KR101847532B1 - 꿀벌의 전염병 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 꿀벌의 전염병 치료용 조성물에 관한 것으로, 식물 추출물에서 유래한 화합물을 포함하는 생체 안전성이 우수한 꿀벌의 전염병 치료용 조성물이 제공된다.

Description

꿀벌의 전염병 예방 및 치료용 조성물{A COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HONEY BEE DISEASES}
본 발명은 꿀벌의 전염병 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물 추출물 유래의 단일 화합물을 포함하여 생체 안전성이 우수할 뿐만 아니라, 꿀벌에 대한 질병을 유발하는 특정 원인균에만 특이적으로 작용하는 내성 발생 가능성이 최소화된 꿀벌의 전염병 치료용 조성물에 관한 것이다.
양봉은 전통적으로 벌꿀(honey)과 밀랍(bee wax) 생산뿐만 아니라, 왕유(royal jelly), 화분(pollen), 봉교(propolis), 봉독(bee venom)등의 생산에 이용되거나, 농작물의 화분매개(bee pollination)에 꿀벌을 이용하기까지 다양하게 활용되고 있다 (최용수 1993).
벌꿀 생산액이 전체 축산업 생산액에서 차지하는 비율(1.2%, 농림수산식품부, 2010)은 그리 크지는 않지만, 우리가 먹는 음식의 40%가 꿀벌에 의하여 수분이 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 꿀벌의 개체수를 유지하는 것은 농업 생산에 지대한 영향을 미칠 것이다.
국내 양봉 산업은 꿀벌 산물의 국내 시장이 약 4,000억 규모에 달하며, 농작물의 화분매개 등 벌의 생태계 다원적 기능은 계량화하기 어려울 정도로 크다. 국내에서 꿀벌에 의한 경제적 가치는 전체 과채류 생산액인 12.5조원 중 50%인 6조원을 담당하고 있으며, 전체 생태계 보존효과는 50조원을 초과한다.
꿀벌은 공장식으로 밀집되어 사육되는 대표적인 가축이다. 농가에 따라서 벌통이 수 백 통에서부터 수 천 통까지 이르며 우리나라의 경우 봉군 수가 세계 20위로 45명당 1개의 봉군 비를 이루고 있다. 국내에는 2011년 기준으로 약 200만 개의 봉군이 있는 것으로 알려져 있다.
밀도가 높으면 질병에 취약할 수밖에 없다. 진균과 같은 감염성 병원균의 입장에서는 감염시킬 수 있는 개체가 상당이 밀집되어 많은 개체수가 있기 때문에 최적의 생존 조건이라 할 수 있다. 따라서 봉군의 관리가 제대로 되지 않아 진균과 같은 병원성 미생물에 전염이 되면 봉군을 잃어버리는 심각한 문제를 일으킬 수 있다.
현재까지 국내의 꿀벌 관련 연구는 농약피해의 실태조사(최와 이, 1986), 양봉경영 및 봉군관리(오, 1988), 양봉농가의 경영분석(김과 박, 1990), 응애피해(우 등, 1994), 양봉관리 실태(강 등, 1995), 양봉산물 생산실태(이 등, 2002), 양봉농가의 경영실태(김, 2009), 꿀벌 질병 진단 기술 개발(윤병수, 2013)등의 연구가 이루어져 왔으며 농림축산검역본부에 꿀벌질병관리센터가 개설 되어 꿀벌에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
하지만, 꿀벌질병관리센터에서는 “기생충성 및 꿀벌질병 진단, 예방 및 방역기술 연구 및 개발”에 대한 연구가 진행되고 있으나, 질병이 발생하였을 경우 치료 할 수 있는 약물의 개발은 거의 이루어지지 않고 있으며 단지 macelignan과 corosolic acid가 사용가능 한 것으로 보고된 바 있다(Shin et al., 2016).
국내 발병이 확인된 15종의 질병은 미국부저병(AFB), 유럽부저병(EFB), 석고병(Chalkbrood), 노제마병(Nosema Disease)의 2종, 낭충봉아부패병(Sacbrood), 한국형 낭충봉아부패병 바이러스(Korean Sacbrood Virus; kSBV), 만성마비병(Chronic bee paralysis virus), Black queen cell virus, 날개불구병(Deformed wing virus) 및 Israel acute paralysis virus, Kakugo virus등 이며, 꿀벌의 주요 질병에 대한 진단시스템이 확립되었다.
석고병은 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)라는 곰팡이균에 의해 발생하는 질병으로, 1984년 처음 경상북도 포항 지역에서 알려진 이후로 현재 전국적으로 발생하고 있다. 현재 알려져 있는 석고병 전문 치료약은 없으며, 철저한 관리를 통해 예방하는 것이 유일한 방법이다. 방제 방법으로서 Propionic acid 훈증성 약제가 사용되고 있다(최승윤. 1992. 양봉, 꿀벌과 벌통. 오성출판사).
꿀벌의 석고병은 유충을 미이라 형태로 만들고 딱딱한 백묵 형태로 변화시켜 꿀벌을 죽이는 병으로서, 1913년에 독일의 마센(Massen)에 의하여 최초로 보고된 이래, 1957년에는 뉴질랜드에서, 1968년에는 미국 캘리포니아주에서 발병되어 거의 모든 주에서 만연된 바 있으며, 캐나다에서는 1971년에 발병되었다는 보고가 있다(Gillam, Honey bee science, 1, 159-162(1980)).
또한, 일본에서는 1974년 아끼다현 및 캐나다산의 수입 양봉에서, 1979년에는 기후현에서도 석고병이 발견된 바 있으며, 전 세계로 확산된 꿀벌 질병 중 가장 피해가 큰 병 중의 하나이다.
석고병을 야기하는 병원균은 1955년 스필토어(Spiltoir) 등에 의해 Ascosphaera apis로 명명되었으며, 꿀벌의 유충에만 감염되고, 포자낭은 환경에 대한 저항성이 강해 병원성이 15년 동안이나 유지된다고 보고된 바 있다(Bailey, Honeybee pathology, 124, Academic press. London, (1981)).
석고병은 감염된 벌통의 오염된 화분 섭취(Mehr et al, Amer. Bee J., 116, 266-268(1976)), 감염된 벌통에서의 여왕벌의 리퀴닝(requeening)(Dejong ＆ Morse, Chalkbrood, New York's Food and Life science, 9, 12-14(1976)), 여왕벌, 일벌 등의 이동, 및 감염된 벌통에 의한 병의 전파(Herbert et al, J. Apic. Res., 16, 204-208(1977))등 다양한 방법으로 감염되며, 국내에서는 1980년대 중반부터 급격히 증가하여 현재는 피해가 가장 큰 꿀벌의 질병 중 하나이다.
현재까지 밝혀진 가장 효과적인 석고병의 방제법은 감염 벌통을 소각하는 방법이지만, 경제적인 손실이 너무 크기 때문에 이를 대체할 수 있는 방법으로서 약제를 이용한 방제법에 관한 연구가 최근 활발히 진행되고 있다.
주로 외국에서 봉군을 수입하는 국내 실정을 고려할 때, 검역을 통해 외래 병원균 유입을 차단하고, 국내 발명을 줄이는 것이 최선의 국가적 예방책이 될 것이며, 현재 상업적으로 개발된 꿀벌의 질병을 대상으로 한 항진균제는 전무한 실정이다.
또한, 과다한 항생제의 사용은 내성 균주의 발생을 야기하고, 향후 질병의 확산에 대한 제어를 더욱 어렵게 하므로 사용이 최소화 되는 것이 바람직하며, 항생제에 대한 양봉업자 및 수요자의 거부감으로 인해 널리 사용하기 어려운 문제가 있어 꿀벌의 질병에 특이적으로 작용하는 치료용 조성물에 대한 개발이 시급하다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 식물 추출물에서 유래한 환경 친화적인 꿀벌의 전염병 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 생체에 대한 부작용 및 유해성이 최소될 수 있도록 꿀벌의 질병을 야기하는 특정 균주에만 특이적으로 작용하는 전염병 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 측면에 따르면, 하기 화학식 1의 화합물, 하기 화학식 2의 화합물 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함하는 꿀벌의 전염병 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112017003098765-pat00001
[화학식 2]
Figure 112017003098765-pat00002
일 실시예에 있어서, 상기 전염병은 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)에 의해 유발될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 전염병은 석고병(chalk brood)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 원인균은 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 항균제 또는 항진균제를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 항균제 또는 항진균제는 아미카신, 젠타마이신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 네틸마이신, 카나마이신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 로메플록사신, 레보플록사신, 에녹사신, 나프티리딘, 술폰아미드, 폴리믹신, 클로르암페니콜, 네오마이신, 파라모모마이신, 콜리스티메테이트, 박시트라신, 반코마이신, 테트라사이클린, 리팜핀, 시클로세린, 베타-락탐, 세팔로스포린, 암포테리신, 플루코나졸, 플루시토신, 나타마이신, 미코나졸, 케토코나졸, 코르티코스테로이드, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 케토롤락, 수프로펜, 코몰린, 로독사미드, 레보카바스틴, 나파졸링, 안타졸린 및 페니라미만으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 꿀벌의 전염병 치료용 조성물은 식물 추출물에서 유래한 단일 화합물을 유효성분으로 포함하므로 체내 독성이 낮고 원인균에 대한 항균 또는 항진균 효과가 우수하여 꿀벌의 전염병, 특히, 석고병 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 상기 꿀벌의 전염병 치료용 조성물은 석고병의 원인균에만 활성을 나타내므로 전체 사용량이 감소되어 내성 발생의 빈도를 저감시킬 수 있으며, 부작용이 최소화될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 아세틸시코닌(Acetylshikonin)의 농도별 처리에 따른 세포 독성을 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 4-하이드록시데리신(4-Hydroxyderricin)의 농도별 처리에 따른 세포 독성을 평가한 결과이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 하기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 또한, 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 발명의 측면에 따르면, 하기 화학식 1의 화합물, 하기 화학식 2의 화합물 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함하는 꿀벌의 전염병 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112017003098765-pat00003
[화학식 2]
Figure 112017003098765-pat00004
상기 조성물은 유효성분으로서 상기 화학식 1의 화학물, 상기 화학식 2의 화합물을 포함할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 아세틸시코닌(Acetylshikonin)으로 지칭되며, 4-[(2S,3R)-4-(1,3-벤조다이옥솔-5-yl)-2,3-디메틸부틸]-2-메톡시페놀 [1-(5,8-디하이드록시-1,4-디옥소나프탈렌-2-일)-4-메틸펜트-3-에닐]아세테이트([1-(5,8-dihydroxy-1,4-dioxonaphthalen-2-yl)-4-methylpent-3-enyl] acetate)로 명명될 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 자초( Lithospermum erythrorhizon S. et Z.) 추출물에서 분리될 수 있다. 상기 자초는 지치과(Borraginaceae)에 속하며, 여러 해 살이 풀로 우리나라 각 처의 산과 들에서 자생한다. 지치, 자초, 지초 또는 자근으로 불리우며 한방에서는 그 뿌리를 자초라고 해서 약재로 사용하고 있다.
상기 자초는 주요 활성성분으로 아세틸시코닌(Acetylshikonin), 시코닌(shikonin), 알칸난(Alkannan), 아이소부틸릴시코닌(Isobutylshikonin)등 나프토퀴(Naphthoquinone)계 화합물을 다량 함유하고 있으며, 이외에도 기름, 정유, 색소 등 다양한 성분을 함유하고 있어 생약재 및 한약재 원료로 널리 이용되고 있다.
상기 자초는 피임작용을 포함한 다양한 약리 기능이 있으며, 최근에는 항염 활성, 박테리아에 대한 항균작용, 약간의 항암 작용, 혈액 순환 촉진작용 등의 약리 효과가 보고되었다.
상기 자초는 상온에서 40℃ 미만의 저온의 물 또는 60℃ 이상의 고온의 물을 용매로 하여 추출될 수 있으며, 또는 알코올을 용매로 하여 추출될 수 있다. 상기 알코올은 탄소수 1 내지 6의 지방족 알코올 일 수 있으며, 구체적으로는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 헥산 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 알코올 추출물은 유기용매 및 물로 분배 추출 될 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 10의 지방족 탄화수소, 탄소수 1 내지 10의 지방족 할로겐화 탄화수소 및 탄소수 2 내지 10의 에스테르 중에서 선택될 수 있다.
상기 자초 추출물에 함유된 화학식 1의 화합물은 추가적인 크로마토그래피, 예컨대, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피법에 의해 단리될 수 있으며, 단일 화합물을 분리하기 위한 공지된 다양한 방법론이 적용될 수 있다.
한편, 상기 화학식 2의 화합물은 4-하이드록시데리신(4-Hydroxyderricin)으로 불리우며, (이)-1-[2-히드록시-4-메톡시-3-(3-메틸부-2-테닐)페닐]-3-(4-히드록시페닐)프로-2-펜-1-원((E)-1-[2-hydroxy-4-methoxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one 으로도 명명될 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물은 신선초(Angelica keiskei) 추출물에서 분리될 수 있다. 상기 신선초는 미나리과(Apiaceae)에 속하는 다년생 초목으로, 명일엽으로도 알려져 있다. 아열대 지방에서 자생하며 우리나라 전역에서 재배되고 있다.
상기 신선초는 주요 활성성분으로 4-하이드록시데리신(4-Hydroxyderricin), 잔소안젤롤(Xanthoangelol), 게르마늄, 비타민, 각종 무기물을 다량 함유하며, 한약재의 원료로도 사용된다. 상기 신선초는 항암, 알레르기 예방, 염증 치료, 노화 방지, 간기능 개선등의 등의 약리 효과가 보고된 바 있다.
상기 4-하이드록시데리신(4-Hydroxyderricin)을 분리하기 위한 식물은 4-하이드록시데리신(4-Hydroxyderricin)을 함유하는 것으로 알려진 알려진 식물 종, 이로부터 유도된 캘러스, 식물 세포, 및 식물 세포 현탁 배양액을 모두 포함할 수 있다. 상기 식물의 사용 부위는 식물체 전체, 잎, 과육, 줄기, 뿌리, 꽃을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 뿌리 부위를 사용할 수 있다.
상기 4-하이드록시데리신(4-Hydroxyderricin)는 메탄올 또는 에탄올과 같은 저급 알코올 용매 또는 이들의 혼합용매로 열수 추출한 후에 감압 농축될 수 있다. 4-하이드록시데리신(4-Hydroxyderricin)을 더욱 효과적으로 추출하기 위해, 상기 신선초 뿌리는 핀밀(pin mill) 또는 볼밀(ball mill) 분쇄기에 의해 100 내지 200 메쉬로 분쇄될 수 있으며, 50 내지 99 %의 저급알코올로 3회 열수 추출될 수 있다.
상기 열수 추출된 엑스는 증류수에 용해시켜 현탁 시킨 후, 여과하여 물 불용성 층 및 물 가용성 층으로 분리될 수 있으며, 상기 물 가용성 층은 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드와 같은 비극성 유기용매에 의해 탈지될 수 있다.
상기 물 가용성층은 4-하이드록시데리신 뿐만 아니라 친수성 또는 소수성 불순물을 다량 함유할 수 있으므로, 상기 물 가용성층을 비극성 유기용매로 탈지시켜 신선초 뿌리의 소수성 불순물을 제거할 수 있으며, 바람직하게는 상기 탈지 공정이 3회 실시될 수 있다.
또한, 상기 신선초 뿌리 추출물에 함유된 화학식 2의 화합물은 당해 기술 분야에 널리 알려진 크로마토그래피법에 의해 단리될 수 있다. 예컨대, 상기 탈지된 물 가용성층은 상기 비극성 유기용매가 제거된 후, 컬럼 크로마토그래피용 비이온성 수지에 흡착될 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 당해 기술 분야에 널리 알려진 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
상기 단리된 화학식 1의 화합물 및 상기 화학식 2의 화합물은 특정 박테리아 또는 곰팡이에 대한 우수한 활성을 보유하므로, 꿀벌의 전염병 치료에 활용될 수 있다.
상기 전염병은 석고병(chalk brood)일 수 있고, 상기 원인균은 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)일 수 있다. 상기 조성물은 석고병의 원인균인 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)에 대한 항균 활성을 가질 수 있다.
즉, 상기 조성물은 특정 균주에 대한 특이적인 항균 활성을 보유하므로 광범위한 사용이 유도되지 않고 내성 발생률이 최소화될 수 있으며, 생체 안전성이 우수하다.
또한, 상기 꿀벌의 전염병 치료용 조성물은 하나 이상의 항균제 또는 항진균제를 더 포함할 수 있다.
상기 항균제 또는 항진균제는 아미카신, 젠타마이신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 네틸마이신, 카나마이신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 로메플록사신, 레보플록사신, 에녹사신, 나프티리딘, 술폰아미드, 폴리믹신, 클로르암페니콜, 네오마이신, 파라모모마이신, 콜리스티메테이트, 박시트라신, 반코마이신, 테트라사이클린, 리팜핀, 시클로세린, 베타-락탐, 세팔로스포린, 암포테리신, 플루코나졸, 플루시토신, 나타마이신, 미코나졸, 케토코나졸, 코르티코스테로이드, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 케토롤락, 수프로펜, 코몰린, 로독사미드, 레보카바스틴, 나파졸링, 안타졸린 및 페니라미만으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 일 수 있다.
즉, 기존에 널리 사용되어온 일부 항균제는 상기 원인균에 대한 항균 활성을 보유하고 있으나, 과도한 사용으로 인해 내성이 증가하고 있으며 생체 독성으로 인해 그 사용이 제한되므로 사용량을 감소시킬 필요가 있다.
따라서, 상기 항균제 또는 항진균제는 상기 단리된 화학식 1의 화합물 및 상기 화학식 2의 화합물과 복합적으로 적용됨으로써 그 사용량이 현저히 저감될 수 있으며, 상승 효과로 인해 항균 활성이 개선될 수 있다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
실험예 1: 세포 독성 평가
상기 화학식 1의 화합물(아세틸시코닌) 및 화학식 2의 화합물(4-히드록시데리신)의 세포 독성을 평가하기 위해 각 화합물이 세포의 성장을 저해하는지 측정하였다 위해 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신을 농도에 따라 HepG2 cell line에 각각 처리하고 MTT assay를 수행하였다.
상기 세포 독성 실험은 Hep-G2 cell lines을 사용하여 수행되었다. 2×103 cells/0.1㎖의 Hep-G2 cell lines을 96-well tissue culture plates(Falcon)의 각 well에 넣은 후 DMSO에 용해된 각 물질을 표시된 농도로 culture plates에 추가하였다.
대조군 DMSO는 최대 농도가 0.2%를 초과하지 않도록 각 plates에 투입하였다. 24시간 또는 48시간 경과 후 100㎕(5mg/㎖) MTT(sigma Cat. M2128)를 투입한 후, ELISA reader(VersaMax, Molecular Devises, USA)를 이용하여 540nm 흡광도에서 활성을 측정하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행되었다.
도 1 및 도 2는 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신의 농도별 처리에 따른 세포 독성을 평가한 결과이다.
도 1을 참조하면, 아세틸시코닌은 고농도(10㎎/ℓ)로 처리한 경우 Hep-G2 cell lines에서는 아세틸시코닌을 처리하지 않은 경우와 비교하여 17.3±6.3%의 세포 성장이 관찰되었다. 반면, HaCaT cell line을 사용한 경우 고농도(10㎎/ℓ)로 처리하였을 때 66.2±4.8%의 세포 성장이 관찰되었다.
미코나졸의 경우 15.25±3.8%의 세포 성장이 보이는 것에 비하여 상기 아세틸시코닌은 고농도로 처리되었을 때 세포의 성장을 일부 저해하였으나, 항진균제로서 통상적인 농도로 사용되는 경우라면 생체에 대한 독성은 극히 미미한 수준일 것으로 분석된다.
도 2를 참조하면, Hep-G2 cell lines에서 4-히드록시데리신을 고농도(10㎎/ℓ)로 처리하였을 때 4-히드록시데리신을 처리하지 않은 경우와 비교하여 88.2±9.8%의 세포 성장이 관찰되었다. 반면, HaCaT cell line에서 고농도(10㎎/ℓ)로 처리하였을 때 96.1±18.0%의 세포 성장이 관찰되었다.
즉, 상기 화학식 1의 화합물(아세틸시코닌) 및 화학식 2(4-히드록시데리신)은 천연 유래의 화합물로서 세포 독성이 낮으므로 인간 또는 꿀벌에 대해 유해성이 낮아 안전하며 친환경적이다.
실험예 2: 항균 활성 평가
상기 화학식 1의 화합물(아세틸시코닌) 및 화학식 2의 화합물(4-히드록시데리신)의 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)에 대한 항균 활성을 평가하였다.
아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신등의 화합물에 대하여 Ascosphaera apis에 대한 항진균 효과를 확인하고자 EUCAST(the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)에서 제시한 broth microdilution assay를 사용하였다. 각 화합물은 10mg/ml의 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 후 사용하였다.
각 화합물의 pH를 7.0으로 조절하였고, 25%의 Glucose가 첨가된 RPMI medium without sodium bicarbonate and with L-glutamine(RPMI 164, Sigma, USA)에 계속적으로 희석하여 DMSO 농도가 2.5% 보다 낮은 수준으로 유지하였다.
각 화합물은 계속적으로 2배 희석된 후 96-well microtitre plate에 100㎕ 첨가되었으며, 100㎕의 Ascosphaera apis 균주 현탁액(1×105CFU/㎖)을 각각의 well 에 투입한 후 35°C에서 24시간 또는 48시간 배양하였다. 각 화합물의 농도를 최대 200㎎/ℓ에서 최소 0.2㎎/ℓ로 하였다. 각 물질에 대한 MIC 값은 각각의 plate에서 군주가 자라지 않는 최소 농도로 확인되었다.
하기 표 1은 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신의 anti-Ascosphaera apis 활성과 함께 기존에 널리 사용되는 항진균제와 후보 물질의 항진균 활성을 비교한 것이다.
표 1을 참조하면, 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신은 MIC 값을 측정한 결과 Ascosphaera apis에 대한 현저한 성장 저해 효과를 나타냈다. 기존에 널리 사용되는 미코나졸과 비교하여 상대적으로 미흡한 항진균 활성을 나타내었으나, Ascosphaera apis의 성장을 효과적으로 억제하였다..
반면, 대조군으로 사용된 비교예 3 내지 32의 화합물은 상기 미생물에 대한 성장 저해 활성을 일부 나타내었으나, 그 효과가 미약하였다.
즉, 상기 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신은 꿀벌에 대한 석고병을 유발하는 Ascosphaera apis에 대한 항진균 활성을 나타내었으며, 기존의 항진균제와 비교하여 그 활성이 약간 떨어지지만 안정성이 우수한 장점이 있다.
구분 화합물 24h 48h
실시예 1 Acetylshikonin 12.5 12.5
실시예 2 4-Hydroxyderricin 3.125 6.25
비교예 1 Miconazole 1.56 1.56
비교예 2 Tetracycline 0.78 1.56
비교예 3 Bisdemethoxy-curcumin >200 >200
비교예 4 Galangin 100 100
비교예 5 Lobatoside C 100 100
비교예 6 Alpiniumisoflavone 50 50
비교예 7 6,8-Diprenylorobol >200 >200
비교예 8 (3aR,9bS)-3a-(4-hydroxybenzyl)-4,9b-dihydro-2,2-dimethyl-3aH-[1,3]dioxolo[4,5-c]chromen-7-ol >200 >200
비교예 9 Eupatilin >200 >200
비교예 10 Esculentic acid >200 >200
비교예 11 Matairesinoside >200 >200
비교예 12 5-Hydroxy-7-methoxy-3-(2'-hydroxybenzyl)-4-chromanone 100 100
비교예 13 Gagaminine 100 100
비교예 14 Kalopanaxsaponin H 25 25
비교예 15 Kurarinone 50 100
비교예 16 Sophoraflavanone G(vexibinol) 50 50
비교예 17 Falcarindiol 12.5 25
비교예 18 Timosaponin AⅢ 12.5 25
비교예 19 ((7S)-8'-(benzo[3',4']dioxol-1'-yl)-7-hydroxypropyl)benzene-2,4-diol 100 100
비교예 20 (R)-(+)-Dalbergiphenol >200 >200
비교예 21 6-(3,4-Dimethylcyclohexa-2,4-dien-1-yl)-2-methylhexane-2,3-diol >200 >200
비교예 22 Actinidic acid 100 100
비교예 23 Alismol >200 >200
비교예 24 Dehydrodieugenol >200 >200
비교예 25 Erythro-(7S,8R)-7-acetoxy-3,4,3′,5′-tetramethoxy-8-O-4′-neolignan >200 >200
비교예 26 Guaiacin 100 100
비교예 27 Myristargenol A 100 100
비교예 28 Oleiferin F 100 100
비교예 29 Otobaphenol 25 25
비교예 30 Pimaric acid >200 >200
비교예 31 Sargachromanol G >200 >200
비교예 32 Sargachromanol I 100 100
실험예 3: 미생물 특이적 항균 효과 확인
상기 화학식 1의 화합물(아세틸시코닌) 및 화학식 2의 화합물(4-히드록시데리신)이 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)에 대한 특이적인 항균 활성을 보유하는지 또는 타 종류의 곰팡이균에 대한 활성을 가지는지 확인하였다.
즉, 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는 치료용 조성물은 특정 균주에 대한 특이적인 활성을 보유함으로써 광범위한 사용이 유도되지 않고 내성 발생률이 최소화될 수 있으므로, 각 균주에 대한 성장 저해 효과를 측정하였다.
Broth microdilution assay를 사용하였으며, 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신의 농도가 최대 200㎎/ℓ 내지 최소 0.2㎎/ℓ이 되도록 계속적으로 2배 희석한 후 96-well microtitre plate에 100㎕씩 첨가하였다. 각 균주 현탁액(1×105CFU/㎖)을 각각의 well 에 투입한 후 35°C에서 24시간 또는 48시간 배양하였다. 아세틸시코닌 및4-히드록시데리신의에 대한 MIC 값은 각각의 plate에서 균주가 자라지 않는 최소 농도로 하였다.
하기 표 2는 상기 아세틸시코닌의 각 균주에 대한 성장 저해 효과를 측정한 것이고, 표 3은 상기 4-히드록시데리신의 각 균주에 대한 성장 저해 효과를 측정한 것이다.
구분 아세틸시코닌
MIC-24h(㎎/ℓ) MIC-48h(㎎/ℓ)
실시예 1 A. apis 12.5 12.5
비교예 1 A. niger >200 >200
비교예 2 A. clavatus 50 50
비교예 3 C. albicans 25 50
비교예 3 C. parapsilosis var. parapsilosis 50 50
비교예 4 C. tropicalis 50 50
비교예 5 C. tropocalis var. tropicalis 25 100
비교예 6 C. glabrata 25 50
비교예 7 F. neoformans var. bacillispora 12.5 50
비교예 8 P. guilliermondii >200 >200
비교예 9 R. oryzae 25 25
비교예 10 S. cerevisiae 12.5 25
표 2에 나타난 바와 같이, Acetylshikonin은 Ascosphaera apis에 대하여 가장 높은 항진균 활성을 나타내었으나, 그 외의 곰팡이 균주에 대한 항진균 활성은 미약하거나 48시간 경과 후 활성이 감소하거나 활성이 전혀 나타나지 않았다.
구분 4-히드록시데리신
MIC-24h(㎎/ℓ) MIC-48h(㎎/ℓ)
실시예 2 A. apis 3.125 6.25
비교예 1 A. niger >200 >200
비교예 2 A. clavatus >200 >200
비교예 3 C. albicans >200 >200
비교예 4 C. parapsilosis var. parapsilosis >200 >200
비교예 5 C. tropicalis >200 >200
비교예 6 C. tropocalis var. tropicalis >200 >200
비교예 7 C. glabrata >200 >200
비교예 8 F. neoformans var. bacillispora >200 >200
비교예 9 P. guilliermondii >200 >200
비교예 10 R. oryzae 0.78 0.78
비교예 11 S. cerevisiae >200 >200
표 3에 나타난 바와 같이, 4-히드록시데리신은 Ascosphaera apis와 R. oryzae에 대하여 높은 항진균 활성을 나타낸 반면, 그 이외의 다른 균주에 대한 항진균 활성은 나타나지 않았다.
즉, 상기 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신은 일부 미생물종에 대하여 특이적으로 작용하여 성장을 저해 하는 효과를 나타냄으로, 꿀벌의 전염병, 특히, 석고병 치료에 유용하게 활용될 수 있으며, 광범위한 사용의 우려가 극히 적을 것으로 사료된다.
실험예 4: 복합 적용에 따른 항균 효과 확인
상기 화학식 1의 화합물(아세틸시코닌) 및 화학식 2의 화합물(4-히드록시데리신)의 기존 항균제와의 복합 적용에 따른 항균 활성을 평가하였다.
미코나졸 및 아세틸시코닌의 혼합 사용에 따른 Ascosphaera apis에 대한 항진균 효과를 확인하고자 상기한 broth microdilution assay를 chequerboard fashion으로 사용하였다.
각 화합물의 농도가 최대 200㎎/ℓ에서 최소 0.2㎎/ℓ이 되도록 계속적으로 2배 희석한 후 96-well microtitre plate에 100㎕씩 첨가하였다. 각 균주 현탁액(1×105CFU/㎖)을 각각의 well 에 투입한 후 35°C에서 24시간 또는 48시간 배양하였다. 각 화합물에 대한 MIC 값은 각각의 plate에서 균주가 자라지 않는 최소 농도로 하여 각각의 plate에서 재차 확인되었다.
상기 혼합 사용에 따른 상승효과는 FICI=(Ac/Aa)+(Bc/Ba) 공식을 사용하여 Fractional inhibitory concentration indexes (FICIs)으로 표시하였다(Drogari-Apiranthitou et al., 2012).
Ac와 Bc는 혼합 사용한 경우 A 물질 및 B 물질 각각의 MIC 값이며, Aa와 Ba는 단독으로 사용한 경우 A 물질 및 B 물질 각각의 MIC 값이다. 상기 FICI값이 0.5이하인 경우 상승효과가 있는 것으로 평가하며, 0.5 내지 4일 경우 상승효과가 없거나 미약한 것으로 평가한다.
표 4는 아세틸시코닌 및 4-히드록시데리신을 미코나졸과 동시에 Ascosphaera apis에 처리한 후 성장 저해능을 평가한 것이다.
구분 FICI-24h(㎎/ℓ) FICI-48h(㎎/ℓ)
아세틸시코닌 + 미코나졸 0.83±0.12 0.88±0.15
4-히드록시데리신 + 미코나졸 0.63±0.10 0.65±0.13
표 4를 참조하면, 아세틸시코닌 및 미코나졸의 복합 사용에 따른 상승 효과는 현저하지 않았다. 그러나, 3.125 ㎎/ℓ의 아세틸시코닌을 사용하였을 때, 미코나졸 0.78 ㎎/ℓ만 사용해도 Ascosphaera apis의 성장을 효과적으로 저해하였다. 즉, 미코나졸은 아세틸시코닌과 복합적으로 사용됨으로써 사용량이 현저히 저감될 수 있다.
또한, 4-히드록시데리신 및 미코나졸의 복합 사용에 따른 상승 효과가 일부 확인되었다. 또한, 4-히드록시데리신 0.78 ㎎/ℓ을 사용하였을 때 미코나졸 0.39 ㎎/ℓ만 사용해도 Ascosphaera apis의 성장을 현저히 저해 하였으며, 미코나졸 0.78 ㎎/ℓ만 사용해도 Ascosphaera apis의 성장을 완전히 차단하였다. 즉, 4-히드록시데리신은 미코나졸과 복합적으로 사용됨으로써 사용량이 현저히 저감될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 하기 화학식 2의 화합물 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함하는 석고병(chalk brood) 예방 및 치료용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112018000239399-pat00005

    [화학식 2]
    Figure 112018000239399-pat00006
  2. 제1항에 있어서,
    상기 석고병은 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)에 의해 유발되는 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 항균제 또는 항진균제를 더 포함하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항균제 또는 항진균제는 아미카신, 젠타마이신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 네틸마이신, 카나마이신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 로메플록사신, 레보플록사신, 에녹사신, 나프티리딘, 술폰아미드, 폴리믹신, 클로르암페니콜, 네오마이신, 파라모모마이신, 콜리스티메테이트, 박시트라신, 반코마이신, 테트라사이클린, 리팜핀, 시클로세린, 베타-락탐, 세팔로스포린, 암포테리신, 플루코나졸, 플루시토신, 나타마이신, 미코나졸, 케토코나졸, 코르티코스테로이드, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 케토롤락, 수프로펜, 코몰린, 로독사미드, 레보카바스틴, 나파졸링, 안타졸린 및 페니라미만으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
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