KR101869790B1 - 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 cc112 또는 이를 함유하는 미생물 제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112)(미생물 수탁번호 : KACC 92129P) 또는 이를 함유하는 미생물 제제에 관한 것이다. 본 발명에 의해 식물병에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물인 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 또는 이를 함유하는 미생물 제제가 제공됨으로써 환경공해와 인체독성이 없는 환경 친화적인 식물병 방제가 가능하여 작물의 수량을 증대시킬 수 있다.
Description
본 발명은 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112) 또는 이를 함유하는 미생물 제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피씨움 sp.(Pythium sp.) 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프트포라 sp.(Phytophthpora sp.), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 및 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)로 이루어진 군에서 선택되는 식물병 유도균에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주 또는 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제에 관한 것이다.
오늘날 농업은 품종 개량, 토양 비옥도 증진, 병해충 방제 및 잡초 제거 등의 방법으로 식량 증산에 몰두해 왔지만 지속적인 농약의 사용과 남용은 토양과 하천의 심각한 오염을 유발하고 있다. 또한, 농작물에 이들 농약이 잔류함으로써 독성, 환경오염 및 사람과 가축에 대한 독성 등의 문제를 일으키기 때문에 농약 사용은 현재 세계적으로 그에 대한 제제 조치가 강화되고 있다. 이와 같은 농약에 대한 우려와 삶의 질에 대한 관심이 커지면서 최근에는 새로운 대안으로서 농작물 병해충 방제에 미생물이나 식물추출물을 이용하는 생물학적 방제가 관심의 대상이 되고 있다. 특히, 미생물을 이용한 생물방제로는 토양미생물로부터 생산된 항생물질 또는 독소를 이용하여 병원균이나 해충을 방제하는 미생물농약 또는 미생물 자체의 길항작용을 이용하여 병원균의 감염으로부터 식물을 보호하고 간접적으로 식물생육을 촉진하는 미생물비료 등이 있다. 이러한 생물학적 방제는 환경에 유해한 화학적 농약을 대신하여 사용이 가능하므로, 소비자에게 안전한 농산물을 제공할 수 있게 된다. 특히, 식물병의 방제는 통상적으로 유독성 화학물질(농약)의 광범위한 사용에 의존하여 왔다. 이러한 유기합성농약에 의한 방제법은 대상 식물과 그 식물의 생산물뿐만 아니라 토양에도 유독성 화학물질을 처리해야 할 때가 많으므로, 식물잔류 및 토양잔류 독성 문제를 발생시키며, 이들 중 많은 화합물은 대상생물 이외의 미생물과 동물에도 독성을 나타내며, 사람에게도 해를 기칠 수 있다고 알려져 있다. 따라서 최근 식물병의 방제 연구 중 상당 부분은 환경친화적인 식물병 방제법을 알아내는 것을 목표로 삼고 있으며, 그 중 하나가 식물병원미생물에 길항적인 생물자원을 이용한 생물농약의 개발이다.
길항 미생물이란 다른 종류의 미생물과 함께 배양될 때 그 다른 미생물의 생육을 저지시키는 미생물을 말한다. 길항 미생물은 기생, 포식, 항생작용 등을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 이러한 길항미생물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112)가 토양유래 식물병에 대한 각종 방제효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식물병에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112)(미생물 수탁번호 : KACC 92129P) 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제를 제공하는 데에 있다. 보다 자세하게는 본 발명의 목적은 피씨움 sp.(Pythium sp.) 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프트포라 sp.(Phytophthpora sp.), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 및 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)로 이루어진 군에서 선택되는 식물병 유도균에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 또는 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 식물병 방제효과를 갖는 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112) (미생물 수탁번호 : KACC 92129P) 균주에 관한 것이다.
상기 식물병은 피씨움 sp.(Pythium sp.) 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프트포라 sp.(Phytophthpora sp.), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 및 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)로 이루어진 군에서 선택되는 균으로부터 유도되는 것을 특징으로 한다.
상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표현되는 16s rRNA의 유전자를 포함한다.
본 발명은 상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.
이에 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 미생물 농약, 종자코팅제, 종자침지제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 10~1000배로 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 종자침지, 종자코팅, 엽면살포 또는 관주살포하는 단계;를 포함하는 식물 병원균을 방제하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 자세하게 설명한다.
본 발명은 식물병 방제효과를 갖는 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112) (미생물 수탁번호 : KACC 92129P) 균주에 관한 것이다. 상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 토마토 근권으로부터 분리되며, 형태적으로 막대모양을 갖는다.
상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 피씨움 sp.(Pythium sp.) 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피토프트포라 sp.(Phytophthpora sp.), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 및 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)로 이루어진 군에서 선택되는 식물병 유도균에 대하여 방제효과를 갖는다.
상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표현되는 16s rRNA의 유전자를 포함한다.
본 발명은 상기 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제를 제공한다. 상기 균주 또는 이의 배양액은 사용용도에 따라 적절하게 물 또는 균주 배양전의 배지로 희석하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 균주 배양액에 적용가능한 배지는 특별히 제한되지 않으며, LB(Luria Bertani), TSB(Tryptic Soy Broth), PDB(Potato Dextrose Broth), NYDB(Nutrient Yeast Dextrose Broth), YP(Yeast extract Peptone), KB(King's B agar), BSM( Bacillus Soytone Medium)에서 선택되는 통상의 미생물 배지 또는 이에 아가로오즈를 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 이 때 가장 바람직하게는 BSM 배지를 사용하는 것이 균주의 생육에 가장 좋다. 또한 상기 배양액은 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112를 pH 5.0~9.0 및 15~50℃에서 배양한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 미생물 제제를 포함하는 미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제에 관한 것이다.
상기 미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제는 통상의 식물 농약에 사용하는 담체 또는 부형제를 사용할 수 있다. 상기 담체 또는 부형제로서 바람직하게는 벤토나이트, 계면활성제, 탈크, 제오라이트 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 통상적으로 사용하는 식물 농약과 혼합하여 사용 가능하다.
또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 10~1000배로 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 종자침지, 종자코팅, 엽면살포 또는 관주살포하는 단계;를 포함하는 식물 병원균을 방제하는 방법을 제공한다. 상기 미생물 제제의 더 바람직한 희석 농도는 10~100배일 수 있다.
본 발명의 균주 또는 미생물 제제의 방제대상 식물은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 겨자, 곱슬겨자, 적겨자, 일당귀, 당귀, 양파, 배추, 오이, 토마토, 파, 무, 인삼, 딸기, 상추, 수박, 마늘 및 고추로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 식물병에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112)(미생물 수탁번호 : KACC 92129P) 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제에 관한 것으로서, 상기 균주를 이용한 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 식물병 방제가 가능하여 작물의 수량을 증대시킬 수 있게 된다. 바실러스 메틸로트로피쿠스와 관련된 식물병 방제제 관련 기술로서 대한민국 공개특허 제10-2016-0054082호 또는 대한민국 공개특허 제10-2013-0136625호 등이 개시되어 있으나, 본 발명의 신규 미생물과는 다른 서열정보를 갖는 16sRNA 염기서열을 포함하고 있으며 방제대상 균주 및 방제효과에 있어서도 다른 점이 확인되기에 기술구성이 다른 발명이라 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주의 형태학적 특성을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주의 계통학적 특징을 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주의 계통학적 특징을 나타내는 그림이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<
실시예
1. 신규 균주의 분리>
본 발명의 선발균주는 춘천의 토마토 뿌리에 붙은 토양을 단계희석하여 80℃에서 10분간 열처리한 후 10% TSA에 도말하여 바실러스 콜로니를 분리하여 다시 TSA 배지에 획선배양하여 단콜로니 분리하였다. 분리된 균주의 형태학적 특징은 도 1에 나타내었다.
<
실시예
2. 신규 균주의 분자생물학적 동정>
선발균주의 동정을 위해 일반적으로 사용되는 16S rRNA 유전자 분석을 하였다. 균주의 외형적 또는 형태학적 특성을 통해 Bacillus spp.의 분류에 유용한 것으로 알려진 DNA gyrase 유전자(gyrB 유전자)의 염기서열을 이용하여 선발균주의 분류학적 위치를 분석하였다. 선발균주는 trypticase soy broth(TSB, Difco)에 접종하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 원심분리하여 균체를 수확하였다. Genomic Plus DNA Prep kit(Inclone, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 16S rRNA 유전자의 증폭을 위해 범용 프라이머인 27F와 1492R을 사용하였고, gyrB 유전자의 증폭을 위해 범용 프라이머인 UP-1과 UP-2r을 사용하여 PCR한 후 각각 유전자의 증폭산물을 얻었다. 3개의 프라이머(518F; CCAGCAGCCGCGGTAATACG, 800R; TACCAGGGTATCTAATCC, 984F; ACGCGARGAACCTTAC)를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 이용하고 gyrB 유전자는 두 개의 염기서열 분석용 프라이머(UP-1S; GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA, UP-2Sr; AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC)를 이용하여 분석하도록 제노텍(대전, 한국)에 의뢰하였다. 얻어진 염기서열은 Seqman(DNASTAR, USA)을 이용하여 직접 오류를 검정하고 연결하였다. 각 유전자의 비교분석을 위해서 16S rRNA 유전자의 염기서열 및 균주간 상동성은 EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)을 통해서 얻었으며, gyrB 유전자의 염기서열은 Genbank(www.ncbi.nlm.nih/genbank)를 통하여 얻었다. 계통도의 작성을 위해 MEGA 5.0 프로그램의 Clustal W 프로그램으로 염기서열을 정렬하고 염기서열 길이를 맞추었다. 계통도를 작성하기 위해 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하였으며, 계통도의 신뢰성을 확보하기 위해 1000회 반복 bootstraping을 수행하였다.
이에 선발균주는 16S rRNA 유전자와 gyrB 유전자를 이용하여 분석한 결과, 바실러스 메틸로트로피쿠스와 일치하여 바실러스 메틸로트로피쿠스로 동정되었고, 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112)라 명명하여 국립농업과학원에 미생물 수탁번호 KACC 92129P로 2016년 6월 22에 기탁하였다.
한편, 상기 선발균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 하기의 서열번호 1의 서열을 포함한다.
서열번호 1 :
<
실시예
3. 신규 균주의 생리화학적 동정>
이렇게 확인된 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주의 생리화학적 특징을 균주 동정을 하는 통상적인 방법을 이용하여 확인한 후 하기 표 1에 나타내었다. 보다 자세하게는 길항균주의 혐기생육, oxidase, catalase, 단백질분해효소, 전분분해효소 생성능은 Smibert & Krieg(1994)의 방법에 준해 분해능을 조사하였다. 그 외의 생리생화학시험은 시판되는 API 20E and API ZYM(bioMerieu)를 이용하여 제조사의 사용지침에 따라 시험하였다.
| Characteristics | 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 |
| Sporangium bulging | - |
| Anaerobic growth | - |
| Utilization of citrate | - |
| Voges-Proskauer reaction | - |
| Nitrate reduction | + |
| H2S production | - |
| Indole production | - |
| Hydrolysis | |
| Starch | + |
| Casein | + |
| Gelatin | - |
| Eesculin | + |
| Enzyme activities | |
| Urease | - |
| Oxidase | + |
| Catalase | + |
| α-Galactosidase | - |
| Arginine dihydrolase | - |
| Lysine decarboxylase | - |
| Ornithine decarboxylase | - |
| Tryptophane deaminase | + |
| Acid production from carbon sources | |
| L-arabinose | - |
| Raffinose | - |
| Salicin | - |
| Galactose | - |
| Lactose | - |
| D xylose | - |
| Carbon sources assimilation | |
| D-glucose | + |
| L-arabinose | + |
| D-mannose | + |
| D-mannitol | + |
| N-acetyl-glucosamine | + |
| D-maltose | + |
| Gluconate | + |
| Caprate | - |
| Adipate | - |
| Malate | + |
| Citrate | + |
| Phenyl-acetate | - |
한편, 기존에 보고된 바실러스 메틸로트로피쿠스 CBMB205 균주(미생물 수탁번호 : KACC 13105)와 본 발명의 신규 균주와의 형태학성 특성을 비교하기 위해, 탄소원에 대한 동화능을 API 50CH(bioMerieu, France)를 이용하여 제조사의 사용지침에 따라 시험하여 비교하였고, 이에 대한 결과는 하기에 나타내었다.
| 항목 | 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 | 바실러스 메틸로트로피쿠스 CBMB205 |
| D-GLUcose | + | + |
| D-FRUctose | + | + |
| D-MaNnosE | + | + |
| L-SorBosE | - | - |
| RHAmnose | - | - |
| DULcitol | - | - |
| INOsitol | - | - |
| MANnitol | - | + |
| a-Methyl-D-Glucoside | - | + |
| ESCulin | + | + |
| SALicin | - | - |
| CELlobise | + | - |
| SUCrose | + | + |
| TREhalose | - | - |
| INUlin | - | - |
| MeLeZitose | - | - |
| RAFfinose | - | - |
| Starch | - | - |
| GLYcogen | - | - |
| XyLiTol | - | - |
| GENtiobiose | + | + |
| 2-Keto-Gluconate | - | + |
| 5-Keto-Gluconate | - | - |
또한 비교균주 바실러스 메틸로트로피쿠스 CBMB205 균주와 본 발명의 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112의 유전학적 차이도 하기와 같이 비교하여 나타내었다.
| Strains | Genomic features | ||||||
| Genome size (bp) |
Number of contig |
G+C contents (%) |
Total number of genes |
Number of Protein-coding genes(CDSs) |
Number of rRNA gene |
Number of tRNA genes |
|
| 바실러스 메틸로트로피쿠스 CBMB205 |
3,929,745 | 1 | 46.5 | 4,113 | 3,985 | 27 | 86 |
| 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 |
3,916,868 | 1 | 46.46 | 3,848 | 3,735 | 27 | 86 |
상기 표 2 및 표 3의 결과를 통해, 본 발명의 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주가 기존 바실러스 메틸로트로피쿠스 CBMB205 균주와는 형태학적 유전학적 특징이 명확한 차이가 있음을 알 수 있다.
<
실시예
4.
바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112 균주의
배양적
특성 조사>
실시예
4-1.
바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112 균주의 배양온도별 균 생장 조사
TSA 배지에 배양하여 자란 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주를 루프로 긁어 삼등분한 LBA 배지에 획선으로 접종하고 3반복하여 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 28℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃의 온도에서 5일간 배양한 후 온도별 균의 생육을 조사하였다.
| 온도(℃) | 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112의 온도별 생육 정도 |
| 10 | - |
| 15 | + |
| 20 | + |
| 25 | + |
| 28 | + |
| 30 | + |
| 35 | + |
| 40 | +++ |
| 45 | +++ |
| 50 | + |
-: 생육못함, + : 1~10㎜, ++ : 10.1~15㎜, +++ : 15.1~25㎜.
상기 표 4를 참고하면, 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 온도별 균 생장 조건에서 15~50℃까지 생육이 가능하며, 40~45℃가 생장하기에 가장 적절하다.
실시예
4-2.
바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112 균주의
pH별
균 생장 조사
바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주를 LB(Luria Bertani) 배지에 배양한 전배양물을, 1N HCl과 1N NaOH로 pH를 조절한 TSB 배지에 2%(v/v)가 되도록 접종하였고, 진탕배양기에서 25℃, 180rpm의 조건으로 배양하였다. 48시간 후 배양액을 희석하여 LB 배지에 도말하였고 48시간 동안 배양하여 생성되는 colony 수를 세어 총 균수를 조사하였다.
| pH | 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균수(cfu/㎖) |
| 4.0 | 4.0×107 |
| 5.0 | 1.2×108 |
| 6.0 | 1.4×109 |
| 7.0 | 2.0×107 |
| 8.0 | 2.2×107 |
| 9.0 | 2.5×106 |
상기 표 5를 참고하면, pH별 생장 조건에서 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 pH 4.0~9.0에서 모두 생육가능하나 pH 6.0에서 생장이 가장 좋다.
실시예
4-3.
바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112 균주의 배지별 균 생장 조사
바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112를 배양하기에 적합한 배지를 선별하기 위해 다양한 종류의 배지에서의 생장상태를 확인하였다. 이 때 사용한 배지 종류로는 LB(Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g /ℓ), TSB(Bacto Tryptone 15g, Bacto Soytone 5g, NaCl 5g /ℓ), PDB(glucose 20g, potato extract 4g /ℓ), NYDB(Peptone 1.2g, Yeast extract 1.2g, Dextrose 0.3g /ℓ), YP(Yeast extract 5g, Peptone 5g, NaCl 5g /ℓ), KB(Peptone 20g, K2HPO4 1.5g, MgSO4·7H2O 1.5g, Glycerol 15㎖ /ℓ), BSM(Soytone 0.5%, Sucrose 2% /ℓ)가 있다.
이를 위해 상기 각각의 배지에 실시예 4-2와 동일한 방법으로 전배양한 균주를 2%(v/v)가 되게 접종하여 진탕배양기에서 25℃, 180rpm 조건으로 배양하였고, 48시간 후 배양액을 희석하여 LB(Luria Bertani) 배지에 도말하였고 48시간 동안 배양하여 생성되는 colony 수를 세어 총 균수를 조사하였다.
| 배지 | 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주 균수(cfu/㎖) |
| LB | 4.9×108 |
| TSB | 1.9×107 |
| NYDB | 1.0×106 |
| KB | 9.0×107 |
| YP | 4.2×107 |
| BSM | 1.2×109 |
상기 표 6을 참고하면, 배지 종류별 균 생장을 조사한 결과, 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 모든 배지에서 생육가능하나 특히 BSM 배지에서 생장이 가장 좋은 것으로 확인된다.
<
실시예
5. 바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112 균주의
식물병원균에
대한 항균활성 검정>
식물병원균 Rhizoctonia solani , Phytophthpora sp. Sclerotium cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea 균주를 PDA(Potato dextrose agar) 배지에 이식 후 Rhizoctonia solani , Phytophthpora sp. 균주를 25℃에서 각각 5~7일간 배양하고, Sclerotium cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea 균주는 20℃에서 각각 5~7일간 배양한 후, 직경 5㎜인 코르크보러를 이용하여 병원균의 균총을 PDA 배지가 분주된 일회용 페트리디쉬 중앙에 치상하였다. 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 TSA 평판배지에 배양한 후 루프를 이용하여 균주를 떼어내어 PDA 배지가 분주된 일회용 페트리디쉬에 3개소에 치상하였다. 이 후 각 병원균별로 25℃와 20℃ 항온기에서 7~10일간 배양 후 저지원의 직경을 조사하였다.
| 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주의 식물병 유도 균주에 대한 균사생장억제 (㎜) | ||||
| Rhizoctonia solani | Sclerotium cepivorum |
Sclerotinia
sclerotiorum |
Phytophthora sp. |
Botrytis
cinerea |
| 17.0 | 12.2 | 13.0 | 15.1 | 5.6 |
상기 표 7을 참고하면, 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주는 Rhizoctonia solani , Phytophthpora sp. Sclerotium cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum , Botrytis cinerea에 모두 항균활성이 있는 것으로 확인된다.
<
실시예
6.
바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112 균주의
식물병
방제 효과 검정>
실시예
6-1.
바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112의 인삼 잘록병(
Rhizoctonia
solani
)에 대한 방제효과 검정
인삼재배용 상토(명품인삼, (주)신성미네랄)를 재배상자(500×300×150㎜)에 넣고, 개갑 인삼 종자를 상자당 54립씩 3반복으로 파종하였다.
이 때 파종 전 종자침지처리를 위해, 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주를 LB(Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g /ℓ), TSB(Bacto Tryptone 15g, Bacto Soytone 5g, NaCl 5g/ℓ), KB(Peptone 20g, K2HPO4 1.5g, MgSO4·7H2O 1.5g, Glycerol 15㎖ /ℓ), BSM(Soytone 0.5%, Sucrose 2% /ℓ) 배지에 28℃에서 2일간 180rpm으로 진탕배양한 각각의 배양액을 준비하였다. 이 배양액을 10배 희석하여 인삼 개각 종자를 1시간 침지한 후 파종하였다.
그리고 관주처리는 인삼 개각종자를 파종한 다음 균주 배양액을 10배로 희석하여 주당 10㎖씩 7일 간격 6회 관주처리하였다.
이 실험에서 모든 처리는 3반복으로 수행하였다. 병원균의 접종은 인삼잘록병을 일으키는 PDA 배지에 배양한 후 액체배지로 균총을 이식하여 25℃에서 15일간 배양하였고, 이를 인삼의 식물병 유도용 접종원으로 사용하였는데, 상자당 9개씩의 인삼에 접종하였고, 최종 6회 처리 7일후 이병주율을 조사하였다.
하기 표 8을 참고하면, 본 발명의 균주가 갖는 인삼의 식물병 방제효과가 매우 우수한 것으로 확인된다.
| 방제대상 - Rhizoctonia solani | |||
| 처 리 | 희석배수 (x) | 이병주율 (%) | 방제가(%) |
| LB 배양액 : 종자침지 | 10 | 10.5 | 65.8 |
| KB 배양액 : 종자침지 | 10 | 22.5 | 26.7 |
| BSM 배양액 : 종자침지 | 10 | 10.1 | 67.1 |
| LB 배양액 : 종자침지 + 토양관주 | 10 + 10 | 11.0 | 64.2 |
| KB 배양액 : 종자침지 + 토양관주 | 10 + 10 | 23.2 | 24.4 |
| BSM 배양액 : 종자침지 + 토양관주 | 10 + 10 | 14.2 | 53.7 |
| 무처리 | - | 30.7 | - |
실시예
6-2.
바실러스
메틸로트로피쿠스
CC112균주
시제품의
인삼잘록병
(
Rhizoctonia
solani
와
Pythium
sp
.) 방제 효과
바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주의 미생물 제제 시제품으로서 벤토나이트를 증량제로 사용하여 9.2×107/g로 제조한 것을 충남대로부터 받아서 실험하였다.
종자 침지처리구는 시제품을 50배와 100배로 각각 희석하여 개각종자를 1시간 침지하여 상자에 파종하였다. 또한 관주처리구는 인삼 개각종자를 상자에 파종한 다음 시제품을 50배와 100배로 각각 희석하여 주당 10㎖씩 처리하였고, 7일 간격 3회 토양에 관주처리하였다.
병원균의 접종은 병원균을 각각 배양한 후 인삼 파종 12일 후에 상자당 8개씩의 인삼에 접종하였다, 인삼종자의 발아율은 파종 20일후 조사하였으며, 인삼 잘록병 발생은 파종 40일후에 이병주율을 조사하였다.
| 방제대상 - Rhizoctonia solani | ||||
| 처 리 | 희석배수 (x) | 평균종자발아수 | 이병주율 (%) | 방제가(%) |
| 종자침지 | 50 | 49.0 | 12.2 | 30.7 |
| 100 | 46.0 | 9.3 | 47.2 | |
| 토양관주 | 50 | 49.0 | 8.4 | 52.3 |
| 100 | 52.7 | 4.0 | 77.3 | |
| 무처리 | 51.3 | 17.6 | - | |
| 방제대상 - Pythium sp. | ||||
| 처 리 | 희석배수 (x) | 평균종자발아수 | 이병주율 (%) | 방제가(%) |
| 종자처리 | 50 | 45.3 | 14.0 | 39.1 |
| 100 | 44.3 | 14.2 | 38.3 | |
| 토양관주 | 50 | 47.3 | 10.0 | 56.5 |
| 100 | 50.7 | 7.9 | 65.7 | |
| 무처리 | 45.0 | 23.0 | - | |
표 9 및 표 10을 참고하면, 인삼 잘록병균 Rhizoctonia solani와 Pythium sp.에 대하여 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주의 시제품은 종자침지와 토양관주에서 모두 방제효과가 있는 것을 알 수 있다. 또한 종자침지보다는 토양관주 처리가 효과적이며, 100배 희석액 관주처리가 50배 희석액 관주처리보다 높은 비율인 65.7~77.3%로 방제되는 것이 확인된다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> New microorganism Bacillus methylotrophicus CC112 or microbial
agent comprising the same
<130> 0254
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1494
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus methylotrophicus
<400> 1
tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg 60
acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg 120
gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac 180
cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcr 240
acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 360
gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg 420
ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 480
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg 540
ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt 600
ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 660
gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct 720
gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780
gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca 840
ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 900
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 960
tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 1020
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1140
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200
aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct 1260
cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1320
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag 1380
agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga gccagccgcc gaaggtggga 1440
cagatgattg gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtatcg gaaggtgcgg ctgg 1494
Claims (6)
- 피씨움 sp.(Pythium sp.) 또는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)로 유도되는 식물병 방제효능을 갖는 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112(Bacillus methylotrophicus CC112)(미생물 수탁번호 : KACC 92129P) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 피토프트포라 sp.(Phytophthpora sp.), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 및 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)로 이루어진 군에서 선택되는 균으로부터 유도되는 식물병 방제효능이 더 있는 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표현되는 16s rRNA의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 균주. - 제1항의 바실러스 메틸로트로피쿠스 CC112 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 피씨움 sp.(Pythium sp.) 또는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)로 유도되는 식물병 방제용 미생물 제제.
- 제4항의 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 피씨움 sp.(Pythium sp.) 또는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)로 유도되는 식물병 방제용 미생물 농약.
- 제4항의 미생물 제제를 10~1000배로 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 종자침지, 종자코팅, 엽면살포 또는 관주살포하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 피씨움 sp.(Pythium sp.) 또는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 방제하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020160149313A KR101869790B1 (ko) | 2016-11-10 | 2016-11-10 | 신규 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 cc112 또는 이를 함유하는 미생물 제제 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR20130096870A (ko) * | 2012-02-23 | 2013-09-02 | 이기성 | 항진균 활성을 가지는 신규의 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 엘케이에스26 |
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-
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