KR101839582B1

KR101839582B1 - 왕겨 추출물을 포함하는 세포 활성화용 조성물 및 세포 활성화 방법

Info

Publication number: KR101839582B1
Application number: KR1020160086002A
Authority: KR
Inventors: 서영권; 박정극; 윤희훈; 김유미; 권순정; 조상은; 장현준
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2018-03-16
Also published as: KR20180005838A

Abstract

본 발명은 왕겨 추출물을 포함하는 세포 활성화용 조성물 및 이의 세포 활성화 방법에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 천연물로 유래된 오르토규산을 포함하며, 체내에서 세포 및 장기에 독성을 유발시키지 않아 생체적합성이 우수하며, 건강보조식품 또는 조직 치료를 위한 보조수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

왕겨 추출물을 포함하는 세포 활성화용 조성물 및 세포 활성화 방법 {Composition for activating cell comprising bran extracts and Method of cell activation}

본 발명은 왕겨 추출물을 포함하는 세포 활성화용 조성물 및 이의 세포 활성화 방법에 관한 것이다.

미네랄은 인체에 꼭 필요한 5대 필수 영양소 중 하나로, 우리 몸에서 차지하는 비율이 4%에 지나지 않지만 체내에서 생성되지 않으므로 따로 음식을 통해 섭취해야 한다. 미네랄은 총 16가지의 영양소로 이루어져 있는데, 필수 미네랄과 미량 미네랄로 나눠지며, 일일 섭취량이 100mg 이상인 영양소를 필수 미네랄, 100mg 미만인 영양소를 미량 미네랄이라고 한다. 이때, 필수 미네랄에는 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 나트륨, 인, 황, 염소가 있으며, 미량 미네랄에는 요오드, 구리, 코발트, 철, 아연, 셀레늄, 크롬, 몰리브덴, 망간 등이 있다. 미네랄은 우리 몸의 대사활동에 중요한 영향을 미치며, 이 중 규소 화합물의 다양한 질병에 대한 치료 효과에 관한 연구가 이루어져왔다.

특히, 합성된 오르토규산 (orthosilicic acid, Si(OH)₄)은 골형성 촉진(Duivenvoorden WC et al, J Trace Elem Med Biol, 22:215-23, 2008, Reffitt DM, Bone, 32:127-35, 2003, Calomme M et al, Calcif Tissue Int, 78:227-32, 2006, Spector TD et al, BMC Musculoskelet Disord, 9:85, 2008, Dong M et al, Biol Trace Elem Res, 2016), 피부 궤양 치료(Barel A et al, Arch Dermatol Res, 297:147-53, 2005, Grotheer V et al, Biomaterials, 34:7314-27, 2013), 연골 치료(Calomme MR et al, Biol Trace Elem Res, 56:153-65, 1997) 등에 대하여 연구되고 있다.

오르토규산은 불멸화 골세포주 (Saos-2, hFOB)의 성장을 촉진시키고 분화 및 부착력을 증가시킨다는 연구결과가 있으며(Duivenvoorden WC et al, J Trace Elem Med Biol, 22:215-23, 2008), 다른 불멸화 골세포주 (MG-63, HCC1)를 이용한 연구에서는 제 1형 콜라겐의 합성과 골분화(osteoblastic differentiation)를 촉진시킨다는 것이 발표되었다(Reffitt DM, Bone, 32:127-35, 2003). 또한, 난소가 적출된 골다공증 쥐(ovariectomized rat, OVX) 모델을 통해 오르토규산의 구강섭취가 대퇴부 골소실 방지에 효과적임을 밝혔으며(Calomme M et al, Calcif Tissue Int, 78:227-32, 2006), 임상연구에서 칼슘과 비타민D를 섭취한 대조군 대비 칼슘과 비타민D를 오르토규산과 같이 섭취한 실험군에서 골밀도가 현저히 증가하였음이 보고되었다(Spector TD et al, BMC Musculoskelet Disord, 9:85, 2008).

골 관련 연구 외에, 오르토규산의 섭취가 연골 내 콜라겐 밀도를 높이고 혈청 내 칼슘농도를 증가시킨다는 것을 관찰하여 오르토규산이 세포외기질의 형성과 칼슘대사에 관여한다는 것이 연구되었으며(Calomme MR et al, Biol Trace Elem Res, 56:153-65, 1997), 임상시험에서는 오르토규산의 섭취는 진피 내 하이드록시프롤린 (hydroxyproline)의 농도를 증가시켜 피부의 물성, 모발과 손톱의 경도 등을 증가시키는 것이 보고됨(Barel A et al, Arch Dermatol Res, 297:147-53, 2005)으로써 오르토규산의 섭취가 피부 및 연골에도 효과적임이 확인되었다. 또한 오르토규산이 염증과 세포사멸인자 등을 억제하여 상처 치료에 효과가 있다는 것이 알려져 다양한 조직의 치료에 효과가 있음이 확인되었다(Grotheer V et al, Biomaterials, 34:7314-27, 2013).

또한, 규산염 (SiO₂/SiO₃)의 경우, 규산염 용액 (Na₂SiO₃)이 주름 개선, 노화 방지 및 모발 성장 촉진용 화장료 등에 첨가물로 이용(한국등록특허 10-1249889호 참조)되고 있으며, 규산염 광물 용출 성분 (SiO₂, Al₂O₃, Fe₂O₃, CaO, MgO, K₂O, Na₂O, MnO, TiO₂, P₂O₅ 등)은 창상치료제 첨가물, 모발 성장 촉진제 및 면역조절 작용을 하는 항암제 등에 이용되고 있다.

다만, 오르토규산은 단일 성분으로 존재하고, 상기 규산염 광물로부터 추출된 불용성 규산염 (SiO₂/SiO₃) 성분은 세포 및 장기에 독성을 유발할 수 있는 문제점이 있다. 이에, 세포에 독성을 유발하지 않는 무기물 혹은 미네랄에 대한 연구가 이루어지고 있지만, 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 다양한 세포의 활성 효과를 갖는 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 왕겨 추출물에 세포 활성 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 활성화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 세포에 처리하고, 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포 활성화 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 활성화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 세포는 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 및 모유두세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포가 외측모근초세포인 경우, 상기 조성물은 제 4형 콜라겐 (type4 collagen) 또는 라미닌 (laminin)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포가 멜라닌세포인 경우, 상기 조성물은 TRP-1 (Tyrosinase-related protein-1), Tyrosinase, MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) 또는 P-CREB (Phosphorylated-cAMP response element-binding protein)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포가 섬유모세포인 경우, 상기 조성물은 제 1형 콜라겐 (type1 collagen), 엘라스틴(elastin), 버시칸 (versican) 또는 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포가 유두세포인 경우, 상기 조성물은 제 1형 콜라겐 (type1 collagen) 또는 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시킬 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 세포에 처리하고, 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포 활성화 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포는 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 및 모유두세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 왕겨 추출물을 포함하는 세포 활성화용 조성물 및 이의 세포 활성화 방법에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 천연물로 유래된 수용성 규산을 포함하며, 체내에서 세포 및 장기에 독성을 유발시키지 않아 생체적합성이 우수하며, 건강보조식품 또는 조직 치료를 위한 보조수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 열수추출(H) 및 NaOH추출(N)로 추출된 왕겨 추출물을 외측모근초세포에 투여 72시간 후 세포생존도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 열수추출(H) 및 NaOH추출(N)로 추출된 왕겨 추출물을 각질형성세포에 투여 72시간 후 세포생존도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 HCl을 용매로 추출된 왕겨 추출물(A) 또는 EtOH을 용매로 추출된 왕겨 추출물(B)을 골세포주에 투여 72시간 후 세포생존도를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 Si(OH)₄을 포함하는 왕겨 추출물 또는 SiO₂/SiO₃을 포함하는 규산염의 세포독성을 확인하는 도이다.
도 5은 외측모근초세포에 물질투여 72시간 후 제 4형 콜라겐(type4 collagen)과 라미닌(laminin) 단백질의 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 멜라닌세포에 물질투여 72시간 후 TRP-1 (Tyrosinase-related protein-1), Tyrosinase, MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) 및 P-CREB (Phosphorylated-cAMP response element-binding protein) 단백질의 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 섬유모세포에 물질투여 72시간 후 제 1형 콜라겐(type1 collagen)과 엘라스틴(elastin), 버시칸(versican), 피브로넥틴(fibronectin) 단백질의 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 모유두세포에 물질투여 72시간 후 제 1형 콜라겐(type1 collagen)과 피브로넥틴(fibronectin) 단백질의 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다.

본 발명자들은, 실시예에서 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 및 모유두세포에 왕겨 추출물을 처리한 경우, 상기 세포들을 활성화 시킬 수 있다는 점에 기반하여 왕겨 추출물의 세포독성 및 세포 내 특정 단백질 발현 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 활성화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 세포는 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 또는 모유두세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 조성물은 제 4형 콜라겐 (type4 collagen), 라미닌 (laminin), TRP-1 (Tyrosinase-related protein-1), Tyrosinase, MITF (Microphthalmia-associated transcription factor), P-CREB (Phosphorylated-cAMP response element-binding protein), 제 1형 콜라겐 (type1 collagen), 엘라스틴(elastin), 버시칸 (versican) 또는 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현을 증가시킬 수 있으나, 상기의 단백질에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 왕겨를 소각하는 단계; 소각된 왕겨를 물 또는 유기용매를 첨가하여 교반하는 단계; 상기 용액으로부터 여과 매체를 통해 왕겨재를 회수하고 추출 용액을 얻는 단계; 상기 왕겨재가 회수된 추출 용액을 가열 또는 원심분리하는 단계; 및 상기 가열 또는 원심분리된 추출물을 멸균하여 왕겨 추출물을 수집하는 단계를 포함하는, 왕겨 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 왕겨 추출물은 용매 추출물로, 당업계에 공지된 천연으로부터 추출물을 수득하는 방법이라면 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 유기용매를 첨가하여 가용 추출하는 방법을 통해 수득할 수 있다.

상기 왕겨에 물이나 유기용매를 첨가하여 추출하는 과정은 교반 또는 방치 등의 방법으로 수행될 수 있는데, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법 또는 초음파 추출법 등을 1회 또는 수회 반복하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출법으로 수행될 수 있고, 이로써 불용성 SiO₂ 및 SiO₃의 용출을 최소화할 수 있다.

이때 첨가할 수 있는 상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 또는 메틸렌클로라이드 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다.

본 발명 왕겨 추출물은 유기물이 제거되고, 미네랄을 다수 포함할 수 있으며, 상기 미네랄은 K, Na, Mg, Ca, 및 P일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 세포는 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 또는 모유두세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 “외측모근초세포”는 상피성 모낭을 이루는 세포로, 모근초의 바깥에 위치하며, 모발의 성장과 발육을 돕고 모발을 보호하는 역할을 한다.

본 발명의 “멜라닌세포”는 신경능에서 기원한 세포로서 멜라닌을 생성하여 피부를 자외선으로부터 보호하는 역할을 한다.

본 발명의 “섬유아세포”는 동물 조직을 위한 스트로마인 세포외기질과 콜라겐을 합성하는 세포의 일종으로, 상처 치유에 중요한 역할을 한다.

본 발명의 “모유두세포”는 모모세포와 함께 모낭의 기초부를 형성하는 세포로, 모세혈관에서 영양을 빨아들여, 모모세포와 상호작용을 통해 모발을 형성 및 성장하게 하는 역할을 한다.

본 발명의 일실시예에서는, 왕겨 추출물의 세포 활성화 효과를 확인하기 위해, 왕겨 추출물의 세포 내 주요 단백질 발현을 확인한 결과, 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 및 모유두세포에 왕겨 추출물 처리 시, 왕겨 추출물을 처리하지 않은 세포에 비하여 우수한 단백질 발현 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다(실시예 3 참조).

따라서, 본 발명에 따른 왕겨는 세포 내 단백질 발현을 증가시켜 세포 활성 효과를 갖는 바, 상기 세포의 활성 효과가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명은 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 모발성장촉진 또는 탈모방지용 조성물을 제공하고, 본 발명의 조성물은 외측모근초세포 또는 모유두세포를 활성화 시켜 모발 성장을 촉진시키고 탈모를 예방할 수 있다.

또한, 본 발명은 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 조성물을 제공하고, 본 발명의 조성물은 멜라닌세포 또는 섬유아세포를 활성화 시켜 피부 멜라닌생성 촉진 효과를 나타내고, 노화를 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 건강기능식품 조성물로도 사용될 수 있고, 이 경우, 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강음료용 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 세포 배양

외측모근초세포와 각질형성세포는 소뇌하수체 추출물 (bovine pituitary extract, Thermo Fisher Scientific) 및 재조합 내피세포 증식 인자 단백질 (EGF recombinant human protein, Thermo Fisher Scientific)을 첨가한 K-SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였으며, 멜라닌아세포는 HMGS-2를 첨가한 M254 배지 (Invitrogen, Waltham, USA)에서, 인간섬유아세포 및 인간모유두세포는 우태아혈청(Fetal bovine serum, JRS)을 10% 첨가한 배지 (DMEM High glucose, Welgene)에서 각각 배양하였다. 상기 각 세포는 배양접시에 배양 후 2일마다 배지를 교환해 주면서 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 배양하였다.

상기 멜라닌아세포의 경우, 물질투여 전 멜라닌세포로 분화시켰으며, 배양배지에 α-MSH (alpha-Melanocyte Stimulating Hormone, sigma aldrich) 10 nM, TPA (12-OTetradecanoyl-phorbol-13-acetate, sigma aldrich) 10 nM 및 Forskolin(sigma aldrich) 20 μM를 첨가하고, 3일간 배양하며 분화유도 하였다.

1-2. 시약

본 발명에서는 기존의 제품화된 오르토규산의 효능을 대표하는 양성대조군으로서 순수한 Si(OH)₄를 합성한 Biosil (natural factors, USA) 제품을 사용하였다.

1-3. 왕겨 추출물의 추출 및 성분 분석

1-3-1. 열수 추출

소각된 왕겨 200 g과 3차 증류수 1000 ml를 계량하여 교반기에 넣고 교반시킨 뒤 100 ℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이에 한번 거른 후 가열하여 최종 100 ml까지 농축한 뒤 0.2 μm 필터로 멸균하였다.

1-3-2. 에탄올 (EtOH) 추출

소각된 왕겨 200 g과 EtOH 1000 ml를 계량하여 교반기에 넣고 교반시킨 뒤 100 ℃에서 24시간 에탄올추출 하였다. 거즈를 통해 왕겨 재를 제거한 뒤 추출 용액을 거름종이에 거른 후 가열하여 최종 100 ml까지 농축한 뒤 0.2 μm 필터로 멸균하였다.

1-3-3. 산 (HCl) 추출법

소각된 왕겨 200 g과 1N HCl 1000 ml를 계량하여 교반기에 넣고 교반시킨 뒤 100 ℃에서 24시간 HCl 추출 하였다. 거즈를 통해 왕겨 재를 제거한 뒤 추출물을 거름종이에 걸러 걸러진 응집물을 수집하였다. 응집물을 비커에 모아 700‘C 2시간 가열하여 얻은 추출물 0.5 g을 100 ml PBS에 녹인 후 0.2 μm 필터로 멸균하였다.

1-3-4. NaOH 추출법

소각된 왕겨 200 g과 3차 증류수 1000 ml를 계량하여 교반기에 넣고 100 ℃에서 3시간동안 교반시켰다. 거즈를 통해 왕겨재를 회수한 뒤 5 g을 취해 40% NaOH 100 ml과 섞어 10시간 이상 상온교반 후 거즈를 통해 왕겨를 제거 하였고, HCl로 적정하여 PH 7을 맞추었다. 원심분리하여 얻은 추출물 0.5g을 가라앉혀 건조시킨 뒤 3차 증류수 100 ml에 넣어 녹여 0.2 μm 필터로 멸균하였다.

1-3-5. 왕겨 추출물의 성분 분석

한국화학융합시험연구원에서 상기 왕겨 추출물의 분석 결과, 하기 표 1과 같이 유기물은 제거되고, 다양한 규산염 성분과 Si, Ca, Mg, K, Na, P 등의 미네랄 성분이 존재하는 것을 확인하였다.

시험항목	단위	결과치	시험방법
Si	mg/kg	180	EPA 3050B, 6010D
Ca	mg/kg	5	EPA 3050B, 6010D
Mg	mg/kg	17	EPA 3050B, 6010D
K	mg/kg	2930	EPA 3050B, 6010D
Na	mg/kg	113	EPA 3050B, 6010D
P	mg/kg	300	EPA 3050B, 6010D

- 수용액 1kg당 들어있는 물질의 mg

1-4. MTT 분석

외측모근초세포 및 각질형성세포의 경우, 48-well 디쉬에 웰당 1×10⁴ cell을 접종한 뒤, 왕겨 열수추출물 및 왕겨 NaOH 추출물을 각각 농도별 (5 μl/ml, 25 μl/ml, 50 μl/ml, 125 μl/ml 및 250 μl/ml)로 투여한 후, 상기 조건에서 72시간 배양 후 물질투여 없이 배양한 세포를 음성대조군으로 하여 세포 생존도 분석 (MTT, thiazolyl blue tetrazolium bromide) 을 진행하였다.

골세포주의 경우, 상기와 동일한 방법으로 왕겨 HCl 열추출물 및 왕겨 EtOH 추출물을 각각 농도별 (10 μl/ml, 20 μl/ml, 50 μl/ml, 100 μl/ml 및 200 μl/ml)로 투여한 후, 상기 조건에서 72시간 배양 후 물질투여 없이 배양한 세포를 음성대조군으로 하여 세포 생존도 분석 (MTT, thiazolyl blue tetrazolium bromide) 을 진행하였다.

섬유아세포의 경우, 상기와 동일한 방법으로 Si(OH)₄ 를 포함하는 왕겨 열추출물 및SiO₂/SiO₃를 각각 농도별 (5 μl/ml, 10 μl/ml, 25 μl/ml, 50 μl/ml 및 100 μl/ml)로 투여한 후, 상기 조건에서 72시간 배양 후 물질투여 없이 배양한 세포를 음성대조군으로 하여 세포 생존도 분석 (MTT, thiazolyl blue tetrazolium bromide) 을 진행하였다.

실시예 2. 왕겨 추출물의 세포독성 확인

상기 실시예 1에서 배양한 각 세포에 대한 왕겨 추출물의 세포독성 시험을 위하여 실시예 1-4와 같이 실험하였다.

그 결과, 외측모근초세포의 경우, 도 1에 나타낸 바와 같이, 왕겨 NaOH 추출물 투여군(N)에서 5 μl/ml 농도부터 독성이 있는 것으로 확인되었고, 왕겨 열수추출물 투여군(H)은 50 μl/ml 농도부터 독성을 나타내는 것으로 관찰되어 NaOH 추출물이 독성이 강한 것을 확인하였으며, 각질형성세포의 경우 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 왕겨 NaOH 추출물 투여군(N)에서 5 μl/ml 농도부터 독성이 있는 것으로 확인되었고, 왕겨 열수추출물 투여군(H)은 50 μl/ml 농도부터 독성을 나타내는 것으로 관찰되어 NaOH 추출물이 독성이 강한 것을 확인하였다(H = 왕겨 열수 추출물, N = 왕겨 NaOH 추출물). 또한, 골세포주의 경우, 도 3에 나타낸 바와 같이, 왕겨 HCl 열처리물 투여군에서는 10 μl/ml 이상의 농도부터 독성이 있는 것으로 확인되었으며(도 3A), 왕겨 EtOH 추출물 투여군에서는 4 μl/ml 농도부터 독성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 3B).

나아가, 왕겨 추출물의 경우, 도 4에 나타낸 바와 같이, SiO₂ 및 SiO₃을 포함하는 규산염에 비하여 낮은 독성을 나타내는 것으로 확인되었다.

이러한 결과는, 왕겨 추출물이 일반적으로 규산염 광물이 포함하고 있는 독성을 띠는 불용성 SiO₂, SiO₃이 아닌, Si(OH)₄를 포함한 수용성 규산 화합물을 다량 포함하고, 특히 열수 추출시, 상기의 불용성 SiO₂, SiO₃이 최소로 포함될 수 있음을 시사하고 있다.

실시예 3: 왕겨 추출물의 처리에 따른 세포 활성 평가

상기 실시예 1에서 배양한 각 세포에 왕겨 추출물을 처리하는 경우, 세포 활성에 어떠한 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

외측모근초세포 및 멜라닌세포의 경우, 배양된 각 세포를 100 mm 디쉬에 웰당 3×10⁵ cell을 접종한 뒤, 이에 바이오실 (Biosil, natural factors, USA, 12 nl/ml) 또는 왕겨 열수추출물(30 μl/ml)을 투여하고, 상기조건에서 72시간 배양 후 세포를 회수하여 단백질 발현 분석을 진행하였으며, 물질투여 없이 배양한 세포를 음성대조군으로 하였다. 이때, 외측모근초세포는 아스코르빈산 (ascorbic acid, sigma aldrich, 50 μM)을 첨가한 후 배양한 세포를, 멜라닌세포는 멜라닌세포자극 호르몬인 MSH (melanocyte stimulating hormone, 5 nM)를 첨가한 후 배양한 세포를 각각 양성대조군으로 사용하였다.

인간섬유아세포 및 인간모유두세포의 경우, 배양된 세포를 6-well 플레이트에 웰당 1×10⁵ cell을 접종한 뒤, 각 실험군당 2배수 실험을 실시하였다. 인간섬유아세포의 경우, 바이오실 (Biosil, natural factors, USA, 12 nl/ml) 및 왕겨 열수추출물(30 μl/ml)을 투여하고, 인간모유두세포의 경우, 합성규소화합물(15 μl/ml)을 추가로 투여하였다. 상기조건에서 72시간 배양 후 세포를 회수하여 단백질 발현 분석을 진행하였으며, 물질투여 없이 배양한 세포를 음성대조군으로 하고, 비타민 C (L-ascorbic acid2-phosphate, 50 μM)를 첨가한 후 배양한 세포를 양성대조군으로 사용하였다.

3-1. 외측모근초세포

외측모근초세포의 경우, 도 5에 나타낸 바와 같이, 외측모근초세포에 물질투여 72시간 후, 모든 실험군 및 대조군에서 제 4형 콜라겐 (type4 collagen) 및 라미닌 (laminin) 발현을 확인 할 수 있었고, 대조군과 비교했을 때, 바이오실 (BS) 또는 왕겨 추출물 투여 실험군에서 특히 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는, 바이오실 (BS) 및 왕겨 추출물이 외측모근초세포의 활성을 증가시키고 있음을 보여준다.

3-2. 멜라닌세포

멜라닌세포의 경우, 도 6에 나타낸 바와 같이, 멜라닌세포에 물질투여 72시간 후, 모든 실험군 및 대조군에서 TRP-1 (Tyrosinase-related protein-1), Tyrosinase, MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) 및 P-CREB (Phosphorylated-cAMP response element-binding protein)의 발현을 확인할 수 있었고, 대조군과 비교했을 때, 특히 왕겨 추출물 투여 실험군에서 상기 TRP-1, Tyrosinase 및 MITF 단백질의 발현이 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는, 왕겨 추출물이 멜라닌세포의 활성을 증가시키고 있음을 보여준다.

3-3. 인간섬유아세포

섬유모세포의 경우, 도 7에 나타낸 바와 같이, 섬유모세포에 물질투여 72시간 후, 모든 실험군 및 대조군에서 제 1형 콜라겐 (type1 collagen), 엘라스틴(elastin), 버시칸 (versican) 및 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현을 확인할 수 있었고, 대조군과 비교했을 때, 특히 왕겨 추출물 투여 실험군에서 제 1형 콜라겐, 엘라스틴 및 버시칸 단백질의 발현이 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는, 왕겨 추출물이 인간섬유아세포의 활성을 증가시키고, 특히 엘라스틴과 버시칸의 발현에 있어 왕겨 추출물의 효과가 우수하다는 것을 시사하고 있다.

3-4. 인간모유두세포

모유두세포의 경우, 도 8에 나타낸 바와 같이, 모유두세포에 물질투여 72시간 후, 모든 실험군 및 대조군에서 제 1형 콜라겐 (type1 collagen) 및 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현을 확인할 수 있었고, 대조군과 비교했을 때, 바이오실 (BS) 또는 왕겨 추출물 투여 실험군에서 특히 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는, 바이오실 (BS) 및 왕겨 추출물이 인간모유두세포의 활성을 증가시키고, 특히 제 1형 콜라겐에서 바이오실과 비슷한 효과를 나타낸다는 것을 시사하고 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

오르토규산(orthosilicic acid)이 함유된 왕겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 조성물은 탈모방지, 발모촉진, 멜라닌생성촉진 또는 피부노화방지의 용도인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 조성물로서,
상기 세포는 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 및 모유두세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 세포가 외측모근초세포인 경우, 상기 조성물은 제 4형 콜라겐 (type4 collagen) 또는 라미닌 (laminin)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 세포가 멜라닌세포인 경우, 상기 조성물은 TRP-1 (Tyrosinase-related protein-1), Tyrosinase, MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) 또는 P-CREB (Phosphorylated-cAMP response element-binding protein)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 세포가 섬유모세포인 경우, 상기 조성물은 제 1형 콜라겐 (type1 collagen), 엘라스틴(elastin), 버시칸 (versican) 또는 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 세포가 모유두세포인 경우, 상기 조성물은 제 1형 콜라겐 (type1 collagen) 또는 피브로넥틴 (fibronectin)의 발현을 증가시킴으로써 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항의 조성물을 세포에 처리하고, 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포 활성화 방법.
제7항에 있어서,
상기 세포는 외측모근초세포, 멜라닌세포, 섬유모세포 및 모유두세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.