KR102069340B1

KR102069340B1 - 피마르산을 유효성분으로 포함하는 부저병의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102069340B1
Application number: KR1020180110061A
Authority: KR
Inventors: 김기영; 박주현; 송현찬; 김재구; 신유경
Original assignee: 경희대학교 산학협력단; 주식회사 진트론바이오텍
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2020-01-22

Abstract

본 발명은 꿀벌의 전염병 치료용 조성물에 관한 것으로, 식물 추출물에서 유래한 화합물을 포함하는 생체 안전성이 우수한 부저병의 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.

Description

피마르산을 유효성분으로 포함하는 부저병의 예방 및 치료용 조성물{A COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF FOULBROOD COMPRISING PIMARIC ACID AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 꿀벌의 전염병 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물 추출물 유래의 단일 화합물을 포함하여 생체 안전성이 우수할 뿐만 아니라, 내성 발생 가능성이 최소화된 꿀벌의 전염병 치료용 조성물에 관한 것이다.

꿀벌은 전세계에서 가장 많은 활동을 보이는 화분매개충으로 농작물뿐만 아니라 다양한 종류의 꽃과 식물의 화분매개(bee pollination)에 중요한 역할을 하고 있다.

비록 벌꿀에 의해서 직접적으로 생산되는 벌꿀(honey), 밀랍(bee wax), 왕유(royal jelly), 화분(pollen), 봉교(propolis), 봉독(bee venom)등의 생산액이 전체 축산업 생산액에서 차지하는 비율(1.2%, 농림수산식품부, 2010)은 크지 않으나, 사람이 먹는 식물성 음식의 40%는 꿀벌에 의하여 수분이 매개 되어야만 하는 것으로 알려져 있다.

따라서 현재 다양한 원인에 의하여 꿀벌의 개체수가 감소하는 것은 농업 생산 분만 아니라 자연 생태계에도 지대한 영향을 미칠 것은 자명하다.

국내 양봉 산업의 경우 꿀벌 산업에 의한 직접적 시장 규모는 약 4,000억 규모에 달하며, 농작물의 화분매개 등 벌의 생태계 다원적 기능은 계량화하기 어려울 정도로 크다.

국내에서 꿀벌에 의한 경제적 가치는 전체 과채류 생산액인 12.5조원 중 50%인 6조원을 담당하고 있으며, 전체 생태계 보존 효과는 50조원을 초과한다.

꿀벌은 공장식으로 밀집되어 사육되는 대표적인 가축이다. 농가에 따라서 벌통이 수 백 통에서부터 수 천 통까지 이르며 우리나라의 경우 봉군 수가 세계 20위로 45명당 1개의 봉군 비를 이루고 있다. 국내에는 2011년 기준으로 약 200만 개의 봉군이 있는 것으로 알려져 있다.

밀도가 높으면 질병에 취약할 수밖에 없다. 진균과 같은 감염성 병원균의 입장에서는 감염시킬 수 있는 개체가 상당이 밀집되어 많은 개체수가 있기 때문에 최적의 생존 조건이라 할 수 있다.

따라서 봉군의 관리가 제대로 되지 않아 진균과 같은 병원성 미생물에 전염이 되면 봉군을 잃어버리는 심각한 문제를 일으킬 수 있다.

현재까지 국내의 꿀벌 관련 연구는 농약 피해의 실태조사(최와 이, 1986), 양봉경영 및 봉군관리(오, 1988), 양봉농가의 경영분석(김과 박, 1990), 응애피해(우 등, 1994), 양봉관리 실태(강 등, 1995), 양봉산물 생산실태(이 등, 2002), 양봉농가의 경영실태(김, 2009), 꿀벌 질병 진단 기술 개발(윤병수, 2013)등의 연구가 이루어져 왔으며 농림축산검역본부에 꿀벌질병관리센터가 개설 되어 꿀벌에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

하지만, 꿀벌질병관리센터는 “기생충성 및 꿀벌질병 진단, 예방 및 방역기술 연구 및 개발”에 대한 연구를 진행하고 있으나, 질병 원인균에 대한 성장 저해제 발굴이나 항(진)균제의 발굴은 하지 않고 있다.

부저병은 유충벌에 감염하는 전염성 질병 중 가장 무서운 질병 중 하나이며 Paenibacillus larvae에 의한 미국부저병(AFB)이 알려져 있다.

Paenibacillus larvae는 그람양성균 중 간균(2.5～5.0 ㎛ × 0.7～0.8 ㎛)의 형태로 포자(spore)를 형성 할 수 있기 때문에 살균제에 대한 저항성이 있고 따라서 특정 조건에서는 35년간 감염력을 유지 할 수도 있다.

미국 부저병의 전염은 오염된 꿀의 재사용이나 오염된 기구를 재 사용 하여 전염되는 경우도 보고 되어 있으며 또한 감염된 벌의 교환 또는 도봉들에 의하여 유충간 또는 봉군간에 전염이 확산 되기도 한다.

Paenibacillus larvae 내생포자에 의한 감염은 꿀벌(Apis mellifera)에서 보고 되어 있으며, 그 이외의 곤충이나 사람에는 감염을 일으키지는 않는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 부화 한지 2일 이내의 유충에 감염이 심각하며, 유충에 전염된 Paenibacillus larvae 내생포자는 경구를 통하여 중장관(midgut)에 도착한 후 1일 이내에 영양세포로 성장을 하며 이후 급속히 증식한다.

증식된 Paenibacillus larvae 세포들은 유충이 죽으면 영양분이 줄어들어 다시 1개의 유충 당 약 500 내지 1,000만개의 내생포자를 형성하여 다른 유충을 감염시킨다.

미국 부저병(AFB)은 공식적으로 1877년 뉴질랜드에서 처음 발병된 것으로 알려져 있으며 부저병은 전세계로 널리 퍼진 이후 미생물에 의한 꿀벌의 전염성 질병 중 가장 많이 발생하고 있으며 피해도 심각한 질병 중 하나이다. 국내에는 1950년 중부지방에서 처음 보고가 된 후 양봉에 매우 심각한 피해를 입힌 바 있으며 현재까지 전국에서 지속적으로 발병되고 있다.

따라서 미국 부저병의 방제는 조기 발견이 가장 중요하며 특히, 상당량의 봉군을 수입하고 있는 국내의 양봉 실정을 감안하면 국내 유입으로의 차단이 매우 중요하며 또한 국내에서의 발병 억제가 최선의 국가적 대책이 될 것이다.

또한 원인균은 수 십년간 감염력을 유지하며 생존할 수 있는 내생포자에 의하여 발병되고 전 세계적으로 상당수의 봉군에서 포자가 있는 것으로 알려진 이상 언제든지 질병이 발생할 것이라 생각하고 그에 대한 대책을 세우는 것이 중요하다.

부저병이 발생한 벌통에 있어 전염성이 심각한 경우 봉저가 곪거나 심한 냄새가 나기도 한다. 일반적으로 부저병이 감염된 봉군의 경우 봉개된 부위가 검붉은 빛을 띠며, 꿀벌의 경우 힘이 없고 복부가 비대하며 먹지 못하여 5 내지 6일 후에 소문으로 기어 나와 죽는다.

심하게 봉군이 전염이 되었을 경우에는 즉각 소각하는 방법이 제일 좋은 것으로 알려져 있으며 전염이 경미할 경우에는 테트라사이클린 계통의 항생제를 사용하기도 한다.

테트라사이클린 계통의 항생제는 거의 모든 박테리아를 죽이게 되기 때문에 유익균까지 모두 죽이게 되어 생태계에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있다.

또한 사용 빈도가 많아, 많은 종류의 박테리아에서 내성 균주의 발생이 보고되고 있다. 따라서 이를 대체하기 위한 약제에 관한 연구가 진행되고 있으나, 아직 주요한 성과가 보고된 바 없다.

외국에서 주로 봉군을 수입하는 우리나라의 경우, 검역 시스템에 의한 병원균 유입을 차단하고 국내의 발명을 줄이는 것이 현재 최선의 국가적 예방책이 될 것이다.

건강 식품으로서 꿀벌 산물에서 항생제나 유해균의 산물이 잔류되는 것은 꿀벌 산물에 대한 경쟁력에 있어 매우 심각한 문제이다. 잔류성 물질이 없는 질 좋은 산물은 외국의 값싼 벌꿀 등의 꿀벌 산물에 대하여 우위를 점할 수 있어 농가의 소득에도 지대한 영향을 미칠 수 있다

또한, 화분 매개체로서 자연 생태계를 유지하기 위하여도 꿀벌의 개체수의 감소를 방지해야 하며, 따라서 양봉에 가장 문제가 되고 있는 병해충 중 하나인 부저병의 치료제에 대한 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 식물 추출물에서 유래하고 부저병을 야기하는 균주에만 특이적으로 작용하는 환경 친화적인 부저병 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 부저병 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

[화학식 1]

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 상기 부저병의 원인균에 대한 항균 활성을 가질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 원인균은 패니바실러스 라배(Paenibacilus larvae)일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 상기 패니바실러스 라배(Paenibacilus larvae)의 생물막 형성을 억제할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 항균제 또는 항진균제를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 항균제 또는 항진균제는 아미카신, 젠타마이신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 네틸마이신, 카나마이신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 로메플록사신, 레보플록사신, 에녹사신, 나프티리딘, 술폰아미드, 폴리믹신, 클로르암페니콜, 네오마이신, 파라모모마이신, 콜리스티메테이트, 박시트라신, 반코마이신, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 리팜핀, 시클로세린, 베타-락탐, 세팔로스포린, 암포테리신, 플루코나졸, 플루시토신, 나타마이신, 미코나졸, 케토코나졸, 코르티코스테로이드, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 케토롤락, 수프로펜, 코몰린, 로독사미드, 레보카바스틴, 나파졸링, 안타졸린 및 페니라미만으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 부저병 치료용 조성물은 식물 추출물에서 유래한 단일 화합물을 유효성분으로 포함하므로 체내 독성이 낮고 원인균에 대한 항균 또는 항진균 효과가 우수하다.

또한, 상기 꿀벌의 전염병 치료용 조성물은 석고병의 원인균에만 활성을 나타내므로 전체 사용량이 감소되어 내성 발생의 빈도를 저감시킬 수 있으며, 부작용이 최소화될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피마르산, 테트라사이클린 또는 옥시테트라사이클린의 처리에 따른 패니바실러스 라배에 대한 항균 효과를 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 피마르산의 농도별 처리에 따른 패니바실러스 라배의 생물막 형성 정도를 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 피마르산의 농도별 처리에 따른 패니바실러스 라배의 세포 파열 정도를 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 피마르산의 농도별 처리에 따른 세포 독성을 평가한 결과이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 하기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 또한, 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 피마르산(Pimaric acid), 덱스트로피마르산(Dextropimaric acid)으로 지칭되고, 13a-메틸-13-비닐포도카프-8(14)-엔-15-오익산(13a-methyl-13-vinylpodocarp-8(14)-ene-15-oic acid)으로 명명될 수 있으며, 소나무의 송진 추출물에서 분리될 수 있다.

상기 송진은 적송(赤松)이 상처를 입었을 때에 분비하는 물질로서, 적송은 송진을 분비하여 상처를 덮어 자기를 보호하는 역할을 한다. 이는 자신의 수분이 날아가는 것을 막고 병균의 번식, 침투를 막으며 상처 치료의 성질을 가지고 있어 상처 부위가 부패하는 것을 방지한다.

각종 한의서와 민간요법에서 활용되고 있는 한방원료들 중 송진은 각종 염증, 위장질환, 폐결핵 등에 효과가 있으며, 최근에는 여드름 피부에 송진가루를 물에 개어 얼굴에 팩을 하면 여드름이 가라앉는 것이 보고되고 있다.

상기 화합물을 분리하기 위한 식물은 식물 종뿐만 아니라 이로부터 유도된 식물 세포 및 식물 세포 현탁 배양액을 모두 포함할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물인 피마르산(Pimaric acid)을 효과적으로 추출하기 위하여 50 내지 99 %의 저급 알코올로 3회 열수 추출한 다음 감압 농축할 수 있다.

상기 열수 추출된 엑스는 증류수에 용해시켜 현탁 시킨 후, 여과하여 물 불용성 층 및 물 가용성 층으로 분리할 수 있으며, 상기 물 가용성 층은 에테르 또는 메틸렌클로라이드와 같은 비극성 유기용매에 의해 탈지될 수 있다.

상기 물 가용성층은 피마르산 뿐만 아니라 다양한 불순물을 함유할 수 있으므로, 상기 물 가용성층을 비극성 유기용매로 탈지시켜 불순물을 제거할 수 있으며, 바람직하게는 상기 탈지 공정이 3회 실시될 수 있다.

또한, 상기 송진 추출물에 함유된 화학식 1의 화합물은 당해 기술 분야에 널리 알려진 크로마토그래피법에 의해 단리될 수 있다. 상기 송진 추출물에 함유된 화학식 1의 화합물은 추가적인 크로마토그래피, 예컨대, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피법에 의해 단리될 수 있으며, 단일 화합물을 분리하기 위한 공지된 다양한 방법론이 적용될 수 있다.

예컨대, 상기 비극성 유기용매가 제거된 후, 컬럼 크로마토그래피용 비이온성 수지에 흡착될 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 당해 기술 분야에 널리 알려진 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.

상기 단리된 화학식 1의 화합물은 꿀벌의 전염병인 부저병의 원인 균주인 패니바실러스 라배(Paenibacilus larvae)에 대한 특이적인 항균 활성을 보유하므로, 부저병의 예방 및 치료에 활용될 수 있다.

즉, 상기 조성물은 특정 균주에 대한 특이적인 항균 활성을 보유하므로 광범위한 사용이 유도되지 않고 내성 발생률이 최소화될 수 있으며, 생체 안전성이 우수하다.

상기 피마르산은 패니바실러스 라배의 성장을 억제할 뿐만 아니라 패니바실러스 라배를 효과적으로 사멸시켰다(실험예 1, 2 및 4).

또한, 패니바실러스 라배의 사멸 기작과 관련하여, 상기 피마르산이 패니바실러스 라배의 생물막 형성을 저해함으로써 사멸시켰다(실험예 3).

또한, 상기 조성물은 하나 이상의 항균제 또는 항진균제를 더 포함할 수 있다.

상기 항균제 또는 항진균제는 아미카신, 젠타마이신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 네틸마이신, 카나마이신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 로메플록사신, 레보플록사신, 에녹사신, 나프티리딘, 술폰아미드, 폴리믹신, 클로르암페니콜, 네오마이신, 파라모모마이신, 콜리스티메테이트, 박시트라신, 반코마이신, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 리팜핀, 시클로세린, 베타-락탐, 세팔로스포린, 암포테리신, 플루코나졸, 플루시토신, 나타마이신, 미코나졸, 케토코나졸, 코르티코스테로이드, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 케토롤락, 수프로펜, 코몰린, 로독사미드, 레보카바스틴, 나파졸링, 안타졸린 및 페니라미만으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 일 수 있고, 바람직하게는 테트라사이클린 또는 옥시테트라사이클린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

기존에 널리 사용되어온 일부 항균제는 상기 원인균에 대한 항균 활성을 보유하고 있으나, 과도한 사용으로 인해 내성이 증가하고 있으며 생체 독성으로 인해 그 사용이 제한되므로 사용량을 감소시킬 필요가 있다.

따라서, 상기 항균제 또는 항진균제는 상기 단리된 화학식 1의 화합물과 복합적으로 적용됨으로써 그 사용량이 현저히 저감될 수 있으며, 상승 효과로 인해 항균 활성이 개선될 수 있다.

상기 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예 1 : 패니바실러스 라배에 대한 항균 활성 시험

상기 화학식 1의 화합물(피마르산, Pimaric acid)의 패니바실러스 라배(Paenibacilus larvae)에 대한 항균 활성을 평가하였다.

화학식 1의 화합물의 항균 효과를 확인하고자 EUCAST(the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)에서 제시한 broth microdilution assay를 사용하였다. 각 화합물은 10 mg/ml의 농도로 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해시킨 후 사용하였다.

Paenibacilus larvae(P649(KACC14031))는 Luria-Bertani(LB) agar(1 % (w/v) bacto-tryptone, 0.5 % (w/v) bacto-yeast extract, 1 %(w/v) NaCl and 4.5 %(w/v) nutrient agar)에 배양하였으며 MYPGP(MYPGP: 1 % of Mueller-Hinton broth, 1.5 % of yeast extract, 0.2 % of glucose, 0.3 % of K₂HPO₄and 0.1 % of sodium pyruvate)를 사용하여 실험을 수행하였다.

각 화합물은 계속적으로 2배 희석된 후 96-well microtitre plate에 100 μL 첨가하였으며, 100 μL의 Paenibacilus larvae 균주 현탁액(OD₆₀₀=0.1)을 각각의 well 에 투입한 후 30 °C에서 24시간 배양하였다.

각 화합물의 농도를 최대 100 μg/mL에서 최소 1.5625 μg/mL로 하였다. 각 물질에 대한 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 값은 각각의 plate에서 군주가 자라지 않는 최소 농도로 확인되었다.

하기 표 1은 화학식 1의 화합물의 anti-Paenibacilus larvae 활성과 함께 기존에 널리 사용되는 후보 물질의 항균 활성을 비교한 것이다.

구분	화합물	P649(KACC14031) MIC at 24hr
실시예	Pimaric acid	6.25
비교예 1	Actinidic acid	50
비교예 2	Folic acid	>100
비교예 3	Gallic acid	>100
비교예 4	Gentisic acid	>100
비교예 5	Gibberellic acid	>100
비교예 6	Glycyrrhizic acid	>100
비교예 7	Hesperidin	>100
비교예 8	Isoborneol	>100
비교예 9	1-Naphthol	>100
비교예 10	Tetracycline	50
비교예 11	Ninhydrin	>100
비교예 12	Paeonol	>100
비교예 13	Sulphosalicylic acid	>100
비교예 14	L-Tartaric acid	>100
비교예 15	Thymol	>100
비교예 16	Vanillin	>100
비교예 17	(-)-Bornyl acetate	>100
비교예 18	4-Carvomenthenol	>100
비교예 19	Citronellol	>100
비교예 20	p-Cymene	>100
비교예 21	Oxytetracycline	50

표 1을 참조하면, 화학식 1의 화합물은 MIC 값을 측정한 결과 Paenibacilus larvae에 대한 현저한 성장 저해 효과를 나타냈으며, 특히, 기존에 널리 사용되는 테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린과 비교하여 우수한 항균 활성을 보여 Paenibacilus larvae의 성장을 효과적으로 억제하였다.반면, 대조군으로 사용된 비교예의 화합물들은 상기 미생물에 대한 성장 저해 활성이 없거나 매우 미약하였다.

즉, 상기 피마르산은 꿀벌에 대한 부저병을 유발하는 Paenibacilus larvae 에 대한 항균 활성을 나타내었으며, 기존의 항균제와 비교하여 그 활성이 동등하거나 우수할 뿐만 아니라, 안전성이 높은 장점이 있다.

실험예 2 : 패니바실러스 라배에 대한 항균 효과 시험

상기 실험예 1에서 Paenibacilus larvae 균주에 항균 활성을 보이는 피마르산, 테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린의 항균 효과를 확인하기 위해 원반 확산 실험(Agar disk diffusion test)를 수행하였다.

각 화합물은 10 mg/ml의 농도로 dimethyl sulfoxide DMSO)에 녹인 후 사용하였다. 각 화합물은 100 μg씩 6-mm diameter antibiotic test disks에 첨가한 뒤 Paenibacillus larvae 균주 현탁액5×10⁴ CFU/mL)을 MYPGP agar plate에 뿌려준 뒤 35 ℃에서 24 시간 또는 36시간 동안 배양하였다. 모든 실험은 3 회 이상 반복 수행하였다.

도 1은 피마르산, 테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린에 대한 Paenibacillus larvae의 감수성을 나타낸 것이며, 하기 표 2는 원반 확산 시험을 통해 얻은 Paenibacillus larvae에 대한 상기 화합물들의 항균 효과를 성장 저해에 의한 클리어존의 평균 지름(mm)으로 수치화한 것이다.

구분	화합물	지름(mm)
구분	화합물	24h	36h
실시예	Pimaric acid	10±0.5	9±0.5
비교예 10	Tetracycline	17±1	14±1
비교예 21	Oxytetracycline	19±1.5	16±0.5

도 1및 표 2를 참조하면, 피마르산은 Paenibacillus larvae에 대하여 24시간 이후에는 10±0.5 mm의 항균 효과를 나타냈고 36시간 이후에는 9±0.5 mm의 항균 효과를 나타내었으며, 이는 테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린의 Paenibacillus larvae에 대한 항균 효과와 비교하여 현저하게 우수하였다.

실험예 3 : 패니바실러스 라배에 대한 생물막 형성 저해 효과 시험

상기 피마르산이 Paenibacillus larvae의 생물막 형성 저해의 정도를 확인하기 위해 Crystal violet assay를 진행하였다.

Paenibacillus larvae를 96 well plate에서 24 시간 피마르산과 함께 키운 후 0.5 % crystal violet으로 30 ℃에서 20 분간 염색을 하였다. 이후 crystal violet을 세척하고 건조시켰다. 건조 후30 % 아세트산으로 생물막에 붙어있는 crystal violet을 용해시켰다.

microplate reader BioTek Instruments를 이용하여 450 nm의 흡광도에서 용해된 crystal violet의 양을 측정하였다. 모든 실험은 3 회 이상 반복 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 피마르산의 농도가 증가할수록 Paenibacillus larvae의 생물막 형성을 효과적으로 저해하였다.

상기 결과는 피마르산이 Paenibacillus larvae의 생물막 형성을 억제함으로써 Paenibacillus larvae에 대한 우수한 항균 효과를 가짐을 시사한다.

실험예 4 : 패니바실러스 라배의 세포 파열 여부 확인 시험

피마르산이 Paenibacillus larvae 세포의 파열을 유도하는지 확인하기 위해 피마르산 처리 후 260 또는 280 nm 흡광도에서 측정되는 물질을 확인하였다.

피마르산을 농도(0, 0.7, 1.5, 3.1, 6.2 또는 12 μg/mL)에 따라 Paenibacillus larvae에 처리를 하였고, 260 또는 280 nm에서 측정하여 세포가 파열되었을 때 나오는 물질들의 양으로 파열된 세포의 양을 확인하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 수행하였으며, 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하면, 피마르산의 농도가 증가할수록 Paenibacillus larvae 의 파열된 세포에서 나오는 물질들이 많이 측정되었으며, 이는 피마르산이 Paenibacillus larvae 균주에 대하여 단순히 성장을 억제하는 물질이 아니라 확실하게 균을 사멸시키는 항균제로 사용될 수 있음을 시사한다.

실험예 5 : 세포 독성 평가

피마르산의 세포 독성을 평가하기 위해 피마르산을 농도에 따라 HepG2 cell line에 각각 처리하고 MTT assay를 수행하였다.

상기 세포 독성 실험은 Hep-G2 cell lines을 사용하여 수행되었다. 2×10⁴ cells/0.1mL의 Hep-G2 cell lines을 96-well tissue culture plates(Falcon)의 각 well에 넣은 후 DMSO에 용해된 각 물질을 표시된 농도로 culture plates에 추가하였다.

대조군 DMSO는 최대 농도가 0.2%를 초과하지 않도록 각 plates에 투입하였다. 24시간 또는 48시간 경과 후 100μL(5mg/mL) MTT(sigma Cat. M2128)를 투입한 후, ELISA reader(VersaMax, Molecular Devises, USA)를 이용하여 540nm 흡광도에서 활성을 측정하였다.

모든 실험은 3회 이상 반복 수행하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 피마르산을 10 μg/mL로 처리하였을 경우 HaCaT cell line 세포에서 저해가 있었으나, Paenibacillus larvae에 대한 피마르산의 MIC값에서는 세포 활성을 거의 저해하지 못하였다.

상기 결과는 항균제로서 통상적인 농도로 사용되는 경우라면 생체에 대한 독성은 극히 미미한 수준임을 시사한다.

실험예 5 : 복합 적용에 따른 항균 효과 시험

피마르산의 기존 항균제와의 복합 적용에 따른 항균 활성을 평가하였다.

테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린의 혼합 사용에 따른 Paenibacillus larvae에 대한 항균 효과를 확인하고자 상기 실험예 1에서 수행한 broth microdilution assay를 checkerboard assay으로 사용하였다.

각 화합물의 농도는 최대 100 μg/mL에서 최소 1.564 μg/mL이 되도록 계속적으로 2 배 희석한 후 96-well microtitre plate에 100 μL 첨가되었으며, 100 μL의 각 균주 현탁액(1×10⁴CFU/mL)을 각각의 well에 투입한 후 35 °C에서 24시간 또는 48시간 배양하였다.

각 화합물에 대한 MIC 값은 각각의 plate에서 균주가 자라지 않는 최소 농도로 하여 각각의 plate에서 다시 확인하였다.

상기 혼합 사용에 따른 상승효과는 FICI=(Ac/Aa)+(Bc/Ba) 공식을 사용하여 Fractional inhibitory concentration indexes(FICIs)로 표시하였다.

Ac와 Bc는 혼합 사용한 경우 A 물질 및 B 물질 각각의 MIC 값이며, Aa와 Ba는 단독으로 사용한 경우 A 물질 및 B 물질 각각의 MIC 값이다.

상기 FICI값이 0.5 이하인 경우 강력한 상승 효과, 0.5 ~ 0.75의 경우 부분적인 상승 효과, 0.75 ~ 1.0의 경우 상가 효과, 1.0 ~ 4.0 범위에서는 두 물질 간 관계 없는 것으로 평가하며, 4.0 이상일 때 반감 효과를 보이는 것으로 평가하였다.

구분	화합물	MIC alone	MIC in combination	FIC index value
실시예	Pimaric acid	6.25	1.56	0.5
비교예 10	Tetracycline	50	12.5	0.5
실시예	Pimaric acid	6.25	3.12	0.625
비교예 21	Oxytetracycline	50	6.25	0.625

표 3을 참조하면, 테트라사이클린 또는 옥시테트라사이클린과 피마르산을 복합적으로 투여하는 경우, FICI가 각각 0.5 및 0.625로 나타났는바, 복합 투여에 의해 부분적인 상승 효과를 보이는 것으로 평가되었다.상기 결과는 피마르산과 테트라사이클린 또는 옥시테트라사이클린을 복합적으로 사용함으로써 나타나는 시너지 효과로서 Paenibacillus larvae에 대한 항균 효과를 증가시켜 항균에 요구되는 양을 현저하게 저감시킬 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 부저병 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 부저병의 원인균에 대한 항균 활성을 가지는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 원인균은 패니바실러스 라배(Paenibacilus larvae)인 조성물.
제3항에 있어서,
상기 패니바실러스 라배의 생물막 형성을 억제하는 조성물.
제1항에 있어서,
하나 이상의 항균제 또는 항진균제를 더 포함하는 조성물.
제5항에 있어서,
상기 항균제 또는 항진균제는 아미카신, 젠타마이신, 토브라마이신, 스트렙토마이신, 네틸마이신, 카나마이신, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 로메플록사신, 레보플록사신, 에녹사신, 나프티리딘, 술폰아미드, 폴리믹신, 클로르암페니콜, 네오마이신, 파라모모마이신, 콜리스티메테이트, 박시트라신, 반코마이신, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 리팜핀, 시클로세린, 베타-락탐, 세팔로스포린, 암포테리신, 플루코나졸, 플루시토신, 나타마이신, 미코나졸, 케토코나졸, 코르티코스테로이드, 디클로페낙, 플루르비프로펜, 케토롤락, 수프로펜, 코몰린, 로독사미드, 레보카바스틴, 나파졸링, 안타졸린 및 페니라미만으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.