KR101874683B1 - 클러스터린을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물 - Google Patents

클러스터린을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 클러스터린이 과발현된 멜라닌 세포에서 티로시나아제 발현 및 활성 저해능이 우수한 것으로 확인됨에 따라, 본 발명의 클러스터린 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부미백용 화장료조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 색소 침착에 의해 발병되는 질환 치료를 위한 약학조성물 및 건강식품으로도 사용될 수 있다. 또한, 클러스터린을 피부미백용 바이오마커 조성물로 제공하여 후보물질의 클러스터린 발현량 변화를 확인함으로써 피부미백용 조성물을 스크리닝하는데 사용할 수 있다.

Description

클러스터린을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물{Composition for skin whitening comprising clusterin}
본 발명은 클러스터린을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 바이오마커 및 이의 의학적 용도에 관한 기술이다.
사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈의 양에 따라 결정되며, 그 중 멜라닌이 가장 결정적인 요소로 작용한다. 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서 자외선 차단 역할을 하여, 멜라닌 색소가 부족한 사람은 햇빛에 매우 민감하여 화상을 입기 쉬우며 어린 나이에도 피부암의 발생 확률이 높다. 반면, 단파장의 자외선 및 발암물질은 피부에서 유해한 자유 라디칼을 형성하는데 멜라닌은 이러한 자유 라디칼 등을 제거하여 단백질과 유전자들을 보호해 주는 유용한 역할을 한다. 따라서 멜라닌의 양이 많다는 것은 물리적 또는 화학적 독성 물질로부터 피부를 보호할 수 있는 효과적인 대응 체계를 가지고 있다는 것을 의미한다.
멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나아제의 작용에 의해 티로신으로부터 복잡한 과정을 거쳐 생성된다. 이때 생성된 멜라닌은 피부 세포에 전달되고 표피 박리와 함께 멜라닌이 상실되어 소멸되는 순환 작용을 보인다. 이러한 멜라닌 생성 과정은 자연적으로 일어나는 현상으로서, 정상 상태의 피부에서는 멜라닌의 과다 생성이 일어나지 않는다. 그러나 피부가 외부의 자극, 예를 들면 자외선, 환경오염 또는 스트레스 등에 반응하면 멜라닌이 과다 생성되어 피부 밖으로 배출되지 못하고 각질형성세포(keratinocyte)로 전달되어 피부 표피층에 축적되어 기미, 주근깨 및 노인성 흑자 등 심각한 미용상의 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 피부노화를 촉진하며 피부암을 유발하기도 한다.
미백제의 개발에 있어서, 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색하는 방법과 멜라닌 색소를 형성하는 효소인 티로시나아제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있다. 그러나 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민류 등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색효과가 아주 작은 것으로 알려져 있다. 따라서 티로시나아제의 활성을 저해시킴으로써 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 저해제가 주목받고 있다.
종래의 화장품 분야에서는 미백 성분으로서, 예를 들면, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나아제 효소 활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민 C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 사용되어 왔다. 그러나 처방계 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 또한, 코지산은 티로시나제의 활성 부위에 존재하는 구리 이온을 흡착시켜 효소활성을 저해하지만, 화장품에 배합시 불안정성, 피부 부작용의 문제 및 최근 동물실험 결과 간암을 유발한다고 밝혀져 화장품 원료로 사용이 중지되었다. 비타민 C 및 그 유도체는 산화가 잘되는 불안정성 때문에 화장품 원료로서 사용이 어려우며, 하이드로퀴논은 피부에 대한 미백효과는 탁월하지만 알레르기를 유발하는 성질, 멜라닌 생성 세포에 대한 독성, 피부의 영구 탈색화 등 피부에 대한 자극성이 높으며, 최근 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되어 각 나라별로 제한적인 농도만 허가하고 있다. 또한, 알부틴은 하이드로퀴논에 글루코피라노사이드(Glucopyranoside)가 결합된 유도체로 하이드로퀴논 사용 시 나타나는 부작용이 적으면서 인체에 대한 독성은 없이 멜라닌 색소의 합성을 억제하는 작용이 있어, 멜라닌 색소 침착이 증가되는 피부 질환의 치료제로서의 이용 가능성이 제시되었으나, 피부 효소에 의해 일부 분해되는 단점이 있다. 따라서, 소량으로도 효능이 우수하고 부작용이 적은 안전한 대체 미백제의 개발이 시급한 실정이다.
한국공개특허 제2010-0005120호(2010.01.13 공개)
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 클러스터린을 피부미백용 바이오마커로 제공하고, 이를 이용한 피부미백용 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다. 또한, 우수한 미백효능과 부작용이 적은 클러스터린을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 클러스터린(Clusterin)을 포함하는 피부미백용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 피부미백용 후보물질을 피부세포에 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 피부세포의 클러스터린 발현량을 후보물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 클러스터린 발현량을 유의하게 변화시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부미백용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료조성물을 제공한다.
본 발명은 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, 클러스터린이 과발현된 멜라닌 세포에서 티로시나아제 발현 및 활성 저해능이 우수한 것으로 확인됨에 따라, 본 발명의 클러스터린 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부미백용 화장료조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 색소 침착에 의해 발병되는 질환 치료를 위한 약학조성물 및 건강식품으로도 사용될 수 있다. 또한, 클러스터린을 피부미백용 바이오마커 조성물로 제공하여 후보물질의 클러스터린 발현량 변화를 확인함으로써 피부미백용 조성물을 스크리닝하는데 사용할 수 있다.
도 1은 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스에 감염된 피부 구성세포에서 클러스터린 발현량을 확인한 결과로, 도 1A는 실시간 PCR 분석결과이며, 도 1B는 역전사 PCR 분석결과이다.
도 2는 UVA 20 J/cm2 및 UVB 50 mJ/cm2가 조사된 사람 피부모세 혈관내피 세포(HDMEC)에 클러스터린 발현량을 확인한 결과로, 도 2A는 UVB 50 mJ/cm2가 조사된 HDMEC에서 클러스터린 유전자 발현량을 확인한 RNA 서열 분석 결과이며, 도 2B는 UVA 20 J/cm2가 조사된 HDMEC에서 클러스터린 mRNA 발현량을 확인한 실시간 PCR 분석결과이다.
도 3은 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스(렌티바이러스)를 감염시킨 멜라닌 세포에서 클러스터린 과발현에 따른 멜라닌 색소 생성 변화를 확인한 결과로, 도 3A는 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스에 감염된 멜라닌 세포의 클러스터린 발현량, MITF 및 티로시나아제 mRNA 발현 정도를 확인한 실시간 PCR 분석 결과이며, 도 3B는 클러스터린에 따른 세포독성을 확인한 결과이며, 도 3C는 클러스터린 과발현된 멜라닌 세포에서 멜라닌 색소 생성량을 확인한 결과이며, 도 3D는 클러스터린 과발현된 멜라닌 세포에서 티로시나아제 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스(렌티바이러스)를 감염시킨 섬유아세포에서 클러스터린 과발현에 따른 멜라닌 색소 생성 정도를 확인한 결과로, 도 4A는 클러스터린이 과발현된 섬유아세포에서 클러스 MITF 및 티로시나아제 mRNA 발현정도를 확인한 실시간 PCR 분석 결과이며, 도 3B는 클러스터린에 따른 세포독성을 확인한 결과이며, 도 3C는 클러스터린 과발현된 멜라닌 세포에서 멜라닌 색소 생성량을 확인한 결과이며, 도 3D는 클러스터린 과발현된 멜라닌 세포에서 티로시나아제 활성을 확인한 결과이다.
본 발명은 클러스터린(Clusterin)을 포함하는 피부미백용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 클러스터린은 자외선에 노출된 피부세포에서 발현이 감소될 수 있으며, 상기 피부세포는 케라틴세포, 섬유아세포, 멜라닌세포 및 피부 모세혈관 내피세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 사람 피부 모세혈관 내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HDMEC)에 UVA 20 J/cm2 또는 UVB 50 mJ/cm2를 조사하고 24시간 후 RNA를 추출하여 RNA 서열분석을 수행한 결과, 도 2와 같이 UVA 또는 UVB가 조사된 세포에서 클러스터린 발현 감소가 확인되었다.
상기 결과와 같이 자외선 노출에 의해 클러스터린 발현 감소가 확인됨에 따라, 자외선 노출에 따른 멜라닌 색소 생성 증가는 클러스터린 발현 감소에 따른 것일 수 있다.
본 발명은 피부미백용 후보물질을 피부세포에 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 피부세포의 클러스터린 발현량을 후보물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 클러스터린 발현량을 유의하게 변화시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부미백용 조성물 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
상기 피부세포는 케라틴세포, 섬유아세포, 멜라닌세포 및 피부 모세혈관 내피세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료조성물을 제공할 수 있다.
상기 화장료조성물은 유효성분인 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 클러스터린은 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성을 억제할 수 있다.
보다 상세하게 티로시나아제는 인체내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로 많은 미백성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 갖고 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 클러스터린이 과발현이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 멜라닌 세포에 클러스터린 유전자를 삽입한 벡터 바이러스와 대조군 벡터 바이러스를 감염시키고 실시간 PCR을 수행하여 클러스터린, MITF 및 티로시나아제 mRNA 발현 정도를 확인한 결과, 도 3A와 같이 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스에 감염된 멜라닌 세포에서 클러스터린 mRNA가 과발현된 것을 확인된 반면, 인체 내 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 효소인 티로시아나제의 mRNA와 티로시아나제 생성에 있어 주요 인자인 MITF mRNA의 발현이 유의하게 억제된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 과발현된 클러스터린은 티로시나아제 활성을 저해시켜 멜라닌 색소 생성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명은 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 피부 색소 침착 질환은 멜라닌 색소의 생성 증가로 피부에 국소적으로 발생하는 질환으로 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 클러스터린을 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 클러스터린의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 건강식품은 상기 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 1> 클러스터린 과발현 벡터 및 렌티바이러스 준비
클러스터린 유전자를 발현시키기 위해 pCDH-CMV-MSC-EF1-Puro 벡터(System Biosciences, USA)에 클러스터린 유전자를 삽입하여 pCDH 벡터를 구축하였다.
상기 구축된 벡터가 삽입된 바이러스를 생산하기 위해, 렌티 바이러스(lentivirus) 생산에 필요한 구조 단백질을 코딩하는 pVSV-G(System Biosciences, USA), 상기 클러스터린 유전자가 삽입된 pCDH 벡터 및 pGag-pol을 동시에 HEK-293TN 세포에 리포좀(Liposome) 방법으로 코-트랜스펙션(co-transfection)하고 6시간 후 새 배지로 교환하여 48시간 배양한 후 바이러스가 포함된 배지를 수확하였으며, 수확된 바이러스를 케라틴세포(Keratinocytes), 멜라닌세포(melanocyte) 및 섬유아세포(fibroblasts)와 혈관세포인 사람 피부 모세혈관 내피세포(HDMEC) 감염에 사용하였다.
상기 제작된 클러스터린 유전자 삽입 벡터 바이러스가 세포내에서 클러스터린 발현을 증가시킬 수 있는지 확인하기 위해, 피부를 구성하는 세포인 케라틴세포(Keratinocytes), 멜라닌세포(melanocyte) 및 섬유아세포(fibroblasts)와 혈관세포인 사람 피부 모세혈관 내피세포(HDMEC)에 대조군 벡터 바이러스와 상기 제작된 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스를 감염시키고 RT-PCR 및 실시간 PCR을 수행하여 세포내 클러스터린 mRNA 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 1과 같이 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스에 감염된 HDMEC, 섬유아세포 및 케라틴세포에서 클러스터린 mRNA가 발현된 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 2> 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR )
1. 역전사 PCR (RT- PCR )
RNeasy Mini Kit(Qiagen Inc., USA)를 이용하여 대조군 바이러스 및 클러스터린 삽입된 벡터 바이러스로 감염된 세포에서 RNA를 분리하고, 분리된 각각의 총 RNA 1㎍을 이용하여 Superscript Ⅲ 역전사 시스템(Invitrogen, USA)으로 cDNA를 제작하였다.
상기 제작된 각 세포군의 cDNA 2㎕를 주형으로 이용하여 클러스터린, 티로시나아제, MITF에 해당하는 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
상기 클러스터린 프라이머는 (정방향) 5’- ATTCATACGAGAAGGCGACG- 3’및 (역방향)5’-CAGCGACCTGGAGGGATT -3’,
티로시나아제 프라이머는 (정방향) 5’- CAC CAC TTG GGC CTC AAT TTC -3, (역방향)5-AAA GCC AAA CTT GCA GTT TCC AC-3’,
MITF 프라이머는 (정방향) 5’-AGA ACA GCA ACG CGC AAA AGA AC -3, (역방향)5-TGA TGA TCC GAT TCA CCA AAT CTG -3’이었으며,
대조군으로는 hGAPDH 유전자에 해당하는 프라이머를 사용하였다.
수행된 PCR 조건은 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초간 반응하는 사이클을 32회 반복 실시한 후 최종 신장을 위해 72℃에서 10분간 반응시켰다.
2. 실시간 PCR (Real-time PCR )
RNeasy Mini Kit(Qiagen Inc., USA)를 이용하여 각각의 벡터 바이러스에 감염된 멜라닌 세포에서 RNA를 추출하고, 추출된 총 RNA 1㎍을 이용하여 Superscript Ⅲ 역전사 시스템(Invitrogen, USA)으로 cDNA를 제작하였다.
상기 제작된 각 실험군의 cDNA 2㎕을 주형으로 사용하여 클러스터린, 티로시나아제, MITF에 해당하는 프라이머로 실시간 PCR(Real-time PCR)을 수행하였다.
사용된 클러스터린 프라이머는 (정방향) 5’- ATTCATACGAGAAGGCGACG- 3’및 (역방향)5’-CAGCGACCTGGAGGGATT -3’,
티로시나아제 프라이머는 (정방향) 5’- CAC CAC TTG GGC CTC AAT TTC -3, (역방향)5-AAA GCC AAA CTT GCA GTT TCC AC-3’,
MITF 프라이머는 (정방향) 5’-AGA ACA GCA ACG CGC AAA AGA AC -3, (역방향)5-TGA TGA TCC GAT TCA CCA AAT CTG -3’이었으며,
대조군으로는 각 세포주의 18s 유전자에 대하여 PCR을 수행하였다.
PCR 조건은 95℃에서 3분, 95℃에서 10초, 60℃에서 30초간 반응하는 사이클을 39회 반복 실시한 후 최종 신장을 위해 95℃에서 10초, 65℃ 5초, 95 ℃ 5초간 반응시켰다.
< 실험예 3> 멜라닌 함량 확인
대조군 벡터 바이러스와 클러스터린 유전자 벡터 바이러스를 감염시켜 배양한 세포를 1x105 로 수집하여 RPM 11,000에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛만 분리하였다.
상기 분리된 펠렛에 1N NaOH 100㎕를 넣고, 60℃에서 1시간 동안 배양하였으며, 배양하는 동안 30분마다 볼텍싱(voltexing)하였다. 그 후, 분광광도계를 사용하여 490 nm 흡광도에서 멜라닌 함량을 측정하였다.
< 실험예 4> 티로시나아제 활성 평가
멜라닌 합성과정의 속도결정단계를 촉매하는 티로시나아제의 DOPA 산화반응에 클러스터린이 미치는 영향을 확인하기 위해, 각각의 벡터로 감염된 세포들을 1x105 으로 배양한 후 수집하고, RPM 11,000에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하여 펠렛을 분리하였다.
상기 펠렛에 2 mM의 L-DOPA를 포함하거나 포함하지 않은 1% 트리톤 X-100을 첨가한 0.1M phosphate buffer 100㎕를 첨가하여, 37℃에서 1.5시간 동안 배양한 후, 분광광도계를 이용하여 490 nm 흡광도에서 멜라닌 함량을 측정하였다.
멜라닌 함량 측정 값은 L-DOPA를 첨가한 시료의 값에서 첨가하지 않은 시료의 값을 제한 값으로 비교하여 분석하였다.
< 실시예 1> 자외선 조사에 따른 클러스터린 발현 정도 확인
사람 피부 모세혈관 내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HDMEC)에 UVB 50 mJ/cm2를 조사하고 24시간 후 RNA를 추출하여 RNA 서열분석(reference)을 수행하였으며, 동일한 방법으로 UVA 20 J/cm2를 사람 피부 모세혈관 내피세포에 조사하여 실시간 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 2와 같이 UVB가 조사된 세포에서 클러스터린 발현 감소가 확인되었으며, UVA가 조사된 세포 역시 클러스터린 발현 감소가 확인되었다.
상기 결과로부터 자외선 노출에 의해 클러스터린 발현 감소가 확인됨에 따라, 자외선 노출에 따른 멜라닌 색소 생성 증가는 클러스터린 발현 감소에 따른 것일 수 있다.
< 실시예 2> 멜라닌 세포에서 과발현된 클러스터린 영향 확인
실제로 클러스터린이 과발현될 경우 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 멜라닌 세포에 클러스터린 유전자를 삽입한 벡터 바이러스와 대조군 벡터 바이러스를 감염시키고 실시간 PCR을 수행하여 클러스터린, MITF 및 티로시나아제 mRNA 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 3A와 같이 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스에 감염된 멜라닌 세포에서 클러스터린 mRNA가 과발현된 것을 확인하였다.
반면, 인체 내 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소인 티로시아나제의 mRNA와 티로시아나제 생성에 중요한 인자인 MITF mRNA은 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 클러스터린이 과발현된 멜라닌 세포에서 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 3C와 같이 대조군보다 클러스터린이 과발현된 멜라닌 세포의 멜라닌 함량이 유의하게 감소한 것으로 확인되었으며, 티로시나아제 활성 역시 3D와 같이 대조군보다 클러스터린 단백질이 과발현된 멜라닌 세포에서 유의한 감소를 나타내었다.
상기 결과로부터 과발현된 클러스터린은 멜라닌 형성 억제에 매우 효과적인 것으로 확인되었다.
< 실시예 3> 섬유아세포에서 과발현된 클러스터린 영향 확인
섬유아세포에서도 과발현된 클러스터린이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 섬유아세포에 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스와 대조군 벡터 바이러스를 각각 감염시키고, 각 세포군에서 클러스터린 mRNA 발현 정도를 실시간 PCR로 확인하였다.
또한, 클러스터린이 과발현된 섬유아세포의 고농축 배양액(concentrate conditioned media)을 멜라닌 세포에 처리한 후 티로시아나제 및 MITF mRNA 발현 정도를 실시간 PCR로 확인하였다.
그 결과, 도 4A와 같이 클러스터린 유전자를 삽입한 벡터 바이러스에 감염된 섬유아세포에서 클러스터린 mRNA가 과발현된 것이 확인된 반면, 인체 내 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소인 티로시아나제의 mRNA와 티로시아나제 생성에 관여하는 주요 인자인 MITF mRNA 발현이 효과적으로 억제된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 클러스터린이 과발현된 섬유아세포의 고농축 배양액이 처리된 멜라닌 세포에서 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 4C와 같이 대조군보다 클러스터린이 과발현된 섬유아세포의 고농축 배양액이 처리된 멜라닌 세포군의 멜라닌 함량이 유의하게 감소된 것으로 확인되었으며, 티로시나아제 활성 역시 4D와 같이 대조군보다 상기 고농축 배양액이 처리된 멜라닌 세포에서 유의한 감소를 나타내었다.
< 실시예 4> 사람 피부 모세혈관 내피세포( HDMEC )에서 과발현된 클러스터린 영향 확인
사람 피부 모세혈관 내피세포(HDMEC)에서 과발현된 클러스터린이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, HDMEC에 클러스터린 유전자가 삽입된 벡터 바이러스와 대조군 벡터 바이러스를 각각 감염시키고, 각 세포군에서 클러스터린 mRNA 발현 정도를 실시간 PCR로 확인하였다.
또한, 클러스터린이 과발현된 HDMEC의 고농축 배양액(concentrate conditioned media)을 멜라닌 세포에 처리한 후 티로시아나제 및 MITF mRNA 발현 정도를 실시간 PCR로 확인하였다.
그 결과, 도 5A와 같이 클러스터린 유전자를 삽입한 벡터 바이러스에 감염된 HDMEC에서 클러스터린 mRNA가 과발현된 것이 확인된 반면, 인체 내 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소인 티로시아나제의 mRNA와 티로시아나제 생성에 관여하는 주요 인자인 MITF mRNA 발현은 유의하게 억제된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 클러스터린이 과발현된 HDMEC의 고농축 배양액이 처리된 멜라닌 세포에서 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 5C와 같이 대조군보다 클러스터린이 과발현된 HDMEC의 고농축 배양액이 처리된 멜라닌 세포군의 멜라닌 함량이 유의하게 감소된 것으로 확인되었으며, 티로시나아제 활성 역시 5D와 같이 대조군보다 상기 HDMEC의 고농축 배양액이 처리된 멜라닌 세포에서 유의한 감소를 나타내었다.
상기 결과들로부터 과발현된 클러스터린은 티로시나아제 활성을 저해시켜 멜라닌 색소 생성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
한편, 본 발명에 따른 클러스터린은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기에서는 본 발명에 따른 클러스터린을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 제제예 1> 화장료 조성물의 제제예
<제제예 1-1> 영양 로션의 제조
프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 클러스터린을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
<제제예 1-2> 영양 크림의 제조
카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부
및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노 스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 클러스터린을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
< 제제예 2> 약학조성물의 처방예
<제제예 2-1> 주사제의 제조
클러스터린 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
<제제예 2-2> 정제의 제조
클러스터린 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
<제제예 2-3> 캡슐제의 제조
클러스터린 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
< 제제예 3> 건강식품의 제조
클러스터린 0.5 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 클러스터린(Clusterin)을 포함하는 피부미백용 바이오마커 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 클러스터린은 자외선에 노출된 피부세포에서 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 피부미백용 바이오마커 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 피부세포는 케라틴세포, 섬유아세포, 멜라닌세포 및 피부 모세혈관 내피세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부미백용 바이오마커 조성물.
  4. 피부미백용 후보물질을 피부세포에 처리하는 단계; 및
    상기 후보물질이 처리된 피부세포의 클러스터린 발현량을 후보물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 클러스터린 발현량을 유의하게 변화시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부미백용 조성물 스크리닝 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 피부세포는 케라틴세포, 섬유아세포, 멜라닌세포 및 피부 모세혈관 내피세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부미백용 조성물 스크리닝 방법.
  6. 클러스터린(Clusterin) 또는 이의 발현 조절제를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 클러스터린은 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성 을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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