ㎍/㎕)로 처리했을 때 푸트레신이 약 300% 증가하였고, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민, 스페르민이 30% 정도 감소하였다.
<실시예 3> 폴리아민 대사체 관련 유전자 발현 분석
1. 총 RNA 샘플 준비
MNPs@SiO2(RITC)가 처리되거나 처리되지 않은 세포의 RNA는 RNAzol B (Tel-Test, Inc., USA)을 사용하여 분리되었고, RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제되었다. 보다 구체적으로, 2x106 세포를 500 ㎕의 RNAzol B 용액으로 처리하여 수득하고, 이후 70 ㎕의 클로로포름을 가한 후 4 ℃에서 5분간 배양하였다. 세포를 600㎕의 이소프로필알콜로 처리하여 RNA를 침전시키고, RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척한 후 공기 건조하고 RNA는 RNase-free water (WelGene, Korea)를 사용하여 펠렛으로부터 용출되었다. RNA의 순도는 분광 광도계 (Eppendorf, USA)로 정량화되었다. PCR 실험에 사용된 RNA의 순도는 광학밀도(OD) 260/230 및 260/280에 기초할 때 1.8-2.0 이었다.
2. 유전자 발현 분석
유전자 발현을 정량화하기 위해, 총 RNA 샘플은 RealMOD™ SYBR Green Real-time PCR kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 사용하여 역전사되었고 각 단편에 맞는 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 반응은 5℃ 에서 2분간, 95℃에서 30초간 수행된 후 95℃에서 5초 및 53℃에서 30초 반응을 40회 반복 수행하였다. PCR 산물은 MJ Opticon Monitor Version 3.1 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 녹는 곡선을 형성함으로써 분석되었다.
유전자 명명 Symbol NCBI
Ref Seq 		Direction Primer sequence (5’-3’)
Homo sapiens ornithine decarboxylase 1 ODC1 NM_002539 Forward GAG CCC GGC AGA TAC TAT GT (서열 1)
Reverse GCT TTA CAT GTG CGT GGT CA (서열 2)
Homo sapiens spermidine synthase 1 SRM1 NM_003132 Forward CGA AAG GTG CTG ATC ATC GG (서열 3)
Reverse CAA AAC CGT CAC CCA CAT GT (서열 4)
Homo sapiens spermidine/spermine acetyltransferase 1 SAT1 NM_002970 Forward ACC TAT GAC CCG TGG ATT GG (서열 5)
Reverse TGC TAC CAA GAA GTG CAT GC (서열 6)
Homo sapiens polyamine oxidase PAOX NM_152911 Forward CAA GAA GGA GAT TGG CCA GC (서열 7)
Reverse CAG CAC GGT ATA CTC CCC AA (서열 8)
Homo sapiens glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GAPDH NM_002046 Forward GAA GAC TGT GGA TGG CCC (서열 9)
Reverse CCA TGC CAG TGA GCT TCC (서열 10)
표 1 및 도 2를 참조하면, ODC1, SAT1, PAOX 및 SRM1 유전자의 발현이 증가한 것으로 관찰되었으며, SRM1 유전자의 발현이 상대적으로 다른 유전자보다 발현 정도가 높지 않았다.
고농도(1.0 μg/μL)의 나노입자를 처리하게 되면 폴리아민 대사체 및 이와 관련된 유전자의 발현 변화가 유도될 수 있어서 고농도의 나노입자는 유전적, 대사체적 측면에서 생체에 영향을 줄 수 있다. 현재 나노입자의 안전성을 평가할 수 있는 명확한 방법론적 지침이나 생물학적 지표가 규격화되어 있지 않은 상황에서 본 발명을 통해 이를 명확하게 평가할 수 있는 방법이 제시된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarker Composition for Diagnosing Nanoparticles Neurotoxicity by Increasing Cytoplasmic Inclusion Bodies in vitro <130> ADP-2016-0285 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ODC1 <400> 1 gagcccggca gatactatgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ODC1 <400> 2 gctttacatg tgcgtggtca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SRM1 <400> 3 cgaaaggtgc tgatcatcgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SRM1 <400> 4 caaaaccgtc acccacatgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SAT1 <400> 5 acctatgacc cgtggattgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SAT1 <400> 6 tgctaccaag aagtgcatgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PAOX <400> 7 caagaaggag attggccagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PAOX <400> 8 cagcacggta tactccccaa 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 9 gaagactgtg gatggccc 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 10 ccatgccagt gagcttcc 18

Claims (14)

  1. 폴리아민 대사체인 푸트레신, N1 -아세틸스페르미딘, N8 -아세틸스페르미딘, N1 -아세틸스페르민 및 스페르민을 포함하는 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 나노입자에 노출된 포유동물로부터 분리된 조직 또는 세포 샘플 내에서 푸트레신, N1 -아세틸스페르미딘, N8 -아세틸스페르미딘, N1 -아세틸스페르민 및 스페르민을 분석하는 단계; 및
    상기 푸트레신, N1 -아세틸스페르미딘, N8 -아세틸스페르미딘, N1 -아세틸스페르민 및 스페르민의 발현 정도를 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 신경독성 평가방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 분석은 푸트레신의 발현이 증가하고, N 1 -아세틸스페르미딘, N 8 -아세틸스페르미딘, N 1 -아세틸스페르민 및 스페르민의 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 나노입자의 신경독성 평가방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 ODC1(유전자 등록번호: NM_002539), SAT1(유전자 등록번호: NM_002970), PAOX(유전자 등록번호: NM_152911) 및 SRM1(유전자 등록번호: NM_003132)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 더 포함하는, 나노입자의 신경독성 여부 진단용 바이오마커 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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