KR101823872B1 - 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법 - Google Patents

생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101823872B1
KR101823872B1 KR1020127003948A KR20127003948A KR101823872B1 KR 101823872 B1 KR101823872 B1 KR 101823872B1 KR 1020127003948 A KR1020127003948 A KR 1020127003948A KR 20127003948 A KR20127003948 A KR 20127003948A KR 101823872 B1 KR101823872 B1 KR 101823872B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
protein
template
mutant
human
Prior art date
Application number
KR1020127003948A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120069664A (ko
Inventor
제이 밀톤 쇼트
Original Assignee
바이오아트라, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오아트라, 엘엘씨 filed Critical 바이오아트라, 엘엘씨
Publication of KR20120069664A publication Critical patent/KR20120069664A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101823872B1 publication Critical patent/KR101823872B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Abstract

본 출원은, 단일 시스템으로 제조하기 위해 진핵세포 숙주에서 치료 단백질과 항체 생성 및/또는 선택, 진화, 및 발현을 통합하는 방법을 제공한다. 항체를 포함하는 치료 단백질은 동일한 진핵세포 숙주 시스템에서 생성되고, 최적화되며, 제조된다. 포괄적인 통합 항체 최적화(CIAO!TM)의 기재된 시스템은 단백질 성능과 발현 최적화의 동시 진화를 허용한다.

Description

생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법{SIMULTANEOUS, INTEGRATED SELECTION AND EVOLUTION OF ANTIBODY/PROTEIN PERFORMANCE AND EXPRESSION IN PRODUCTION HOSTS}
본 출원은 미국을 제외한 모든 국가를 지정하기 위한 출원인인 미국 국내 법인 BioAtIa, LLC의 명칭으로, 미국만을 지정하기 위한 출원인인 미국 국적의 제이 밀톤 쇼트(Jay Milton Short)의 명칭으로 PCT 국제 특허 출원으로 2010년 7월 16일자로 출원되고, 2009년 7월 17일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/271,168호에 대한 우선권을 청구하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
기술 분야
특별한 양상에서, 본 발명은 단백질에 관한 것이고, 단백질 진화(protein evolution)에 의해 단백질의 최적화에 관한 것이다. 단백질 치료제는 동일한 유전 시스템을 사용하여 동일 숙주에서 발견되고, 진화되며, 제조된다.
후보 단백질 치료 분자를 생성하는 각종의 항체 및 기타 단백질 시스템이 설계되고, 개발되어 시행되어 왔다. 보다 최근에, 많은 진화 시스템이 개발되어 단백질의 기능을 향상시켜왔다. 별도로, 포유동물 발현 시스템이 치료 적용을 위한 항체 및 다른 단백질의 고 수율 생산을 위해 개발되어 왔다. 지금까지, 단일의 효율적인 포유동물 발현 시스템에서 항체 또는 단백질의 생성, 진화, 및 단백질 생산/제조가 가능하도록 하는 시스템을 개발한 그룹은 없었다.
많은 항체가 세균에서 세균 파아지 디스플레이 시스템을 사용하여 개발되어 있지만, 완전한 길이의 항체의 발현은 주로 포유동물 세포 내에서 수행된다. 이러한 유사성의 결여는 발현용 클론의 진화 또는 선택을 불가능하도록 한다. 추가 장벽은 전통적인 기술을 사용하여 스크리닝될 다수의 변이체에 대한 전통적인 요건을 포함하며 고 수준의 포유동물 발현 시스템은 발현을 위해 최적화되어 왔지만, 다수의 변이체의 클로닝을 위해서는 최적화되어 있지 않다. 통합 항체/단백질 선택, 진화 및 포유동물 발현 시스템은 이전에 설계되어 있지 않다. 최적화된 포유동물 숙주 세포의 내부의 항체/단백질의 비-확률적인 진화과 결합된, 다수를 처리하기 위한 포유동물 세포 내 표면 디스플레이의 사용은 성공 가능성을 증가시키고 제조시 요구되는 포유동물 세포 내에서 충분히 높은 수준으로 발현할 최적화된 항체/단백질을 생성하기 위한 공정을 크게 가속화시킨다.
본 발명은, 단일 시스템으로 제조하기 위해, 포유동물 세포 숙주 또는 효모 세포 숙주와 같은 진핵세포 숙주에서 치료 단백질(항체 포함) 생성 및/또는 선택, 진화 및 발현을 통합하는 방법을 제공한다. 항체를 포함하는 치료 단백질은 동일한 진핵 세포 숙주 시스템에서 생성되고, 최적화되며 제조된다. 포괄적인 통합 항체 최적화(CIAO!TM)의 기재된 시스템은 단백질 성능과 발현 최적화의 동시 진화를 허용한다.
일 실시예에서, 기재내용은 포유동물 세포 생산 숙주에서 항체의 선택, 진화 및 발현 방법; 항체 세포 표면 디스플레이를 사용하여 포유동물 세포 생산 숙주에서 항-항원 항체 라이브러리(library)를 생성하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 라이브러리를 스크리닝하며; 라이브러리로부터 템플릿 항체(template antibody)를 선택하고; 템플릿 항체를 진화시켜 항체 세포 표면 디스플레이를 갖는 포유동물 CHO 세포주(cell line)에서 돌연변이체 항체 세트를 생산하며; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 항체를 스크리닝하며; 템플릿 항체와 비교시 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화를 기준으로 돌연변이체 항체 세트로부터 상향-돌연변이체(up-mutant) 항체를 선택하고; 생성 단계에서 사용된 것과 동일한 포유동물 CHO 세포주에서 상향-돌연변이체 항체를 발현시킴을 포함하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 항체는 미리 선택된다. 다른 측면에서, 항-항원 항체 라이브러리는 인간화 항-항원 항체 라이브러리이다.
일 측면에서, 포유동물 세포 생산 숙주는 3T3 마우스 섬유모세포 세포; BHK21 시리안 햄스터(Syrian hamster) 섬유모세포 세포; MDCK, 개 상피 세포; 헬라(HeIa) 인간 상피 세포; PtKl 랫트 캥거루 상피 세포; SP2/0 마우스 혈장 세포; 및 NSO 마우스 마우스 혈장 세포; HEK 293 인간 배아 신장 세포; COS 원숭이 신장 세포; CHO, CHO-S 차이니즈 햄스터(Chinese hamster) 난소 세포; Rl 마우스 배아 세포; E14.1 마우스 배아 세포; Hl 인간 배아 세포; H9 인간 배아 세포; PER C.6, 인간 배아 세포; 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 효모 세포; 또는 피키아(picchia) 효모 세포 중에서 선택된다. 특별한 측면에서, 포유동물 시스템은 CHO-S 또는 HEK293이다. 일 측면에서, 스크리닝 단계는 형광성-활성화된 세포 분류(FACS)를 이용한다.
다른 측면에서, 진화 단계는 m개의 상보성 결정 영역들(CDRs)을 가진 템플릿 항체로부터 형성된 돌연변이체 항체 세트를 생산하는 단계를 포함하며, 여기서, m은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중에서 선택된 정수이고, 각각의 상기 m개의 CDR들은 n개의 아미노산 잔기들을 포함하며, 상기 방법은 n개의 개별 항체 세트를 생성하고, 각각의 세트는 CDR들의 단일의 미리 결정된 위치에서 X개 구성원의 서로 상이한 미리 결정된 아미노산 잔기들을 갖는 구성원 항체(member antibody)를 포함하며; 여기서, 각각의 항체 세트는 단일의 미리 결정된 위치에서 상이하고; 생성된 상이한 구성원 항체의 수는 n×X와 동등하다. 특정한 측면에서, m은 6이다.
일 측면에서, 상기 템플릿 항체는 n개의 아미노산 잔기들을 갖고 상기 진화 단계는 템플릿 항체로부터 돌연변이체 폴리펩티드의 n-1개의 개별 세트를 포함하며, 각각의 세트는 폴리펩티드의 단일의 미리 결정된 위치에서 상이한 미리 결정된 아미노산 잔기의 X 구성원을 가진 구성원 폴리펩티드를 포함하며; 여기서, 각각의 폴리펩티드의 세트는 단일의 미리 결정된 위치에서 상이하고; 생성된 상이한 구성원 폴리펩티드의 수는 [n-1]×X과 동등하다. 일 측면에서, X는 템플릿 폴리펩티드의 제공된 위치에서 존재하지 않는 19개의 자연 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다.
다른 측면에서, 스크리닝 단계는 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 각각의 구성원 폴리펩티드를 분석하고; 템플릿 항체에 대한 구성원 폴리펩티드의 상기 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 특정 변화를 확인하며; 기능성 맵(functional map)(여기서, 기능성 맵은 템플릿 항체와 비교하여 상향-돌연변이체 및/또는 잠재 돌연변이(silent mutation)를 생성하는 돌연변이체 폴리펩티드내 위치 및 돌연변이를 확인하기 위해 사용된다)을 생성함을 포함한다.
다른 측면에서, 기능성 맵을 사용하여 (a) 템플릿 항체와 비교하여 돌연변이체 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치지 않는 위치 및 돌연변이; (b) 템플릿 항체와 비교하여 완전하게 돌연변이 가능한 부위; 및 (c) 템플릿 항체와 비교하여 상향-돌연변이체를 생성하는 위치 및 돌연변이를 확인한다.
다른 측면에서, 항체 단편은 중쇄, 경쇄, 가변 도메인, 고정 도메인, 초가변 영역, 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR3) 중에서 선택된다.
다른 측면에서, 생성 단계는 상기 템플릿 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 코돈(codon)을 돌연변이 유발시킬 각각의 코돈에 대해 64배 변성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제-계 증폭에 적용시키고, 여기서, 상기 64배 변성 올리고뉴클레오티드 각각은 제1의 동종 서열 및 변성 N,N,N 삼중 서열로 구성됨으로써 후대(progeny) 폴리뉴클레오티드의 세트를 생성하며; 상기 후대 폴리뉴클레오티드의 세트를 클론 증폭에 적용시킴으로써 후대 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드가 발현되도록 함을 포함한다.
청구항 1의 방법에서, 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성이 단백질-단백질 응집, 단백질 안정성의 향상, 증가된 단백질 가용성, 글리코실화 부위의 도입, 접합 부위의 도입, 면역원성의 감소, 단백질 발현의 향상, 항원 친화성에 있어서의 증가, 항원 친화성에 있어서의 감소, 결합 친화성에 있어서의 변화, 면역원성에 있어서의 변화, 또는 특이성의 향상 중에서 선택된다.
다른 실시예에서, 본원은 포유동물 CHO 세포주에서 항체의 진화 및 발현 방법을 제공하며; 당해 방법은 템플릿 항체를 선택하고; 템플릿 항체를 진화시켜 항체 세포 표면 디스플레이를 사용하여 포유동물 세포 생산 숙주에서 돌연변이체 항체 세트를 생산하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 항체를 스크리닝하며; 템플릿 항체와 비교하여 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화를 기준으로 돌연변이체 항체 세트로부터 상향-돌연변이체 항체를 선택하고; 진화 단계에서 사용된 동일한 포유동물 세포 생산 숙주에서 상향-돌연변이체 항체를 발현시킴을 포함한다.
일 측면에서, 스크리닝 단계는 기능성 맵을 생성함을 포함하며, 여기서, 기능성 맵은 템플릿 폴리펩티드와 비교하여 상향-돌연변이체 및/또는 잠재 돌연변이를 생성하는 돌연변이체 폴리펩티드내 위치 및 돌연변이를 확인하기 위해 사용된다. 다른 측면에서, 스크리닝 단계는 형광성-활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다.
일 측면에서, 포유동물 세포 생산 숙주는 3T3 마우스 섬유모세포 세포; BHK21 시리안 햄스터 섬유모세포 세포; MDCK, 개 상피 세포; HeIa 인간 상피 세포; PtKl 랫트 캥거루 상피 세포; SP2/0 마우스 혈장 세포; 및 NSO 마우스 마우스 혈장 세포; HEK 293 인간 배아 신장 세포; COS 원숭이 신장 세포; CHO, CHO-S 차이니즈 햄스터 난소 세포; Rl 마우스 배아 세포; E14.1 마우스 배아 세포; Hl 인간 배아 세포; H9 인간 배아 세포; 및 PER C.6, 인간 배아 세포 중에서 선택된다. 특수한 측면에서, 포유동물 시스템은 CHO-S 또는 HEK293이다. 다른 측면에서, 세포 생산 숙주는 CHOKlSV 또는 NSO 숙주 세포주로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 본원은 진핵 세포 생산 숙주에서 단백질의 진화 및 발현 방법을 제공하며; 당해 방법은 템플릿 항체를 선택하고; 템플릿 항체를 진화시켜 진핵 세포 생산 숙주에서 돌연변이체 항체 세트를 생산하며; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 항체를 스크리닝하고; 템플릿 항체와 비교하여 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화를 기준으로 돌연변이체 항체 세트로부터 상향-돌연변이체 항체를 선택하며; 어떠한 상업적 규모를 위해 진화 단계에서와 동일한 진핵 세포 생산 숙주에서 상향-돌연변이체 항체를 발현시킴을 포함한다.
일 실시예에서, 본원은 세포 생산 숙주에서 인간 단백질의 진화 및 제조 방법을 제공하며; 당해 방법은 CHO 세포주에서 인간 단백질 라리브러리를 생성하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 라이브러리를 스크리닝하며; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성을 기준으로 라이브러리로부터 템플릿 인간 단백질을 선택하며; 템플릿 인간 단백질을 진화시켜 CHO 세포주에서 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 생산하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 스크리닝하고 변형된 발현에 대해 스크리닝하며; (1) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화와, (2) 템플릿 인간 단백질과 비교하여 변형된 발현을 기준으로 돌연변이체 인간 단백질의 세트로부터 상향-돌연변이체 인간 단백질을 선택하며; 생성 단계에서와 동일한 CHO 세포주에서 상향-돌연변이체 인간 단백질을 발현시킴을 포함하여 인간 단백질을 제조함을 포함한다. 일 측면에서, 선택 단계에서 변형된 발현은 개선된 발현이다.
다른 측면에서, 진화 단계는 포괄적인 위치 진화(CPE); 포괄적인 위치 삽입 진화(CPI); 포괄적인 위치 결실 진화(CPD); 포괄적인 위치 진화(CPE)에 이은 조합적인 단백질 합성(CPS); 포괄적인 위치 결실 진화(CPD)에 이은 조합 단백질 합성(CPS); 또는 포괄적인 위치 결실 진화(CPD)에 이은 조합 단백질 합성(CPS) 중 하나로부터 선택된 진화 기술을 포함한다.
일 측면에서, 상기 템플릿 인간 단백질은 템플릿 인간 항체이다. 다른 측면에서, 상기 템플릿 인간 항체는 완전한 길이의 항체이다.
다른 측면에서, 스크리닝 단계(e)에서 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성은 상기 템플릿 인간 항체와 비교하여, (1) 잠재 돌연변이에 대한 스크리닝 및 (2) 미스센스(missense) 돌연변이에 대한 스크리닝 중 하나 이상을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 완전한 길이의 항체는 템플릿 인간 항체와 비교하여 상향-돌연변이 인간 항체를 발생시키기 위해 Fc 및 Fv; 골격(framework); 및 하나 이상의 CDR들로부터 선택된 하나 이상의 영역들에서 변형된다.
다른 측면에서, 스크리닝 단계는 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 스크리닝하고 동시에 변형된 발현에 대해 스크리닝하는 단계를 포함한다.
추가 측면에서, 진화 및 제조를 위한 템플릿 인간 단백질은 효소 사이토킨, 수용체, DNA 결합 단백질, 킬레이트제 또는 호르몬 중에서 선택된다.
다른 측면에서, 세포 생산 숙주는 진핵세포 생산 숙주이고 진화 단계는 템플릿 인간 단백질을 진화시켜 세포 표면 디스플레이를 사용하여 진핵세포 생산 숙주에서 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 생산하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본원은 진핵 세포 생산 숙주에서 인간 단백질의 향상된 발현 및 제조를 위한 진화 방법을 제공하며; 당해 방법은 진화를 위한 템플릿 인간 단백질을 선택하고; 템플릿 인간 단백질을 암호화하는 돌연변이체 코돈을 생성시켜 생산 숙주에서 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 생산하는 단계를 포함하는 템플릿 인간 단백질을 진화시키고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 스크리닝하며 템플릿 인간 단백질과 비교하여 향상된 발현에 대해 스크리닝하고; (1) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 보유 또는 최적화와, (2) 템플릿 인간 단백질과 비교하여 향상된 발현을 기준으로 돌연변이체 인간 단백질의 세트로부터 상향-돌연변이체 인간 단백질을 선택하며; 진화 단계에서와 동일한 생산 숙주에서 상향-돌연변이체 인간 단백질을 발현시킴을 포함하여 상향-돌연변이체 인간 단백질을 제조함을 포함한다.
일 측면에서, 상향-돌연변이체 인간 단백질의 돌연변이체 코돈은 적어도 하나의 잠재 돌연변이 및/또는 미스센스 돌연변이를 초래한다. 다른 측면에서, 상향-돌연변이체 인간 단백질의 돌연변이체 코돈은 적어도 하나의 잠재 돌연변이를 초래한다.
추가 측면에서, 템플릿 인간 단백질은 입증된 윤리적인 단백질 치료 약물이고, 상향-돌연변이체 인간 단백질은 바이오시밀러(biosimilar)이다.
다른 측면에서, 선택 단계는, (1) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화와, (2) 템플릿 인간 단백질과 비교하여 향상된 발현을 기준으로 돌연변이체 인간 단백질의 세트로부터 상향-돌연변이체 인간 단백질을 선택하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본원은 표적 인간 단백질을 확인하고 생산하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 단백질 세포 표면 디스플레이를 사용하여 진핵 세포 생산 숙주에서 인간 단백질 라이브러리를 생성하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 라이브러리를 스크리닝하며; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성을 기준으로 라이브러리로부터 표적 인간 단백질을 확인하고; 표적 인간 단백질을 생산하기 위한 생성 단계에서와 동일한 진핵 세포 생산 숙주에서 표적 인간 단백질을 발현시킴을 포함한다. 일 측면에서, 표적 인간 단백질은 항체이고, 또 다른 측면에서, 항체는 완전한 길이의 항체이다.
다른 실시예에서, 본원은 제조하는 숙주에서 인간 단백질의 진화 방법을 제공하며, 당해 방법은 템플릿 인간 단백질을 돌연변이시켜 제조하는 숙주에서 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 생산하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 후대 단백질의 세트를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 당해 방법은 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성을 기준으로 돌연변이체 인간 단백질의 세트로부터 상향-돌연변이체 인간 단백질을 선택함을 추가로 포함한다. 다른 측면에서, 당해 방법은 돌연변이 단계에서와 동일한 생산 숙주에서 상향-돌연변이체 인간 단백질을 발현시킴을 포함하여 상향-돌연변이체 인간 단백질을 제조함을 추가로 포함하며, 다른 측면에서, 선택 단계는 (1) 템플릿 인간 단백질과 비교하여 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화, 및 (2) 템플릿 인간 단백질과 비교하여 변형된 발현을 기준으로 돌연변이체 인간 단백질의 세트로부터 상향-돌연변이체 인간 단백질을 선택함을 추가로 포함한다. 일 측면에서, 변형된 발현은 향상된 발현이다.
다른 실시예에서, 본원은 세포 제조 숙주에서 인간 단백질의 진화 및 제조 방법을 제공하며; 당해 방법은 템플릿 인간 단백질을 돌연변이시켜 제조 숙주에서 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 생산하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 스크리닝하며 변형된 발현을 스크리닝하고; (1) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화, 및 (2) 템플릿 인간 단백질과 비교하여 변형된 발현을 기준으로 돌연변이체 인간 단백질의 세트로부터 상향-돌연변이체 인간 단백질을 선택하고; 돌연변이 단계에서와 동일한 제조 숙주에서 상향-돌연변이체 인간 단백질을 발현시킴을 포함하여 인간 단백질을 제조함을 포함한다.
추가 실시예에서, 본원은 진핵 세포 생산 숙주에서 인간 단백질의 향상된 발현 및 제조를 위한 진화 방법을 제공하며; 당해 방법은 템플릿 인간 단백질을 암호화하는 돌연변이체 코돈을 생성하여 제조하는 숙주에서 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 생산하는 단계를 포함하여 템플릿 인간 단백질을 돌연변이화하고; 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 스크리닝하며 템플릿 인간 단백질과 비교하여 향상된 발현에 대해 스크리닝하고; (1) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 보유 또는 최적화와, (2) 템플릿 인간 단백질과 비교하여 향상된 발현을 기준으로 돌연변이체 인간 단백질의 세트로부터 상향-돌연변이체 인간 단백질을 선택하며; 돌연변이 단계에서와 동일한 제조 숙주에서 상향-돌연변이체 인간 단백질을 제조함을 포함한다.
일 측면에서, 스크리닝 단계는 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이체 인간 단백질의 세트를 스크리닝하고 동시에 향상된 발현에 대해 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명은, 포유동물 세포 숙주 또는 효모 세포 숙주와 같은 진핵세포 숙주에서 치료 단백질(항체 포함) 생성 및/또는 선택, 진화 및 발현을 통합하는 방법을 제공하는 효과를 갖는다.
도 1은, 단일 시스템에서 제조하기 위해, 포유동물 세포 숙주 또는 효소 세포 숙주와 같은 진핵 세포 숙주에서 치료 단백질(예를 들어, 항체) 생성 및/또는 선택, 진화 및 발현을 통합하는 CIAO!TM 방법의 개략도를 제공한다.
도 2는, 포괄적인 위치 진화(CPETM)을 사용하여 분자 특이적인 데이터베이스(EvoMapTM)를 생성하는 방법을 나타낸다.
도 3은, CPETM로부터 상향-돌연변이체를 결합시키기 위해 사용될 수 있는 포괄적인 위치 합성(CPSTM)의 개략도를 나타낸다.
도 4는, 포괄적인 위치 삽입(CPITM) 진화의 개략도를 나타낸다.
도 5는, 진화 방법의 하나의 조합을 나타내며: CPITM 진화로부터의 길어진 핵산은 포괄적인 위치 진화(CPE)에 적용되어 분자 특이적인 데이터베이스(EvoMap)를 생성하는데 사용된다.
도 6은, 포괄적인 위치 결실(CPDTM) 진화의 개략도를 나타낸다.
도 7은, 진화 방법의 다른 조합을 나타내며; CPDTM 진화로부터 단축된 핵산은 포괄적인 위치 진화(CPE -.TM- )에 적용시키고 분자 특이적인 데이터베이스(EvoMapTM)를 생성하는데 사용한다.
용어의 정의
본 명세서에 제공된 예의 이해를 용이하게 하기 위하여, 특정의 흔히 나타나는 방법 및/또는 용어를 기술할 것이다.
용어 "제제(agent)"는, 본원에서 폴리펩티드, 공간적으로 국재화된 화합물의 배열(예를 들어, VLSIPS 펩티드 배열, 폴리뉴클레오티드 배열, 및/또는 조합 소 분자 배열), 생물학적 거대분자, 박테리오파아지 펩티드 디스플레이 라이브러리, 박테리오파아지 항체(예를 들어, scFv) 디스플레이 라이브러리, 폴리솜 펩티드 디스플레이 라이브러리, 또는 세균, 식물, 진균 또는 동물(특히 포유동물) 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타낸다. 제제는 하기 본 명세서에 기술된 스크리닝 검정에 포함시킴에 의해 항신생물제, 소염 또는 세포자멸사 조절인자로서 잠재적인 활성에 대해 평가된다. 제제는 본원에서 하기 기술된 스크리닝 검정에 포함시킴에 의해 특이적인 단백질 상호작용 억제제(즉, 2개의 미리 결정된 폴리펩티드 사이의 결합 상호작용을 선택적으로 억제하지만 세포 생존능을 실질적으로 방해하지 않는 제제)로서의 잠재적인 활성에 대해 평가된다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "아미노산"은, 바람직하게는 유리 그룹으로서 또는 펩티드 결합의 일부로서 축합 후 아미노 그룹(--NH2) 및 카복실 그룹(--COOH)을 함유하는 특정 유기 화합물을 말한다. "20개의 자연 암호화된 폴리펩티드 형성 알파-아미노산"은 당해 분야에 이해되어 있으며 알라닌(ala 또는 A), 아르기닌(arg 또는 R), 아스파라긴(asn 또는 N), 아스파르트산(asp 또는 D), 시스테인(cys 또는 C), 글루탐산(glu 또는 E), 글루타민(gin 또는 Q), 글리신(gly 또는 G), 히스티딘(his 또는 H), 이소루이신(ile 또는 I), 루이신(leu 또는 L), 라이신(lys 또는 K), 메티오닌(met 또는 M), 페닐알라닌(phe 또는 F), 프롤린(pro 또는 P), 세린(ser 또는 S), 트레오닌(thr 또는 T), 트립토판(trp 또는 W), 타이로신(tyr 또는 Y), 및 발린(val 또는 V)을 말한다.
용어 "증폭(amplification)"은, 폴리뉴클레오티드의 카피의 수가 증가됨을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는, 완전한 면역글로불린 분자, 및 항원의 에피토프(epitope)에 결합할 수 있는 Fab, Fab1, (Fab')2, Fv, 및 SCA 단편과 같은 면역글로불린 분자의 단편을 말한다. 이들이 기원한 항체의 항원(예를 들어, 폴리펩티드 항원)에 선택적으로 결합하는 일부 능력을 보유한 이들 항체 단편은 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있으며(참조: 예를 들어, 상기한 Harlow and Lane), 다음과 같이 추가로 기술된다. 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 항원의 제조 양을 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 항체의 각종의 다른 용도는 예를 들어, 신생물, 자가면역병, AIDS, 심혈관병, 감염 등과 같은 질병을 치료하기 위한 치료 적용이다. 키메라, 인간-유사, 인간화되거나 완전한 인간 항체는 인간 환자에게 투여하기에 특히 유용하다.
Fab 단편은 항체 분자의 1가 항원-결합 단편으로 이루어지며, 전체 항체 분자를 효소 파파인으로 분해함으로써 완전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어진 단편을 수득함으로써 생산될 수 있다.
항체 분자의 Fab' 단편은 전체 항체 단편을 펩신으로 처리한 후, 환원시켜 완전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어진 분자를 수득함으로써 수득할 수 있다. 2개의 Fab' 단편은 이러한 방식으로 처리된 항체 분자당 수득된다.
항체의 (Fab')2 단편은 후속적인 환원없이 전체 항체 분자를 효소 펩신으로 처리함으로써 수득할 수 있다. (Fab')2 단편은 2개의 Fab' 단편의 이합체이며, 2개의 이황화물 결합에 의해 함께 유지된다.
Fv 단편은 경쇄의 2개의 쇄로서 발현된 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 가공된 단편으로 정의된다.
단일쇄 항체("SCA")는, 적합하고 굴곡가능한 폴리펩티드 라이너(liner)에 의해 연결된, 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 가공된 단일쇄 분자이다.
또한 "응용 생물학(follow-on biologic)"으로도 불리는 용어인 "바이오시밀러(biosimilar)"는, 특허 또는 독점 기간 만료 후, 혁신자 생물약제 제품의 공식적으로 승인된 신규 버젼을 말한다.
용어 "세포 생산 숙주(cell production host)" 또는 "제조 숙주(manufacturing host)"는, 단백질의 생산 또는 제조를 위해 사용된 세포주를 말한다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 햄스터, 랫트, 원숭이 세포주를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 포유동물 세포뿐만 아니라, 효모, 곤충 및 식물 세포주도 포함한다. 원핵 세포도 달리 이용될 수 있다. 일 측면에서, 포유동물 세포 생산 숙주는 3T3 마우스 섬유모세포 세포; BHK21 시리안 햄스터 섬유모세포 세포; MDCK, 개 상피 세포; HeIa 인간 상피 세포; PtKl 랫트 캥거루 상피 세포; SP2/0 마우스 혈장 세포; 및 NSO 마우스 마우스 혈장 세포; HEK 293 인간 배아 신장 세포; COS 원숭이 신장 세포; CHO, CHO-S 차이니즈 햄스터 난소 세포; Rl 마우스 배아 세포; E14.1 마우스 배아 세포; Hl 인간 배아 세포; H9 인간 배아 세포; PER C.6, 인간 배아 세포로 이루어진 그룹의 구성원으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 세포 생산 숙주는 GS-NSO 또는 GS-CHOKl 세포주이다. 다른 측면에서, 세포 생산 숙주는 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 효모 세포; 및 피키아(picchia) 효모 세포 중에서 선택된다. 다른 측면에서, 세포 생산 숙주는 세균 세포주이다.
"키메라 특성(chimeric property)"을 가진 분자는, 1) 제1의 참조 분자에 대해 부분적으로 동종이고 부분적으로 이종인 반면; 2) 동시에 제2의 참조 분자에 대해 부분적으로 동종이고 부분적으로 이종이며; 3) 동시에 하나 이상의 추가 참조 분자에 대해 여전히 부분적으로 동종이고 부분적으로 이종임을 불가능하게 하지 않는 분자이다. 비-제한적 실시예에서, 키메라 분자는 부분적인 분자 서열의 재모음을 조립함으로써 제조될 수 있다. 비-제한적인 측면에서, 키메라 폴리뉴클레오티드 분자는 키메라 폴리뉴클레오티드를 다수의 분자 템플릿을 사용하여 합성함으로써 수득되는 키메라 폴리뉴클레오티드가 다수의 템플릿의 특성을 갖도록 제조할 수 있다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "인지체(cognate)"라는 용어는, 종간에 진화적으로 및 기능적으로 관련된 유전자 서열을 말한다. 예를 들어, 그러나 한정함이 없이, 인간 게놈에서 인간 CD4 유전자는 마우스 3d4 유전자에 대한 인지체 유전자인데, 이는 이들 2개 유전자의 서열 및 구조가, 이들이 고도로 동종이며 유전자 둘다가 MHC 부류 II-제한된 항원 인식을 통해 T 세포 활성화를 시그날링하는데 있어 기능하는 단백질을 암호화함을 나타내기 때문이다.
용어 "시판 규모(commercial scale)"는, 재판매에 적절한 규모에서 단백질 또는 항체의 생산을 의미한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "비교 윈도우(comparison window)"는, 적어도 20개의 연속된 뉴클레오티드 위치의 개념 분절(conceptual segment)을 나타내고, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 20개의 연속된 뉴클레오티드의 참조 서열과 비교될 수 있고, 여기서 비교 윈도우 내 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부는 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열(이는 첨가 또는 결실을 포함하지 않는다)에 비교하여 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[참조: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482]의 국소 동종성 알고리즘에 의해, 문헌[참조: Needlemen and Wuncsch J. MoI. Biol. 48: 443 (1970)]의 동종성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[참조: Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법의 조사에 의해, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터처리된 이행, 또는 검사에 의해 수행될 수 있으며, 각종 방법에 의해 생성된 가장 우수한 정렬(즉, 비교 윈도우에 걸쳐 최대 동종성 퍼센트를 초래하는)을 선택한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "상보성-결정 영역"과 "CDR"이라는 용어는, 카바트(Kabat) 및 쵸티아(Chothia)에 의해 예시된 바와 같은 당해 분야에 인식된 용어를 말한다. CDR 정의는 또한 일반적으로 초가변성 영역 또는 과가변성 루프로 공지되어 있다(참조: Chothia and Leks, 1987; Clothia et al., 1989; Kabat et al., 1987; 및 Tramontano et al., 1990). 비록 어느 정도 보다 짧거나 긴 가변 도메인이 단일쇄 항체를 형성하기에 적합하다고 해도, 다양한 영역 도메인은 대표적으로, 자연 존재하는 면역글로불린 쇄의 아미노-말단성 대략 105 내지 115개 아미노산(예를 들어, 아미노산 1 내지 110번)을 포함한다. CDR은 상기 분자의 특이성을 결정하고 특이적인 리간드와 접촉하는 면역글로불린의 부분이다. CDR은 분자의 가장 가변성인 부분이며 이들 분자의 다양성에 기여한다. 각각의 V 도메인 내에 3개의 CDR 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3가 있다. CDR-H는 가변 중쇄의 CDR 영역을 나타내며 CDR-L은 가변 경쇄의 CDR 영역에 관한 것이다. H는 가변 중쇄를 의미하고 L은 가변 경쇄를 의미한다. Ig-기원한 영역의 CDR 영역은 문헌[참조: Kabat (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 and Chothia (1989) Nature, 342, 877-883]에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다.
"포괄적인"이라는 용어는, 본원에서 진화의 기술을 말하는 데 사용되며, 여기서 모든 가능한 변화는 템플릿 폴리뉴클레오티드 또는 템플릿 폴리펩티드의 각각의 위치에서 이루어지며 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 의도된 변화가 이루어졌는지를 확인하기 위해 시험된다.
"보존적 아미노산 치환"은, 유사한 측쇄를 가진 잔기의 상호교환능을 말한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 및 이소루이신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이며; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-루이신-이소루이신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다.
"~에 상응하는"이라는 용어는, 본원에서, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부에 대해 동종(즉, 동일하지만, 절대적으로 진화적으로 관련되지 않은)이거나, 폴리펩티드 서열이 참조 폴리펩티드 서열에 대해 동일함을 의미하는 데 사용된다. 대조적으로, 용어 "에 상보적인"은 본원에서, 상보성 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부에 대해 동종임을 의미하기 위해 사용된다. 설명을 위해, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 참조 "TATAC"에 상응하며 참조 서열 "GTATA"에 대해 상보성이다.
"분해에 유효한(degrading effective)" 양(amount)이라는 용어는, 효소와 접촉되지 않은 기질과 비교하여, 기질의 적어도 50%를 진행시키는데 요구되는 효소의 양을 말한다. 바람직하게, 기질의 적어도 80%가 분해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "한정된 서열 골격"이라는 용어는, 비-무작위 기준, 일반적으로 실험 데이터 또는 구조 데이터를 기준으로 선택되는 한정된 서열의 세트를 말하며; 예를 들어, 한정된 서열 골격은 β-시이트 구조(β-sheet structure)를 형성하는 것으로 예측되는 아미노산 서열의 세트를 포함하거나 다른 변이 중에서 루이신 지퍼 헵타드 반복 모티프(zipper heptad repeat motif), 아연-핑거 도메인(zinc-finger domain)을 포함할 수 있다. "한정된 서열 커날(kernal)"은 가변성의 제한된 범주를 포함하는 서열의 세트이다. 반면 (1) 20개의 통상적인 아미노산의 완전한 무작위 10-머(10-mer) 서열은 (20)10개 서열 중 어느 것일 수 있고, (2) 20개의 통상적인 아미노산 중 램덤추출 10-머 서열은 (20)10개 서열 중 어느 것일 수 있지만 특정 위치 및/또는 전체적으로 특정 잔기에 대한 편재(bias)를 나타낼 것이고, (3) 한정된 서열 커날은, 각각의 잔기 위치가 허용되는 20개의 통상의 아미노산(및/또는 허용되는 비통상적인 아미노/이미노산) 중 어느 것이 되도록 허용한 경우 서열의 소세트이다. 한정된 서열 커날은 일반적으로 변이체 및 비변이체 잔기 위치를 포함하고/하거나 개개의 선택된 라이브러리 구성원 서열의 전체 길이에 걸쳐서 또는 분절적으로 아미노산 잔기의 정의된 소 세트 등으로부터 선택된 잔기를 포함할 수 있는 변이체 잔기 위치를 포함한다. 한정된 서열 커날은 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나를 언급할 수 있다. 설명 및 제한하지 않고, 서열(NNK)IO 및 (NNM)IO(여기서, N은 A, T, G, 또는 C를 나타내고; K는 G 또는 T를 나타내며; M은 A 또는 C를 나타낸다)는 한정된 서열 커날이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "탈면역화(deimmunization)"라는 용어는, 인간에서 상기 변이체가 비-면역원성이거나 거의 비면역원성이 되도록 함으로써 원래의 야생형 분자와 비교하여 변형된 템플릿 결합 분자의 변이체의 생산에 관한 것이다. 본 발명에 따른 탈면역화된 분자는 비-인간 기원의 항체 또는 이의 부분(유사 구조 및/또는 CDR)에 관한 것이다. 상응하는 예는 US 4,361,549에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이다. 용어 "탈면역화된'은 또한 T 세포 에피토프를 생성하기 위해 감소된 경향을 나타내는 분자를 말한다. 본 발명에 따라서, 용어 "T 세포 에피토프를 생성하기 위한 감소된 경향"은 특이적인 T 세포 활성화를 가져오는 T-세포 에피토프의 제거에 관한 것이다.
또한, T 세포 에피토프를 생성하기 위한 감소된 경향은 T 세포 에피토프의 형성에 기여하는 아미노산의 치환, 즉, T 세포 에피토프의 형성에 필수적인, 아미노산의 치환을 의미한다. 달리 말해서, T 세포 에피토프를 생성하기 위한 감소된 경향은 항원 독립적인 T 세포 증식을 유도하는 감소된 면역원성 또는 감소된 능력에 관한 것이다. 또한, T 세포 에피토프를 생성하는 감소된 경향은 항원 독립적인 T 세포 증식을 유도하는 아미노산 서열의 잠재적인 T 세포 에피토프의 손실 또는 감소를 의미하는 탈면역화에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포 에피토프(epitope)"는, 세포 내에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 동안 방출될 수 있고 T 세포의 활성화를 유발하기 위하여 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 분자에 의해 후속적으로 나타날 수 있는 단축된 펩티드 서열에 관한 것이다(참조: 특히 WO 02/066514). MHC 부류 II에 의해 제공된 펩티드의 경우, T 세포의 이러한 활성화는 이후에 B 세포의 직접적인 자극에 의하여 항체 반응을 유도함으로써 상기 항체를 생산할 수 있다.
DNA의 "분해(digestion)"는, DNA내 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소를 사용한 DNA의 촉매적 분해를 말한다. 본 명세서에 사용된 각종 제한 효소는 시판되고 있으며 이들의 반응 조건, 보조인자 및 기타 요건은 통상의 기술자에게 공지될 수 있는 바와 같이 사용되었다. 분석 목적을 위해, 1㎍의 플라스미드 또는 DNA 단편을 약 20㎕의 완충제 용액 속에서 약 2 단위의 효소와 함께 사용한다. 플라스미드 작제를 위한 DNA 단편을 분리할 목적을 위해, 통상적으로 5 내지 50㎍의 DNA를 보다 큰 용적으로 20 내지 250 단위의 효소를 사용하여 분해한다. 특수한 제한 효소를 위한 적절한 완충액 및 기질 양은 제조업자에 의해 명시되어 있다. 37℃에서 약 1시간의 항온처리 시간이 주로 사용되지만, 제공업자의 지시에 따라 변할 수 있다. 분해 후에, 반응물을 겔 위에서 직접 전기영동시켜 바람직한 단편을 분리한다.
용어 "DNA 셔플링(DNA shuffling)"은, 본원에서 실질적으로 동종이지만 동일하지 않은 서열 사이에서 재조합을 나타내기 위해 사용되며, 일부 실시예에서, DNA 셔플링은 cer/lox 및/또는 flp/frt 시스템 등을 통해서와 같은 비-동종 재조합을 통한 교차를 포함할 수 있다. DNA 셔플링은 무작위(random) 또는 비-무작위(non-random)일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는, 피타제-특이적인 항체와 같은 항체의 파라토프가 결합된 피타제 폴리펩티드와 같은, 항원상의 항원성 결정인자를 말한다. 항원성 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 이루어지며, 특이적인 3-차원 구조 특성, 및 특이적인 전하 특성을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "에피토프"는, 항체의 가변 영역 결합체와 상호작용하는 결합 상호작용을 형성할 수 있는 다른 거대분자 또는 항원의 일부를 말한다. 통상적으로 이러한 결합 상호작용은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로 분명해진다.
용어 "진화(evolution)"는, 템플릿 단백질 또는 항체와 비교하여 유전적으로 또는 합성적으로 변형된 단백질 또는 항체의 적어도 하나의 특징, 특성 또는 활성에 있어서의 변화를 말한다.
용어 "단편(fragment)", "유도체(derivative)", 및 "유사체(analog)"는, 참조 폴리펩티드를 언급하는 경우 참조 폴리펩티드의 것과 적어도 필수적으로 동일한 적어도 하나의 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 용어 "단편", "유도체" 또는 "유사체"는 유의적으로 보다 높은 활성을 가진 성숙한 효소를 생산하기 위해 분해에 의해 변형될 수 있는 낮은 활성의 프로단백질과 같은 "프로-형태(pro-form)" 분자로 예시된다.
본원에서는 "완전한 범위의 단일 아미노산 치환"이 각각의 아미노산 위치에서 나타나는 후대 폴리펩티드의 세트를 템플릿 폴리펩티드로부터 생산하기 위한 방법이 제공된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "전체 범위의 단일 아미노산 치환"은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 자연 암호화된 20개의 자연 암호화된 폴리펩티드-형성 알파-아미노산을 참조한다.
용어 "유전자(gene)"는, 폴리펩티드 쇄를 생산하는데 포함된 DNA의 분절을 의미하며; 이는 암호화 영역을 앞서는 및 후속하는 영역(리더 및 트레일러(trailer)) 및 또한 개개의 암호화 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "유전적 불안정성"은, 반복된 서열의 손실을 통해 서열 단순화를 일반적으로 포함하는 환원 현상의 공정을 통해 손실되는 고도의 반복적인 서열의 천연적인 경향을 말한다. 결실은 반복체 사이의 모든 것과 반복물의 하나의 카피의 손실을 포함하는 경향이 있다.
용어 "이종(heterologous)"은, 하나의 단일쇄 핵산 서열이 다른 단일쇄 핵산 서열 또는 이의 상보체에 하이브리드화할 수 없음을 의미한다. 따라서, 이종성의 부위는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 영역이 다른 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 없는 이들의 서열 내 영역 또는 범위를 갖는다. 이러한 영역 또는 범위는 예를 들어, 돌연변이의 범위이다.
용어 "동종(homologous)" 또는 "이종(homeologous)"은, 하나의 단일쇄 핵산 서열이 상보성의 단일쇄 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있음을 의미한다. 하이브리드화 정도는 후에 논의되는 바와 같은 온도 및 염 농도와 같은 하이브리드화 조건과 서열 사이의 동일성의 양을 포함하는 다수의 인자에 의존할 수 있다. 바람직하게는 동일성 영역은 약 5bp 초과이며, 보다 바람직하게는 동일성의 영역은 10bp 초과이다.
"인간화(humanized)"라는 용어는, 포유동물, 예를 들어, 마우스로부터의 상보성 결정 영역(CDR)이 인간 골격 영역과 결합되어 있는 항체를 기술하기 위해 사용된다. 흔히, 분리된 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 가변 영역 골격(및 임의로 고정 영역)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드내로 이식되어 폴리뉴클레오티드 암호화 완전한 항체(예를 들어, 인간화되거나 완전한 인간), 항체 단편 등을 형성할 것이다. 다른 측면에서, 마우스 항체 외에, 다른 종, 예를 들어, 다른 설치류, 낙타, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 말, 소, 어류, 라마 및 상어가 인간화될 수 있다. 광범위한 측면에서, 항체를 생산하는 특정 종을 인간화 항체의 생산에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 이들의 표적에 대한 이들의 친화성을 감소시키지 않고, 이들의 잠재적인 항원성을 감소시키기 위하여, 키메라, 인간-유사, 인간화 또는 완전한 인간일 수 있다. 키메라, 인간-유사 및 인간화 항체는 일반적으로 당해 분야에 기술되어 있다. 하이브리드 항체내에서 가능한 한 외부 서열을 적게 도입시킴으로써, 항원성을 감소시킨다. 이들 하이브리드 항체의 제조는 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
대안적 측면에서, 인간 또는 마우스 항체는 위험에 처한 종과 같은 상이한 수용체 종에 적응시켜 이들을 음성적인 면역 반응으로부터 보호하면서 수용체 종에 대한 치료제를 제공한다. 당해 측면에서, 수용체 종으로부터의 골격은 공지되거나 제2의 종 항체로부터 CDR과 함께 사용된다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 또한 CDR로 명명된 3개의 과가변 영역에 의해 차단된 "골격" 영역으로 이루어진다. 골격 영역 및 CDR의 정도는 상세하게 정의되어 왔다(참조: "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat et al., 1987). 상이한 경쇄 또는 중쇄의 골격 영역의 서열은 종내에서 비교적 보존되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "인간 골격 영역"은 자연 존재하는 인간 면역글로불린의 골격 영역과 실질적으로 동일한(약 85개 이상, 일반적으로 90 내지 95개 이상) 골격 영역이다. 구성 성분 경쇄 및 중쇄의 결합된 골격 영역인 항체의 골격 영역은 위치를 제공하며 CDR을 정렬한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합에 관여하며, 본 발명에 따라서, 골격 영역은 항원과 접촉하도록 하는 고가변성 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 단백질 스캐폴드를 제공하는 면역글로불린의 V 도메인(VH 또는 VL 도메인)내 영역에 관한 것이며, 각각의 V 도메인에서는 FRl, FR2, FR3, 및 FR4로 지정된 4개의 골격 영역이 존재한다. 골격 1은, CDR1의 개시까지 V 도메인의 N-말단으로부터의 영역을 포함하며, 골격 2는 CDR1 및 CDR2 사이의 영역에 관한 것이고, 골격 3은 CDR2 및 CDR3 사이의 영역을 포함하며 골격 4는 V 도메인의 C-말단까지 CDR3의 말단으로부터의 영역을 의미한다(참조: 특히, Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5th ed). 따라서, 골격 영역은 VH 또는 VL 도메인 내 CDR 영역의 외부 영역 모두를 포함한다.
당업자는 위치 내에 제공된 서열로부터 골격 영역, 및 CDR을 용이하게 유추한다 [참조: Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987) J. MoI. Biol. 196, 901-917 and Chothia (1989) Nature, 342, 877-883].
본 발명의 이익은 "산업적 적용"(또는 산업적 공정)으로 확장되며, 당해 용어는 적절한 산업적(또는 단순히 산업) 및 비-산업적 적용(예를 들어, 비-영리 기관에서 생물의학 조사)에서의 적용을 포함하기 위해 사용된다. 관련 적용은 진단, 의약, 농업, 제조 및 학문의 분야에서의 것들을 포함한다.
"동일한" 또는 "동일성"이라는 용어는, 2개의 핵산 서열이 동일한 서열 또는 상보성 서열을 가짐을 의미한다. 따라서, "동일성 범위"는, 폴리뉴클레오티드 또는 전체 폴리뉴클레오티드의 영역 또는 범위가 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 범위와 동일하거나 상보성임을 의미한다.
"분리된(isolated)"이라는 용어는, 물질이 이의 원래의 환경(예를 들어, 이것이 자연 존재하는 경우 천연 환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 내에 존재하는 자연 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 분리되지 않지만, 천연 시스템에서 공존하는 물질 중 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 분리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 조성물의 부분일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 이의 천연 환경의 부분이 아니라는 점에서 여전히 분리될 수 있다.
"분리된 핵산"은, 이것이 기원하는 유기체의 자연 존재하는 게놈 내에 존재하는 경우 일반적으로 이와 함께 바로 연속성인 5' 및 3' 플랭킹 서열과 바로 연속성이 아닌 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 따라서, 당해 용어는 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터 내에 혼입된 핵산; 이종 세포(또는 동종 세포의 게놈이지만, 이것이 자연 존재하는 부위와 상이한 부위에 있는)의 게놈 내로 혼입된 핵산; 및 개별 분자, 예를 들어, PCR 증폭 또는 제한 효소 분해에 의해 생산된 DNA 단편, 또는 시험관 내 전사에 의해 생산된 RNA 분자로서 존재하는 핵산을 기술한다. 당해 용어는 또한 예를 들어, 융합 단백질의 생산시 사용될 수 있는 추가 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 부분을 형성하는 재조합체 핵산을 기술한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "리간드"는 특수 수용체에 의해 인식된, 램덤 펩티드 또는 가변 분절 서열과 같은 분자를 말한다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 분자(또는 거대분자 복합체)는 수용체 및 리간드 둘 다일 수 있다. 일반적으로, 보다 작은 분자량을 가진 결합 파트너는 리간드로서 언급되며 보다 큰 분자량을 가진 결합 파트너는 수용체로서 언급된다.
"연결(ligation)"은 2개의 이본쇄 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 공정을 말한다(참조: Maniatis et al., 1982, p. 146). 달리 제공하지 않는 한, 연결은 연결되는 DNA 단편의 0.5㎍의 대략의 등몰량당 10 단위의 T4 DNA 리가제("리가제")를 사용한 공지된 조건 및 완충제를 사용하여 달성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "링커" 또는 "스페이서(spacer)"는, DNA 결합 단백질 및 무작위 펩티드와 같이 2개 분자를 연결하는 분자 또는 분자의 그룹을 말하며, 2개의 분자를 바람직한 구조로 위치하도록 함으로써, 예를 들어, 무작위 펩티드가 DNA 결합 단백질로부터 최소의 입체적 장애로 수용체에 결합할 수 있도록 할 수 있다.
"포유동물 세포 표면 디스플레이"라는 용어는, 이에 의해 단백질 또는 항체, 또는 항체의 일부가 발현되어 스크리닝 목적; 예를 들어, 자기 비드 및 형광성-활성화된 세포 분류의 조합에 의해 특이적인 항체 결합에 대해 스크리닝함에 의해 포유동물 숙주 세포 표면상에 디스플레이되는 기술을 말하며, 일 측면에서, 포유동물 발현 벡터는 본 명세서에 참조로 혼입된 두브릿지(DuBridge) 등의 US 2009/0136950에서와 같이 분비된 및 세포 표면 결합된 형태 모두로서 면역글로불린의 동시 발현에 사용되며, 다른 측면에서, 가오(Gao) 등의 기술이 항체의 라이브러리를 암호화하는 바이러스 벡터에 사용되거나 항체 단편이 본 명세서에 참조로 혼입된 가오 등의 US 2007/0111260에서와 같이 세포 내에서 발현되는 경우 세포 막 상에 디스플레이된다. 포유동물 세포상에서 전체 IgG 표면 디스플레이는 공지되어 있다. 예를 들어, 아카마쓰(Akamatsuu) 등은 항원-결합 친화성 및 생물학적 활성을 기준으로 IgG 분자를 직접 분리하기에 적합한 포유동물 세포 표면 디스플레이 벡터를 개발하였다. 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)-기원한 에피소옴 벡터를 사용하여, 항체 라이브러리를 세포 표면상에서 전체 IgG 분자로서 디스플레이하고 자기 비드 및 형광성-활성화된 세포 분류의 조합에 의해 특이적인 항원 결합에 대해 스크리닝하였다. 바람직한 결합 특성을 가진 항체를 암호화하는 플라스미드를 분류된 세포로부터 회수하여 가용성 IgG의 생산용 형태로 전환시켰다[참조: 본 명세서에 참조로 혼입된 Akamatsuu et al. J. Immunol. Methods 2007 327(1 -2):40-52]. 호(Ho) 등은 친화성 성숙을 위해 단일쇄 Fv 항체의 세포 표면 디스플레이를 위한 일시적인 단백질 발현에 광범위하게 사용된 인간 배아 신장 293T 세포를 사용하였다. 고 친화성을 갖는 드믄 돌연변이체 항체를 발현하는 세포는 약간 더 낮은 친화성을 가진 WT 항체를 발현하는 세포의 다량으로부터 단일-통과 세포 분류에 의해 240배 농축되었다. 또한, 고도로 농축된 돌연변이체가 고유의 항체 핫스폿(hotspot)을 무작위화하는 조합적인 라이브러리의 단일 선택 후 CD22에 대한 증가된 결합 친화성으로 수득되었다[참조: 본 명세서에 참조로 혼입된 Ho et al. Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells, Proc Natl Acad Sci U S A 2006 June 20; 103(25): 9637-9642].
비어리(Beerli) 등은 인간 공여체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 직접 분리된 목적한 항원에 대해 특이적인 B 세포를 사용하였다. 재조합체, 항원-특이적인 단일쇄 Fv(scFv) 라이브러리가 B 세포의 당해 혼주물(pool)로부터 생성되어 신드비스 바이러스(Sindbis virus) 발현 시스템을 사용함으로써 포유동물 세포 표면 디스플레이에 의해 스크리닝된다. 당해 방법은 FACS의 1회 라운드에 의해 항원-특이적인 항체를 분리할 수 있다. 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 가변 영역(VR)을 양성 클론 및 전체 IgG 또는 Fab 단편으로서 생산된 재조합체 완전한 인간 항체로부터 분리하였다. 당해 방식으로, Q/3 바이러스 유사 입자(VLP), 모델 바이러스 항원에 결합하는 몇 가지의 과돌연변이된 고-친화성 항체, 및 니코틴에 특이적인 항체를 분리하였다. 모든 항체는 세포 배양물 속에서 높은 발현 수준을 나타내었다. 인간 니코틴-특이적인 mAb는 마우스 모델에서 전임상적으로 가치가 있었다 [참조: 본 명세서에 참조로 혼입된 Beerli et al., Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 September 23; 105(38): 14336-14341].
효모 세포 표면 디스플레이가 또한 공지되어 있는데, 예를 들어, 문헌[참조: Kondo and Ueda 2004, Yeast cell-surface display-applications of molecular display, Appl. Microbiol. Biotechnol., 64(1): 28-40]은 효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)을 사용하여 세포-표면 가공 시스템을 기술한다. 효모 에스. 세레비지아에 내에서 발현을 위한 몇 가지 대표적인 디스플레이 시스템이 문헌[참조: Lee et al, 2003, Microbial cell-surface display, TRENDS in Bitechnol. 21(1): 45-52; 또한 Boder and Wittrup 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnol., 15(6): 553]에 기술되어 있다.
"제조"라는 용어는, 치료 단백질의 적어도 단계 I 임상 시험을 허용하기에 충분한 양 또는 진단 단백질의 조절성 승인에 충분한 양의 단백질의 생산을 말한다.
"미스센스 돌연변이(missense mutation)"라는 용어는, 단일의 뉴클레오티드가 변화되어 상이한 아미노산을 암호화하는 코돈을 초래하는 점 돌연변이를 말한다. 아미노산을 정지 코돈으로 변화시키는 돌연변이는 넌센스 돌연변이로 불린다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "진화될 분자 특성'은, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 분자, 폴리펩티드 서열을 포함한 분자, 및 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 및 폴리펩티드 서열의 일부를 포함한 분자에 대한 참조물을 포함한다. 진화될 분자 특성의 특히 관련되지만 제한되지 않는 예는 온도; 염분; 압력; pH; 및 글리세롤, DMSO, 세제 및/또는 접촉시 반응 환경내에서 제조된 다른 어떠한 분자 종의 농도와 관련된 것과 같은 규정된 조건에서 효소 활성을 포함한다. 진화될 분자 특성의 추가 특히 관련되지만 제한되지 않는 예는 안정성, 예를 들어, 저장 동안 직면할 수 있는 것과 같은, 규정된 환경에 대한 규정된 노출 시간 후 존재하는 잔류 분자 특성의 양을 포함한다.
"돌연변이되는(mutating)"이라는 용어는, 핵산 서열에서 돌연변이를 생성함을 의미하며; 돌연변이가 단백질의 암호화 영역 내에서 발생하는 경우에, 이는 아미노산 변화를 초래하거나 초래하지 않을 수 있는 코돈 변화를 가져올 것이다.
"돌연변이(mutation)"라는 용어는, 펩티드 또는 폴리펩티드의 서열 내 변화 또는 야생형 핵산 서열의 서열 내 변화를 의미한다. 이러한 돌연변이는 전이 또는 전환과 같은 점 돌연변이일 수 있다. 돌연변이는 결실, 삽입 또는 중복일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 변성된 "N,N,G/T" 뉴클레오티드 서열은 32개의 가능한 삼중체(triplet)를 나타내며, 여기서, "N"은 A,C,G 또는 T일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 변성 "N,N,N" 뉴클레오타디드 서열은 64개의 가능한 삼중체를 나타내며, 여기서, "N"은 A, C, G 또는 T일 수 있다.
대상체에 적용되는 경우에 본 명세서에 사용된 것으로서 "자연 존재하는"이라는 용어는, 대상체가 천연에서 발견될 수 있는 사실을 말한다. 예를 들어, 자연 공급원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 존재한다. 일반적으로, '자연 존재하는'이라는 당해 용어는 종에 대해 대표적일 수 있는 것과 같은, 비-병원성(질병이 없는) 개인에 존재하는 대상을 말한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "핵산 분자"는, 이것이 각각 단일쇄 또는 이본쇄인 것에 따라 적어도 하나의 염기 또는 하나의 염기쌍으로 구성된다. 또한, 핵산 분자는 핵산 분자의 다음 그룹에 의해 예시되지만, 이에 한정되지 않는 뉴클레오티드-함유 분자의 특정 그룹에 배타적으로 또는 키메라적으로 속할 수 있다: RNA, DNA, 게놈성 핵산, 비-게놈성 핵산, 자연 존재하는 핵산 및 자연 존재하지 않는 핵산, 및 합성 핵산. 이는 비-제한적인 예로써, 미토콘드리아, 리보소옴 RNA 및, 자연 존재하는 성분과 함께 자연 존재하지 않는 하나 이상의 성분으로 키메라적으로 구성된 핵산 분자와 연합된 핵산을 포함한다.
또한, "핵산 분자"는 아미노산 및 당에 의해 예시되지만 이에 한정되지 않는 부분적으로 하나 이상의 비-뉴클레오티드-계 성분을 함유할 수 있다. 따라서, 예로써, 그러나 이에 한정되지 않고, 부분적으로 뉴클레오티드-계 및 부분적으로 단백질-계인 리보자임은 "핵산 분자"로 고려된다.
또한, 예이지만 이로써 제한되지는 않는, 검출 가능한 잔기, 예를 들어, 방사활성 또는 달리는 비-방사활성 라벨로 표지화되는 핵산 분자는 마찬가지로 "핵산 분자"로 고려된다.
특수 단백질 "에 대한 핵산 서열 암호화" 또는 "특수 단백질 "의 DNA 암호화 서열" 또는 특수 단백질을 "암호화하는 뉴클레오티드 서열" 뿐만 아니라, 이와 다른 유사한 용어는, 적절한 조절 서열의 조절하에 위치하는 경우 효소로 전사되어 해독되는 DNA 서열을 말한다. "프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 하부(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 DNA 서열의 부분이다. 당해 서열 영역은 이의 3' 말단에서 출발 코돈을 갖는다. 프로모터 서열은 최소 수의 염기를 포함하며 여기서, 성분은 배경 초과의 검출 가능한 수준에서 전사를 개사하는데 필수적이다. 그러나, RNA 폴리머라제가 서열에 결합하여 전사가 출발 코돈(프로모터를 지닌 3' 말단)에서 개시된 후, 전사는 3' 방향에서 하부로 진행한다. 프로모터 서열 내에서 RNA 폴리머라제의 결합에 관여하는 전사 개시 부위(통상적으로 뉴클레아제 S1을 사용한 맵핑에 의해 편리하게 정의됨) 및 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)이 발견될 것이다.
"단백질을 암호화하는 핵산" 또는 "단백질을 암호화하는 DNA" 또는 "단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어 및 이와 다른 유사 용어는, 단백질에 대한 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 추가 암호화 서열 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 가지 바람직한 실시예에서, "특이 핵산 분자 종"은, 이의 주요 서열에 의해 예시되지만, 이에 한정되지 않는 이의 화학적 구조에 의해 정의되며, 다른 바람직한 실시예에서, 특이적인 "핵산 분자 종"은 핵산 종의 기능에 의해 또는 핵산 종으로부터 기원한 생성물의 기능에 의해 정의된다. 따라서, 비-제한적 예로써, "특이 핵산 분자 종"은 이의 발현된 생성물에 기여할 수 있는 활성 또는 특성을 포함하는, 이에 기여할 수 있는 하나 이상의 활성 또는 특성에 의해 정의될 수 있다.
"작업 핵산 시료의 핵산 라이브러리 내로의 조립"의 본 정의는 핵산 시료를 벡터 내로의 연결 또는 숙주의 형질전환에 의해서와 같이 벡터-계 수집으로 혼입시키는 공정을 포함한다. 관련 벡터, 숙주 및 다른 시약, 및 이의 특이적인 비-제한적 예의 설명은 이후 제공된다. "작업 핵산 시료의 핵산 라이브러리 내로의 조립"의 본 정의는 또한 핵산 시료의, 적응인자에 대한 연결에 의해서와 같이 비-벡터-계 수집 내로의 혼입 과정을 포함한다. 바람직하게는 적응 인자는 PCR 프라이머에 어닐링시켜 PCR에 의한 증폭을 촉진할 수 있다.
따라서, 비-제한적 실시예에서, "핵산 라이브러리"는 하나 이상의 핵산 분자의 벡터-계 수집으로 구성된다. 다른 바람직한 실시예에서, "핵산 라이브러리"는 핵산 분자의 비-벡터-계 수집으로 구성된다. 여전히 다른 바람직한 실시예에서, "핵산 라이브러리"는 부분적으로 벡터-계 및 부분적으로 비-벡터-계인 핵산 분자의 결합된 수집으로 구성된다. 바람직하게, 라이브러리를 포함하는 분자의 수집은 조사가능하며 개개의 핵산 분자 종에 따라 분리될 수 있다.
본 발명은 "핵산 작제물" 또는 대안적으로 "뉴클레오티드 작제물" 또는 달리는 "DNA 작제물"을 제공한다. "작제물(construct)"이라는 용어는, 본원에서 폴리뉴클레오티드와 같은 분자(예를 들어, 피타제 폴리뉴클레오티드)가 임으로 벡터, 또는 벡터의 부분과 같은 하나 이상의 추가 분자 잔기에 화학적으로 결합될 수 있음을 기술하기 위해 사용된다. 특정의, 그러나 제한되지 않는 측면에서, 뉴클레오티드 작제물은 숙주 세포의 형질전환에 적합한 DNA 발현 DNA 발현 작제물에 의해 예시된다.
"올리고뉴클레오티드"(또는 유사하게 "올리고")는 화학적으로 합성될 수 있는 단일쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 2개의 상보성 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 말한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다. 가지지 않는 것은 카나제의 존재하에서 ATP를 사용하여 포스페이트를 첨가하지 않고 다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 연결될 것이다. 폴리머라제-계 증폭(PCR과 같은)을 달성하기 위하여, "일련의 적어도 제1의 동종 서열, 변성 N,N,G/T 서열, 및 제2의 동종 서열로 구성된 32-배 변성 올리고뉴클레오티드"가 언급된다. 이와 관련하여 사용된 것으로서, "동종"은 올리고와, 폴리머라제-계 증폭에 적용된 모 폴리뉴클레오티드 사이의 동종성과 관련된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이라는 용어는, 기능적 관계의 폴리뉴클레오티드 성분의 연결을 말한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓인 경우 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. '작동 가능하게 연결된'은, 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 연속적이며 2개의 단백질 암호화 영역을 결합시키는데 필수적인 경우 연속적이며 판독 프레임 내에 있다.
암호화 서열(coding sequence)은, RNA 폴리머라제가 2개의 암호화 서열을 단일의 mRNA 내로 전사할 겨우 다른 암호화 서열에 "작동 가능하게 연결"되고, 이는 이후에 암호화 서열 모두로부터 기원한 아미노산을 가진 단일의 폴리펩티드로 해독된다. 암호화 서열은, 발현된 서열이 궁극적으로 프로세싱되어 바람직한 단백질을 생산하는 한, 서로 연속적일 필요는 없다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "생리학적 조건"이라는 용어는, 다양한 유기체와 적합성이고/이거나 전형적으로 살아있는 배양된 효모 세포 또는 포유동물 세포 내에 세포 내적으로 존재하는 유사 생화학적 매개변수, 점도, 이온 강도, pH 및 온도를 말한다. 예를 들어, 전형적인 실험실 배양 조건하에서 성장시킨 효모 세포 내에서 세포 내 조건은 생리학적 조건이다. 시험관 내 전사 콕테일(cocktail)을 위한 적합한 시험관 내 반응 조건은 일반적으로 생리학적 조건이다. 일반적으로, 시험관 내 생리학적 조건은 50~200 mM NaCl 또는 KCl, pH 6.5~8.5, 20~45℃ 및 0.001~10 mM 2가 양이온(예를 들어, Mg++, Ca++); 바람직하게는 약 150 mM NaCl 또는 KCl, pH 7.2~7.6, 5 mM 2가 양이온을 포함하며, 흔히 0.01~1.0%의 비특이적인 단백질(예를 들어, BSA)을 포함한다. 비-이온성 세제(Tween, NP-40, Triton X-100)은 흔히 일반적으로 약 0.001 내지 2%, 전형적으로 0.05~0.2%(v/v)에서 존재할 수 있다. 특수한 수성 조건은 숙련자가 통상의 방법에 따라 선택할 수 있다. 일반적인 안내를 위해, 다음의 완충된 수성 조건이 적용 가능하다: 10~250 mM NaCl, 5~50 mM Tris HCl, pH 5~8, 및 임의의 2가 양이온(들) 및/또는 금속 킬레이터 및/또는 비-이온성 세제 및/또는 막 분획 및/또는 소포제 및/또는 신틸런트(scintillant).
본 명세서에 사용된 "집단(population)"이라는 용어는, 폴리뉴클레오티드, 부분 또는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 같은 성분의 수집을 의미한다. "혼합된 집단"은 핵산 또는 단백질의 동일한 계열에 속하지만(즉, 관련된), 이들의 서열에 있어서 상이하여(즉, 동일하지 않아서) 이들의 생물학적 활성에 있어서 상이한 성분의 수집을 의미한다.
"프로-형태(pro-form)"를 갖는 분자는 참조 프로-형태 분자와 비교하여 특성 차이(예를 들어, 활성에 있어서의 증가)를 갖는 보다 성숙한 분자 형태를 획득하기 위한 도중에 하나 이상의 공유 및 비공유 화학적 변형(예를 들어, 글리코실화, 단백질분해적 분해, 이합체화 또는 올리고머화, 온도-유도되거나 pH-유도된 구조적 변화, 보조 인자와의 연합)의 특정 조합을 겪는 분자를 말한다. 2개 이상의 화학적 변형(예를 들어, 2개의 단백질분해적 분해, 또는 단백질분해적 분해 및 탈글리코실화)가 성숙한 분자의 생산 도중에 구별될 수 있는 경우, 참조 전구체 분자는 "예비-프로-형태" 분자로 명명될 수 있다.
"특성'은 최적화될 단백질 또는 항체의 물리적, 화학적 또는 활성 특징적인 특성을 포함하는 특정의 특징을 설명할 수 있다. 예를 들어, 특정의 측면에서, 최적화된 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성은 단백질-단백질 응집, 단백질 안정성의 향상, 증가된 단백질 가용성, 증가된 단백질 pH 안정성, 증가된 단백질 온도 안정성, 증가된 단백질 용매 안정성, 증가된 선택성, 증가된 선택성, 글리코실화 부위의 도입, 접합 부위의 도입, 면역원성의 감소, 단백질 발현의 향상, 항원 친화성에 있어서의 증가, 항원 친화성에 있어서의 감소, 결합 친화성에 있어서의 변화, 면역원성에 있어서의 변화, 촉매 활성에 있어서의 변화, pH 최적화 또는, 특이성의 향상 중에서 선택될 수 있다. "최적화된" 특성은 템플릿 단백질, 항체 또는 세포 각각과 비교하여 돌연변이체 단백질, 항체 또는 세포의 특수 특성에 있어서의 바람직한 변화를 말한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "의사 무작위(pseudorandom)"라는 용어는, 제한된 가변성을 가짐으로써, 예를 들어, 다른 위치에서 잔기 가변성의 정도, 그러나 특정의 의사 무작위 위치가 일부 잔기 변화의 정도를 허용하지만, 제한하는 서열의 세트를 말한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "유사-반복된 단위(Quasi-repeated unit)"는, 재-분류될 반복물을 말하며 동일하지 않은 정의에 의해 존재한다. 실제로, 당해 방법은 동일한 출발 서열의 돌연변이에 의해 생산된 실질적으로 동일한 암호화 단위에 대해서만이 아니라, 일부 영역 내에서 유의적으로 다양할 수 있는 유사하거나 관련된 서열의 재배열로도 제안된다. 그럼에도 불구하고, 서열이 당해 시도에 의해 재분류될 충분한 상동성을 함유하는 경우, 이들은 "유사-반복된" 단위로 언급될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "무작위 펩티드 라이브러리"는 램덤 펩티드의 세트를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 세트 및, 이들 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 무작위 펩티드의 세트를 말하며, 융합 단백질은 이들 무작위 펩티드를 함유한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "무작위 펩티드 서열"은 2개 이상의 아미노산 단량체로 구성된 아미노산 서열을 말하며 확률적 또는 무작위 공정에 의해 작제된다. 무작위 펩티드는 비가변 서열을 포함할 수 있는, 골격 또는 스캐폴딩 모티프를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "수용체(receptor)"는 제공된 리간드에 대해 친화성을 갖는 분자를 말한다. 수용체는 자연 존재하거나 합성 분자일 수 있다. 수용체는 변경되지 않은 상태로서 또는 다른 종과의 응집체로서 사용될 수 있다. 수용체는 결합 구성원에 직접 또는 특이적인 결합 물질을 통해 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착될 수 있다. 수용체의 예는 단클론 항체를 포함하는 항체 및 특이적인 항원성 결정인자(바이러스, 세포 또는 다른 물질상에서와 같은)와 반응성인 항혈청, 세포 막 수용체, 복합체 탄수화물 및 당단백질, 효소 및 호르몬 수용체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"재조합체(recombinant)" 단백질은, 재조합체 DNA 기술에 의해 생산된, 즉, 바람직한 효소를 암호화하는 외인성 DNA 작제물에 의해 형질전환된 세포로부터 생산된 단백질을 말한다. "합성" 단백질은 화학적 합성에 의해 제조된 것이다.
"관련 폴리뉴클레오티드"라는 용어는, 폴리뉴클레오티드의 영역 또는 부위가 동일하고 폴리뉴클레오티드의 영역 또는 부위가 이종인 영역 또는 부위를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "환원적 재분류(reductive reassortment)"는, 반복 서열에 의해 매개된 결실(및/또는 삽입) 현상을 통해 발생된 분자 다양성에 있어서의 증가를 말한다.
다음 용어는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 관계를 설명하기 위해 사용된다: "참조 서열", "비교 윈도우(comparison window)", "서열 동일성", "서열 동일성 퍼센트" 및 "실질적인 동일성".
"참조 서열'은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용된 한정된 서열이며; 참조 서열은 예를 들어, 서열 목록에 제공된 완전한 길이의 cDNA 또는 유전자 서열의 분절로서, 보다 큰 서열의 소세트일 수 있거나, 완전한 cDNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은, 길이가 20개 이상의 뉴클레오티드, 흔히 길이가 25개 이상의 뉴클레오티드 및 흔히 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 2개의 폴리뉴클레오티드 사이에 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)을 포함하고 (2) 2개의 폴리뉴클레오티드 사이에 갈리는 서열을 추가로 포함할 수 있으므로, 2개(또는 이상)의 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 전형적으로 "비교 윈도우"에 걸친 2개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "반복 지표(RI)"는 클로닝 벡터 내에 함유된 유사-반복 단위의 카피의 평균수이다.
용어 "포화"는 진화 기술을 말하며 여기서, 모든 가능한 변화는 템플릿 폴리뉴클레오티드 또는 템플릿 폴리펩티드의 각각의 위치에서 이루어지나; 각각의 위치에서 변화는 시험에 의해 확인되지 않지만, 단지 통계적으로 추정되며, 여기서, 가능한 변화의 대부분 또는 거의 모든 가능한 변화는 템플릿의 각각의 위치에서 발생하는 것으로 추정된다.
용어 "서열 동일성"은, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 윈도우에 걸쳐 동일함(즉, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 기준)을 의미한다. 용어 "서열 동일성의 퍼센트"는 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U, 또는 I)가 서열 둘다에서 발생하여 다수의 매치된 위치를 생성하는 위치의 수를 측정하고, 매치된 위치의 수를 비교 윈도우내 위치의 전체 수(즉, 윈도우 크기)로 나누며, 당해 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 수득함으로서 계산된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 당해 "실질적인 동일성'은 폴리뉴클레오티드 서열의 특징을 나타내며, 여기서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 25~50개의 뉴클레오티드의 비교 윈도우의 참조 서열과 비교하여 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 85%의 서열 동일성, 흔히 90 내지 95%의 서열 동일성, 및 가장 일반적으로 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서, 서열 동일성의 퍼센트는 참조 서열을, 비교 윈도우에 걸쳐 참조 서열의 총 20% 이하의 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 계산한다.
용어 "잠재 돌연변이(silent mutation)"는, 발현된 폴리펩티드내 아미노산 변화를 초래하지 않으며 아미노산 삽입을 위한 코돈 사용의 풍부성을 기준으로 하는 코돈 변화를 말한다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 2개 효소 사이의 "유사성"은 하나의 단백질의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환을 제2 단백질의 서열과 비교함으로써 측정한다. 유사성은 당해 분야에 잘 공지된 과정, 예를 들어, BLAST 프로그램(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information)으로 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단일쇄 항체"는, 일반적으로 스페이서 펩티드{예를 들어, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x}를 통해 연결되고 아미노- 및/또는 카복시- 말단에서 추가 아미노산 서열을 포함할 수 있는 폴리펩티드 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어, 단일쇄 항체는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 연결을 위한 테터 분절(tether segment)을 포함할 수 있다. 예로써, scFv는 단일쇄 항체이다. 단일쇄 항체는 일반적으로 면역글로불린 상과(예를 들어, 본 명세서에 참조로 혼입된 문헌: Williams and Barclay, 1989, pp. 361-368 참조)의 유전자에 의해 실질적으로 암호화된, 설치류, 비-인간 영장류, 조류, 돼지, 소, 양, 염소 또는, 인간 중쇄 또는 경쇄 유전자 서열에 의해 가장 흔히 암호화된 적어도 10개의 연속된 아미노의 하나 이상의 폴리펩티드 분절로 이루어진 단백질이다. 기능성 단일쇄 항체는 일반적으로 충분한 부위의 면역글로불린 상과 유전자 생성물을 함유함으로써 특이적인 표적 분자, 대표적으로 수용체 또는 항원(에피토프)에 대한 결합 특성을 보유하도록 한다.
분자의 쌍(예를 들어, 항체-항원쌍 또는 핵산 쌍)의 구성원은, 이들이 서로 다른 비-특이적인 분자에 대해서 보다 더 큰 친화성으로 서로에 결합하는 경우 서로에 대해 "특이적으로 결합하는"으로 일컬어진다. 예를 들어, 이것이 비특이적인 단백질에 대해서보다 더 효율적으로 결합하는 항원에 대해 생성된 항체는 항원에 대해 특이적으로 결합하는 것으로 설명될 수 있다 {유사하게, 핵산 프로브는, 이것이 염기 쌍화 상호작용(상기 참조)에 의해 표적과 특이적인 이중체를 형성하는 경우, 핵산 표적에 대해 특이적으로 결합하는 것으로 설명될 수 있다}.
"특이적인 하이브리드화"는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드와 구별되지만 실질적으로 동일한 서열을 가진 폴리뉴클레오티드) 사이에 하이브리드의 형성으로 본원에서 정의되며, 여기서, 실질적으로 관련되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열은 혼합물 속에서 하이브리드를 형성하지 않는다.
용어 "특이적인 폴리뉴클레오티드"는 특정의 종점을 가지고 특정의 핵산 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 하나의 폴리뉴클레오티드가 제2 폴리뉴클레오티드의 일부와 동일한 서열을 가지지만 말단이 상이한 2개의 폴리뉴클레오티드는 2개의 상이한 특이적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"엄격한 하이브리드화 조건(stringent hybridization condition)"은, 하이브리드화가 서열 사이에 적어도 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 97% 동일성이 존재하는 경우에만 발생할 것임을 의미한다 (참조: Sambrook et al., 1989, 이는 전문이 본 명세서에 참조로 포함되어 있다).
또한 본 명세서에 기술된 어떠한 서열 번호 중 하나와 같이, 폴리펩티드의 서열에 대해 "실질적으로 동일한" 서열을 갖는 폴리펩티드가 또한 본 발명에 포함된다. "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 동일한 부류의 다른 것에 대한 하나의 아미노산의 치환(예를 들어, 이소루이신, 발린, 루이신, 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 아미노산의 다른 것으로의 치환, 또는 하나의 극성 아미노산의 다른 것으로의 치환, 예를 들어, 라이신에 대한 아르기닌의 치환, 아스파르트산에 대한 글루탐산의 치환, 또는 아스파라긴에 대한 글루탐산의 치환)에 의해서만 참조 서열과 상이한 서열이다.
또한, "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 참조 서열로부터 또는, 특히 이러한 치환이 분자의 활성 부위가 아닌 부위에서 발생하는 경우 하나 이상의 비-보존적 치환, 결실 또는 삽입에 의해 상이한 서열이며, 단, 폴리펩티드는 실질적으로 이의 거위 특성을 보유한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은 피타제 폴리펩티드로부터 결실되어 이의 생물학적 활성을 유의적으로 변경시키지 않고 폴리펩티드의 구조의 변형을 초래할 수 있다. 예를 들어, 피타제 생물학적 활성에 요구되지 않는 아미노- 또는 카복실-말단 아미노산이 제거될 수 있다. 이러한 변형은 보다 작은 활성 피타제 폴리펩티드의 진화를 초래할 수 있다.
본 발명은 "실질적으로 순수한 효소"를 제공한다. 용어 "실질적으로 순수한 효소"는 본원에서 다른 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산, 및 이것이 자연 관련되어 있는 다른 생물학적 물질이 실질적으로 없는 폴리펩티드(예를 들어, 피타제 폴리펩티드 또는 이의 단편)과 같은 분자를 기술하기 위해 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드와 같은 실질적으로 순수한 분자는 목적한 분자의 무수 중량당 적어도 60%일 수 있다. 폴리펩티드의 순도는 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE), 컬럼 크로마토그래피{예를 들어, 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)}, 및 아미노-말단 아미노산 서열 분석을 포함하는 표준 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 존재하는 우세한 종(즉, 몰 기준으로 이는 조성물 내 다른 어떠한 개개 거대분자 종보다 더 풍부하다)을 의미하며, 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은, 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준)를 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 속에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80 내지 90% 이상을 포함할 것이다. 가장 바람직하게, 대상 종은 필수적인 상동성으로 정제되며(오염 종은 통상의 검출 방법에 의해 조성물 속에서 검출될 수 없다), 여기서, 조성물은 필수적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다. 용매 종, 소 분자(<500 달톤), 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로 고려되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "템플릿 올리고펩티드(template oligopeptide)"는, 변이체의 제2의 라이브러리가 요구되는 단백질을 의미한다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 어떠한 수의 템플릿도 본 발명에서 용도가 발견된다. "단백질" 또는 "올리고뉴클레오티드"의 정의 내에는 효소 도메인, 결합 도메인 등과 같은 기능적 도메인, 및 턴(turn), 루프(loop) 등과 같은 보다 작은 단편을 포함하는 공지된 단백질의 도메인 및 단편이 특이적으로 포함된다. 즉, 단백질의 일부가 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 것으로서 "단백질"은 단백질, 올리고펩티드, 및 펩티드를 포함한다. 또한, 단백질 변이체, 즉, 자연 존재하지 않는 단백질 유사체 구조가 사용될 수 있다.
적합한 단백질은 리간드, 세포 표면 수용체, 항원, 항체, 사이토킨, 호르몬, 전사 인자, 시그날링 모듈, 세포골격 단백질 및 효소를 포함하는 산업용 및 약제학적 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 부류의 효소는 프로테아제, 탄수화물, 업파제와 같은 하이드롤라제; 라세마제, 에피머라제, 토우토머라제 또는 무타제와 같은 이소머라제; 트랜스퍼라제, 키나제, 옥시도리덕타제 및 포스파타제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 효소는 스위스-프롯 효소 데이터베이트(Swiss-Prot enzyme database)에 나열되어 있다. 적합한 단백질 골격은 구조적 생물정보학을 위한 조사 콜레보러토리(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics: RCSB, 이전에는 Brookhaven National Lab)에 의해 편집되고 제공된 단백질 데이터베이스에서 발견된 것 모두를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "가변 분절"은, 무작위, 의사 무작위 또는 정의된 커날 서열(kernel sequence)을 포함하는 발생기 펩티드의 일부를 말한다. '가변 분절"은 무작위, 의사 무작위 또는 정의된 커날 서열을 포함하는 발생기 펩티드의 일부를 말한다. 가변 분절은 가변체 및 비가변체 잔기 위치 둘다를 포함할 수 있으며, 변이체 잔기 위치에서 잔기 변이의 정도는 제한될 수 있고: 옵션 둘다는 실시자의 재량으로 선택된다. 전형적으로, 가변 분절은 비록 더 길수 있고 항체 단편, 핵산 결합 단백질, 수용체 단백질 등과 같은 항체 부위 또는 수용체 단백질을 포함할 수 있다고 해도, 길이가 약 5 내지 20개(예를 들어, 8 내지 10개) 아미노산 잔기이다.
용어 "야생-형" 또는 "야생형"은, 폴리뉴클레오티드가 어떠한 돌연변이도 포함하지 않음을 의미한다. "야생형" 단백질은, 단백질이 자연 발견된 활성 수준에서 활성이고 자연에서 발견될 아미노산 서열을 포함할 것임을 의미한다.
본원은 단일 시스템에서 제조하기 위한 포유동물 숙주에서 치료 단백질(항체 포함) 생성 및/또는 선택, 진화 및 발현을 통합하는 방법을 제공하며, CIAO 방법의 일 실시예에서, 항체를 포함하는 치료 단백질이 동일한 포유동물 숙주 시스템에서 생성되고, 최적화되며 제조되고, 다른 실시예에서, 단백질 치료제는 동일한 숙주에서 발견되고 제조된다. 이는 매우 초기 비용 절감(시간 및 재료)으로부터 제조를 최적화한다.
역사적으로, 항체의 발견은 진핵(euk) 및 원핵(prok) 숙주에서 수행되어 왔다. 대표적으로, 세균[대장균(E.coli)]에서, 부분 길이 항체가 예를 들어, 파아지 디스플레이 기술에서 발견되어 있으며, Fab가 회수되어 때때로 완전한 길이의 하부(downstream)로 전환되어 있다. 이들 시도에는 몇 가지 잠재적인 단점이 존재한다.
한 가지 예에서, Fc 및 Fv 영역은 교류하여 결합 및 발현과 같은 항체 특성을 발휘한다는 몇 가지 증거가 존재한다. 따라서, 항체 단편을 발현과 같은 특성을 위해 최적화하는 경우, 개선은 항상 완전한 길이의 조립된 항체에서 개선된 발현으로 해독되지 않는다. 예를 들어, Fc의 라이브러리는 어떠한 숙주에서도 발현을 증진시키기 위하여 어떠한 Fv에도 부착될 수 있는 "홀리 그레일(holy grail)" Fc를 발견하기 위한 시도에서 생성되었다.
일 측면에서, 코돈 돌연변이 유발은 포유동물 세포 발현의 최적화를 위해 고정 영역에서 수행되었다. 상세하게는 326개 돌연변이체가 고정 영역에서 생성되어 HEK 293 및 CHO-S 세포 내에서 발현되었다. 스크리닝은 ELISA로 수행하였다. 몇 가지 Fc는 향상된 발현의 범주를 충족하였으며, 특정의 최적화된 Fc는 심지어, 형질전환된 양성 효과가 다수 세포주에 영향을 미침이 확인되었으나; 상이한 Fv를 Fc에 부착하는 경우, 발현에 있어서의 증진은 해독되지 않았다. 이는, Fc 및 Fv가 교류함을 입증한다.
하나의 바람직한 측면에서, 항체 단편의 재조합시 예측하지 않은 결과를 피하기 위하여, CIAO 방법을 사용하여 완전한 길이의 항체 분자를 발견하며, 다른 바람직한 측면에서, CIAO 방법은 진핵 숙주를 이용한다.
일 실시예에서, 진핵세포 시스템은, CHO, HEK293, IM9, DS-I, THP-I, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, 저캣(Jurkat), MMl, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDA-MB-468, LnCAP, NRK-49F, 및 SP2/0 세포주로 이루어진 그룹 중 하나; 및 마우스 비장세포 및 토끼 PBMC 중에서 선택된 포유동물 시스템이다. 일 측면에서, 포유동물 시스템은 CHO 또는 HEK293 세포주 중에서 선택된다. 하나의 특수 측면에서, 포유동물 시스템은 CHO-S 세포주이다. 다른 특수 측면에서, 포유동물 시스템은 HEK293 세포주이다. 다른 실시예에서, 진핵 시스템은 효모 세포 시스템이다. 일 측면에서, 진핵 시스템은 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 효모 세포 또는 피키아 효모 세포 중에서 선택된다.
또 다른 실시예에서, 포유동물 세포주 생성은 계약 연구 또는 통상의 제조 기관에 의해 상업적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 재조합체 항체 또는 다른 단백질의 경우, 론자(Lonza Group Ltd, Basel, Switzerland)는 벡터를 생성시켜 GS Gene Expression SystemTM 기술을 CHOKlSV 또는 NSO 숙주 세포주와 함께 사용하여 생성물을 발현시킬 수 있다.
또 다른 실시예에서, 진화는 원핵 숙주(예를 들어, 대장균)내에서 수행할 수 있으며 스크리닝은 제조 숙주와 동일한 숙주에서 일어나는 한, 진핵 숙주(예를 들어, CHO)에서 수행할 수 있다.
선도 후보 단백질(들)의 선택
각종의 방법을 사용하여, 진화시킬 하나 이상의 치료 단백질 후보물질을 발견하고/하거나, 생성하고/하거나 선택할 수 있다. 선택된 분자는 존재하는 재조합체 단백질일 수 있거나 효소, 호르몬 및 항체를 포함하는 재조합체 단백질의 수집으로부터 올 수 있다. 치료 단백질은 클로닝된 인간 효소 및 호르몬을 포함할 수 있다. 재조합체 항체는 이용가능한 특정 수의 생성 및 스크리닝 플랫포옴을 사용하여 발견할 수 있다. 항체는 단일쇄, 완전한 인간, Fab, Fv, Fc, 이-기능성, 키메라, 인간화되거나, 완전한 인간 항체 또는 이의 단편을 포함하는 어떠한 형태일 수 있으며, 하나의 바람직한 측면에서, CIAO 방법을 완전한 길이의 항체 분자를 발견하기 위해 사용한다. 재조합체 항체의 라이브러리는 최적화되거나 최적화되지 않은 포유동물 숙주에서 선택 또는 스크리닝 시스템을 사용하여 생성시키고 스크리닝함으로써 진화용 후보물질을 수득한다. 수개의 진핵세포 발현 시스템, 예를 들어, 포유동물 또는 효모 세포 시스템이 공지되어 있다.
본 발명의 방법에서, 이러한 포유동물 발현 시스템, 특히, 스크리닝 및 선택용 분자의 세포 표면 디스플레이를 사용하는 시스템을 사용하여 제조용 후보물질, 또는 제조 이후 진화를 확인하고 선택한다. 바람직하게, 이러한 포유동물 숙주는 섬유모세포 세포(3T3, 마우스; BHK21, 시리안 햄스터) 상피 세포(MDCK, 개; HeIa, 인간; PtKl, 랫트 캥거루) 혈장 세포((SP2/0 및 NSO, 마우스) 신장 세포(293, 인간; COS, 원숭이) 난소 세포(CHO, 차이니즈 햄스터) 배아 세포(R1 및 E14.1, 마우스; H1 및 H9, 인간; PER C.6, 인간)이다. 세포 표면 디스플레이 기술을 사용하여 스크리닝용 포유동물 세포의 표면에 단백질을 디스플레이한다. 단백질은 발현되는 경우, 예를 들어, 고속, 고-처리량 스크리닝용 세포의 표면에 단백질을 디스플레이하는 막 분자와의 융합체로서 클로닝된다.
특정 실시예에서, 본원은 최적화된 항체를 제공하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 항원이 선택되고 인간 항체 라이브러리가 포유동물 시스템, 예를 들어, CHO-S 세포에서 생성되고 발현된다. 라이브러리를 스크리닝하여 예를 들어, 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 완전한 인간 항체 히트(hit)를 확인한다. 이후에, 완전한 인간 항체 히트를 어떠한 관련된 검정에 의해 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 스크리닝/특성화하고, 일 측면에서, 진화된 분자는 예를 들어 개선된 기능 및 발현과 동시에 다수의 특성에 대해 스크리닝한다. 관련된 분석은 예를 들어, ELISA, 또는 배열 기술을 포함할 수 있다. 템플릿 항체는 인간 항체 히트로부터 선택한다. 어떠한 진화 방법도 템플릿 항체 또는 이의 단편 폴리펩티드 상에서 수행하여 돌연변이체 항체 세트를 제조하며, 일 측면에서, 진화는 돌연변이 항체 세트를 생산하기 위한 포괄적인 단백질 가공 방법으로 수행한다. 포괄적인 단백질 가공 방법은 예를 들어, 포괄적인 위치 진화(CPETM), 포괄적인 단백질 합성(CPSTM), 플렉스 진화(Flex Evolution), 동반 상승 진화(Synergy Evolution), 포괄적인 위치 삽입 진화(CPFM), 또는 포괄적인 위치 결실 진화(CPDTM) 중 하나 또는 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 다른 측면에서, 돌연변이체 항체는 인간 항체 라이브러리를 생성하는데 사용된 동일한 포유동물 시스템에서 발현된다.
돌연변이체 항체 세트는 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 특성화하고/스크리닝한다. 일 측면에서, 돌연변이체 항체 세트는 예를 들어, 향상된 기능 및 발현에 대해 동시에 스크리닝된다. 일 측면에서, 기능적 위치 맵(EvoMapTM)의 형태의 분자 특이적인 데이터베이스를 당해 분야에 공지된 하나 이상의 단백질 진화 기술에 의해 추가 최적화에 이어; 상향-돌연변이체의 확인 및 특성화에 사용한다. 최적화된 항체는 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성과 관련하여 템플릿 항체에 대해 비교함으로써 선택한다.
일 측면에서, 선택된 최적화된 항체의 그람 규모 발현에 이어; 비-GLP 독성학을 수행한다. 안정한 세포주 형질감염, 마스타 세포 뱅크(Master Cell Bank)의 공정 개발 및 생성을 수행한다. GMP 제조는 인간 항체 라이브러리, 예를 들어, CHO-S 세포를 생성하는데 사용된 동일한 포유동물 시스템에서 수행하여 최적화된 치료 재조합체 mAB를 생성한다.
다른 실시예에서, CIAO 방법을 템플릿 하이브리도마 또는 재조합체 항체의 선택; 포유동물 세포 시스템에서 항체 세포 표면 디스플레이의 사용에 의해 스크리닝된 돌연변이체 항체 세트를 제공하기 위한 항체의 진화로부터 출발하며; 제조는 스크리닝에 사용된 동일한 포유동물 세포 시스템에서 수행한다.
다른 실시예에서, 선택된 템플릿 하이브리도마/재조합체 항체는 제조 숙주에서 인간화되고 스크리닝된 후 제조 숙주에서 생산되며, 여기서, 최적화(진화) 단계는 모두 함께 생략된다.
본 발명의 다른 측면에서, 제조 숙주 내 하부 발현 최적화는 항체의 Fc 영역, 항체내 잠재성 코돈 및/또는 단백질 발현에 사용된 벡터 및/또는 숙주 유전자를 진화시켜 수행하며, 일 측면에서, Fc 라이브러리는 어떠한 진화 기술에 의해서도 생성되고, 발현 최적화의 하나의 특수 측면에서, CPE는 항체의 Fc 도메인에서 수행하여 어떠한 Fv에 대해서도 최적 파트너를 선택하는데 사용될 수 있는 Fc 돌연변이체의 라이브러리를 생성한다. 최적화는 각각의 신규 Fv 영역에 대해 모든 Fc CPE 변이체의 신속한 부착을 위해 설계된다. 달리는, 이들 Fe의 소세트를 사용하여 상이한 Fv에 부착시킬 수 있다. 이들 Fc CPE 변이체/Fv 조합 각각은 최적 발현을 위해 포유동물 세포(예를 들어, CHO, 비용-효과적인 배지) 속에서 발현된 완전한 길이의 항체로서 스크리닝된다. 또한, CPS를 수행하여 발현 증진용 포유동물 세포 내에서 이들 CPE 히트 중 12개 이하 또는 12개 이상의 모든 이론적인 순열을 스크리닝할 수 있다. 특이적으로 바람직한 코돈 변화를 또한 선택하여 발현이 증가된 클론을 확인할 수 있다. 잠재성 코돈을 확인하고 CPE를 이들 위치에서 수행한다. 이들 CPE 라이브러리를 스크리닝하여 최적의 발현 히트를 확인한다. 또한, 12개 이하 또는 12개 이상의 CPE 히트의 모든 이론적인 순열을 CPS 공정에서 사용하여 발현 증진용 포유동물 세포 내에서 스크리닝될 수 있는 신규한 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 상부(top) CPS 잠재 돌연변이 히트를 사용하여 특이적인 세포주 및 배지에서 최적 발현을 위해 단백질을 제작한다. 이는 바이오시밀러 우수한 구조 대조군에 대한 기회를 제공한다.
발현의 향상을 위한 다른 범위는 다음을 포함한다: 프로모터, 스플라이스 부위, 5' 및 3' 말단, 플랭킹 서열, 유전자 결실 및 재배열의 감소, 숙주 세포 유전자 활성의 증진, 숙주 글리코실화 효소의 최적화 및, 염색체 광범위한 숙주 세포 돌연변이 유발 및 선택. 5' 아미노산 서열은 발현의 향상에 중요함이 입증되어 있다.
선도 후보물질의 평가
어떠한 단백질 진화 방법도 단백질 성능과 발현 최적화의 동시 진화를 위해 사용할 수 있다. 단백질 성능의 최적화는 친화성, 약력학적 특징, 조직 표적화, 단백질-단백질 응집, 높은 분석 가변성의 중점 처리 및 생체내 특징에 있어서 다른 것의 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 선택된 후보물질을 포함하는, 분자를 진화시키기 위한 방법은 확률적 및 비-확률적 방법을 포함한다. 발표된 방법은 무작위 및 비-무작위 돌연변이 유발 시도를 포함한다. 이들 시도 중 어느 것도 사용하여 상이한 온도 또는 pH 환경에서 보다 우수한 안정성, 또는 숙주 세포에서 보다 우수한 발현과 같은 바람직한 특징에 대해 본 발명의 치료 단백질의 특성을 진화시킬 수 있다. 향상된 촉매 활성, 각종 조건에서 향상된 단백질 안정성, 향상된 선택성 및/또는 가용성, 및 감소된 응집과 같은 향상된 특징에 의한 향상된 발현 결과는 진화 실험에서 선택될 수 있다.
진화는 치료 단백질의 하부 생산을 위해 사용될, 포유동물 세포 숙주 또는 효모 세포 숙주와 같은 진핵 세포 숙주에서 직접 수행된다. 후보물질은 스크리닝 및/또는 진화시키고 제조하는데 사용된 동일한 숙주에서 최적 발현을 위해 진화시킬 수 있다. 발현 최적화는 사용된 벡터(프로모터, 스플라이스 부위, 5' 및 3' 말단 및 플랭킹 서열과 같은 벡터 성분)의 최적화, 유전자결실 및 재배열을 감소시키기 위한 숙주 세포의 유전자 변형, 관련 유전자를 진화시키는 생체내 또는 시험관 내 방법에 의한 숙주 세포 유전자 활성의 진화, 관련 유전자의 진화 및/또는 염색체 광범위 숙주 세포 돌연변이 유발에 의한 숙주 글리코실화 효소의 최적화 및, 발현능이 향상된 세포를 선택하기 위한 선택 방법에 의해 달성할 수 있다. 숙주 세포가 또한 본 명세서에 기술되어 있다.
세포 표면 디스플레이 발현 및 스크리닝 기술(예를 들어, 위에서 정의한 바와 같은)을 사용하여 제조될 후보물질에 대한 진화한 단백질의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
출발 분자로부터 대체 단백질을 생성하기 위해 광범위하게 사용된 현재의 방법은 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발 기술, 오류-발생이 쉬운(error-prone) 폴리머라제 쇄 반응 및 카세트 돌연변이 유발이며, 여기서, 최적화될 특이적인 영역은 합성적으로 돌연변이 유발된 올리고뉴클레오티드로 치환된다. 이 경우에, 다수의 돌연변이체 부위가 원래의 서열 내 특정 부위 주변에 생성된다.
올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발에서, 단축된 서열은 합성적으로 돌연변이 유발된 올리고뉴클레오티드로 치환된다. 오류-발생이 쉬운 PCR은 신뢰성이 낮은 중합 조건을 사용하여 긴 서열에 걸쳐 무작위하게 낮은 수준의 점 돌연변이를 도입시키며, 공지되지 않은 서열의 단편의 혼합물에서는, 오류-발생이 쉬운 PCR을 사용하여 혼합물을 돌연변이 유발시킬 수 있고, 카세트 돌연변이 유발에서는, 단일 템플릿의 서열 블록을 전형적으로 (부분적으로) 무작위화된 서열로 치환시킨다.
키메라 유전자는 2개의 폴리뉴클레오티드 단편을 제한 효소(들)에 의해 생성된 적합성 점착성 말단을 사용하여 연결시킴에 의해 제조되어 왔으며, 여기서, 각각의 단편은 별도의 후대(또는 모) 분자로부터 기원한다. 다른 예는 단일 부위-돌연변이 유발된 폴리펩티드를 암호화하는 단일의 후대 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위한 모 폴리뉴클레오티드내에서 단일 코돈 위치의 돌연변이 유발(즉, 코돈 치환, 첨가 또는 결실을 달성하기 위한)이다.
또한, 생체내 부위 특이적인 재조합 시스템을 이용하여 유전자의 하이브리드, 및 또한 생체내 재조합의 무작위 방법, 및 플라스미드 상에서 동종이지만, 트렁케이트(truncate)된 유전자 사이의 재조합을 생성시킨다. 돌연변이 유발은 또한 연장 및 PCR을 중첩함으로써 보고되어 왔다.
비-무작위 방법을 사용하여 다수의 점 돌연변이 및/또는 키메라화를 달성하여 왔는데, 예를 들어, 종합적이거나 철저한 시도를 사용하여 템플릿 분자 내에서 특이적인 구조적 그룹(예를 들어, 2개 이상의 아미노산 위치로 구성된 서열 또는 특이적인 단일 아미노산 위치)에 대한 기능성에 기여하고, 돌연변이의 특이적인 그룹화를 범주화하고 비교하기 위한, 돌연변이의 특수 그룹화 내에 모든 분자 종을 생성시켜 왔다. 미국 특허 7033781(발명의 명칭: "Whole cell engineering my mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating")는 바람직한 특징으로 유기체를 진화시키는 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 6764835(발명의 명칭: "Saturation mutagenesis in directed evolution") 및 미국 특허 6562594(발명의 명칭: "Synthetic ligation reassembly in directed evolution")는 분자의 바람직한 특징에 대한 철저한 진화 및 스크리닝 방법을 기술하고 있다. 이러한 어떤 방법도 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
본원의 바람직한 "포화 돌연변이 유발"의 이미 공지된 방법 및 "포괄적인" 진화 사이에 차이가 존재한다. 포화 돌연변이 유발은, 모든 가능한 변화는 템플릿 폴리뉴클레오티드 또는 템플릿 폴리펩티드의 각각의 위치에서 이루어지지만; 각 위치에서의 변화는 시험에 의해 확인되지 않고, 단지 통계적으로 추정되는 진화 기술을 말한다. 포괄적인 진화는, 모든 가능한 변화가 템플릿 폴리뉴클레오티드 또는 템플릿 폴리펩티드의 각각의 위치에서 이루어지고 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 의도된 변화가 이루어졌는지를 확인하기 위해 시험되는 진화 기술을 말한다.
포화 방법은 고유의 통계적이고, 비-포괄적인 방법이며, 또한 모든 단계(예를 들어, 교차 돌연변이체 생성, 돌연변이체 확인, 돌연변이체 단백질 발현, 돌연변이체 단백질 스크리닝 및, 재조합된 상향-돌연변이체 생성, 확인, 발현 및 스크리닝)에 걸쳐 진실로 절대 종합적이지 않다. 포괄적인 진화 기술에서, 각각의 분자는 돌연변이 유발의 제1 단계 및 또한 상향-돌연변이체 또는 히트를 재조합시키는 제2 단계 둘다에서 스크리닝되고 확인된다.
포화 돌연변이 유발이 서열분석 또는 다른 일부 방법에 의해 확인되지 않는 한, 당해 기술은 수개의 가능한 이유로 인해 포괄적인 것으로 고려될 수 없다. 예를 들어, 1) 클로닝 시스템은 클로닝 또는 합성 오차, 또는 분자를 클론하는데 어려움으로 인하여 100% 효율적이지 않거나 2) 일부 단백질은 발현되는 경우 독성이므로 효율적으로 발현될 수 없다. 따라서, 각각의 단계에서 서열분석 또는 일부 다른 기술에 의해 확인하는 것이 중요하다. 발현을 위해 스크리닝하기 위하여 매 단계를 점수매기는 것이 유용하므로, 비-발현 클론은 앞서의 작업에서와 같이 "음성"으로 지정되지 않으며, 이들은 단지 비-발현성으로 점수매겨진다. 따라서, 포괄적인 기술은 "확인" 단계에 의해 확인되는 바와 같이, 포화 기술보다 더 순수한 비-확률적 시스템인 것으로 고려된다.
포괄적인 위치 진화
도 1을 참조하면, 제1 단계에서, 단순한 예로서 선형 펩티드를 사용하여, 1 내지 n번 위치(여기서, n은 폴리펩티드 쇄내 잔기의 수에 상응한다)로부터의 각각의 코돈에 대한 자연 존재하는 아미노산 변이체의 세트(또는 이의 소세트, 또는 아미노산 유도체)를 본원에서 포괄적인 위치 진화(CPETM)로 언급된 공정으로 생성시킨다. 당해 과정은 표적 분자의 각각의 폴리펩티드 쇄에 대해 반복한다. 아미노산 돌연변이의 최소 세트는 19개의 아미노산 각각에 대해 단지 하나의 코돈을 함유한다. 그러나, 각각의 발현 시스템은 코돈 편향(codon bias)으로 고생할 수 있으며, 여기서, 불충분한 tRNA 혼주물(pool)은 해독 스탈링(translation stalling), 조기성숙 해독 종결, 해독 프레임쉬프팅(frameshifting) 및 아미노산 오혼입(misincorporation)을 일으킬 수 있다. 따라서, 발현 최적화를 위해 각각의 세트는 정지 코돈을 포함하는 63개 이하의 상이한 코돈을 함유한다. 다음 단계에서, 돌연변이는 각각의 신규 분자를 서열분석하여 확인된다. 다른 확인 방법이 또한 사용될 수 있다.
그런 다음, 각각의 아미노산 세트는,
- 향상된 기능
- 중성 돌연변이
- 억제 돌연변이
- 발현
- 클론과 숙주 시스템의 적합성 중
적어도 하나에 대해 스크린된다.
예를 들어, 향상된 기능 및 발현과 같은 다수 특징을 동시에 스크리닝하는 것이 바람직하다.
각각의 세트에 대한 데이터를 전체 폴리펩티드 쇄(들)에 대해 합하고 표적 분자의 상세한 기능성 맵(본원에서 EvoMapTM으로 언급)에 대해 결합시킨다. 당해 맵은, 각각의 돌연변이가 수행/발현 및/또는 표적 분자의 클로닝 능력에 영향을 미치는 방법에 대한 상세한 정보를 함유한다. 이는 모든 부위의 확인을 허용하며, 여기서, 무 변화는 단백질 기능(예를 들어, 항체의 경우에 항원/수용체 결합)에 있어서의 손실 없이 이루어질 수 있다. 이는 또한, 기능에 영향을 미치지 않고 변화가 이루어질 수 있는 곳을 나타낸다. 이는 또한, 숙주 시스템에서 발현하지 않음으로써, 돌연변이의 효과를 평가할 수 없는 분자를 초래하는 변화를 확인한다.
이론적인 EvoMapTM의 개략도는 도 1에 나타낸다. 템플릿에서 각각의 위치는 제한된 부위(돌연변이 불가능한), 완전히 돌연변이 가능한 부위, 부분적으로 돌연변이 가능한 부위 또는 특이적인 아미노산 치환을 위한 상향-돌연변이체로서 확인된다. 각각의 부분적으로 돌연변이 가능한 부위는 또한 예를 들어, 하전된 잔기로의 치환 또는 비-극성 잔기 치환와의 치환, 및 숙주 시스템에서 클로닝될 수 없는 분자 및/또는 비-발현 클론으로 치환하기 쉽도록 설계될 수 있다.
유리한 단일 아미노산 치환을 인식하여 재조합하고, 표적 분자에 있어 바람직한 특징을 추가로 최적화하기 위해 스크리닝하도록 하기 위해 EvoMapTM을 이용하는 것도 가능하다. 그러나, 특정 특징의 진화는 2개 이상의 동시 돌연변이가 관측가능하도록 하는 것이 요구될 수 있다. EvoMapTM을 이용하여 비-무작위 방식으로 다중-부위 돌연변이체 폴리펩티드의 세트를 효율적으로 및 비용 효과적으로 생산할 수 있다. 이후에, 다중-부위 돌연변이체 폴리펩티드의 세트를 다중-부위 상향돌연변이체에 대해 스크리닝할 수 있다.
CPE는 완성된 생체내 확인된 단배질 돌연변이 맵을 가능하도록 한다. 상향-돌연변이체의 전체 세트의 확인은 추가 조합 진화 단계(들)을 가능하도록 한다. CPE는 비-표면 돌연변이의 선택; T-세포 에피토프의 제거; 및 체세포 돌연변이의 모방에 의해 진화된 단백질의 면역원성 위험을 감소시키기 위해 이용할 수 있다.
일 측면에서, CPE는 5개, 10개 또는 15개 이하의 아미노산, 또는 모든 19개 이하의 아미노산의 라이브러리를 생성하는데 사용할 수 있다. 변화는 단백질내 각각의 위치에서 이루어지며 결합 친화성 또는 발현과 같은 바람직한 특징에 대해 스크리닝되고, EvoMapTM이 생성된다. 돌연변이 및 스크리닝의 후기 라운드를 사용하여 모든 19개 아미노산에 대한 데이터를 생성할 수 있다. 맵으로부터, 완전하게 돌연변이 가능한 부위가 확인된다. 이들 부위는 새로운 특징에 대해 제조될 수 있고 시험될 수 있는 분자의 신규 수집을 생성하기 위해 변형될 수 있는 위치를 확인하는데 유용하다. 예를 들어, 정보학(informatics)을 사용하여 서열 내 HLA 일배체형을 확인할 수 있고, 바람직한 변화를 이루어서 맵으로부터 확인된 "중성"("완전히 돌연변이 가능한") 부위에서 특이적인 표적화된 변화를 제조함으로써 이들 일배체형을 피할 수 있으며, 여기서, 주요 특징은 영향받지 않을 것이다. 이는 잠재적으로 면역원성 위험을 감소시킬 수 있다(비-표면 돌연변이를 선택하고, t-세포 에피토프를 제거하며 초체세포(hypersomatic) 돌연변이를 모사할 수 있다). 또한, 당해 맵은 각종 특징을 증진시키기 위한 부위 특이적인 변형(글리코실화 및 화학적 접합)에 대한 부위를 나타낼 수 있다. 또한, 잠재 돌연변이의 최적화는 각종 숙주에서 단백질 발현을 증진시킬 수 있다.
상승작용 진화( Synergy Evolution )
본 발명의 일 실시예에서, EvoMapTM은 도 2에 나타낸 바와 같이, 상승작용 진화를 위해 생성되어 이용된다. 상승작용 진화에서, 2 내지 20개의 선택된 부위에서 동시 돌연변이를 결합시켜 조합 효과를 생산할 수 있다. 템플릿 폴리펩티드의 EvoMapTM을 사용하여 다중-부위 폴리펩티드 돌연변이에 대한 조립에 대해 특이적인 단일 아미노산 점 돌연변이를 선택할 수 있다.
상승작용 진화에서, 비-탈활성화 아미노산 점 돌연변이를 EvoMapTM상의 비-돌연변이 가능한 부위 근처에 있는 부분적으로 돌연변이 가능한 부위 내로부터 선택한다. 일 측면에서, 선택된 비-탈활성화 점 돌연변이는 비-돌연변이 가능한 부위에 근접하여 존재한다. 상승작용 진화에서, 선택된 부위의 2 내지 20개에서 아미노산의 동시 돌연변이를 조합 효과를 위해 수행한다. 일 측면에서, 2 내지 20개의 선택된 돌연변이의 재조합을 사용하여 다중-부위 돌연변이체 폴리펩티드의 집단을 암호화하는 코돈 변이체 라이브러리를 생산하다. 클로닝 및 발현에 이어서, 생산된 다중-부위 돌연변이체 폴리펩티드를 이후에 템플릿 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 스크리닝하며, 이러한 방식으로, 다중-부위 상향돌연변이체 폴리펩티드가 확인될 수 있다. 일 측면에서, 다중-부위 돌연변이체 폴리펩티드는 조합 단백질 합성에 의해 생산되다. 상승작용 진화의 하나의 장점은, 이것이 템플릿 폴리펩티드의 진화를 지시하기 위한 단백질 x-선 결정 구조를 필요로 하지 않는다는 것이다. 당해 기술은 고 검정 변화 및 다른 다중-부위 효과를 가진 단백질의 경우 특히 유용하다.
본 발명에 따라서, 상승작용 진화의 적용은 복합체 분자 기계적 변화의 진화, 고 검정 변이를 지닌 단백질의 진화, 단백질 특이성의 진화, 각종 발현 숙주에서 발현의 증진, 단백질 촉매 확성, 안정성 및 pH 최적화의 증진을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상승작용 진화는 호르몬, 효소, 사이토킨 및 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 모든 단백질 치료 유형에 적용가능하다.
본 발명의 일 측면에서, 상승작용 진화를 사용하여 단백질 분자의 일부인 폴리펩티드의 하나 이상의 측면을 최적화할 수 있다. 단백질 분자는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 돌연변이체 핵산을 골격 폴리펩티드를 암호화하는 0개 또는 하나 이상의 핵산과 연결시켜 당해 분야에 공지된 클로닝, 해독 및 발현 기술에 의해 변이체 단백질을 생성시킴으로써 조립할 수 있다. 일 측면에서, 골격 폴리펩티드는 야생형 단백질 분자로부터 기원한다. 당해 측면에서, 상승작용 진화는 항체 인간화 기술과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스 단클론 항체는 진화 및 인간화를 위해 선택할 수 있다. 항체의 CDR 영역을 클로닝하고 서열분석하며 개개의 CDR 영역((CDR1, CDR2, CDR3)을 합성하고 인간 항체 골격 폴리펩티드를 암호화하는 다른 뉴클레오티드에 연결한 후 인간 변이체 IgG 라이브러리를 생산할 수 있다. 인간 변이체 IgG 라이브러리는 이후 적어도 하나의 특성, 예를 들어, 마우스 mAb와 비교하여, 향상된 기능 및 발현을 포함하는 2개 이상의 특성에 대해 스크리닝된다. 다른 측면에서, 골격 폴리펩티드는 인공적인 스캐폴드 폴리펩티드이다. ds DNA 단편 제조, 핵산의 연결 및 조립, 클로닝, 형질감염, 발현, 하이브러리의 고체 상 합성, 라이브러리의 용액 상 합성, 포괄적인 위치 진화, 조합적인 단백질 합성, ELISA 정량화에 의한 발현의 정량화 및 β-갈락토시다제 검정, 및 기능적 ELISA의 특이적인 기술을 예 단락에서 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상승작용 진화를 사용하여 항체의 결합 친화성을 향상시킬 수 있으며, 당해 실시예에서, 항체 가변 영역의 최적화가 수행될 수 있다. 예를 들어, 인간 돌연변이체의 생산을 위해, CPE를 선택된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대해 수행하고 EvoMapTM을 생성시킨다. 돌연변이체를 재조립을 위해 선택하는데; 예를 들어, 조립을 위해 경쇄의 변이체를 선택하고 중쇄의 변이체를 선택한다. 비-탈활성화 아미노산 점 돌연변이를 비-돌연변이 가능한 부위인 부분적으로 돌연변이 가능한 부위로부터 선택한다. CPS를 이용하는 재조립 기술을 사용하여 중쇄의 라이브러리를 생성할 수 있다. 경쇄 변이체는 중쇄 변이체와 합하여, 크로닝하고, 발현시켜 변이체를 진핵 세포주 상층액으로부터 완전한 IgG로서 스크리닝한다. 특정의 변이체에 대한 결합 친화성은 예를 들어, ELISA, BIAcore 및/또는 사피다인(Sapidyne) 기기장치 검정, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술로 검정한다.
플렉스 진화( Flex Evolution )
또 다른 실시예에서, CPE/EvoMap을 사용하여 완전한 돌연변이 가능한 부위를 확인하고 이용할 수 있다. 일 측면에서, 다수의 완전한 돌연변이 가능한 부위의 이용이 플렉스 진화로 명명되며 글리코실화용 부위(예를 들어, N- 또는 O-연결된 글리코실화용 아미노산에 대한 코돈: 컨센서스 서열 Asn-Aa-Ser-Thr 또는 Ser/Thr내 Asn)의 도입 및 화학적 접합과 같은 표적화된 변화를 제조한다. 플렉스 진화는 또한 프로테아제 절단 부위의 설계, 정제 및/또는 검출용 태그의 도입, 부위-특이적인 표지화 등의 설계시 사용할 수 있다. 또한, 잠재 돌연변이의 코돈 최적화를 단백질 발현의 증진을 위해 이용할 수 있다. 당해 실시예에서, 명명된 플렉스 진화에 이어, 단백질 발현, 생산된 돌연변이체 폴리펩티드 라이브러리를 템플릿 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 재스크리닝한다. 일 측면에서, 미리 결정된 특성은 단백질-단백질 응집의 감소, 단백질 안정성의 향상, 또는 증가된 단백질 가용성을 포함한다. 일 측면에서, 돌연변이체 폴리펩티드 라이브러리는 2개 이상의 특성에 대해 동시에 스크리닝된다. 다른 측면에서, 예를 들어, 포유동물, 식물, 효모 및 곤충 세포주와 같은, 글리코실화되는 어떠한 진핵 세포 발현 시스템도 글리코실화 부위의 도입에 사용될 수 있다.
플렉스 진화에서, 생물정보학의 평가 및 관련된 단백질, 또는 템플릿 단백질 또는 폴리펩티드의 단백질 x-선 결정 구조는 템플릿 최적화에 유용하다. 일 측면에서, 선택된 부위는 접촉 잔기가 아니다. 다른 측면에서, 비-표면 단백질 돌연변이의 선택은 감소된 면역원성 위험을 허용한다.
플렉스 진화의 적용은 단백질-단백질 응집의 감소, 단백질 가용성의 증진, 글리코실화 라이브러리를 통한 약력학의 최적화, 단백질 제2 및 제 3 구조의 최적화 및, 돌연변이 세트를 통해 직접적으로 또는 글리코실화 차폐를 통해 간접적으로 항원 부위의 탈면역화를 포함하나, 어느 정도는 이에 제한되지 않는다.
플렉스 진화의 일 측면에서, EvoMapTM을 이용하여 완전히 돌연변이 가능한 부위를 확인하며, CPS 생성을 글리코실화 잔기의 완전히 돌연변이 가능한 부위(또는 해독 효과를 위한 잠재 돌연변이)의 삽입으로 수행하고, 조합 글리코실화된 라이브러리의 스크리닝을 분석적 분석(예를 들어, 질량 분광학 분석, 동적 광 산란), 면역원성 감소(생물정보학 또는 검정에 의한), 및/또는 약력학적 분석[예를 들어, 폭스늘누(Foxnlnu) 마우스]에 의해 수행한다.
일 측면에서, 플렉스 진화는 기능을 유지하면서 면역원성을 제거하기 위한 탈면역화에 사용될 수 있다. 플렉스 진화 탈면역화는 면역원성을 글리코실화로 차폐하고, 면역원성을 제거할 수 있는 인간 초체세포 돌연변이 스펙트럼 아미노산 치환을 확인하는 한편, 기능, 면역원성 잠재능을 피하기 위한 투여량 감소, 및 비-표면 아미노산 잔기 변화의 최소화를 확인함으로써 수행할 수 있다. 또한, 면역원성 데이터베이스 및 알고리즘을 사용하여 잠재적인 MHC 결합 에피토프를 확인하고 대체할 수 있다. 일 측면에서, 실리코 변형 예측은 CPE/CPS 데이터와 커플링시켜 변이체를 생성한다.
T-세포 에피토프 및/또는 탈면역화를 생성하기 위한 감소된 경향은 당해 분야에 공지된 기술로 측정할 수 있다. 바람직하게, 단백질의 탈면역화는 T 세포 증식 검정에 의해 시험관 내에서 시험할 수 있다. 당해 검정에서, 세계에서 HLA-DR 대립유전자의 >80%를 나타내는 공여자로부터의 PBMC를 야생형 또는 탈면역화된 펩티드에 대한 반응에 있어 증식에 대해 스크리닝한다. 이상적으로 세포 증식은 단지 야생형 펩티드를 지닌 항원-제공 세포의 로딩(loading)시 검출된다. 탈면역화를 위한 추가 검정은 인간 시험관 내 PBMC 재-자극 검정[예를 들어, 인터페론 감마(TH1) 또는 IL4(TH2) ELISA]을 포함한다. 대안적으로, 모든 일배체형을 나타내는 HLA-DR 테트라머를 발현시킴으로써 탈면역화를 시험할 수 있다. 탈-면역화된 펩티드가 HLA-DR 일배체형에서 표시되는지를 시험하기 위하여, 예를 들어, PBMC에서 형광성-표지된 펩티드의 결합을 측정할 수 있다. HLA I 부류와 II 부류 유전자삽입 마우스의 측정은 표적 항원(예를 들어, 인터페론 감마 또는 IL4)에 대한 반응에 대해 이루어질 수 있다. 달리는, 교육된 T 세포(MHCI 9머; MHCII 20머)를 사용한 에피토프 라이브러리 스크리닝은 PBMC 및/또는 유전자삽입 마우스 검정으로부터 이루어질 수 있다. 또한, 탈면역화는, 탈면역화된 분자에 대한 항체가 환자에서 투여 후 생성되는지를 측정함으로써 입증될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 플렉스 진화 기술은 발현 최적화에 사용할 수 있다. 일 측면에서, 본 발명은 진핵 세포 내에서 발현이 향상된 잠재 돌연변이 코돈 최적화된 Fc 변이체를 개발하기 위한 단백질 가공 방법의 유용성을 기술한다. 잠재 돌연변이는, DNA 서열의 변이가 단백질의 아미노산 서열 내 변화를 초래하지 않는 것이다. 일 측면에서, 코돈 돌연변이 유발은 진핵 세포 발현의 최적화를 위한 고정 영역 내에서 수행된다. 발현 특성이 증진되었지만 효과기 기능을 매개하기 위한 능력을 보유하는 코돈 최적화된 Fc 변이체는 치료 항체의 생산을 증진시킨다. 당해 측면에서, 예를 들어, 항체 분자의 고정 영역은 상이한 발현 숙주에서 스크리닝, 예를 들어, CHO, HEK293 및 COS-7을 이용한 포유동물 세포주 발현 스크리닝을 위해 진화시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현에 대한 고정 영역 내 코돈 돌연변이 유발에 의한 발현 최적화의 하나의 예는 도 3에 나타나 있으며 예 19에 기술되어 있다. 나타낸 발현 수준은 각각 4개의 데이터 점의 평균이고, 다수 실험에 걸쳐 확인되다. 다수 세포주 능력은 HEK293 및 CHO 세포주 발현 시스템에서 시험된 제1 돌연변이체에 대해 입증되었다.
또한, EvoMapTM을 사용하여 올리고펩티드, 또는 이의 특이적인 영역의 3-차원 컴퓨터 분자 모델을 생성하고, 예를 들어, 항체-에피토프 특이성 및 안정성에 포함된 구조적 메카니즘을 실험할 수 있다. 이론적 3-차원 EvoMapTM은 도 13에 나타낸다.
EvoMap에서의 정보는 또한 구조적 정보(이용가능할 경우)와 결합시켜 예를 들어 가용성을 증가시키고/응집을 감소시키기 위한 돌연변이용 표면 잔기만을 선택할 수 있다.
포괄적인 위치 삽입 진화
일 실시예에서, 본원은 템플릿 펩티드로부터 또는 이를 기준으로 형성된 돌연변이체 폴리펩티드를 확인하고 맵핑하는 방법을 제공한다. 제1 단계에서 단순 예로서, 선형 펩티드를 사용하는 도 9을 참조하면, 2번 내지 n번(여기서, n은 폴리펩티드 쇄내 잔기의 번호에 상응한다)으로부터의 각각의 코돈에 대한 자연 존재하는 아미노산 변이체(또는 이의 소세트, 또는 아미노산 유도체)의 세트는 포괄적인 위치 삽입(CPITM) 진화로 본원에서 언급된 공정에 의해 생성된다.
CPITM에서, 아미노산은 1회에 1개의 템플릿 폴리펩티드를 통해 각각의 아미노산 다음에 삽입되어 길어진 폴리펩티드의 세트를 생성한다. CPI는 1회에 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 새로운 부위를 삽입하는데 사용될 수 있다. 20개 아미노산 각각은 각각의 신규 위치에 1회에 1개 가해져서 템플릿 내에 가해진 각각의 새로운 위치에서 20개의 상이한 분자의 세트를 생성한다. 이 경우, 메티오닌이고 변이체가 아닌 1번 위치는 생략된다. 당해 과정은 표적 분자의 각각의 폴리펩티드 쇄에 대해 반복된다. 아미노산 돌연변이의 최소 세트는 20개의 천연 아미노산 각각에 대해 단지 1개의 코돈을 함유한다.
본 발명은 템플릿 폴리펩티드로부터 또는 이를 기준으로 형성된 돌연변이체 폴리펩티드를 확인하고 맵핑하는 방법에 관한 것이다. 대표적으로, 폴리펩티드는 n개 아미노산 잔기를 포함할 것이며, 여기서, 당해 방법은 (a) n+[20×(n-1)]개의 개별 폴리펩티드를 생성하고, 여기서, 각각의 폴리펩티드는, 이것이 템플릿 내에서 1회에 20개 아미노산 중 각각 1개가 각각의 위치 다음에 삽입된다는 점에서 템플릿 폴리펩티드와는 상이하며(도 1에 나열됨); 각각의 폴리펩티드를 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 검정하는 단계; 및 (b) 템플릿 폴리펩티드에 대해 상기 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 어떠한 변화도 확인하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 하나 이상의 영역을 돌연변이 유발에 대해 선택하여 상기 기술된 바와 같이 1회에 1개 위치에 첨가된다. 이러한 경우에, n은 템플릿 폴리펩티드의 소세트 또는 영역을 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체인 경우, 전체 항체 또는 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 돌연변이 유발에 적용시켜 각각의 위치 다음에 템플릿 폴리펩티드내에서 1회에 1개 위치를 첨가한다.
따라서, 본 발명은 적어도 1개, 및 바람직하게는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖고, 여기서, CDR은 함께 n개의 아미노산 잔기를 포함하는, 템플릿 항체로부터 형성된 돌연변이체 항체 세트를 맵핑하는 방법을 포함하며, 당해 방법은 (a) n+[20×(n-1)]개의 개별 항체를 생성하고, 여기서, 각각의 항체는, 템플릿 서열 내 각각의 위치 다음에 1회에 1개씩 단일의 미리 결정된 위치가 삽입된다는 점에서 템플릿 항체와는 상이하고; (b) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 각각의 세트를 검정하며; (c) 각각의 구성원에 대해 템플릿 폴리펩티드에 대해 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 어떠한 변화도 확인함을 포함한다. 항체의 경우, 미리 결정된 특성, 특징 또는 특성은 예를 들어, 결합 친화성 및/또는 면역원성일 수 있다.
또한, 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 템플릿 항체로부터 형성된 돌연변이체 항체 세트를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서, CDR은 n개의 아미노산 잔기를 포함하고, 당해 방법은: (a) n+[20×(n-1)]개의 개별 항체를 생성하며, 여기서, 각각의 항체는, 이것이 CDR의 단일의 미리 결정된 위치에서 가해진 여분의 아미노산을 가진다는 점에서 템플릿 항체와는 상이함을 포함한다. 다른 실시예에서, 항체는 6개의 CDR을 포함하며, CDR은 함께 n개의 아미노산 잔기를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 위에서 기술된 새로운 연장된 폴리펩티드는 추가로 돌연변이시키고 스크리닝 후 맵핑하여 단축된 폴리펩티드에 대한 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 변화를 확인한다. 대표적으로, 연장된 폴리펩티드는 n개 아미노사 잔기를 포함할 것이며, 여기서, 당해 방법은 (a) n (초기 잔기가 메티오닌인 경우 n-1)개의 개별 폴리펩티드 세트를 생성하고, 여기서, 각각의 세트는 폴리펩티드의 단일의 미리 결정된 위치에서 X개 구성원의 서로 상이한 미리 결정된 아미노산 잔기를 갖는 구성원 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 폴리펩티드의 각각의 세트는 단일의 미리 결정된 위치에서 상이하고; 각각의 세트를 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 검정하며; (b) 각각의 구성원에 대해 템플릿 폴리펩티드에 대해 상기 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 어떠한 변화도 확인하고; 임의로 (c) 이러한 변화를 반영하는 기능 맵을 생성함을 포함한다. 바람직하게, 생성된 상이한 구성원 폴리펩티드의 수는 n×X (또는 [n-1]×X, 존재할 수 있는 경우)와 동등하다.
대안적으로, 당해 방법은 연장된 폴리펩티드로부터 돌연변이된 폴리펩티드의 세트를 포함하는 단일 집단을 생성함을 포함하며, 당해 실시예에서, 전체의 신규 집단이 스크리닝되고, 개개 구성원이 확인되며, 기능 맵이 생성된다.
통상적으로, 각각의 자연 존재하는 아미노산이 사용되는 경우, X는 19(템플릿 폴리펩티드의 제공된 위치 내에 존재하는 특수 잔기를 제외하고 20개의 자연 존재하는 아미노산 잔기를 나타냄)일 것이다. 그러나, 어떠한 아미노산의 소세트도 전체를 통해 사용될 수 있으며, 각각의 폴리펩티드 세트는 전체 집단에 사용된 총 X 모두 또는 소세트로 치환될 수 있다.
그러나, 각각의 발현 시스템은 코돈 편재(bias)로 고생할 수 있으며, 여기서, 불충분한 tRNA 풀은 해독 지체, 조기성숙 해독 종결, 해독 골격이동(frameshifting) 및 아미노산 오혼입을 초래할 수 있다. 따라서, 발현 최적화를 위하여 각각의 세트는 63개 이하의 상이한 코돈을 함유한다.
각각의 아미노산 세트를 이후에 개선된 기능; 중성 돌연변이, 억제 돌연변이 및 발현과 같은 적어도 1개, 및 바람직하게는 2개 이상의 바람직한 특성에 대해 스크리닝한다.
일 측면에서, 연장된 폴리펩티드를 맵핑하여 "야생형'과 비교하여 단축된 폴리펩티드를 초래하는 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 변화를 확인할 수 있다. 각각의 세트에 대한 데이터는 전체 폴리펩티드 또는 "표적 분자"와 결합된다. 이후에, 연장된 폴리펩티드(표적 분자)의 스크리닝으로부터의 히트(hit)는 추가 포괄적인 돌연변이 유발 쇄(들) 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 스크리닝에 사용될 수 있다. 돌연변이 유발로부터의 데이터는, 발생하는 표적 분자의 상세한 기능성 맵(본원에서 EvoMapTM이라고 함)을 제공한다. 당해 맵은, 각각의 돌연변이가 표적 분자의 성능/발현에 영향을 미치는 방법에 대한 상세한 정보를 함유한다. 이는, 단백질 기능(또는 항체의 경우에 항원/수용체 결합)에 있어서의 손실없이 변화가 이루어질 수 없는 모든 부위의 확인을 허용한다. 이는 또한, 기능에 영향을 미치지 않고 변화가 이루어지는 곳을 나타낸다.
또 다른 측면에서, CPE를 사용하여 각각의 목적한 위치에서 5, 10, 15개 이하, 또는 모든 19개 아미노산의 라이브러리를 생성할 수 있다.
포괄적인 위치 결실 진화
포괄적인 위치 결실 진화(CPDTM)는 템플릿 폴리펩티드로부터 또는 이를 기준으로 형성된 돌연변이체 폴리펩티드를 확인하고 맵핑하는 방법에 관한 것이다. CPD 진화는 1회에 1개 위치에서 단백질을 통해 모든 아미노산을 결실시킨다. 대표적으로, 폴리펩티드는 n개 아미노산 잔기를 포함할 것이며, 여기서, 당해 방법은 (a) n-1 (초기 잔기가 메티오닌인 경우에 n-2)개의 개별 폴리펩티드를 생성하고, 여기서, 각각의 폴리펩티드는, 이것이 단일의 미리 결정된 위치에서 결여되어 있다는 점에서 템플릿 폴리펩티드와는 상이하며; 각각의 폴리펩티드를 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 검정하며; (b) 각각의 구성원에 대해 템플릿 폴리펩티드에 대해 상기 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 어떠한 변화도 확인함을 포함한다.
CPD 진화의 일 실시예에서, 하나 이상의 영역을 돌연변이 유발에 대해 선택하여 1회에 1개 위치를 제거한다. 이러한 경우에, n은 템플릿 폴리펩티드의 소세트 또는 영역을 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체인 경우, 전체 항체 또는 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 돌연변이 유발에 적용시켜 템플릿 폴리펩티드에서 1회에 1개 위치를 제거한다.
일 실시예에서, 따라서, CPD는 적어도 1개, 및 바람직하게는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 템플릿 항체로부터 형성된 돌연변이체 항체 세트를 맵핑하는 방법을 포함하며, CDR은 함께 n개 아미노산 잔기를 포함하고, 당해 방법은 (a) (n-1)개의 개별 항체를 생성하고, 여기서, 각각의 항체는 단일의 미리 결정된 위치를 결여하고 있다는 점에서 템플릿 항체와는 상이하며; (b) 각각의 세트를 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 검정하며; (c) 각각의 구성원에 대해 템플릿 폴리펩티드에 대해 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 어떠한 변화도 확인함을 포함한다. 항체의 경우, 미리 결정된 특성, 특징 또는 특성은 예를 들어, 결합 친화성 및/또는 면역원성일 수 있다.
CDR 진화의 일 측면은 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 템플릿 항체로부터 형성된 돌연변이체 항체 세트를 생산하는 방법을 포함하며, 당해 CDR은 n개의 아미노산 잔기를 포함하고, 당해 방법은: (a) n-1개의 개별 항체를 생성하며, 여기서, 각각의 항체는 이것이 CDR의 단일의 미리 결정된 위치에서 결여되어 있다는 점에서 템플릿 항체와는 상이함을 포함한다. 다른 실시예에서, 항체는 6개의 CDR을 포함하며, CDR은 함께 n개 아미노산 잔기를 포함한다.
CPD 진화의 또 다른 실시예에서, 위에서 기술된 새로운 단축된 폴리펩티드는 추가로 돌연변이시키고 스크리닝 후 맵핑하여 단축된 폴리펩티드에 대한 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 변화를 확인한다. 대표적으로, 단축된 폴리펩티드는 n개 아미노산 잔기를 포함할 것이며, 여기서, 당해 방법은 (a) n (초기 잔기가 메티오닌인 경우 n-1)개의 개별 폴리펩티드 세트를 생성하고, 여기서, 각각의 세트는 폴리펩티드의 단일의 미리 결정된 위치에서 X 개의 상이한 미리 결정된 아미노산 잔기를 갖는 구성원 폴리펩티드를 포함하며; 여기서, 폴리펩티드의 각각의 세트는 단일의 미리 결정된 위치에서 상이하며; 각각의 세트를 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 검정하며; (b) 각각의 구성원에 대해 템플릿 폴리펩티드에 대해 상기 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 어떠한 변화도 확인하고; (c) 이러한 변화를 반영하는 기능 맵을 생성함을 포함한다. 바람직하게, 생성된 상이한 구성원 폴리펩티드의 수는 n×X (또는 [n-1]×X, 존재할 수 있는 경우)개와 동등하다.
대안적으로, 당해 CPD 방법은 단축된 폴리펩티드로부터 돌연변이된 폴리펩티드의 세트를 포함하는 단일 집단을 생성함을 포함하며, 당해 실시예에서, 전체의 신규 집단이 스크리닝되고, 개개 구성원이 확인되며, 기능 맵이 생성된다. 대표적으로, 각각의 자연 존재하는 아미노산이 사용되는 경우, X는 19(템플릿 폴리펩티드의 제공된 위치 내에 존재하는 특수 잔기를 제외하고 20개의 자연 존재하는 아미노산 잔기를 나타냄)일 것이다. 그러나, 어떠한 아미노산의 소세트도 전체를 통해 사용될 수 있으며, 각각의 폴리펩티드 세트는 전체 집단에 사용된 총 X의 모두 또는 소세트로 치환될 수 있다.
어떠한 돌연변이 또는 합성 수단도 CPD 진화에서 돌연변이체의 세트를 생성하는데 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 폴리펩티드의 생성은 (i) 템플릿 폴리펩티드를 암호화하는 코돈-함유 폴리뉴클레오티드를 폴리머라제-계 증폭에 64배 변성 올리코뉴클레오티드를 돌연변이 유발시킬 각각의 코돈에 대해 사용하여 적용시키고, 여기서, 64-배의 변성 올리고뉴클레오티드 각각은 제1 동종 서열 및 변성 N,N,N 삼중 서열로 이루어짐으로써 후대 폴리뉴클레오티드의 세트를 생성하며; (ii) 후대 폴리펩티드의 세트를 클로날 증폭에 적용시킴으로써 후대 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드가 발현되도록 함을 포함한다.
CPD 진화의 일 실시예에서, 전체의 단축된 폴리펩티드는 포화 돌연변이 유발에 적용시키며, 다른 실시예에서, 하나 이상의 영역은 포화 돌연변이 유발을 위해 선택된다. 이러한 경우, n은 템플릿 폴리펩티드의 소세트 또는 영역을 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체인 경우, 전체 항체 또는 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)은 포화 돌연변이 유발에 적용시킨다.
따라서, CPD 진화는 적어도 1개, 및 바람직하게는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖고, CDR은 함께 n개의 아미노산 잔기를 포함하는, 단축된 템플릿 항체로부터 형성된 돌연변이체 항체 세트를 맵핑하는 방법을 포함하며, 당해 방법은 (a) n의 개별 항체 세트를 생성하고, 여기서, 각각의 세트는, CDR의 단일의 미리 결정된 위치에서 상이한 미리 결정된 X개의 아미노산 잔기를 갖는 구성원 항체를 포함하며; 여기서, 항체의 각각의 세트는 단일의 미리 결정된 위치 내에서 상이하고; 생성된 상이한 구성원 항체의 수는 n x X와 동등하며; (b) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 각각의 세트를 검정하며; (c) 각각의 구성원에 대해 템플릿 폴리펩티드에 대해 특성, 특징 또는 활성에 있어서의 어떠한 변화도 확인하고; (d) 이러한 변화의 구조적 위치 맵을 생성시킴을 포함한다. 항체의 경우, 미리 결정된 특성, 특징 또는 특성은 결합 친화성 및/또는 면역원성일 수 있다. 위에서 명시된 바와 같이, 대안으로 돌연변이된 항체 세트 모두를 포함하는 단일 집단이 생성될 수 있다.
또한, 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 단축된 템플릿 항체로부터 형성된 돌연변이체 항체 세트를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 CDR은 n개의 아미노산 잔기를 포함하고, 당해 방법은, (a) n의 개별 항체 세트를 생성하며, 각각의 세트는 CDR의 단일의 미리 결정된 위치에서 상이한 미리 결정된 아미노산 잔기의 X개를 갖는 구성원 항체를 포함하고; 여기서, 항체 세트 각각은 단일의 미리 결정된 위치에서 상이하며; 생성된 상이한 구성원 항체의 수는 n×X와 동등하다. 다른 실시예에서, 항체는 6개의 CDR을 포함하며, CDR은 함께 n개 아미노산 잔기를 포함한다.
CPMTM 진화 방법은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제조된 기능적 위치 맵(EvoMapTM)을 포함하고, 추가 실시예에서, 변화에 특히 민감한 특정의 잔기는 EvoMapTM 상에 나타낼 수 있다. 추가 최적화는 이들 민감성 위치의 외부의 위치에서 추가 돌연변이적 변화를 이룸으로써 시행할 수 있다. 조합 단백질 합성(CPSTM)이라 불리는 공정에서, 유리한 단일 아미노산 치환을 인식하고 조합시키며, 표적 분자 내 바람직한 특징을 추가로 최적화하기 위해 스크리닝하기 위해서 EvoMapTM을 이용하는 것도 또한 가능하다.
조합 단백질 합성
조합 단백질 합성(CPSTM)은 CPE, CPI, CPD, 또는 어떠한 다른 진화 기술로부터의 개개의 히트를 결합시켜 2개 이상의 돌연변이를 결합함을 포함한다. CPS를사용하여 돌연변이가 조합된 단백질을 합성하고 이후에 이를 최적화된 유전자 및 단백질 특징에 대해 스크리닝한다. CPSTM의 개략도는 도 3에 나타낸다. 일 측면에서, 상향-돌연변이체(up-mutant) 또는 중성 돌연변이체를 초래하는 2개 이상의 점 돌연변이를 CPS 내에서 조합시킨다.
일 실시예에서, CPE는 CPS와 결합시켜 돌연변이체를 생성한 후, 이를 바람직한 특성에 대해 스크리닝한다. 일 측면에서, 시간 및 공급원은 1회에 1개에 대해 1회에 2개의 aa 또는 3개의 aa 또는 4개의 aa를 변화시킴으로써 CPE 공정내에서 저장할 수 있고; 이렇게 하여 단백질내 aa의 수가 N개인 경우, 1회에 2개의 aa에 대해 생성되고 스크리닝된 총 수는 (202)×½N일 수 있으며, 1회에 3개는 (203)×⅓N 등이 될 수 있다. 예를 들어, 하나의 특이적인 측면에서, (2aa 예에서): 첫 번째 aa 위치에서 첫 번째 aa는 두 번째 aa 위치에서 모든 20개와 결합하고 모든 다른 aa는 동일하게 남은 후, 첫 번째 aa 위치에서 두 번째 aa는 2번째 aa 위치에서 모든 20개와 결합하고 모든 다른 aa가 동일하게 남는다. 전체 집단을 상향 돌연변이에 대해 스크리닝한 후 라인 하부의 다음 2개의 aa의 두 번째 세트에서 돌연변이를 수행한다. 유사한 측면에서, 이는 1회에 3개의 aa에 대해 수행하거나 1회에 4개의 aa에 대해 수행할 수 있다. 다른 측면에서, 임의로 상향돌연변이체(이의 특정 소세트 포함)의 CPS를 사용한 CPE 공정이 따른다.
일 측면에서, 비-천연 아미노산을, 첨부되고 관련된 논문[참조: Neumann et al. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome Nature 464, 441-444 (14 February 2010)]에 기술된 콰드루플렛 코돈(quadruplet codon)과 같은 신규 기술을 사용함으로써 공정(따라서 19개의 다른 아미노산 모두 또는 이의 소세트와, 비-천연 아미노산)내로 도입할 수 있다. 당해 측면에서, CPE/CPS는 비-천연 아미노산의 혼입을 위해 수행된다.
추가 측면에서, 전체 CPE 라이브러리는 합성적으로(시판되는 기계에서 분자 모두를 합성) 생성된다. 합성기가 충분히 다량의 쇄(strand)를 생성할 수 없는 경우에, 단편이 합성된 후 연결되어 완전한 길이의 분자가 생성된다. 당해 라이브러리를 스크리닝하고 CPS를 수반하여 바람직한 돌연변이를 결합시킨다. 이는, CPE만의 1단계가 아닌, CPE에 이어 CPS가 수반되는 2단계 공정이다.
다른 측면에서, CPE 라이브러리가 생성되어 스크리닝된 후, 다음과 같이 상향 돌연변이체를 결합시키는 CPS가 수반된다: 10개의 상향-돌연변이체가 존재하는 경우, 모두 10개의 변화를 가진 단일 분자를 시험한 후, 9개의 돌연변이의 모든 버젼을 시험한 후, 그룹 중 하나가 앞서의 그룹에서 어느 것보다 향상된 분자를 발견하지 않을 때까지 8, 7, 6, 5 등으로 시험한다. 향상된 분자가 확인되면 공정이 종결될 수 있다.
추가 측면에서, CPE는 친화성 및 발현에 대해 상향-돌연변이체 및 중성 돌연변이를 확인하기 위해 수행된 후, CPS가 상향 돌연변이체 및 중성 돌연변이의 조합으로 수행되며, 라이브러리는 기능, 친화성 및/또는 발현과 같은 특징에 있어서의 추가 증진을 위해 재스크리닝된다.
추가 측면에서, CPE는 Fc의 코돈 상에서 또는 글리코실화 변화에 대한 다른 도메인에서 수행된다.
다른 측면에서, CPE 또는, 마이크로RNA 또는 인트론의 CPS와 결합된 CPE가 수행될 수 있다.
추가 측면에서, CPE 또는, 설치류 항체 CDR의 CPS와 결합된 CPE를 수행한 후, 상향-돌연변이체에 대해 스크리닝한 후 인간화한다.
일 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE를 수행하여 최종 반응에서 바람직한 돌연변이, 예를 들어 우라실로 전환하는 메틸화된 사이토신을 초래하는 대안의 중간체 뉴클레오티드를 생산한다.
일 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE 및 정보과학을 마우스 CDR을 인간 CDR로 전환시키거나 역으로 전환시키는데 이용한다.
일 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE를 단백질 전체에서 2개 및 3개 돌연변이와 함께 이용한다.
또 다른 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE를 증가된 민감성에 대한 스크리닝 평가를 위해 이중 쇄 벡터에서 사용한다.
추가 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE를 알로스테릭 변화(allosteric change)에 대해 스크리닝하는데 이용한다.
몇 가지 스크리닝 기술 중 어느 것도 사용하여 CPE/CPS 돌연변이체를 평가할 수 있다. 일 측면에서, CPE 또는, CPS 돌연변이체와 결합된 CPE를 선택하여 진핵세포 숙주에 디스플레이할 수 있다. 달리는, CPE 또는, CPS 돌연변이체와 결합된 CPE를 대장균내에서 생산하고 진핵세포 숙주에서 스크리닝할 수 있다. 다른 측면에서, CPE를 15aa 또는 10aa에서 출발한 후 CPS를 수행한 후; 나머지 19aa 중 나머지를 수행할 수 있다. 다른 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE를 비-표면 아미노산 변화를 사용하여 단백질을 특이적으로 진화시키는데 이용한다. 일 측면에서, CPE는 다-차원 에피토프 맵핑에 이용할 수 있다. 다른 측면에서, CPE 또는, CPS 스크리닝과 결합된 CPE는 진핵 세포 내에서 일시적으로 수행할 수 있다. 추가 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE를 수행한 후, 모든 클론의 서열 분석 및 정렬을 예를 들어, 발현 및 스크리닝을 위한 칩 기반 또는 웰-기반 포맷으로 수행한다. 다른 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE는 변화하는 이온 농도를 선택함으로써 금속 이온 배위를 진화시키는데 이용한다. 추가 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE를 수행하고, 단백질을 세포 유리된 조건 및 비-인간 살아있는 유기체내에서 발현시키고 스크리닝한다. 일 측면에서 CPE 또는, 줄기 세포의 CPS 스크리닝과 결합된 CPE를 분화 및 단백질과 RNA 및 mRNA 발현에 있어서 변화하는 효과에 대해 수행한다. 추가 측면에서, CPE 또는, CPS 복합 스크리닝과 결합된 CPE를 발현 및 결합과 같은 다수 단백질 특징에 대해 수행한다. 다른 측면에서, CPE 또는, CPS와 결합된 CPE는 뇌 이동 및 막 교차에 포함된 템플릿 분자에서 수행한다. 다른 측면에서, CPE 또는, CPS 돌연변이체와 결합된 CPE는 단백질 가습 특징에 대해 스크리닝하며, 다른 측면에서 CPE 또는, CPS 돌연변이체와 결합된 CPE는 역학적 단백질을 선택하기 위해 검정한다. 일 측면에서, CPE 또는 CPS 스크리닝과 결합된 CPE는 표적 조건을 벗어나서 수행함으로서 표적 조건내의 돌연변이체를 확인하며, 이의 역도 수행한다.
일 실시예에서, CPE 또는, CPS과 결합된 CPE의 상기 측면중 어느 것도 CPI, CPD 및, CPD와 CPI 조합으로부터 선택된 방법과 함께 이용된다.
또 다른 실시예에서, CPE 또는, CPS과 결합된 CPE의 상기 측면 중 어느 것도 플렉스 진화 및 템플릿으로부터 수행된 상승작용 진화로부터 선택된 방법과 함께 이용된다.
"템플릿"이라는 용어는, 염기 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 말할 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 어떠한 템플릿도 본 발명의 기술 및 조성물에 사용될 수 있다. 돌연변이됨으로써 진화될 수 있는 템플릿을 사용하여 본 발명에 기술된 바와 같은 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리의 합성을 안내할 수 있다. 본 명세서에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 진화 가능한 템플릿은 폴리펩티드의 합성을 암호화하며 후에 폴리펩티드의 합성 이력을 해독하고 폴리펩티드를 간접적으로 증폭시키고/시키거나 폴리펩티드를 진화(즉, 다양화, 선택 및 증폭)시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 진화 가능한 템플릿은 핵산이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 템플릿은 핵산을 기준으로 하며, 다른 실시예에서, 템플릿은 폴리펩티드이다.
본 발명에 사용된 핵산 템플릿은, DNA, RNA, DNA와 RNA의 하이브리드, 또는 DNA와 RNA의 유도체로 제조되며 단일쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 템플릿의 서열을 사용하여 폴리펩티드, 바람직하게는 핵산 또는 핵산 유사체(예를 들어, 비천연 중합체 또는 소 분자)가 아니거나, 또는 이와 유사하지 않은 화합물의 합성을 암호화한다. 특정의 비천연 중합체의 경우에, 핵산 템플릿을 사용하여, 중합체내에 나타날 서열 내 단량체 단위를 정렬하며, 이들을 템플릿에 따라 인접한 단량체 단위와 근접하도록 함으로써 이들을 반응시켜 공유 결합에 의해 연결할 것이며, 특정의 다른 실시예에서, 템플릿을 이용하여 뉴클레오티드의 무작위 영역으로 이루어진 합성 DNA 템플릿 라이브러리의 PCR 증폭에 의해 비-천연 중합체를 생성할 수 있다.
템플릿이 다수의 염기에서 현저히 변할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 특정 실시예에서, 템플릿은 10 내지 10,000개 염기 길이, 바람직하게는 10 내지 1,000개 염기 길이일 수 있다. 템플릿의 길이는 물론 코돈의 길이, 라이브러리의 복잡성, 합성할 비천연 중합체의 길이, 합성할 소 분자의 복잡성, 공간 서열의 용도 등에 의존할 것이다. 핵산 서열은 핵산 서열을 제조하기 위한 당해 분야에 공지된 어떠한 방법으로도 제조할 수 있다. 이들 방법은 PCR, 플라스미드 제조, 엔도뉴클레아제 분해, 고체상 합성, 시험관 내 전사, 쇄 분리 등을 포함하는 생체내 및 시험관 내 방법 둘다를 포함한다. 특정 실시예에서, 핵산 템플릿은 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 합성한다.
상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 특정 실시예에서, 당해 방법은 핵산 또는 핵산 유사체가 아니거나 이들과 유사하지 않은 폴리펩티드를 합성하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 특정 실시예에서, 핵산 템플릿은 비천연 중합체 또는 소 분자의 합성을 암호화하는 염기의 서열을 포함한다. 핵산 템플릿내에 암호화된 전령(message)은, 중합이 일어날 수 있는 화학적으로 반응성인 부위에서 일어나는 특이적인 코돈으로 개시하거나, 소 분자를 합성하는 경우에, "출발" 코돈은 소 분자 스캐폴드 또는 제1 반응제와 관련된 항-코돈을 암호화할 수 있다. 본 발명의 "출발" 코돈은 아미노산 메티오닌을 암호화하는 "출발" 코돈인, ATG와 유사하다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 핵산 템플릿 자체는 중합체 합성(예를 들어, 친핵체) 또는 소 분자 스캐폴드를 위한 개시 부위를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 핵산 템플릿은 단량체 단위의 중합을 개시하는데 사용된 반응성 그룹에서 종결하는 그 말단 중 한 쪽에 헤어핀 루프(hairpin loop)를 포함한다. 예를 들어, DNA 템플릿은 5'-아미노 그룹에서 종결하는 헤어핀 루프를 포함할 수 있으며, 이는 보호되거나 보호되지 않을 수 있다. 아미노 그룹으로부터 비천연 중합체의 중합이 시작될 수 있다. 반응성 아미노 그룹은 또한 소 분자 라이브러리를 합성하기 위하여 핵산 템플릿상에 소 분자 스캐폴드를 연결하는데 사용될 수 있다.
비천연 중합체의 합성을 종결시키기 위하여 "정지" 코돈은 바람직하게는 암호화 서열의 말단에서 핵산 템플릿내에 포함되어야 한다. 본 발명의 "정지" 코돈은 niRNA 전사체에서 발견된 "정지" 코돈(즉, TAA, TAG, TGA)와 유사하다. 이들 코돈은 단백질 합성의 종결을 이끈다. 특정 실시예에서, 비천연 중합체를 암호화하는데 사용된 인공 유전 코드와 혼용성인 "정지" 코돈이 선택된다. 예를 들어, "정지" 코돈은 합성을 암호화하는데 사용된 다른 어떠한 코돈과 상충하지 않아야 하며, 이는 템플릿에서 사용된 다른 코돈과 동일한 일반 형이어야 한다. "정지" 코돈은 추가 부착을 위한 반응성 그룹을 제공하지 않음으로써 중합을 종결하는 단량체 단위를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 정지 단량체 단위는 1차 아민보다는 아세트아미드와 같은 차단된 반응성 그룹을 함유할 수 있다. 여전히 다른 실시예에서, 정지 단량체 단위는 중합 단계를 종결하고 수득되는 중합체를 정제하는 편리한 방법을 제공하는 바이오티닐화된 말단을 포함한다.
일 실시예에서, 돌연변이 유발된 DNA 생성물은 상응하는 돌연변이체 단백질의 시험관 내 합성에 대한 템플릿으로서 직접 사용된다. 19개의 모든 아미노산 치환이 단일 잔기에서 생성될 수 있는 고 효율로 인하여, 목적한 다수의 잔기에서 단백질내 다른 돌연변이와 독립적으로 또는 이와 함께 포화 돌연변이 유발을 수행하는 것이 가능하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "완전한 포화" 돌연변이 유발은 단백질내 제공된 아미노산을 다른 19개의 자연 존재하는 아미노산으로 대체하는 것으로 정의된다. 예를 들어, 단백질 서열을 따라 최소한 모든 가능한 단일 아미노산 치환을 전신계적으로 실행하는 유전자 부위 포화 돌연변이 유발이 문헌[참조: Kretz et al., Methods in Enzymology, 2004, 388:3-11; Short, 미국 특허 6,171,820; 및 Short, 미국 특허 6,562,594]에 기술되어 있으며, 이들 각각은 참조함으로써 본 명세서에 통합된다.
일 측면에서, 본 발명은 점 돌연변이를 폴리뉴클레오티드내로 도입함으로써 전체 범위의 단일 아미노산 치환이 각각의 아미노산 위치에서 표시되는 후대 폴리펩티드의 세트를 생성하기 위한 코돈 프라이머(변성 N,N,G/T 서열 함유)의 용도를 제공한다(참조: 미국 특허 6,171,820; 참조: 또한 미국 특허 5,677,149, 각각은 본 명세서에 참조로 포함되어 있다). 사용된 올리고는 제1의 동종 서열, 변성 N,N,G/T 서열을 연속적으로 포함하며 바람직하게는 제2 동종 서열은 필수적이지 않다. 이러한 올리고의 사용으로부터 하부 후대 해독 생성물은 폴리펩티드를 따라 각각의 아미노 부위에서 모든 가능한 아미노산 변화를 포함하는데, 이는, N,N,G/T 서열의 변성이 모든 20개 아미노산에 대한 코돈을 포함하기 때문이다.
코돈 용도는 진핵 세포 유전자 발현에 있어 중요 인자 중 한 가지이다. 상이한 코돈이 사용된 빈도는 상이한 숙주 사이에서, 및 동일한 유기체내 높거나 낮은 수준에서 발현된 단백질 사이에서 유의적으로 변한다. 이러한 변화의 가장 적절한 이유는, 바람직한 코돈이 세포 내에서 이용가능한 인지체 tRNA의 풍부성과 상호관련있다는 것이다. 코돈 사용 및 tRNA 수용체 농도는 동시진화할 수 있으며, 이러한 동시-진화를 위한 선택압은 낮은 수준에서 발현된 유전자보다 고도로 발현된 유전자의 경우 보다 더 현저하다.
일 측면에서, 하나의 이러한 변성 올리고(하나의 변성 N,N,G/T 카세트로 이루어짐)는 모 폴리뉴클레오티드 템플릿 내 각각의 원래의 코돈을 완전한 범위의 코돈 치환에 적용시키기 위해 사용된다. 다른 측면에서, 적어도 2개의 변성 N,N,G/T 카세트가 동일한 올리고에서 또는 다른 올리고에서, 모 폴리뉴클레오티드 템플릿 내 적어도 2개의 원래의 코돈을 전체 범위의 코돈 치환에 적용시키기 위해 사용된다. 따라서, 1개 이상의 N,N,G/T 서열은 1개의 올리고에 함유됨으로써 1개 이상의 부위에 아미노산 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 이러한 다수의 N,N,G/T 서열은 직접적으로 연속일 수 있거나 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 분리될 수 있다. 다른 측면에서, 첨가 및 결실을 도입시키기 위해 제공가능한 올리고는 단독으로 또는 N,N,G/T 서열을 함유하는 코돈과 함께 사용되어 아미노산 첨가, 결실 및/또는 치환의 특정 조합 또는 순열을 도입할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 N,N,G/T 서열보다 덜 변성인 변성 카세트의 용도를 제공한다. 예를 들어, 일부 예에서, 단지 하나의 N(여기서, N은 삼본체의 제2 또는 제 3 위치 내에서 존재할 수 있다)으로 이루어진 변성 삼본체 서열을 사용(예를 들어, 올리고 내에서)하는 것이 바람직할 수 있다. 이의 특정 조합 및 순열을 포함하는 다른 어떠한 염기도 삼본체의 나머지 2개 위치에서 사용될 수 있다. 달리는, 일부 예에서 변성 N,N,N 삼본체 서열을 사용(예를 들어, 올리고 내에서)하는 것이 바람직할 수 있다.
그러나, 본 명세서에 기재된 것으로서 변성 N,N,G/T 삼본체의 사용은 몇 가지 이유로 유리하며, 일 측면에서, 본 발명은 전체 범위의 가능한 아미노산(총 20개 아미노산)의 폴리펩티드내 각각의 및 매 아미노산 위치 내로의 치환을 전신계적으로 및 매우 용이하게 생성시키는 수단을 제공한다. 따라서, 100개의 아미노산 폴리펩티드의 경우, 본 발명은 2000개의 명백한 종(즉, 위치당 20개의 가능한 아미노산 X 100개 아미노산 위치)을 전신계적으로 및 매우 용이하게 생성하는 방법을 제공한다. 변성 N,N,G/T 삼본체를 함유하는 올리고의 사용을 통해, 20개의 가능한 아미노산을 암호화하는 32개의 개개 서열이 제공된다는 것은 인식가능하다. 따라서, 모 폴리뉴클레오티드 서열이 하나의 이러한 올리고를 사용한 포화 돌연변이 유발에 적용되는 반응 용기내에서, 20개의 명백한 폴리펩티드를 암호화하는 32개의 명백한 후대 폴리뉴클레오티드가 존재하며, 대조적으로, 부위-지정 돌연변이 유발에서 비-변성 올리고의 사용은 반응 용기당 단지 하나의 후대 폴리펩티드 생성물을 생성한다.
따라서, 바람직한 실시예에서, 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기는 적어도 20개의 후대 폴리펩티드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유함으로써 모든 20개의 아미노산이 모 폴리뉴클레오티드내에서 돌연변이 유발된 코돈 위치에 상응하는 하나의 특이적인 아미노산 위치에서 표시된다. 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기로부터 생성된 32-배 변성 후대 폴리뉴클레오티드는 클론성 증폭에 적용시킬 수 있고(예를 들어, 발현 벡터를 사용하여 적합한 대장균 숙주 내로 클로닝시킴) 발현 스크리닝에 적용시킬 수 있다. 개개의 후대 폴리펩티드가 스크리닝에 의해 확인되어 특성에 있어서의 변화(템플릿 폴리펩티드와 비교하는 경우)를 나타내는 경우, 이를 서열분석하여 이에 함유된 이러한 변화에 관여하는 아미노산 치환을 확인할 수 있다.
템플릿 폴리펩티드는 어떠한 단백질도 가능할 수 있으나, 촉매적 활성 또는 리간드 결합과 같은 활성에 대한 편리한 검정을 갖는 단백질이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 리간드는 단백질에 결합하는 소 분자와 같은, 보다 큰 분자에 특이적으로 결합하는 특정 분자이다. 표적 상호작용의 대표적인 예는 촉매 작용, 효소-기질 상호작용, 단백질-핵산 상호작용, 수용체-리간드 상호작용, 단백질-금속 상호작용 및 항체-항원 상호작용을 포함한다. 대표적인 표적 단백질은 효소, 항체, 사이토킨, 수용체, DNA 결합 단백질, 킬레이트제 및 호르몬을 포함한다.
어떠한 화학적 합성 또는 재조합체 돌연변이 유발 방법도 돌연변이체 폴리펩티드의 집단을 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자삽입 생물학, 미생물학, 재조합체 DNA, 및 면역학의 통상의 기술을 사용할 수 있으며, 이는 당해 분야의 기술내에 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 참조: 예를 들어, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cell(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller and M. P. Cabs eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymnology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embiyo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 냉 Spring Harbor, N. Y., 1986).
일 실시예에서, 템플릿 폴리펩티드는 항체이다. 항체는 본 명세서에 기술된 방법을 적용시켜 예를 들어, 결합 친화성에 영향을 미치는 CDR내 위치를 맵핑하고 이해한다. 각종 항체-계 작제물 및 이의 단편을 제조하고 사용하는 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 중요한 측면은 목적한 상호작용(예를 들어, 항원-항체 상호작용, 금속 킬레이트화, 수용체 결합, 기질 결합 등)에 역활을 하거나 역활을 하는 경향이 있는 잔기의 확인이다. 어떠한 항체 또는 항체 단편도 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 진화 플랫폼 CPE, CPI, CPD 및 CPS 중 어느 것도 효능제 항체, 즉, 활성화 항체를 생성하는데 이용할 수 있다. 이들 진화 기술은 더 단순한 단백질 가교결합 유형 활성화를 초과하는 효능제 항체의 생성을 가능하게 하며 특히 펩티드에 의해 전통적으로 활성화된 GPL-I 또는 2와 같은 수용체의 활성화를 허용한다.
일 측면에서, 항체는 FACS 또는 현미경에 의해 선택되거나, 세포 표면 수형체가 활성화되는 경우 형성성을 나타내는 형광성 시그날을 지닌 세포를 사용함으로써 약하게 활성화되는 항체와 동등하다. 후속적으로, 진화 도구를 사용하여 이러한 활성화를 향상시킬 수 있다. 이후에, CPS 기술을 사용하여 상향-돌연변이체를 결합시킨다.
다른 측면에서, 에피토프 맵핑에 의해 측정된 것으로서 수용체 활성화 부위를 결합시키는 항체를 선택한다. CPE, CPI 및/또는 CPD 기술은 칼슘 이온 방출에 대한 반응시 형광성 또는 당해 분야에 잘 공지된 다른 검정과 같은 세포 내 판독에 의해 측정된 것으로서 수용체의 자극을 유발하는 돌연변이체를 선택하는데 사용된다. 이후에, CPS 기술을 이용하여 상향-돌연변이체를 결합시키다.
특정 측면에서, 단일, 이중 또는 삼중 아미노산 삽입을 갖는 CPI의 주요 장점 중 일부는, 이들 삽입된 아미노산이 수용체의 결합 포켓내로 연장되어 수용체를 활성화할 수 있다는 것이다. 다른 특수 측면에서, CPD는 활성화를 증진시키거나 일으키기 위해 수용체와 상호작용하는 아미노산을 리모델링하고/하거나 재위치시킬 수 있으며 최종적으로 CPE는 수용체 활성화를 일으키기 위해 비교작 작을 변화를 수행할 수 있다.
항체의 특이성은 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)내 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 측정된다. 완전한 항체의 크기의 약 1/3인, 항체의 Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 완정한 경쇄 고정 영역 및 중쇄 고정 영역의 일부를 함유한다. Fab 분자는 고정 영역 서열의 기여로 인하여 안정하고 잘 연합된다. 그러나, 세균 시스템에서 발현된 기능적 Fab의 수율은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 보다 작은 Fv 단편의 것보다 더 적다. Fv 단편은 여전히 기능적 항원 결합 부위를 보유하는 항체의 최소 부위이다. Fv 단편은 Fab와 동일한 결합 특성을 가지지만, 고정 영역에 의해 부여된 안정성의 부재하에서, Fv의 2개 쇄는 희석 조건하에서 비교적 용이하게 연합될 수 있다.
일 측면에서, VH 및 VL 영역은 폴리펩티드 링커를 통해 융합되어(참조: Huston et al., 1991) 항원 결합 부위를 안정화시킬 수 있다. 이러한 단일 폴리펩티드 Fv 단편은 단일쇄 항체(scFv)로서 공지되어 있다. VH 및 VL은 우선 하나의 도메인과 배열될 수 있다. 링커는 제1 쇄의 카복시 말단을 제2 쇄의 아미노 말단에 결합시킨다.
당업자는, 단일쇄 Fv, 중쇄 또는 경쇄 Fv 또는 Fab 단편이 이러한 시스템과 함께 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 중쇄 및 경쇄는 상보성 쇄를 용액에 첨가시킴으로써 돌연변이 유발시킬 수 있다. 이후에, 2개 쇄를 결합하도록 하고 기능적 항체 단편을 형성한다. 무작위 비-특이적인 경쇄 또는 중쇄 서열의 첨가는 다양한 구성원의 라이브러리를 생성하기 위한 조합 시스템의 생산을 가능하도록 한다.
일반적으로, 단일쇄 발현 폴리뉴클레오티드가 생성된다. 이러한 발현 폴리뉴클레오티드는 (1) 단일쇄 항체를 암호화하기 위해 작동 가능하게 연결된 VH 도메인, 스페이서 펩티드, 및 VL 도메인으로 이루어진 단일쇄 항체 카세트, (2) 단일쇄 항체를 암호화하는 MRNA를 형성하는 단일쇄 항체 카세트의 시험관 내 전사를 보증하기 위해 작동 가능하게 연결된 시험관 내 전사에 적합한 프로모터(예를 들어, T7 프로모터, SP6 프로모터 등), 및 (3) 시험관 내 전사 반응에서 기능하기에 적합한 전사 종결 서열을 함유한다. 임의로, 발현 폴리뉴클레오티드는 또한 복제 오리진 및/또는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 적합한 발현 폴리뉴클레오티드의 예는 pLM166이다.
VH 및 VL 서열은 V 유전자 계열-특이적인 프라이머 또는 V 유전자-특이적인 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 생산된 VH 및 VL 서열의 라이브러리로부터 편리하게 수득될 수 있거나(참조: Nicholls et al., J. Immunol. Meth., 1993, 165: 81; W093/12227) 이용가능한 서열 정보를 기준으로 표준 당해분야에 공지된 방법에 따라 설게된다. 대표적으로, 마우스 또는 인간 VH 및 VL 서열이 분리된다. 이후에, VH 및 VL 서열은 일반적으로 개재 스페이서 서열(예를 들어, 프레임내 유연한 펩티드 스페이서를 암호화하는)을 사용하여 연결시킴으로써 단일쇄 항체를 암호화하는 카세트를 형성한다. 통상적으로, 다수의 VH 및 VL 서열을 포함하는 라이브러리를 사용하며(때때로 또한 나타낸 다수의 스페이서 펩티드 종을 사용), 여기서, 라이브러리는 특히 CDR 잔기, 때때로 골격 잔기에서 서열 다양성을 증가시키기 위해 돌연변이된 하나 이상의 VH 및 VL 서열을 사용하여 작제한다. V 영역 서열은 편리하게는 면역글로불린-발현 세포를 위한 cDNA 또는 PCR 증폭 생성물로서 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 인간 하이브리도마 또는 림프종으로부터의 세포, 또는 세포 표면 또는 분비된 면역글로불린을 합성하는 다른 세포주를 폴리 A+ RNA의 분리에 사용할 수 있다. 이후에, RNA는 효소 역 트랜스크립타제를 사용하여 올리고 dT 프라임된 cDNA의 합성에 사용된다(일반적인 방법에 대해서 참조: Goodspeed et al., Gene 1989, 76: 1; Dunn et al., J. Biol. Chem., 1989, 264: 13057). V-영역 CDNA 또는 PCR 생성물이 분리되면, 이를 벡터 내로 클로닝하여 단일쇄 항체 카세트를 형성시킨다.
항체 및 항체 단편의 구성을 이루기 위해, 암호화 유전자를 분리하여 확인한다. 유전자는 발현 벡터 내로 클로닝 또는 시험관 내 전사/해독을 허용하도록 변형시킬 수 있다. 비록 하이브리도마 cDNA로부터 VH 및 VL에 대한 DNA를 프로빙(probing)하거나(참조: Maniatis et al., 1982), VH 및 VL에 대한 합성 유전자를 작제하는(참조: Barbas et al., 1992) 방법을 사용할 수 있다고 해도, 편리한 방식은 항체 서열을 증폭시키기 위해 템플릿 지시된 방법을 사용하는 것이다. 항체 유전자의 다양한 집단은 항체의 골격으로 공지된 가변 영역의 3' 및 5' 말단에서 보존된 서열 또는 항체의 고정 영역에 대해 프라이머를 설계함으로써 템플릿 시료로부터 증폭시킬 수 있다(참조: Iverson et al., 1989). 프라이머내에서, 제한 부위는 발현 벡터 내로 클로닝을 촉진시키기 위해 위치시킬 수 있다. 프로이머를 이들 보존된 영역에 지시함으로써, 항체 집단의 다양성이 유지되어 다양한 라이브러리의 작제를 허용한다. 항체의 특이적인 종 및 부류는 본 명세서에 참조로 혼입된 문헌(참조: Kabat et al., 1987)에 제공된 항체의 모든 유형에 대한 서열 다수에 의해 설명된 바와 같은 프라이머 서열의 선택에 의해 정의될 수 있다.
동물의 비장 또는 말초 혈액으로부터 분리된 전령 RNA는 항체 라이브러리의 증폭을 위한 템플릿으로 사용될 수 있다. 특정 상황에서, 세포 표면에 항체 단편의 동종 집단을 디스플레이하는 것이 바람직한 경우, mRNA를 단클론 항체의 집단으로부터 분리할 수 있다. 어느 공급원으로부터의 전령 RNA도 표준 방법에 의해 제조하여 cDNA 템플릿의 제조에 또는 직접 사용할 수 있다. 항체를 클로닝하기 위한 목적을 위한 mRNA의 생성은 항체의 제조 및 특성화를 위한 잘-공지된 과정을 따라 용이하게 달성된다(참조: 예를 들어, 본 명세서에 참조로 혼입된, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988).
단클론 항체(MAb)의 생성은 일반적으로 다클론 항체를 제조하기 위한 것과 동일한 과정을 따른다. 요약하면, 다클론 항체는 동물을 면역원성 조성물로 면역화시키고 면역화된 동물로부터의 항혈청을 수집함으로써 제조된다. 광범위한 동물 종이 항혈청의 생산에 사용될 수 있다. 대표적으로 항-항혈청의 생산에 사용된 동물은 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 또는 염소이다. 토끼의 비교적 다량의 혈액 용적으로 인하여, 토끼가 다클론 항체를 생산하는데 일반적으로 바람직하다.
면역원성 조성물은 흔히 면역원성에 있어 다양하다. 따라서, 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 담체에 커플링시킴으로써 달성될 수 있는 바와 같이, 숙주 면역 시스템을 부스팅(boosting)하는 것이 필수적이다. 예시적이고 바람직한 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 오브알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 다른 알부민을 또한 담체로서 사용할 수 있다. 폴리펩티드를 담체 단백질에 접합시키기 위한 인식된 수단은 잘 공지되어 있으며 글루타르알데하이드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 카르보디이미드 및 비스-디아조타이드화 벤지딘을 포함한다.
특정한 면역원 조성물의 면역원성은 보조제로 공지된 면역 반응의 비-특이적인 자극인자의 사용으로 향상될 수 있다. 예시적이고 바람직한 보조제는 완전한 프루언드 보조제(complete Freund's adjuvant)(사멸된 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비-특이적인 자극인자), 불완전 프루언드 보조제 및 수산화알루미늄 보조제를 포함한다.
다클론 항체의 생산에 사용된 면역원 조성물의 양은 면역원의 특성 및 면역화에 사용된 동물의 특성에 따라 변한다. 각종 경로를 사용하여 면역원을 투여할 수 있다(피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내). 다클론 항체의 생산은 면역화된 동물의 혈액을 다양한 싯점에서 시료채취한 후 면역화하여 모니터링할 수 있다. 제2의 부스터 주시가 또한 제공될 수 있다. 부스팅 및 역가측정(titering)의 공정은, 적합한 역가가 달성될 때까지 반복한다. 바람직한 수준의 면역원성이 수득된 경우, 면역화된 동물을 방혈시키고 혈청을 분리하고, 저장한고 혈장을 다클론 반응으로부터 mRNA의 분리를 위해 수거하거나 동물을 동종 항체 집단으로부터 mRNA를 분리하기 위해 MAb를 생성할 수 있다.
MAb는 본 명세서에 참조로 인용된 미국 특허 4,196,265에 기술된 것과 같은 잘-공지된 기술의 사용을 통해 용이하게 제조할 수 있다. 통상적으로, 당해 기술은 적합한 동물을 선택된 면역원 조성물, 예를 들어, 담체에 접함된 소 분자 합텐, 정제되거나 부분적으로 정제된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 면역화시킴을 포함한다. 면역화 조성물은 항체 생산 세포를 자극하는데 효과적인 방식으로 투여한다. 마우스 및 랫트와 같은 설치류가 흔히 사용된 동물이지만; 토끼, 양, 개구리 세포의 사용 또한 가능하다. 랫트의 사용은 특정의 장점을 제공할 수 있으나(참조: Goding, pp. 60-61, 1986), 마우스가 바람직하고, BALB/c 마우스가 가장 흔히 사용되고 일반적으로 보다 높은 퍼센트의 안정한 융합을 제공하므로 특히 바람직하다.
면역화 후에, 항체를 생산하는 잠재성을 가진 체세포, 특이적으로 B 림프구(B 세포)를 MAb 생성 프로토콜에서 사용하기 위해 선택한다. 이들 세포는 생검 비장, 편도 또는 림프절로부터, 또는 혈액 시료로부터 수득될 수 있다. 비장 세포 및 혈액 세포가 바람직한데, 전자는 형질모세포 단계를 나누는데 있어 존재하는 항체-생산 세포의 풍부한 공급원이고, 후자는 혈액이 용이하게 접근가능하기 때문이다. 흔히, 동물의 패널을 면역화시키고 항체 역가가 최고인 동물의 비장을 제거하고 비장을 주사기로 균질화시켜 림프구를 수득할 것이다. 대표적으로, 면역화된 마우스로부터의 비장은 대략 5×107 내지 2×108개 림프구를 함유한다.
그런 다음, 면역화된 동물로부터의 항체-생산 B 림프구는 무한증식 흑색종 세포, 일반적으로 면역화된 동물과 동일한 종 중 하나인 세포와 융합시킨다. 하이브리도마-생산 융합 과정에서 사용하기에 적합한 흑색종 세포주는 바람직하게는 비-항체-생산성이며, 높은 융합 효율을 가지고, 이후에 단지 바람직한 융합된 세포(하이브리도마)의 성장을 지지하는 특정의 선택적 배지에서 성장할 수 없도록 하는 효소 결핍성이다.
다수의 흑색종 세포중 어느 하나를 당업자에게 공지된 바와 같이 사용할 수 있다(참조: Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, 1984). 예를 들어, 면역화된 동물이 마우스인 경우, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-Il, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 BuI를 사용할 수 있으며; 랫트의 경우, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210; 및 U-266을 사용할 수 있고, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6은 모두 인간 세포 융합과 관련하여 유용하다.
하나의 바람직한 쥐 흑색종 세포는 NS-I 흑색종 세포주(또한 P3-NS-l-Ag4-l으로 명명됨)이며, 이는 세포 기탁 번호 GM3573을 요청하여 NIGMS Human Genetic Mutant cell Repository으로부터 용이하게 이용가능하다. 사용될 수 있는 다른 마우스 흑색종 세포주는 8-아자구아닌-내성 마우스 쥐 흑색종 SP2/0 비-생산인자 세포주이다.
항체-생산 비장 또는 림프절 세포 및 흑색종 세포의 하이브리드를 생성하기 위한 방법은 일반적으로 체세포를 흑색종 세포와 2:1의 비로 세포 막의 융합을 촉진하는 제제 또는 제제들(화학제 또는 전기적 제제)의 존재하에서 혼합함을 포함하며, 상기 비율은 각각 약 20:1 내지 약 1:1로 변할 수 있다. 센다이 바이러스를 사용하는 융합 방법은 문헌[참조: Kohler & Milstein (1975; 1976), 및 37% (v/v)]에 기술되어 있으며, PEG와 같이 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하는 것은 문헌[참조: Gefter et al., 1977]에 기술되어 있다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용 또한 적절하다(참조: Goding pp. 71-74, 1986).
융합 과정은 일반적으로 약 1×1O-6 내지 1×1O-8의 낮은 빈도에서 생 하이브리드(viable hybrid)를 생산한다. 그러나, 이는, 생, 융합된 하이브리드가 선택된 배지 속에서 배양함에 의해 융합되지 않은 모 세포(특히 일반적으로 무기한 계속 분열하는 융합되지 않은 흑색종 세포)로부터 분화되므로, 문제를 내포하지 않는다. 선택적 배지는 일반적으로 조직 배양 배지 속에서 뉴클레오티드의 자체 합성을 차단하는 제제를 함유하는 것이다. 예시적이고 바람직한 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트, 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 푸린 및 피리미딘 둘다의 자체 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 푸린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 배지는 뉴클레오티드 공급원으로서 하이폭산틴 및 티미딘으로 보충된다(HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 배지에 하이폭산틴이 보충된다.
바람직한 선택 배지는 HAT이다. 뉴클레오티드 구조 경로를 작동할 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 흑색종 세포는 구조 경로의 주요 효소, 예를 들어, 하이폭산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HRRT)를 결여하고 있으며, 이들은 생존할 수 없다. B 세포는 이러한 경로를 작동할 수 있으나, 이들은 배양물 속에서 제한된 수명을 가지며 일반적으로 약 2주내 사멸한다. 따라서, 선택 배지 속에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 흑색종 및 B 세포로부터 형성된 하이브리드이다.
이러한 배양은, 특이적인 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마의 집단을 제공한다. 대표적으로, 하이브리도마의 선택은 세포를 미세역가 플레이트 속에서 단일-클론 희석에 의해 배양한 후, 개개 클론 상층액을 (약 2 내지 3주 후에) 바람직한 반응성에 대해 시험함으로써 수행한다. 단순하고 신속한 검정은 방사면역분석, 효소 면역분석, 세포독성 검정, 플라크 검정, 도트(dot) 면역결합 검정 등을 포함한다.
선택된 하이브리도마는 일련 희석시켜 클론이 이후에 무한적으로 증식하여 MAb를 제공하는 개개의 항체-생산 세포주내로 클로닝된다. 세포주는 2개의 기본적인 방식으로 MAb 생산에 대해 이용될 수 있다. 하이브리도마의 시료를 원래의 융합을 위해 체세포 및 흑색종 세포를 제공하기 위해 사용된 유형의 조직적합성 동물 내로 주사(흔히 복강내에)할 수 있다. 주사된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생산된 특이적인 단클론 항체를 분비하는 종양으로 진행된다. 혈청 또는 복수액과 같은 동물의 체액을 이후에 트랩핑하여 고 농도의 MAb를 제공할 수 있다. 개개의 세포주는 또한 시험관 내에서 배양할 수 있으며, 여기서, MAb는 자연적으로 배양 배지내로 분비되며 이로부터 이들은 고 농도로 용이하게 수득될 수 있다. 어느 수단에 의해 생산된 MAb도 경우에 따라 여과, 원심분리 및, HPLC 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 각종 크로마토그래피 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다.
바람직한 단클론 항체의 분리 및 특성화에 이어서, mRNA를 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 분리하고 표적 서열의 증폭을 위한 템플릿으로 사용할 수 있다.
다수의 템플릿 의존적 공정은 돌연변이 유발 전 및 후에 표적 서열을 증폭시키는데 이용가능하다. 가장 잘 공지된 증폭 방법 중 하나는 폴리머라제 쇄 반응(PCR이라고 언급됨)이며, 이는 미국 특허 4,683,195, 4,683,202 및 4,800,159, 및 문헌(참조: Innis et al., 1990)에 상세히 기술되어 있고, 이들 각각은 이의 전문이 본 명세서에 참조로 혼입된다. 요약하면, PCR에서, 표적 서열의 반대 상보성 쇄 상의 영역에 대해 상보성인 2개의 프라이머 서열이 제조된다. 과량의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 반응 혼합물에 DNA 폴리머라제, 예를 들어, Taq 폴리머라제와 함께 가한다. 표적 서열이 시료 속에 존재할 경우, 프라이머는 표적에 결합할 것이며 폴리머라제는, 프라이머가 뉴클레오티드를 첨가함에 의해 표적 서열을 따라 연장하도록 할 것이다. 반응 혼합물의 온도를 상승시키거나 강하시킴에 의해, 연장된 프라이머는 표적으로부터 해리되어 반응 생성물을 형성할 것이며, 과량의 프라이머가 표적 및 반응 생성물에 결합할 것이고 당해 공정은 반복된다. 바람직하게, 역 트랜스크립타제 PCR 증폭 과정을 수행하여 증폭된 표적의 양을 정량화할 수 있다. 폴리머라제 쇄 반응 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. PCR과 같은 효소 증폭 기술을 사용하여, 바람직한 대조군 성분을 프라이머내로 설게함으로써, DNA 생성물내로 혼입될 것이다.
증폭의 또 다른 바람직한 방법은 본 명세서에 이의 전문이 참조로 혼입된 유럽 특허원 320 308에 기재된 리가제 쇄 반응("LCR")이다. LCR에서, 2개의 상보성 프로브 쌍을 제조하며, 표적 서열의 존재하에서, 각각의 쌍은 표적의 반대쪽 상보성 쇄에 이들이 인접하도록 결합할 것이다. 리가제의 존재하에서, 2개의 프로브 쌍은 연결되어 단일의 단위를 형성할 것이다. PCR에서와 같은 온도 주기화에 의해서, 결합되고 연결된 단위는 표적으로부터 해리된 후 과량의 프로브 쌍의 연결을 위한 "표적 서열"로서 제공된다. 미국 특허 4,883,750는 프로브 쌍을 표적 서열에 결합시키기 위한 LCR과 유사한 방법을 기술하고 있다.
PCT 출원 PCT/US87/00880에 기술된 Qbeta 레플리카제를 또한 증폭 방법으로서 사용할 수 있다. 당해 방법에서, 표적의 것에 상보성인 영역을 갖는 RNA의 복제성 서열을 RNA 폴리머라제의 존재하에 시료에 가한다. 폴리머라제는 이후에 검출할 수 있는 복제성 서열을 카피할 것이다.
제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 사용하여 제한 부위의 하나의 쇄내에 뉴클레오티드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 함유하는 표적 분자의 증폭을 달성하는 등온 증폭 방법은 핵산의 증폭에서 또한 유용할 수 있다(참조: Walker et al, 1992).
쇄 교체 증폭(SDA)은 쇄 교체 및 합성, 즉 닉 해독(nick translation)의 다수 라운드를 포함하는 핵산의 등온 증폭을 수행하는 다른 방법이다. 복구 쇄 반응(RCR)으로 불리는, 유사한 방법은 증폭을 위해 표적화된 영역 전체를 통해 몇 가지 프로브를 어닐링한 후, 4개의 염기 중 단지 2개만 존재하는 복구 반응을 수행함을 포함한다. 다른 2개의 염기는 용이한 검출을 위해 바이오티닐화된 유도체로서 가해질 수 있다. 유사한 시도가 SDA에서 사용된다. 표적 특이적인 서열이 또한 사이클릭 프로브 반응(CPR)을 사용하여 검출될 수 있다. CPR에서, 비-특이적인 DNA의 3' 및 5' 서열 및, 특이적인 RNA의 중간 서열을 갖는 프로브를 시료 속에 존재하는 DNA에 하이브리드화한다. 하이브리드화시, 반응물을 RNaseH로 처리하고, 프로브의 생성물은 분해 후에 방출되는 명백한 생성물로서 확인된다. 원래의 템플릿은 다른 사이클링 브로브에 어닐링하고 반응을 반복한다.
다른 증폭 방법은 영국 특허원 2 202 328, 및 PCT 특허원 PCTAJS 89/01025에 기술되어 있으며, 이들 각각은, 전문이 본 명세서에 참조로 인용되어 있고, 본 발명에 따라서 사용될 수 있으며, 전자의 출원에서, "변형된" 프라이머는 PCR 유사, 템플릿 및 효소 의존적 합성에서 사용된다. 프라이머는 포획 잔기(예를 들어, 바이오틴) 및/또는 검출인자 잔기(예를 들어, 효소)로 표지화함으로써 변형시킬 수 있다. 후자의 출원에서는, 과량의 표지된 프로브를 시료에 가한다. 표적 서열의 존재하에서, 프로브는 결합하여 촉매적으로 분해된다. 분해 후, 표적 서열은 과량의 프로브에 의해 결합된 채로 완전하게 방출된다. 표지된 프로브의 분해는 표적 서열의 존재를 신호한다.
다른 핵산 증폭 과정은 핵산 서열 계 증폭(NASBA) 및 3SR(참조: Kwoh et al., 1989)를 포함하는, 전사-계 증폭 시스템(TAS)를 포함한다. NASBA에서, 핵산은 표준 페놀/클로로포름 추출, 임상 시료의 열 변성, 분해 완충액을 사용한 처리 및, DNA 및 RNA의 분리를 위한 미니스핀 컬럼 또는 RNA의 구아니디늄 클로라이드 추출에 의한 증폭을 위해 제조될 수 있다. 이들 증폭 기술은 표적 특이적인 서열을 갖는 프라이머를 어닐링함을 포함한다. 중합에 이어서, DNA/RNA 하이브리드를RNase H로 분해하는 한편, 이본쇄 DNA 분자를 다시 열변성시키며, 각각의 경우에서 단일쇄 DNA는 제2의 표적 특이적인 프라이머의 첨가에 이은 중합에 의해 완전히 이본쇄로 제조된다. 이본쇄 DNA 분자는 이후에 T7 또는 SP6과 같는 폴리머라제에 의해 다중 전사된다. 등온 주기 반응에서, RNA는 이본쇄 DNA내로 역전사되며, T7 또는 SP6과 같은 폴리머라제로 이에 대해 1회 전사된다. 수득되는 생성물은 트렁케이트(truncate)되거나 완전한 것에 상관없이, 표적 특이적인 서열을 나타낸다.
다베이(Davey) 등의 유럽 특허원 329 822(본 명세서에 이의 전문이 참조로 혼입됨)는 본 발명에 따라 사용될 수 있는, 단일쇄 RNA("ssRNA"), ssDNA, 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 주기적으로 합성하는 것을 포함하는 핵산 증폭 공정을 기재하고 있다. ssRNA는 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드에 대한 제1 템플릿이며, 이는 역 트랜스크립타제(RNA-의존성 DNA 폴리머라제)에 의해 신장된다. 이후에, RNA는 수득되는 DNA:RNA 이중체로부터 리보뉴클레아제 H(RNase H, DNA 또는 RNA를 갖는 이중체내에서 RNA에 대해 특이적인 RNase)의 작용에 의해 제거된다. 수득되는 ssDNA는 제2 프라이머에 대한 제2 템플릿이며, 이는 또한 템플릿에 대한 이의 동족체에 대해 5' 로 RNA 폴리머라제 프로모터(T7 RNA 폴리머라제로 예시됨)의 서열을 포함한다. 이후에, 당해 프라이머는 DNA 폴리머라제(대장균 DNA 폴리머라제 I의 거대한 "키에노우" 단편에 의해 예시됨)에 의해 연장되어 프라이머 사이에 원래의 RNA의 것과 동일한 서열을 가지고, 추가로 한쪽 끝에 프로모터 서열을 갖는 이본쇄 DNA("dsDNA") 분자를 생성한다. 당해 프로모터 서열은 적절한 RNA 폴리머라제에 의해 DNA의 많은 RNA 카피를 제조하는데 사용될 수 있다. 이후에, 이들 카피는 매우 신속한 증폭을 초래하는 주기에 재-도입될 수 있다. 효소의 적절한 선택으로, 당해 증폭은 각각의 주기에서 효소의 추가없이 등온적으로 수행될 수 있다. 당해 공정의 주기적 특성으로 인하여, 출발 서열은 DNA 또는 RNA의 형태가 되도록 선택할 수 있다.
밀러(Miller) 등의 PCT 출원 WO 89/06700(본 명세서에 이의 저눈이 참조로 혼입됨)은 표적 단일쇄 DNA("ssDNA")에 대한 프로모터/프라이머 서열의 하이브리드화에 이은 서열의 많은 RNA 카피의 전사를 기초로 하는 핵산 서열 증폭 개략도를 기재하고 있다. 당해 개략도는 주기성이 아니며, 즉, 신규 템플릿은 수득되는 RNA 전사체로부터 생산되지 않는다. 다른 증폭 방법은 "레이스(race)" 및 "한 단면(one-sided) PCR"(참조: Frohman, 1990; O'Hara et al., 1989)을 포함한다.
수득되는 "디-올리고뉴클레오티드의 서열을 가져서 디-올리고뉴클레오티드를 증폭시키는 핵산의 존재하에서 2개(이상)의 올리고뉴클레오티드의 연결을 기초로 하는 방법은 또한 증폭 단계에서 사용할 수 있다(참조: Wu et al., 1989).
증폭 생성물은 표준 방법을 사용하여 아가로즈, 아가로즈-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다(참조: 예를 들어, Maniatis et al., 1982). 예를 들어, 에티디움 브로마이드로 염색하고 UV 광하에서 가시화시킨 1% 아가로즈 겔을 사용할 수 있다. 달리는, 증폭 생성물은 방사선- 또는 형광분석적으로-표지된 뉴클레오티드로 입체적으로 표지화할 수 있다. 이후에, 겔을 각각 x-선 필름에 노출시키거나 적절한 자극 스펙트럼하에 가시화할 수 있다.
본 발명의 돌연변이 유발 과정은 유전자내에서 특수 부위에 대해 조절할 수 있는 어떠한 돌연변이 유발 시도, 즉, 부위-지시되거나 부위-특이적인 돌연변이 유발을 포함할 수 있다. 본 발명이 포괄적인 돌연변이 유발에 의존하므로, 본 발명은 신속하고, 효율적이며 비용 효과적인 돌연변이 유발 과정을 바람직한 실시예로서 고려한다.
일 실시예에서, 돌연변이 유발 과정은 화학적 합성 기술을 이용한다. 이렇게 함으로서, 유전자내 하나 이상의 특수 부위에서 치환이 정확하게 일어나도록 할 수 있으며, 또한 변경의 특성을 특이적으로 정의할 수 있다. DNA에 대한 화학적 합성 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 고체 상 기술이 이와 관련하여 바람직하다.
유전자 합성의 고체 상 방법에 대한 한 가지 장점은 조합 합성 기술을 사용한 돌연변이 유발을 위한 기회이다. 조합 합성 기술은 상이한 빌딩 블록을 연속적으로 연결시킴으로서 화합물의 라이브러리 또는 거대 수집물을 동시에 생산하는 기술로 정의된다. 라이브러리는 용액 속에서 유리된 화합물을 사용하여 작제할 수 있지만, 바람직하게는 화합물은 비드, 고체 입자와 같은 고체 지지체에 연결되거나, 심지어 미생물의 표면에 디스플레이된다.
스플릿 합성(split synthesis) 또는 평행 합성을 포함하는, 조합 합성을 위한 몇 가지 방법이 존재한다(참조: Holmes et al., 1995; Burbaum et al., 1995; Martin et al., 1995; Freier et al., 1995; Pei et al., 1991; Bruce et al., 1995; Ohlmeyer et al., 1993). 스플릿 합성은 비교적 다수의 화합물의 소량을 생산하는데 사용할 수 있지만, 평행 합성은 비교적 소수의 화합물을 다량 생산할 것이다. 스플릿 합성을 사용하는 일반적인 측면에서, 화합물은 미세입자의 표면에 합성된다. 각각의 단계에서, 입자는 다음 성분의 첨가를 위해 몇개 그룹으로 분배된다. 이후에, 상이한 그룹을 재조합하고 분배하여 새로운 그룹을 형성한다. 당해 공정은, 화합물이 완료될 때까지 반복된다. 각각의 입자는 용이한 분리 및 정제를 허용하는 동일한 화합물의 몇 가지 카피를 보유한다. 스플릿 합성은 단지 고체 지지체를 사용하여 수행할 수 있다.
평행 합성으로 공지된 대안적인 기술은 고체상 또는 액상으로 수행될 수 있다. 평행 합성을 사용하여, 상이한 화합물을 개별 용기 속에서 흔히 자동화를 사용하여 합성한다. 평행 합성은 미세역가 플레이트 속에서 수행할 수 있으며, 여기서, 상이한 시약을 미리 결정된 방식으로 각각의 웰에 가하여 조합 라이브러리를 생산할 수 있다. 평행 합성은 효소 기술을 사용하기 위한 바람직한 시도이다. 당해 기술의 많은 변형이 존재하며 본 발명과 함께 사용하기 위해 채택될 수 있음은 잘 이해된다. 조합 방법을 사용하여, 다수의 돌연변이체 유전자 템플릿을 합성할 수 있다.
돌연변이체 유전자는 또한 당해 분야에 공지된 반합성 방법(참조: Barbas et al., 1992)으로 생성할 수 있다. 골격으로서 항체 단편의 보존된 영역을 사용하여, 다양한 영역을 램덤 조합에서 1회에 1개 이상 삽입하여 항체 단편의 특이성을 변경시키고 특히 독성 또는 분해되기 쉬운 화합물과 같은 면역화에 대해 수행성이 아닌 항원에 대한 항체의 생성시 신규 결합 부위를 생성할 수 있다. 동일한 세포주와 함께, 공지된 항체 서열은 돌연변이를 무작위하게 도입함으로써 변화시킬 수 있다. 이는 오류 발생이 쉬운(error-prone) PCR의 사용과 같이 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 달성할 수 있다.
적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, PCR을 결합 단백질 유전자내에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 DNA 템플릿의 신속한 합성에 사용한다. 부위-특이적인 돌연변이 유발은, 근본 DNA의 특이적인 돌연변이 유발을 통해 개개 펩티드, 또는 생물학적으로 기능성인 등량체 단백질 또는 펩티드의 제조에 유용한 기술이다. 당해 기술은 추가로 DNA내로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 도입시킴으로써 하나 이상의 전술한 고려사항을 도입하는, 서열 변이체를 제조하고 시험하기 위한 용이한 능력을 제공한다. 부위-특이적인 돌연변이 유발은 바람직한 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특이적인 올리고뉴클레오티드 서열, 및 충분한 수의 인접한 뉴클레오티드의 사용을 통해 돌연변이체의 생산을 허용함으로써, 가로지는 결실 연결의 양쪽 측면에 안정한 이중체를 형성하기에 충분한 크기 및 서열 복잡성의 프라이머 서열을 제공한다. 대표적으로, 길이가 약 17 내지 25개 뉴클레오티드인 프라이머가 바람직하며, 서열의 연결부의 양쪽 측면에서 약 5 내지 10개 잔기가 변경된다.
당해 기술은 통상적으로 단일쇄 및 이본쇄 형태 둘다로 존재하는 박테리오파아지 벡터를 사용한다. 부위-지정 돌연변이 유발에 유용한 대표적인 벡터는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파아지 벡터는 시판되고 있으며 이들의 용도는 당업자에게 일반적으로 잘 공지되어 있다. 이본쇄 플라스미드는 또한 부위 지시된 돌연변이 유발에서 통상적으로 사용되며, 목적한 유전자를 이는 파아지로부터 플라스미드로 이전시키는 단계를 제거한다.
일반적으로, 부위-지정 돌연변이 유발은 우선 단일쇄 벡터를 수득하거나, 이의 서열 내에 목적한 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 이본쇄 벡터의 2개의 쇄를 용융시킴으로써 수행한다. 목적한 돌연변이된 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드 프라이머는 합성적으로 제조한다. 이후에, 당해 프라이머를 단일쇄 DNA제제로 어닐링하고, 하이브리드화 조건의 선택시 미스매치의 정도를 고려하여, 대장균 폴리머라제 I 클레노우 단편과 같은 DNA 폴리머라제 효소에 적용시켜 돌연변이를 지닌 쇄의 합성을 완료한다. 따라서, 이종이중체가 형성되며, 여기서, 하나의 쇄는 원래의 비-돌연변이된 서열을 암호화하고 제2 쇄는 목적한 돌연변이를 지닌다. 당해 이종이중체 벡터를 이후에 대장균 세포와 같은 적절한 세포를 형질전환하는데 사용하고, 돌연변이된 서열 배열을 지닌 재조합체 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.
부위-지정 돌연변이를 사용하는 선택된 유전자의 서열 변이체의 제조는 잠재적으로 유용한 종을 생산하는 수단으로서 제공되며, 유전자의 서열 변이체가 수득될 수 있는 다른 방법이 존재하므로, 이에 한정됨을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 목적한 유전자를 암호화하는 재조합체 벡터는 하이드록실아민과 같은 돌연변이 유발제로 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다.
특정 용도, 부위 지시된 돌연변이 유발에 의한 아미노산의 치환에서, 보다 낮은 스트링전시(stringency) 조건이 요구됨이 인식된다. 이러한 조건하에서, 하이브리드화는, 프로브 및 표적 쇄의 서열이 완전하게 상보성이지는 않지만 하나 이상의 위치에서 미스매치된다해도 발생할 수 있다. 조건은 염 농도를 증가시키고 온도를 강하시킴에 의해 덜 스트링전시되도록 할 수 있다. 예를 들어, 배지 스트링전시 조건은 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.1 내지 0.25M NaCl에 의해 제공될 수 있지만, 낮은 스트링전시 조건은 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M 염에 의해 제공될 수 있다. 따라서, 하이브리드화 조건은 용이하게 조작될 수 있으므로, 일반적으로 바람직한 결과에 따른 선택 방법일 것이다.
다른 실시예에서, 하이브리드화는 예를 들어, 대략 20℃ 내지 약 37℃의 온도에서 50 mM 트리스-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨의 조건하에서 달성될 수 있다. 이용된 다른 하이브리드화 조건은 대략 40℃ 내지 약 72℃ 범위의 온도에서 대략 10 mM 트리스-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5μM MgC12를 포함할 수 있다. 포름아미드 및 SDS 또한 하이브리드화 조건을 변경시키는데 사용할 수 있다.
특정 실시예에서, 중복 PCR을 사용할 수 있다. 요약하면, 플라스미드는 PCR의 첫회 라운드에 대한 템플릿으로 사용된다. 제1 라운드로부터 PCR 생성물을 정제하고 외부 프라이머와 함께 오우버랩 연장 PCR 반응에서 사용한다. 최종 생성물은 제공된 아미노산을 모든 다른 가능한 아미노산 잔기로 부위 지시된 교체시키는 것을 함유하였다.
목적한 폴리펩티드에 대한 돌연변이 유발된 DNA 템플릿은 시험관 내 전사/해독을 위한 플라스미드내로 클로닝될 수 있으며, 바람직한 실시예에서, 적절한 대조군 성분은 직접적인 시험관 내 전사/해독을 지시하기 위한 PCR 생성물내에 포함되고, 유전자의 시험관 내 전사/해독은 세포 유리된 추출물을 사용함으로써 요구된 효소, 리보소옴 및 단백질 인자를 제공한다. 단백질의 합성은 목적한 DNA 템플릿으로부터 합성된 mRNA에 의해 지시된다. DNA 템플릿은 리보소옴 결합 부위 및 프로모터 서열을 포함하는 사용된 시스템에 대한 적절한 조절 성분을 함유하여야만 한다. 당업자는 각각의 시스템에 대한 적절히 요구된 성분을 명확하게 인식할 수 있다.
단백질 생산을 위한 원핵세포 시험관 내 기술을 우선 사용하였다(참조: Zubay et al., 1970). 후속적으로, 진핵세포 시스템은 맥아(참조: Roberts, 1973) 및 토끼 망상적혈구(참조: Pelham, 1976)를 사용하여 개발하였다. 몇 가지 신규한 개발은 당해 기술의 효율을 증가시켰다. 예에는 선형 DNA 템플릿을 사용하여 결과를 증진시키기 위한 대장균의 뉴클레아제 결핍성 균주의 개발 및, 시스템으로부터 어떠한 배경 발현도 저하시키기 위한 마이크로코쿠스 뉴클레아제를 사용한 망상적혈구 분해물의 처리를 포함한다.
시험관 내 전사/해독을 위해 개발된 가장 최근의 시스템은 SP6 및 SP7을 포함하는 파아지 RNA에 의한 전사를 기초로 한다(참조: Krieg, 1987, Studier, 1990). T7 프로모터의 조절하에 있는 DNA는 T7 RNA 폴리머라제에 의한 시험관 내 전사 또는, 원핵세포 또는 진핵세포 단백질 합성 시스템에 가해진 폴리머라제를 사용한 완전한 시험관 내 전사/해독을 위한 템플릿으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법이 시험관 내 전사/해독 시스템 중 어느 것과 함께 사용될 있지만, T7 시스템이 전사에 바람직하며 원핵세포 해독 시스템의 사용이 RNA의 캡핑이 요구되지 않으므로 바람직하다.
해독용 시험관 내 방법을 사용하여, 아미노산 유도체를 단백질내로, 유도체화된 아미노산을 단백질 합성 시스템 혼합물에 가함에 의해 혼입할 수 있다. 정상 아미노산과 관련하여, 유도체의 농도의 변화는 혼합된 집단을 생성하고 상대 효과를 측정하도록 한다.
본 발명에 의해 생성된 돌연변이체 폴리펩티드는 각종 기술을 사용하여 특성화할 수 있다. 일반적으로, 단백질 생성물은 SDS-PAGE를 사용하여 정확하고 명백한 분자량에 대해 분석할 수 있다. 이는, 폴리펩티드가 실제로 합성되었다는 초기 지표를 제공한다. 천연 분자와 비교하여, 이는 또한, 정상의 폴딩(folding) 또는 프로세싱이 돌연변이체로 발생하는지를 나타내며, 이와 관련하여, 폴리펩티드를 표지화하는 것이 유용할 수 있음이 입증될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 겔의 염색에 의해 확인될 수 있다.
단순한 합성 외에, 단백질은 각종 특성 및 광범위한 기능에 따라 특징화할 수 있다. 특성은 등전점, 열 안정성, 침강률 및 폴딩을 포함한다. 폴딩을 시험하는 하나의 방식은 인식체 결합 파트너에 이해 인식되는 능력이다. 당해 기능의 주요 예는 항체-항원 상호작용이다. 광범위한 상이한 면역분석 양식이 당해 목적에 이용가능하며 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 원칙적으로, 단백질을 특이적인 리간드 또는 관련 리간드의 패널과 접촉시키는 경우 친화성 또는 특이성에 있어서의 변화를 측정할 수 있다.
면역분석은 일반적으로 2개 유형으로 분리할 수 있다: 다수의 분리 단계를 필요로하는 이종 검정, 및 직접 수행되는 동종 검정. 일반적으로 이종 면역분석은 고체 매트릭스상에 고정된 리간드 또는 항체를 포함한다. 리간드를 함유하는 시료는 고정된 항체와 접촉시키고 매트릭스 지지체상에 형성된 복합체의 양을 고정화된 복합체에 직접 또는 간접적으로 부착된 표지로부터 측정한다. 본 발명의 내용에서 사용된 것으로서, 리간드는 동일하지 않은 분자와 상호작용하여 단단하게 결합된, 안정한 복합체를 형성하는 종으로 정의된다. 실제 목적을 위해, 결합 친화성은 일반적으로 약 106 M-1보다 크며 바람직하게는 109 - 1015 M-1의 범위이다. 리간드는 지환족 탄화수소, 다핵 방향족 화합물, 할로겐화된 화합물, 벤제노이드, 다핵 탄화수소, 질소 헤테로사이클 화합물, 황 헤테로사이클 화합물, 산소 헤테로사이클 화합물, 및 알칸, 알켄, 알킬, 탄화수소 등을 포함하는 유기 분자의 몇 가지 유형 중 임의의 것일 수 있다. 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질, 당류, 핵산 및 이의 조합을 포함하는, 생물학적 분자가 특히 관심이 집중되고 있다. 물론, 이들은 단지 예이며, 고려된 면역분석 방법은 목적한 리간드와 결합하는 항체를 수득할 수 있는 한, 특별히 광범위한 화합물을 검출하는데 적용가능함은 이해될 것이다.
이종 면역분석은 샌드위치 검정으로 수행될 수 있으며, 여기서, 목적 분자는 이러한 분자와 고 친화성으로 특이적으로 결합하는 고정화된 항체와 반응한다. 제2 단계에서, 항원 및 마커 분자에 대한 동일하거나 상이한 항체로부터 형성된 접합체를 고정화 매트릭스 상에서 항원-항체 복합체와 반응시킨다. 과량의 유리 마커 접합체를 제거한 후, 시료 속의 리간드 양과 비례하는 결합된 마커 접합체를 측정한다.
면역복합체 형성의 검출은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 다수의 시도의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 시도는 통상적으로 당해 분야에 공지된 방사활성, 형광성, 화학발광성, 전기화학발광성, 생물학적 또는 효소적 태그 또는 표지 중 어느 것과 같은 표지 또는 마커의 검출을 기준으로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 미국 특허는 미국 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241을 포함하며, 이들 각각은 본 명세서에 참조로 혼입된다. 물론, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 제2 항체 또는 바이오틴/아비딘 리간드 결합 배열과 같은 제2 결합 리간드의 사용을 통해 추가 장점을 찾을 수 있다.
바람직한 검출 방법은 방사면역분석(RIA) 또는 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)를 포함하며, ELISA는 일반적으로 증가된 민감성으로 인하여 가장 바람직하다. ELISA는 생물공학 적용시, 특히 광범위한 항원 물질에 대한 면역분석으로서 광범위하게 사용된다. ELISA의 민감성은 시그날의 효소적 증폭을 기초로 한다.
본 발명에 따라 사용하기 위해 고려된 다른 바람직한 단백질은 활성에 대한 편리한 검정을 갖는 것이다. 표적 상호작용의 대표적인 예는 촉매작용, 효소-기질 상호작용, 단백질-핵산 상호작용, 수용체-리간드 상호작용 및 단백질-금속 상호작용을 포함한다. 이러한 검정에서 돌연변이체 단백질은 외부 기능 중 어느 것을 수행하기 위해 능력에 있어서 변화에 대해 야생형 단백질과 비교할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "접촉하는"은, 바람직한 상호작용이 일어나도록 반응 성분을 서로 충분인 인접하게 하는 것으로 정의한다. 접촉은 예를 들어, 용액 중 성분을 혼합하거나, 성분 중 하나와 결합하는 고정화 매트릭스 또는 컬럼을 유동 접촉과 같은 이종 상호작용에 의해 달성될 수 있다.
촉매적 활성을 갖는 돌연변이체 단백질의 경우, 적절한 반응을 촉매율에 있어서의 변화 또는 특이성에 있어서의 변경에 대해 모니터링할 수 있다.
본 발명의 방법으로 생산되고 분리된 항체는 미리 결정된 표적에 결합하도록 선택된다. 대표적으로, 미리 결정된 표적을 진단 및/또는 치료 표적으로서 이의 적용능의 측면에서 선택할 것이다. 미리 결정된 표적은 공지되거나 공지되지 않은 에피토프일 수 있다. 항체는 일반적으로 미리 결정된 항원(예를 들어, 면역원)과 적어도 약 1×107 M-1의 친화성, 바람직하게는 약 적어도 5×lO7 M-1 이상의 친화성, 보다 바람직하게는 적어도 1×1O8 M-1 내지 1×1O9 M-1 이상의 친화성, 또는 보다 때때로, 1×1010 M-1 이하 또는 그 이상의 친화성으로 결합한다. 흔히, 미리 결정된 항원은 예를 들어, 인간 세포 표면 항원(예를 들어, CD4, CD8, IL-2 수용체, EGF 수용체, PDGF 수용체), 다른 인간 생물학적 거대분자(예를 들어, 트롬보모듈린, 단백질 C, 탄수화물 항원, 시알릴 루이스 항원, L-셀렉틴), 또는 비인간 질병 관련된 거대분자(예를 들어, 바이러스 LPS, 비리온 캡시드 단백질 또는 엔벨로프 당단백질) 등과 같은 인간 단백질이다.
다른 예에서, scFv의 진단학적 및 치료 용도의 몇 가지 보고가 발표되어 있다(참조: Gruber et al., 1994 op.cit; Lilley et al., 1994 op.cit; Huston et al., Int. Rev. Immunol 1993, 10:a 195, Sandhu JS, Crit. Rev. Biotechnol., 1992,12: 437).
바람직한 특이성의 고 친화성 항체는 각종 시스템에서 가공하여 발현시킬 수 있다. 예를 들어, scFv는 식물에서 생산되며[참조: Firek et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23: 861] 원핵세포 시스템에서 용이하게 이루어질 수 있다(참조: Owens RJ and Young RJ, J. Immunol. Meth., 1994,168: 149; Johnson S and Bird RE, Methods Enzymol., 1991, 203: 88). 또한, 단일쇄 항체를 전체 항체 또는 이의 각종 단편을 작제하기 위한 기본으로 사용할 수 있다(참조: Kettleborough et al., Euro J. Immunol, 1994, 24: 952). 가변 영역 암호화 서열은 분리하여(예를 들어, PCR 증폭 또는 서브클로닝에 의해) 바람직한 인간 고정 영역을 암호화하는 서열에 스플라이싱(splicing)시킴으로써, 면역원성이 바람직하게 최소화되는 인간 치료 용도에 보다 적합한 인간 서열 항체를 암호화할 수 있다. 수득되는 완전한 인간 암호화 서열(들)을 갖는 폴리뉴클레오티드(들)은 숙주 세포 내에서 발현되어(예를 들어, 진핵 세포 내 발현 벡터로부터) 약제학적 제형을 위해 정제될 수 있다.
DNA 발현 작제물은 통상적으로 자연 관련되거나 이종인 프로모터 영역을 포함하는, 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 DNA 서열을 포함할 것이다. 바람직하게, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질감염시키거나 형질전환시킬 수 있는 벡터 내 진핵세포 프로모터 시스템일 것이다. 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고 수준 발현, 및 돌연변이체 "가공된" 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에 유지시킨다.
앞서 기술한 바와 같이, DNA 서열은, 서열이 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된(즉, 구조 유전자의 전사 및 해독을 보증하도록 위치한) 후 숙주에서 발현될 것이다. 이러한 발현 벡터는 통상적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합적인 부분으로서 숙주 유기체내에서 복제가능하다. 일반적으로, 발혀 벡터는 선택 마커, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유함으로써 바람직한 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용한다(참조: 미국 특허 4,704,362, 이는 본 명세서에 참조로 혼입됨).
효모와 같은 진핵 미생물 외에도, 포유동물 조직과 같은 세포 배양물을 또한 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 수 있다(참조: Winnacker, "From Genes to Clones," VCH Publishers, N. Y., N. Y. (1987), 이는 본 명세서에 참조로 혼입된다). 완전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 적합한 숙주 세포주 다수가 당해 분야에 개발되어 있기 때문에, 진핵 세포가 바람직하며, CHO 세포주, 각종 COS 세포주, HeLa 세포주, 흑색종 세포주, B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 복제 오리진(origin), 프로모터, 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 서열(참조: Queen et al., Immunol. Rev. 1986, 89: 49), 및 리보소옴 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결인자 서열과 같은 필수적인 프로세싱 정보 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스 등으로부터 기원한 프로모터이다.
진핵 DNA 전사체는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입시킴에 의해 증가시킬 수 있다. 인핸서는 프로모터에 의한 전사를 증가시키는 10 내지 30 obp 사이의 시스-작용 서열이다. 인핸서는 전사 단위에 대해 5' 또는 3'인 경우 전사를 효율적으로 증가시킬 수 있다. 이들은 또한, 암호화 서열 자체 내에 또는 인트론 내에 위치하는 경우 효과적이다. 통상적으로, SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함하는 바이러스 인핸서가 사용된다. 포유동물 시스템으로부터의 인핸서 서열, 예를 들어, 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서가 일반적으로 또한 사용된다.
포유동물 발현 벡터 시스템은 또한 통상적으로 선택가능한 마커 유전자를 포함할 것이다. 적합한 마커의 예는 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(DHFR), 티미딘 키나제 유전자(TK) 또는 약물 내성을 부여하는 원핵 세포 유전자를 포함한다. 제1의 2개의 마커 유전자는 성장 배지에 티미딘을 첨가하지 않고 성장하는 능력을 결여한 돌연변이체 세포주의 사용을 선호한다. 형질전환된 세포는 이후에 보충되지 않은 배지에서 성장하는 이의 능력에 의해 확인될 수 있다. 마커로서 유용한 원핵 세포 약물 내성 유전자의 예는 G418, 마이코페놀산 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다.
해당 DNA 분절을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 잘-공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염이 원핵 세포에 대해 일반적으로 이용되는 반면, 인산칼슘 처리, 지질감염 또는 전기천공(electroporation)은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하는데 사용된 다른 방법은 폴리브렌, 원형질 융합, 리포좀, 전기천공, 및 미세주입의 사용을 포함한다(참조: 일반적으로 상기한 Sambrook et al.).
일단 발현되면, 본 발명의 항체, 개개의 돌연변이된 면역글로불린 쇄, 돌연변이된 항체 단편, 및 다른 면역글로불린 폴리펩티드를 황산암모늄 침전, 분획 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는, 당해 분야의 표준 과정에 따라 정제할 수 있다[참조: 일반적으로, Scopes, R., Protein Purification, Springer- Verlag, N. Y. (1982)]. 일단 경우에 따라 부분적으로 또는 균질성으로 정제되면, 폴리펩티드를 이후에 치료학적으로 또는 검정 과정, 면역형광성 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용할 수 있다[참조: 일반적으로, Immunological Methods, Vols. I and II, Eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, N.Y. N. Y. (1979 and 1981)].
본 발명의 올리고펩티드는 진단 및 치료요법에 사용할 수 있다. 설명하지만 제한하지 않고, 항체는 암, 자가면역병 또는 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 암의 치료시, 항체는 전형적으로 암 세포에서 우선적으로 발현된 항원, 예를 들어, erbB-2, CEA, CD33, 및 당업자에게 잘 공지된 많은 다른 항원에 결합할 것이다. 자가면역병의 치료를 위해, 항체를 전형적으로 T-세포에서 발현된 항원, 예를 들어, CD4, IL-2 수용체, 각종 T-세포 항원 수용체 및 당업자에게 잘 공지된 많은 다른 항원에 결합시킬 것이다(예를 들어, 참조: Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul, ed., Raven Press: New York, N.Y., 이는 본 명세서에 참조로 포함되어 있다). 바이러스 감염의 치료를 위해, 항체는 전형적으로 헤르페스 단성 바이러스 및 사이토메갈로바이러스의 각종 당단백질(예를 들어, gB, gD, gE), 및 당업자에게 잘 공지된 많은 다른 항원과 같은 특수 바이러스에 의해 감염된 세포상에서 발현된 항원에 결합할 것이다(예를 들어, 참조: Virology, 2nd ed., B. N. Fields et al., eds., (1990), Raven Press: New York, N. Y.).
본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 유용하다. 비경구 투여를 위한 조성물은 일반적으로, 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체 속에 용해된 항체의 용액 또는 이의 칵테일을 포함할 것이다. 각종의 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균되며 일반적으로 입상 물질을 함유하지 않는다. 이들 조성물은 통상의, 잘 공지된 멸균 기술에 의해 멸균시킬 수 있다. 조성물은 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은 적절한 생리학적 조건에 요구되는 것으로서 약제학적으로 허용되는 보조 물질 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 것이다. 이들 제형 중 돌연변이체 항체의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.01% 미만, 일반적으로 적어도 약 0.1% 내지 5중량%와 같이 많은 양까지 변할 수 있으며 선택된 특수 투여 방식에 따라 유체 용적, 점도 등을 기초로 주로 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사용의 대표적인 약제학적 조성물을 1ml의 멸균된 완충수, 및 약 1mg의 돌연변이체 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 정맥내 주입을 위한 대표적인 조성물은 250ml의 멸균 링거액(Ringer's solution), 및 10mg의 돌연변이체 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백하며 예를 들어, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 20th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (2000), 이는 본 명세서에 참조로 인용된다]에 보다 상세히 기술되어 있다.
후보물질 및/또는 진화된 후보물질의 제조
일 실시예에서, 진핵 시스템은 CHO, HEK293, BV19, DS-I, THP-I, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MMl, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDA-MB-468, LnCAP, NRK-49F, 및 SP2/0 세포주; 및 마우스 비장 세포 및 토끼 PBMC로 이루어진 그룹 중 하나로부터 선택된 포유동물 시스템이다.
일 실시예에서, 섬유모세포 세포 (3T3, 마우스; BHK21, 시리안 햄스터) 상피 세포 (MDCK, 개; HeIa, 인간; PtKl, 랫트 캥거루) 혈장 세포 ((SP2/0 및 NSO, 마우스) 신장 세포 (293, 인간; COS, 원숭이) 난소 세포(CHO, 차이니즈 햄스터) 배아 세포 (R1 및 E14.1, 마우스; H1 및 H9, 인간; PER C.6, 인간)을 포함하는 각종의 포유동물 숙주 세포를 후보물질의 제조에 사용할 수 있다.
특정 측면에서, 재조합체 항체는 CHO 및 NSO 및 SP2/0 세포에서 생산된다. 특수 측면에서, 포유동물 시스템은 CHO-S 세포주이다. 가장 흔히 사용된 발현 벡터 시스템은 글루타민 신테타제 발현 시스템 및 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자를 기초로 한 다른 것이다.
다른 실시예에서, 진핵 시스템은 효모 세포 시스템이다. 일 측면에서, 효모 세포 시스템은 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 또는 피키아(picchia) 세포 중에서 선택된다.
본 발명의 방법에서, 진화된 분자를 스크리닝하는데 사용된 숙주는 히트의 하부 제조에 사용된 숙주와 동일하며, 본 발명의 다른 측면에서, 단백질의 발견 및 진화에 사용된 유전 시스템은 시판되는 적용을 위해 단백질을 제조하는데 사용된 유전 시스템과 동일하다.
바이로시밀러
바이오시밀러는 더 이상 특허 보호되지 않는 승인된 윤리적 약물로서 동일한 아미노산 서열(즉, 화학적 조성물)을 갖는 단백질계 치료제이며, 일 측면에서, CIAO 방법이 바이오시밀러와 특히 관련되어 있다. 동등한 제형 및 조성물로 단백질 치료제를 생산하는 것이 필수적이지만, 시장에서 경쟁력이 있기 위해서, 바이시밀러가 가능한 한 신속하고 저렴하게 제조될 수 있어야 한다. 세포 배양 배지 및 공정 개발은 바이오시밀러를 제조하고 생산하는 가장 비용 및 시간 소모적인 부분 중 일부이다.
단백질 치료제 내 잠재 돌연변이 코돈의 변화는 단백질 해독에 사용된 코돈을 변화시키지만 단백질내 아미노산 서열을 보존한다. 분자내 다양한 위치, 특히 아미노 말단에서 이들 코돈 변화는 발현에 유의적인 영향을 가질 수 있으며 일부 경우에 심지어 글리코실화에 유의적인 영향을 가질 수 있다. 일 측면에서 CIAO 방법은 제조에 궁극적으로 사용된 것과 유사한 숙주 세포 내에서 단백질내 잠재 돌연변이 코돈을 선택하고 진화시키는데 사용된다. 따라서, 가공 시간은 보다 높은 단백질 수율 및, 단백질이 숙주 세포주내에서 발현하도록 선택되었다는 사실로 인하여 감소될 수 있으므로, 이러한 대부분의 전통적인 제조 사안은 분자를 선택하여 왔다. 또한, 저렴하고, 혈청 유리된 배양 배지내에서 분자를 선택함으로써, 분자를 저렴한 제조 및 정제를 허용하는 코돈을 사용하여 선택할 수 있다.
추가 노력 없이, 당업자는 앞서의 설명을 이용하여, 본 발명을 이의 완전한 정도로 이용할 수 있다고 여겨진다. 다음 예는 설명하는 것으로 고려되어야 하며, 이에 따라 어떠한 방식으로도 본 기재내용의 나머지를 제한하지 않는다.
예
예 1. 항체 라이브러리의 생성 및 스크리닝
이 예는 포유동물 세포 표면 디스플레이 인간 항체 라이브러리를 생성하고 스크리닝함으로써 유동 세포분석법 분류 및 ELISA의 조합을 사용하여 표적 항원에 대한 결합 활성으로 인간 항체를 분리하는 방법을 기술한다.
유동 세포분석법 분석에 의한 라이브러리 스크리닝
1. 하기 부록 1.2, 1.3, 및 1.4에 기술된 것과 같은 포유동물 세포 내에 안정하게 통합된 인간 항체 라이브러리를 생성한다.
2. 유동 세포 분석법 분석 전에 안정한 완전한 인간 항체 라이브러리를 확장시킨다.
3. 유동 세포분석법 분석 당일에, 1×107개의 세포를 1×PBS로 세척한다.
4. 세포를 데타킨(Detachin) 세포 탈착 배지로 탈착시키고 세포를 1×PBS 속에 수집한다.
5. 세포를 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다. 상층액을 제거한다.
6. 세포 펠릿(pellet)을 1 ml의 냉 1×PBS 속에 재-현탁시키고 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다.
7. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 냉 1×PBS 중 500㎕의 2㎍/ml의 정제된 인간 001 단백질 속에 재-현탁시킨다.
8. 빙상에서 손으로 때때로 혼합하면서 1시간 동안 배양한다.
9. 세포를 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다. 상층액을 제거한다.
10. 세포 펠릿을 1 ml의 냉 1×PBS 속에 재-현탁시키고 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다.
11. 단계 7 및 8을 반복한다.
12. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 10% 염소 혈청이 들어있는 냉 1×PBS 중 500㎕의 1㎍/ml의 토끼 항-인간 001 다클론 항체 속에 재-현탁시킨다.
13. 빙상에서 때때로 손으로 혼합하면서 30분 동안 배양한다.
14. 세포를 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다. 상층액을 제거한다.
15. 세포 펠릿을 1 ml의 냉 1×PBS 속에 재-현탁시키고 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다.
16. 단계 7 및 8을 반복한다.
17. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 10% 염소 혈청이 들어있는 냉 1×PBS 중 500㎕의 FITC와의 염소 항-토끼 항체 접합체 및 피로에르트린 과의 염소 항-인간 Fc 항체 접합체를 재-현탁시킨다.
18. 빙상에서 손으로 때때로 혼합하면서 1시간 동안 배양한다.
19. 세포를 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다. 상층액을 제거한다.
20. 세포 펠릿을 1 ml의 냉 1×PBS 속에 재-현탁시키고 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킨다.
21. 단계 7 및 8을 반복한다.
22. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 2% 염소 혈청이 들어있는 1 ml의 냉 1×PBS 속에 재-현탁시킨다.
23. Dako MoFlo를 사용하여 유동 세포분석법 분석을 진행한다.
24. 분류 윈도우(sort window)를 드로우(draw)하여 PE/FITC 형광성의 비 측면에서 총 세포의 상부 0.1%를 포함시킨다. 분류 윈도우에 속하는 세포를 100㎕의 성장 배지가 들어있는 96 웰 플레이트 속에 수집한다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열의 회수
1. 클론을 96 웰 플레이트로부터 6 웰 플레이트로 확장시킨다. 세포가 6 웰 플레이트 속에서 80% 합치성에 이르는 경우, Qiagen DNeasy 조직 키트를 사용하여 게놈 DNA 분리를 진행한다.
2. 세포로부터 배지를 흡입 제거한다. 500 ml의 1×PBS를 각각의 6 웰에 가한다. 플레이트를 멸균 피펫 팁으로 긁어 세포를 제거한다. PBS 중 긁은 세포를 멸균 미세-원심분리 튜브 속으로 이전한다.
3. 세포를 5분 동안 3000 rpm에서 원심분리한다.
4. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 200㎕의 1×PBS 속에 재-현탁시킨다.
5. 20㎕의 프로테이나제 K 및 200㎕의 완충액 AL을 시료에 가하고, 와동시킴으로써 골고루 혼합하고, 56℃에서 10분 동안 배양한다.
6. 200㎕의 에탄올을 시료에 가하고 와동시켜 골고루 혼합한다.
7. 단계 6으로부터의 혼합물을 회전 컬럼 내로 피펫팅한다. 8000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다. 유동-통과물을 버린다.
8. 500㎕의 완충액 AWl을 가하고 1분 동안 8000 rpm에서 원심분리한다. 유동-통과물을 버린다.
9. 500㎕의 완충액 AW2을 가하고 2분 동안 14,000 rpm에서 원심분리한다. 유동-통과물을 버린다. 다시 1분 동안 14,000 rpm에서 원심분리한다. 막이 완저히 건조되도록 한다.
10. 회전 컬럼을 멸균 미세-원심분리 튜브 속에 두고 200㎕의 완충액 AE를 막위에 직접 피펫팅한다.
11. 실온에서 1분 동안 배양하고 1분 동안 8000 rpm에서 원심분리하여 게놈성 DNA를 용출시킨다.
12. 다음 반응물을 1.5 ml의 미세원심분리 튜브 속에 셋팅함으로써 게놈 DNA를 QC한다:
gDNA 5㎕
10× 시료 로딩 완충액 5㎕
총 부피 10㎕
0.8% 아가로즈 TAE 겔 위에 0.5㎍/ml 에티디움 브로마이드와 함께 로딩한다. IkB DNA 래더(ladder)를 표준물로서 사용한다. 겔을 100V에서 20 내지 30분 동안 1×TAE 완충액 속에 이동시킨다.
13. 다음 PCR 반응물을 멸균 PCR 튜브 속에 셋팅한다:
gDNA 1㎕
2×HotStar Taq 마스터 혼합물(Master Mix) 12.5㎕
가변 도메인 전방 프라이머* 0.5㎕
가변 도메인 역방 프라이머* 0.5㎕
H 2 O 10.5㎕
총 부피 25㎕
*부록 1.2 참조
14. PCR 튜브를 열 순환기 속에 두고 순환 프로그램을 개시한다.
초기 활성화 단계: 95℃에서 15분
3-단계 주기
변성: 94℃에서 40초
어닐링: 55℃에서 40초
연장: 72℃에서 2분
주기 수: 30회
최종 연장 단계: 72℃에서 10분
15. 다음 반응물을 1.5ml의 미세 원심분리 튜브 속에 셋팅함으로써 PCR 반응물을 QC한다:
PCR 반응물 5㎕
IQ ×시료 로딩 완충액 5㎕
총 부피 10㎕
1% 아가로즈 TAE 겔 위에 0.5㎍/ml 에티디움 브로마이드를 로딩한다. 1kB DNA 래더를 표준물로서 사용한다. 겔을 100V에서 20 내지 30분 동안 1×TAE 완충액 속에서 작동시킨다.
16. 다음 클로닝 반응물을 1.5 ml의 미세-원심분리 튜브 속에서 Invitrogen TOPO 2.1 키트를 사용하여 셋팅한다:
PCR 반응물 4㎕
염 용액 1㎕
TOPO 벡터 1㎕
총 부피 6㎕
17. 반응물을 온화하게 혼합하고 5분 동안 실온에서 배양한다.
18. 단계 17로부터의 2㎕의 TOPO 클로닝 반응물을 원 샷 화학적 성분 대장균(One Shot Chemically competent E. coli)의 바이알 내에 가하고 온화하게 혼합한다.
19. 빙상에서 30분 동안 배양한다.
20. 세포를 30초 동안 42℃에서 열-쇼크(heat-shock)한다.
21. 튜브를 얼음에 이전시키고 2분 동안 배양한다.
22. 250㎕의 실온 S.O.C. 배지를 가한다.
23. 튜브를 수평적으로 37℃에서 1시간 동안 200 rpm으로 진탕시킨다.
24. 10㎕의 형질전환물을 재-가온시킨 LB-카르베니실린 플레이트상에 분배한다.
25. 플레이트를 밤새 37℃에서 배양한다.
26. 각각의 형질전환물로부터 6개 클론을 서열분석을 위해 집어낸다.
27. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 분석한다. 제2 라운드의 스크리닝을 ELISA 방법을 사용하여 진행한다.
벡터 및 인간 항체 클론을 제한 효소로 분해한다
반응은 선택된 제한 효소(들)에 의존할 것이며 제조업자의 지시에 따라; 예를 여기에 제공한다: 다음 분해 반응물을 미세원심분리 튜브 속에 빙상에서 제조한다:
벡터 DNA(2㎍) x㎕
10× Rest Enz 완충액× 10㎕
뉴클레아제가 없는 물 Q 내지 97㎕
Rest Enz 1(10 U/㎕) 3㎕
Rest Enz 2(10 U/㎕) 3㎕
총 반응 부피 100㎕
인간 항체 클론(5ug) x㎕
1O× Rest Enz 완충액× 10㎕
뉴클레아제가 없는 물 Q 내지 97㎕
Rest Enz 1(10 U/㎕) 3㎕
Rest Enz 2(10 U/㎕) 3㎕
총 반응 부피 100㎕
1. 온화하게 혼합하고 미세원심분리기 속에서 약간(5초) 회전시킨다
2. 반응물을 37℃에서 밤새 배양한다.
벡터를 CIP 분해하고 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제한다
3. 2㎕의 Apex 포스파타제를 벡터 분해 반응물을 함유하는 미세 원심분리기에 가한다.
4. 37℃에서 10분 동안 배양한다.
5. 70℃에서 5분 동안 가열하여 Apex 포스파타제를 비활성화시킨다.
6. 500㎕의 완충액 PBI를 미세원심분리기에 가한다.
7. 와동시켜 혼합하고 신속하게 원심분리한다.
8. 750㎕를 한번에 컬럼에 로딩한다.
9. 12,000 x g에서 1분 동안 원심분리하고 액체를 수집 튜브로부터 경사여과(decant)한다.
10. 모든 시료가 가공될 때까지 반복한다.
11. 750㎕의 PE 완충액(에탄올을 가한다)으로 세척한다.
12. 12,000 x g에서 1분 동안 원심분리하고 액체를 수집 튜브로부터 경사여과한다.
13. 컬럼을 다시 수집 튜브상에 두고 다시 원심분리한다.
14. 컬럼을 신규한 미세원심분리 튜브에 두고 50㎕의 EB 완충액으로 용출시킨다.
제한 효소 분해된 인간 항체 클론을 겔 정제한다
1. 다음 반응물을 1.5 ml의 미세-원심분리 튜브 속에 셋팅한다:
Rest Enz 분해된 완전한 인간 항체 클론 100㎕
10× 시료 로딩 완충액 3㎕
총 부피 103㎕
2. 1% 아가로즈 TAE 겔 위에 0.5㎍/ml 에티디움 브로마이드를 로딩한다. IkB DNA 래더를 표준물로서 사용한다. 겔을 100V에서 20~30분 동안 I× TAE 완충액 속에서 이동시킨다.
3. 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변 영역에 상응하는 밴드를 잘라서 QIAquick Gel 추출 키트를 사용하여 정제한다.
4. 3 용적의 완충액 QG를 1 용적의 겔에 가한다.
5. 50℃에서 10분 동안, 겔 조각이 완전히 분해될 때까지 배양한다. 1개의 겔 용적의 이소프로판올을 시료에 가하고 혼합한다.
6. QIAquick 회전 컬럼을 제공된 2ml 수집 튜브 속에 둔다.
7. 시료를 QIAquick 컬럼에 적용시키고, 1분 동안 원심분리한다.
8. 유동-통과물을 버리고 QIAquick 컬럼을 다시 동일한 수집 튜브에 둔다.
9. 0.75 ml의 완충액 PE를 QIAquick 컬럼에 가하고 1분 동안 원심분리한다.
10. 유동-통과물을 버리고 QIAquick 컬럼을 추가로 1분 동안 17,900 x g (13,000 rpm)에서 원심분리한다.
11. QIAquick 컬럼을 깨끗한 1.5 ml 미세원심분리기 튜브 내로 둔다.
12. 52㎕의 완충액 EB를 QIAquick 막의 중심에 두고 컬럼을 1분 동안 원심분리한다. 컬럼을 1분 동안 그대로 둔 후, 1분 동안 원심분리한다.
인간 HC 및 LC 가변 도메인을 분해된 벡터 DNA 로 연결한다
다음 연결 반응물을 미세원심분리기 튜브 속에서 빙상에서 제조한다:
분해된 벡터 DNA(100 ng) x㎕
인간 HC 및 LC 가변 도메인 y㎕
5× T4 리가제 완충액 4㎕
뉴클레아제가 없는 물 QS 내지 19㎕
T4 리가제 (2,000 U/㎕) 1㎕
총 반응 부피 20㎕
1. 온화하게 혼합하고 원심분리기 속에서 약간(5초) 회전시킨다.
2. 실온에서 2시간 동안 또는 16℃에서 밤새 배양한다.
3. 연결 반응 혼합물 각각을 슈퍼컴피턴트(Supercompetent) 대장균 세포 내로 형질전환시킨다.
4. 14 ml BD Falcon 폴리프로필렌 환저 튜브를 빙상에서 예비-급냉시킨다. SOC 배지를 42℃로 제조한다.
5. 슈퍼컴피턴트 세포를 빙상에서 해동시킨다. 해동되면, 온화하게 혼합하고 1OO㎕의 세포를 예비-급냉시킨 튜브 각각에 분취한다.
6. 1.7㎕의 β-머캅토에탄올을 각각의 세포 분취량에 가한다. 세포를 빙상에서 10분 동안 항온처리하고, 매 2분마다 온화하게 소용돌이시킨다.
7. 2㎕의 연결 반응 혼합물을 세포의 1개의 분취량에 가한다. 튜브를 온화하게 턴다.
8. 튜브를 빙상에서 30분 동안 배양한다.
9. 튜브를 42℃ 수욕 속에서 45초 동안 열-펄싱(heat-pulse)한다.
10. 튜브를 빙상에서 2분 동안 배양한다.
11. 900㎕의 예비가열된 SOC 배지를 가하고 튜브를 37℃에서 1시간 동안 225~250 rpm으로 진탕시키면서 배양한다.
12. 20㎕ 및 200㎕의 형질전환 혼합물을 카르베니실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅한다.
13. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한다.
14. 플레이트 상의 콜로니를 계수하고 PCR 스크리닝 및 서열 분석을 위해 6개 콜로니를 집는다.
15. 정확한 서열을 가진 1개 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA를 제조하고, 293F 세포 속에서 형질감염을 진행시킨다.
293F 세포의 형질감염
1. 형질감염 전 1주일째에, 293F 세포를 단층 배양물에 혈청 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(D-MEM) 속에 이전한다.
2. 형질감염 전날에, 0.1×105개의 세포를 형질감염 시료당 100 Dl의 혈청 보충된 D-MEM 속에 96 웰 양식으로 플레이팅한다.
3. 각각의 형질감염 시료에 대해, DNA-리포펙타민 복합체를 제조한다.
4. 0.2㎍의 DNA를 50㎕ Opti-MEM 환원된 혈청 배지 속에 희석시킨다. 온화하게 혼합한다.
5. 0.125㎕ 리포펙타민을 50㎕의 Opti-MEM 환원된 혈청 배지 속에 희석시킨다. 온화하게 혼합하고 5분 동안 실온에서 배양한다.
6. 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민과 합한다. 온화하게 혼합하고 20분 동안 실온에서 배양한다.
7. 100㎕의 DNA-리포펙타민 복합체를 세포 및 배지를 함유하는 각각의 웰에 가한다. 플레이트를 앞뒤로 흔들어 온화하게 혼합한다.
8. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기 속에서 배양한다.
9. 100㎕의 혈청 보충된 D-MEM을 각각의 웰에 6시간 후에 가한다. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기 속에서 밤새 배양한다.
10. 배지를 각각의 웰 속에서 흡인제거한다. 각각의 웰을 100㎕의 293 SFM II와 4 mM L-글루타민으로 세척한다. 100㎕의 293 SFM II과 4 mM L-글루타민을 각각의 웰에 가한다.
11. 상층액을 ELISA를 위해 형질감염 후 96시간째에 수집한다.
부록 1.1: 완충액 제조법
2% 염소 혈청이 들어있는 1×PBS
· 2 ml 염소 혈청
· 98 ml의 1×PBS
50× TAE 완충액
· 242 g 트리스 염기
· 57.1 ml의 빙초산
· 37.2 g의 Na2EDTA-2H2O
· 멸균 H2O를 1 리터의 최종 용적에 가한다.
1× TAE 완충액
· 20 ml 5OX TAE 완충액
· 800 ml 증류된 H2O
에티디움 브로마이드가 들어있는 0.8% 아가로즈 겔
· 0.8 g LE 아가로즈
· 100 ml 1× TAE 완충액
· 아가로즈를 초음파 오븐 속에 용융시키고 소용돌이시켜 균일하게 혼합시킨다.
· 아가로즈를 55℃로 냉각시킨다.
· 2.5㎕의 20 mg/ml 에티디움 브로마이드를 아가로즈에 가한다.
· 겔 플랫포옴에 붓는다.
에티디움 브로마이드가 들어있는 1% 아가로즈 겔
· 1 g의 LE 아가로즈
· 100 ml의 1X TAE 완충액
· 아가로즈를 초음파 오븐 속에 용융시키고 소용돌이시켜 균일하게 혼합시킨다.
· 아가로즈를 55℃로 냉각시킨다.
· 2.5㎕의 20 mg/ml 에티디움 브로마이드를 아가로즈에 가한다.
· 겔 플랫포옴에 붓는다.
LB
· 1O g의 NaCl
· lO g의 트립톤
· 5 g의 효모 추출물
· 증류된 H2O를 1 리터의 최종 용적으로 가한다.
· pH를 5 N NaOH를 사용하여 7.0으로 조절한다.
· 오토클레이빙한다.
LB-카르베니실린 우무(agar)
· 1O g의 NaCl
· 1O g의 트립톤
· 5 g의 효모 추출물
· 2O g의 우무
· 증류된 H2O를 1 리터의 최종 용적으로 가한다.
· pH를 5 N NaOH를 사용하여 7.0으로 조절한다.
· 오토클레이빙한다.
· 55℃로 냉각시킨다.
· 10 ml의 10 mg/ml의 여과기-멸균된 카르베니실린을 가한다.
· 페트리 디쉬(25 ml/100-mm 플레이트) 내로 붓는다.
SOC 배지
· 0.5 g NaCl
· 2O g 트립톤
· 0.5 g 효모 추출물
· 2 ml의 여과기-멸균된 20% 글루코즈
· 증류된 H2O를 1 리터의 최종 용적으로 가한다.
· 오토클레이빙한다.
· 10 ml의 여과기-멸균된 1M MgCl2 및 10 ml의 여과기-멸균된 1M MgSO5을 사용 전에 가한다.
세척 용액
· PBS 중 0.05 % 트윈-20
차단 용액
· PBS 중 2% 카네이션 탈지 분유
열 비활성화된 태아 소 혈청
· 원래의 판매사 병 속의 500 ml의 열 비활성화된 태아 소 혈청
· 30분 동안 56℃에서 매 5분마다 혼합하면서 가열한다.
· 50 ml의 분취량을 제조하고 -20℃에 저장한다.
혈청 보충된 둘베코 변형된 이글 배지
· 500 ml의 둘베코 변형된 이글 배지
· 50 ml의 열 비활성화된 태아 소 혈청
· 5 ml의 10 mM MEM 비-필수 아미노산
4 mM L-글루타민이 들어있는 293 SFM II
· 500 ml의 SFM II
· 10 ml의 200 mM L-글루타민
DEAE-덱스트란 용액
· 1 g의 DEAE-덱스트란(디에틸아미노에틸-덱스트란)
· 100 ml의 증류수 속에 용해한다.
· 여과기 멸균
부록 1.2: 완전한 인간 항체 라이브러리의 작제
모든 기능적 인간 배선 중쇄(VH) 및 카파 경쇄(Vk) V 영역을 V 기재 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)로부터 수득하여 정렬할 수 있다. 이후에 정렬을 다양성, 특히 골격 3개 영역 내에서 분석할 수 있다. 얻어진 서열 무리로부터 바람직한 수의 VH 및 Vk 유전자를 라이브러리 작제를 위해 선택할 수 있다.
V 영역 클로닝
중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자(골격 1, 2, 및 3 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 포함)를 인간 게놈성 DNA로부터 2개 조각으로 유전자 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이후에, 부분 V-영역 유전자를 오우버랩 PCR에 의해 합한다. 링커를 완전한 길이의 LC V-영역으로 포유동물 발현 벡터 내에 클로닝하기 전에 내포된 PCR에 의해 가한다. 클로닝된 LC 가변 도메인을 서열 확인한다(LC V 클론 수득). 중쇄 가변 도메인은 TOPO 클로닝하고 서열을 확인한다(HC V TOPO 클론). HC V 영역으로 확인된 서열을 상응하는 플라스미드로부터 증폭시키고, 링커를 3' 말단에 가하고, 수득되는 PCR 생성물을 LC V 가변 도메인 클론내로 클로닝하여 Vk/VH 조합을 형성시키고 포유동물 벡터 내로 클로닝한다.
완전한 길이의 IgG 의 발현
바람직한 포유동물 벡터 내 완전한 길이의 카파 경쇄 및 IgG1 중쇄의 발현은 단일 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터로부터 구동될 수 있다. 각각의 쇄는 인접한 폴리펩티드 쇄를 세망세포질(ER)에 표적화하는 분비 시그날 앞에 존재한다. 앵커 시그날을 중쇄의 C-말단에 융합시킬 수 있다. 당해 시그날을 분해 제거하고 완전한 길이의 IgG를 분비 후 세포 막의 외부에 부착시키는 앵커(anchor)로 교체한다.
부록 1.3: 형질감염에 의한 포유동물 세포 내에서 안정한 완전한 인간 항체 라이브러리의 생성
1. 형질감염 1주일 전에, CHO-S 세포를 혈청 보충된 둘베코 변형 이글 배지(D-MEM) 중 단층 배양물에 이전시킨다.
2. 형질감염 1일 전에, 형질감염 시료 당 15 ml의 혈청 보충된 D-MEM 중 6×106 세포를 10-cm 조직 배양 플레이트 속에 플레이팅한다. 10개의 10-cm 플레이트를 제조한다.
3. 각각의 10-cm 플레이트의 경우, DNA-리포펙타민 복합체를 다음 4 내지 7 단계에 따라 제조한다.
4. 25㎍의 최대-예비(maxi-prep) 완전한 인간 항체 라이브러리 플라스미드 DNA를 1.5 ml의 Opti-MEM 환원된 혈청 배지 속에 희석시킨다. 혼화하게 혼합한다.
5. 60㎕의 리포펙타민을 1.5 ml의 Opti-MEM 환원된 혈청 배지 속에 희석시킨다. 혼화하게 혼합하고 5분 동안 실온에서 배양한다.
6. 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민과 합한다. 온화하게 혼합하고 20분 동안 실온에서 배양한다.
7. 3 ml의 DNA-리포펙타민 복합체를 세포 및 배지를 함유하는 플레이트 각각에 가한다. 플레이트를 앞뒤로 흔들어서 온화하게 혼합한다.
8. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기 속에서 밤새 배양한다.
9. 배지를 각각의 플레이트에서 15 ml의 혈청 보충된 D-MEM으로 교환한다. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기 속에서 48시간 동안 배양한다.
10. 세포를 테타친 세포 탈착 배지로 탈착시키고 세포를 혈청 보충된 D-MEM 속에 재-현탁시킨다.
11. 0.4×106 개의 세포를 10 ml의 혈청 보충된 D-MEM 속에서 800㎍/ml G418와 함께 1개의 10-cm 조직 배양 플레이트 속에 플레이팅한다. 모든 형질감염된 세포를 이전하여 15O×10-cm 플레이트를 수득한다.
12. 0.4×106 개의 형질감염되지 않은 CHO-S 세포를 800㎍/ml G418이 들어있는 10 ml의 혈청 보충된 D-MEM 속에 1개의 10-cm 조직 배양 플레이트 속에 플레이팅한다.
13. 세포에 800㎍/ml G418이 들어있는 혈청-보충된 D-MEM로 매 4일마다 공급한다.
14. 14일 후, 형질감염되지 않은 CHO-S 세포가 들어있는 플레이트를 관찰한다. 플레이트에 생 세포는 존재하지 않아야 한다.
15. 나머지 형질감염된 세포를 데타친 세포 탈착 배지로 탈착시키고 세포를 동결 배지 속에서 1×107 세포/ml로 동결시킨다.
부록 1.4: 레트로바이러스 감염에 의한 포유동물 세포 내에서 안정한 완전 인간 항체의 생성
1. 형질감염 1일 전, 6×106 EcoPack-2 293 세포를 형질감염 시료당 15 ml의 혈청-보충된 D-MEM 속에 10-cm 조직 배양 플레이트 속에서 플레이팅한다. 10개의 10-cm 플레이트를 제조한다.
2. MBS-함유 배지를 제조한다. 이는 형질감염 직전에 수행한다. 각각의 10-cm 조직 배양 플레이트에 대해, 12 ml의 MBS-함유 배지를 제조하여야 한다.
3. 12 ml의 MBS-함유 배지를 각각의 10-cm 플레이트에 가하고 플레이트를 37℃ 배양기에 다시 둔다. 이는 DNA 현탁액의 첨가 전 20 내지 30분째에 수행되어야 한다.
4. 10㎍의 최대-예비 MIy 인간 항체 라이브러리 플라스미드 DNA 펠릿를 450㎕의 멸균 H2O 속에 재현탁시키고 DNA를 이전시켜 5-ml BD Falcon 폴리스티렌 환저 튜브를 분리한다.
5. Stratagene Transfection MBS 포유동물 형질감염 키트로부터의 50㎕의 용액 I 및 500㎕ 용액 II를 DNA에 가한다.
6. 500㎕에서 설정된 피펫기를 사용하여 현탁액을 상하로 피펫팅함으로써 DNA 현탁액 속의 어떠한 침전물도 온화하게 재현탁시킨다.
7. DNA 현탁액을 실온에서 10분 동안 배양한다.
8. 형질감염시킬 10-cm 플레이트를 배양기로부터 제거하고 DNA 현탁액을 플레이트 위에 적가 방식으로, 온화하게 저으면서 가하여 세포가 플레이트로부터 떨어지는 것을 방지하고 DNA 현탁액이 균일하게 분배되도록 한다.
9. 조직 배양 플레이트를 37℃ 배양기에 다시 둔다.
10. 3시간 동안 배양한 후, 배지를 플레이트로부터 제거하고 이를 25μM 클로로퀸이 보충된 4 ml의 4 ml 혈청-보충된 D-MEM으로 교체한다. 플레이트를 37℃ 배양기에 다시 둔다.
11. 추가로 6 내지 7시간 동안 배양한 후, 25μM 클로로퀸을 함유하는 성장 배지를 제거하고 클로로퀸이 없는 4ml의 혈청-보충된 D-MEM으로 교체한다.
12. 플레이트를 37℃ 배양기 속에서 밤새 배양한다.
13. 배지를 플레이트로부터 제거하고 3.0 ml의 신선한 혈청 보충된 D-MEM으로 교체한다. 플레이트를 37℃ 배양기에 다시 둔다.
14. 바이러스-생산 패키징 세포를 배양기로부터 제거한다.
15. 바이러스-함유 상층액을 제1 플레이트로부터 수집하고 이를 0.45㎛ 여과기를 통해 멸균 50-ml 원뿔모양 튜브내로 여과한다.
16. 바이러스 상층액을 1.5 ml 동결 바이알내로 분취하고 무수 빙/에탄올 욕 속에서 신속히 동결시킨다. 바이러스 상층액을 -80℃에서 저장한다.
17. 0.5×106 NIH-3T3 세포를 10 ml의 혈청 보충된 D-MEM 중에 1개의 10-cm 조직 배양 플레이트 속에서 플레이팅한다. 102×10-cm 조직 배양 플레이트를 플레이팅한다.
18. 상층액을 37℃ H2O 욕 속에서 신속하게 교반하여 빠르게 해동시킨다.
19. 바이러스를 송아지 혈청-보충된 DMEM 속에 DEAE-덱스트란 용액을 사용하여 0.3×105 바이러스 입자/ml의 역가로 희석시킨다. 감염시킬 3 ml의 희석된 바이러스 perlOO-mm 플레이트를 제조한다(세포의 20%가 감염될 것이다). 음성 대조군으로 사용될 성장 배지 및 DEAE-덱스트란의 "목 칵테일(mock cocktail)"을 제조한다.
20. 배지를 NIH-3T3 세포로부터 통기 제거한다. 각각의 플레이트에 대해 3.0 ml의 희석된 바이러스를 세포 위에 균일하게 분배시킨다. 플레이트를 37℃ 배양기에 3시간 동안 다시 둔다.
21. 3시간 배양한 후, 추가 7.0 ml 송아지 혈청-보충된 D-MEM을 각각의 플레이트에 가하고, 플레이트를 37℃ 배양기에 다시 둔다. 플레이트를 48시간 동안 배양한다.
22. 배지를 800㎍/ml G418이 보충된 10 ml의 송아지 혈청-보충된 D-MEM으로 각각의 10-cm 조직 배양 플레이트 속에서 교체한다.
23. 세포에 송아지 혈청-보충된 D-MEM을 800㎍/ml G418과 함께 매 4일마다 공급한다.
24. 14일 후, 모의-감염된 NIH-3T3 세포가 들어있는 플레이트를 관찰한다. 플레이트에 생 세포가 없어야 한다.
25. 남아있는 형질감염된 세포를 데타친 세포 탈착 배지로 탈착시키고 세포를 동결 배지 속에서 1×107 세포/ml로 동결시킨다.
예 2. 포괄적인 위치 진화( CPE )에 대한 반응
돌연변이 유발 반응
한 쌍의 프라이머(프라이머 혼합물 1 및 프라이머 혼합물 2)를 삽입될 각각의 코돈에 대해 설계한다. 설계는 유전자 서열에 좌우될 것이며, Sequencher(Gene Codes Corporation) 또는 벡터NTI®(Life Technologies)와 같은 서열 분석 데이터베이스를 사용하여 프라이머를 설계할 수 있다. CPE의 경우, 한쌍의 프라이머를 돌연변이될 각각의 코돈에 대해 설계한다. 변성 표적 코돈(NNK 또는 NNN)는 중간에 있으며, 각각의 측면에 20개 염기로 플랭킹되어 있다(총 프라이머 길이: 43개 염기, 독특한 돌연변이체를 확인하기 위한 서열분석용의 9f 클론). 템플릿 DNA는 표적 유전자(들)을 가진 벡터 DNA이다.
다음 반응물을 96-웰 박 벽(well thin wall) PCR 플레이트 또는 0.2 ml의 박 벽 PCR 튜브 속에서 빙상에서 제조한다:
프라이머 혼합물 1(2.5μM) 5㎕
프라이머 혼합물 2(2.5μM) 5㎕
10× Pfu 터보 DNA 폴리머라제 완충액 2.5㎕
DNA 템플릿(5, 10, 25 ng) x㎕
dNTPs 2㎕
뉴클레아제가 없는 물 QS 내지 24.5㎕
Pfu turbo DNA 폴리머라제 (2.5 U㎕) 0.5㎕
총 반응 부피 25㎕
1. 1개의 96-웰 플레이트당 하나의 음성 대조군 반응물을 제조한다(프라이머를 TE 완충액으로 교체한다)
2. 온화하게 혼합하고 테이블 탑 원심분리기(table top centrifuge) 속에서 약간(5분) 회전시킨다.
3. 반응물을 하기 요약한 주기 매개변수를 사용하여 순환시킨다:
분절 주기 온도 시간
1 1 95℃ 30초
2 18 95℃ 30초
55℃ 1분
68℃ 16분
품질 조절 분석
1. 증폭 반응물을 QC하기 위해, 다음 반응물을 96-웰 박 벽 PCR 플레이트 속에서 또는 0.2 ml의 박 벽 PCR 튜브 속에서 셋팅한다:
돌연변이 유발 반응 5㎕
물 4㎕
시료 로딩 완충액 1㎕
부피 1O㎕
2. 10㎕를 0.5㎍/ml 에티디움 브로마이드가 들어있는 1% 아가로즈 TAE 겔 위에 로딩한다. 1kb 및 DNA 래더를 표준물로서 사용한다. 겔을 100V에서 20 내지 30분 동안 1× TAE 완충액 속에서 이동시킨다.
돌연변이 유발 반응물을 벡터 DNA 내로 클로닝하기에 적절한 제한 효소로 분해한다 - Dpnl 제한 효소에 대한 예
1. 0.5㎕의 Dpnl 제한 효소(10 U/㎕)를 직접 각각의 반응물에 가한다.
2. 온화하게 혼합하고 테이블 탑 원심분리기 속에서 약간(5분) 회전시킨다.
3. 37℃에서 PCR 장치 속에서 2시간 동안 배양한다.
4. 96-웰 플레이트 각각으로부터의 6개의 반응 혼합물를 XLI 블루 슈퍼컴피턴트(Blue Supercompetent) 세포 내로 형질전환시킨다. 반응물의 나머지는 -20℃에 저장한다.
5. 0.2 ml의 PCR 튜브를 빙상에 예비-급냉시킨다. SOC 배지를 42℃로 가온시킨다.
6. XLI 블루 슈퍼컴피턴트 세포를 빙상에서 해동시킨다. 해동되면, 온화하게 혼합하고 50㎕의 세포를 예비-급냉시킨 튜브 각각에 분취한다.
7. 0.8㎕의 베타-머캅토에탄올을 각각의 세포 분취량에 가한다. 세포를 빙상에서 10분 동안 매 2분마다 온화하게 저으면서 배양한다.
8. 2㎕의 반응 혼합물을 세포의 1개 분취량에 가한다. 튜브를 온화하게 턴다.
9. 튜브를 냉 블록 속에서 30분 동안 배양한다.
10. 튜브를 42℃ 수욕 속에서 45초 동안 열-펄싱시킨다.
11. 튜브를 빙상에서 2분 동안 배양한다.
12. 100㎕의 예비가열시킨 SOC 배지를 가하고 튜브를 37℃에서 1시간 동안 225 내지 250 rpm으로 진탕시키면서 배양한다.
13. 전체 형질전환 혼합물을 카르베니실린을 함유하는 LB 우무 플레이트 위에 플레이팅한다.
14. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한다.
15. 플레이트 위의 콜로니를 계수하고 미니프렙 및 서열분석을 위해 각각의 형질전환 반응물로부터 12개의 콜로니를 집는다.
대규모 형질전환
1. XLI 블루 슈퍼컴피턴트 세포를 빙상에서 해동시킨다. 컴피턴트 세포의 20개 튜브를 96개 반응을 위해 해동시킨다. 해동되면, 4㎕의 /3-머캅토에탄올을 250㎕의 컴피턴트 세포의 각각의 튜브에 가한다. 세포를 빙상에서 10분 동안 매 2분마다 온화하게 저으면서 배양한다.
2. 0.2 ml의 PCR 튜브를 빙상에서 예비-급냉시킨다. SOC 배지를 42℃로 가온한다.
3. 50㎕의 세포를 예비-급냉시킨 튜브 각각에 분취한다.
4. 2㎕의 반응 혼합물을 세포의 1개 분취량에 가한다. 튜브를 온화하게 턴다.
5. 튜브를 냉 블록 위에서 30분 동안 배양한다.
6. 튜브를 42℃ 수욕 속에서 45초 동안 열-펄싱한다.
7. 튜브를 빙상에서 2분 동안 배양한다.
8. 100㎕의 예비가열된 SOC 배지를 가하고 튜브를 37℃에서 1시간 동안 225 내지 250 rpm에서 진탕시키면서 배양한다.
9. 전체 형질전환 혼합물을 카르베니실린을 함유하는 LB 우무 플레이트 상에 플레이팅한다.
10. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한다.
11. 세포를 96 웰 블록 속에서 미니프렙을 위해 성장시킨다.
12. 미니프렙 DNA를 QIA Vac 96 키트를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 제조한다.
예 3. 항체 친화성 증진 형질감염을 위한 스크리닝
형질감염 1주 전에, 293F 세포를 혈청-보충된 둘베코 이글 배지(D-MEM) 속에서 단층 배양물에 이전시킨다. 형질감염 1일 전에, 형질감염 시료당 100㎕의 혈청 보충된 D-MEM 중의 0.2×105 및 0.4×105 세포를 96웰 양식으로 플레이팅한다.
1. 각각의 형질감염 시료에 대해, DNA-리포펙타민 복합체를 제조한다.
2. 0.2㎍의 DNA를 50㎕ Opti-MEM 환원된 혈청 배지 속에 희석시킨다. 온화하게 혼합한다.
3. 0.125㎕ 리포펙타민을 50㎕의 Opti-MEM 환원된 혈청 배지 속에 희석시킨다. 온화하게 혼합하고 5분 동안 실온에서 배양한다.
4. 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민과 합한다. 온화하게 혼합하고 20분 동안 실온에서 배양한다.
5. 100㎕의 DNA-리포펙타민 복합체를 세포 및 배지를 함유하는 각각의 웰에 가한다. 플레이트를 앞뒤로 흔들어 온화하게 혼합한다.
6. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기 속에서 배양한다.
7. 100㎕의 혈청 보충된 D-MEM을 각각의 웰에 6시간 후에 가한다. 세포를 37℃에서 5% CO2 배양기 속에서 밤새 배양한다.
8. 각각의 웰 속에서 배지를 흡인제거한다. 각각의 웰을 100㎕의 293 SFM II와 4 mM L-글루타민으로 세척한다. 100㎕의 293 SFM II과 4 mM L-글루타민을 각각의 웰에 가한다.
9. 상층액을 ELISA를 위해 형질감염 후 96시간째에 수집한다.
기능적 ELISA
1. Nunc-Immuno Maxisorp 96 웰 플레이트를 피복 용액 중 100㎕의 2㎍/ml 항원으로 피복한다.
2. 플레이트를 밀봉기로 덮고 4℃에서 밤새 배양한다.
3. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려 제거한다.
4. 200㎕의 세척 용액을 가한다. 200 rpm에서 5분 동안 실온으로 진탕한다.
5. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려 제거한다.
6. 200㎕의 차단 용액을 가한다. 200 rpm에서 1 시간 동안 실온에서 진탕한다.
7. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려 제거한다.
8. 차단 용액 중 100㎕/웰의 대조군 항체(2㎍/ml)의 이중체(duplicate)를 플레이트에 가한다.
9. 형질감염(SOP 5A)으로부터의 100㎕의 상층액의 이중체를 플레이트에 가한다.
10. 200 rpm에서 1시간 동안 실온에서 진탕한다.
11. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려서 제거한다.
12. 200㎕의 세척 용액을 가한다. 200 rpm에서 5분 동안 실온에서 진탕한다.
13. 단계 11과 12를 3회 반복한다.
14. 차단 용액 중 HRP와의 친화성 정제된 염소 항-인간 항체 접합체의 1:5000 희석물 100㎕를 각각의 웰에 가한다.
15. 200 rpm에서 1시간 동안 실온에서 진탕한다.
16. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려서 제거한다.
17. 200㎕의 세척 용액을 가한다. 200 rpm에서 5분 동안 실온에서 진탕한다.
18. 단계 17과 18을 3회 반복한다.
19. 100㎕의 Sigma TMB 기질을 각각의 웰에 가한다. 실온에서 배양하고 매 2 내지 5분마다 점검한다.
20. 100㎕의 1N HCl을 가하고 반응을 정지시킨다.
21. 450 nm에서 판독한다.
정량화 ELISA
1. Nunc-hnmuno Maxisorp 96 웰 플레이트를 피복 완충액중 100㎕의 10㎍/ml 친화성-정제된 Fc-특이적인 염소 항-인간 IgG로 피복한다.
2. 플레이트를 밀봉기로 덮고 4℃에서 밤새 배양한다.
3. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려 제거한다.
4. 200㎕의 세척 용액을 가한다. 200 rpm에서 5분 동안 실온으로 진탕한다.
5. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려 제거한다.
6. 200㎕의 차단 용액을 가한다. 200 rpm에서 1 시간 동안 실온에서 진탕한다.
7. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려 제거한다.
8. 차단 용액 중 100㎕/웰의 표준화된 농도의 정제된 인간 혈청 IgG의 이중체를 플레이트에 가한다.
9. 형질감염(SOP 5A)으로부터의 100㎕의 상층액의 이중체를 플레이트에 가한다.
10. 200 rpm에서 1시간 동안 실온에서 진탕한다.
11. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려서 제거한다.
12. 200㎕의 세척 용액을 가한다. 200 rpm에서 5분 동안 실온에서 진탕한다.
13. 단계 11과 12를 3회 반복한다.
14. 차단 용액 중 HRP와의 친화성 정제된 염소 항-인간 항체 접합체의 1:5000 희석물 100㎕를 각각의 웰에 가한다.
15. 200 rpm에서 1시간 동안 실온에서 진탕한다.
16. 플레이트를 경사여과하고 잔류 액체를 두드려서 제거한다.
17. 200㎕의 세척 용액을 가한다. 200 rpm에서 5분 동안 실온에서 진탕한다.
18. 단계 17과 18을 3회 반복한다.
19. 100㎕의 Sigma TMB 기질을 각각의 웰에 가한다. 실온에서 배양하고 매 2 내지 5분마다 점검한다.
20. 100㎕의 1N HCl을 가하고 반응을 정지시킨다.
21. 450 nm에서 판독한다.
예 4. 최적 항체 발현을 위한 Fc 코돈 변이체 라이브러리의 생성 및 스크리닝
본 예는 Fc 코돈 변이체 라이브러리를 생성하는 방법 및 Fc 폴리펩티드의 모 형태와 비교하여 생산 숙주 세포 내에서 향상된 발현을 위해 최적화된 Fc 변이체를 수득하는 스크리닝 방법을 제공한다.
A. Fc 코돈 변이체 라이브러리의 설계 및 작제
표적 부위(이 경우 인간 IgG1 분자의 Fc 부분)내 각각의 코돈의 경우, 변성 프라이머(상방 및 역방)의 쌍을 각각의 측면에서 표적 코돈 및 20개 염기를 포함하도록 설계한다. 표적 코돈의 3번째 위치[우블(wobble) 위치]는 동일한 코돈(예 A)을 사용하는 표적 위치에서 모든 잠재 돌연변이의 생성을 허용하는 혼합된 염기(표 2)를 함유한다. 상응하는 아미노산이 다른 코돈에 의해 암호화될 수 있는 경우(예 B), 변성 프라이머의 제2 세트를 동일한 코돈 위치에 대해 설계한다. 상응하는 상방 및 역방 변성 프라이머를 1:1로 혼합하고, 템플릿으로 어닐링하고 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용한 표준 교체에 의해 완전한 길이의 생성물로 연장시킨다. 템플릿을 Dpnl으로 분해하고 완전한 길이의 연장 생성물을 대장균내로 형질전환시킨다. 돌연변이 유발 반응물당 12개까지의 콜로니를 서열분석한다. 서열 확인된 돌연변이체를 96 웰 플레이트내에 배열하고 글리세롤 스톡처리한다. 글리세롤 스톡은 미니프렙 플라스미드 DNA에 대해 포유동물 세포 내로의 형질감염 및 서열 분석을 위해 사용한다.
합성 올리고 내에서 변성 염기에 대한 코돈
기호 혼합된 염기
R A, G
Y C, T
M A, C
K G, T
S C, G
W A, T
H A, C, T
B C, G, T
V A, C, G
D A, G, T
N A, C, G, T
예 A : 표적 코돈 = CCC (프롤린)
-> 상방 프라이머: CCD, 역방 프라이머: HGG
예 B : 표적 코돈 = TCG (세린)
-> 상방 프라이머 1 : TCH, 역방 프라이머 1 : DGA
-> 상방 프라이머 2: AGY, 역방 프라이머 2: RCT
표적 코돈을 플랭킹한 20개 염기는 나타내지 않는다. 전체 프라이머 길이: 43개 염기.
B. Fc 코돈 변이체 라이브러리의 발현 및 ELISA 계 스크리닝
Fc 코돈 변이체 라이브러리로부터의 클론을 포유동물 세포주내로 형질감염시켰다. 완전한 길이의 IgG를 생산하고 배지내로 분비한다. 발현된 Fc 코돈 변이체의 상층액을 모 클론보다 더 높은 IgG 발현 수준에 대해 ELISA 검정을 사용하여 스크리닝한다. ELISA 데이터를 형질감염 효능을 측정하는 베타-갈락토시다제 검정으로 표준화하였다. 1차 스크리닝에서 확인된 상부 히트를 재-형질감염시키고 3회 재-스크리닝하여 증가된 발현 수준을 확인하였다.

Claims (48)

  1. CHO 세포주(cell line)에서 단백질을 진화 및 발현시키는 방법에 있어서,
    a. 템플릿 항체를 선택하는 단계;
    b. 상기 템플릿 항체를 진화시켜 상기 CHO 세포주에서 복수의 돌연변이 항체들을 생산하는 단계;
    c. 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 상기 돌연변이 항체들을 스크리닝(screening)하는 단계;
    d. 상기 템플릿 항체와 비교하여 상기 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화를 기준으로, 상기 복수의 돌연변이 항체들로부터 상기 템플릿 항체에 관하여 개선된 기능 또는 발현을 갖는 상향-돌연변이 항체(up-mutant antibody)를 선택하는 단계;
    e. 상기 상향-돌연변이 항체의 생산을 재판매하기 위해 적합한 시판 규모를 위해 단계(b)에서와 동일한 CHO 세포주에서 상기 상향-돌연변이 항체를 발현시키는 단계를
    포함하는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계(a)는,
    a1. 항체 세포 표면 디스플레이를 사용하여 상기 CHO 세포주에서 항-항원 항체 라이브러리(anti-antigen antibody library)를 생성하는 단계; 및
    a2. 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 상기 라이브러리를 스크리닝하는 단계를
    포함하는 단계들에 의해 선행되고,
    상기 템플릿 항체는 상기 라이브러리로부터 선택되고, 상기 진화 단계는 항체 세포 표면 디스플레이를 사용하여 상기 CHO 세포주에서 상기 복수의 돌연변이 항체들을 생산하는 것을 포함하는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 포함하는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 진화 단계는 m개의 상보성 결정 영역들(CDRs)을 갖는 상기 템플릿 항체로부터 형성된 복수의 돌연변이 항체들을 생산하는 단계를 포함하고, 여기서, m은 1 내지 6의 정수이고, 상기 m개의 CDR들은 전체적으로 n개의 아미노산 잔기들을 포함하며, 상기 방법은:
    a. n개의 개별 세트들의 항체들을 생성하는 단계로서, 각각의 세트는 상기 CDR들의 미리 결정된 단일 위치에서 X 번의 서로 다른 미리 결정된 아미노산 잔기들을 갖는 구성원 항체들을 포함하고; 여기서, 각 세트의 항체들은 미리 결정된 단일 위치에서 다르고; 생성된 서로 다른 구성원 항체들의 수는 n×X와 동등한, 상기 생성 단계를
    포함하는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, m은 6인, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 템플릿 항체는 중쇄, 경쇄, 가변 도메인, 고정 도메인, 초가변 영역, 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)으로부터 선택된 항체 단편인, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 템플릿 항체는 n개의 아미노산 잔기들을 갖고 상기 진화 단계(b)는,
    h. 상기 템플릿 항체로부터 n-1개의 개별 세트들의 돌연변이 폴리펩티드들을 생성하는 단계로서, 각각의 세트는 상기 폴리펩티드의 미리 결정된 단일 위치에서 X 번의 서로 다른 미리 결정된 아미노산 잔기들을 갖는 구성원 폴리펩티드들을 포함하고; 여기서, 각 세트의 폴리펩티드들은 미리 결정된 단일 위치에서 다르고; 생성된 서로 다른 구성원 폴리펩티드들의 수는 [n-1] x X와 동일한, 단계를
    포함하고,
    상기 스크리닝 단계(c)는,
    i. 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 각각의 구성원 폴리펩티드를 분석하는 단계;
    j. 상기 템플릿 항체에 대해 상기 구성원 폴리펩티드의 상기 특성, 특징 또는 활성의 임의의 변화를 확인하는 단계;
    k. 상기 템플릿 항체와 비교하여 상향-돌연변이 또는 잠재 돌연변이(silent mutation)를 초래하는 돌연변이 폴리펩티드에서의 위치들 및 돌연변이들을 확인하기 위해 사용되는 기능성 맵을 생성하는 단계를
    포함하는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, X는 19인, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생성 단계는:
    i. 상기 템플릿 항체를 암호화하는 코돈-함유 폴리뉴클레오티드를, 돌연변이가 일어날 각각의 코돈에 대해 64-배 변성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제-계 증폭에 적용시키고, 상기 64-배 변성 올리고뉴클레오티드 각각은 제1 동종 서열과 변성 N,N,N 삼중 서열로 이루어져, 한 세트의 후대 폴리뉴클레오티드들을 생성하는 단계; 및
    ii. 상기 세트의 후대 폴리뉴클레오티드들을 클론 증폭에 적용시켜, 상기 후대 폴리뉴클레오티드들에 의해 암호화된 폴리펩티드들이 발현되도록 하는 단계를
    포함하는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 기능성 맵은, (a) 상기 템플릿 항체와 비교하여 상기 돌연변이 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치지 않는 위치들 및 돌연변이들; (b) 상기 템플릿 항체와 비교하여 완전하게 돌연변이 가능한 부위들; 및 (c) 상기 템플릿 항체와 비교하여 상향-돌연변이체를 초래하는 위치들 및 돌연변이들 중 하나 이상을 확인하기 위해 사용되는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성은, 단백질-단백질 응집의 감소, 단백질 안정성의 향상, 증가된 단백질 용해성, 글리코실화 부위들의 도입, 접합 부위들의 도입, 면역원성의 감소, 단백질 발현의 향상, 항원 친화성의 증가, 항원 친화성의 감소, 결합 친화성의 변화, 면역원성의 변화, 및 특이성의 향상으로부터 선택되는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  14. 제2항에 있어서, 단계(a1)는,
    항원을 선택하는 단계를
    포함하는 단계에 의해 선행되는, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  15. 제2항에 있어서, 상기 항-항원 항체 라이브러리는 인간화 항-항원 항체 라이브러리인, 단백질을 진화 및 발현시키는 방법.
  16. 삭제
  17. CHO 세포주에서 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법에 있어서,
    a. 상기 CHO 세포주에서 인간 단백질 라이브러리를 생성하는 단계;
    b. 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 라이브러리를 스크리닝하는 단계;
    c. 상기 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성을 기준으로 상기 라이브러리로부터 템플릿 인간 단백질을 선택하는 단계;
    d. 상기 템플릿 인간 단백질을 진화시켜 상기 CHO 세포주에서 복수의 돌연변이 인간 단백질들을 생산하는 단계;
    e. 상기 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 상기 복수의 돌연변이 인간 단백질들을 스크리닝하고, 변형된 발현에 대해 스크리닝하는 단계;
    f. (1) 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성의 최적화와, (2) 상기 템플릿 인간 단백질과 비교하여 변형된 발현을 기준으로 돌연변이 인간 단백질들의 세트로부터 상기 템플릿 인간 단백질에 관하여 개선된 기능 또는 발현을 갖는 상향-돌연변이 인간 단백질을 선택하는 단계; 및
    g. 상기 생성 단계(a)에서와 동일한 CHO 세포주에서 상기 상향-돌연변이 인간 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 상기 선택된 상향-돌연변이 인간 단백질을 제조하는 단계를
    포함하는, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변형된 발현은 향상된 발현인, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 진화 단계는, 포괄적인 위치 진화(CPE); 포괄적인 위치 삽입 진화(CPI); 포괄적인 위치 결실 진화(CPD); 포괄적인 위치 진화(CPE)에 이은 조합적인 단백질 합성(CPS); 포괄적인 위치 결실 진화(CPD)에 이은 조합적인 단백질 합성(CPS); 또는 포괄적인 위치 결실 진화(CPD)에 이은 조합적인 단백질 합성(CPS) 중 하나를 포함하는, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 템플릿 인간 단백질은 템플릿 인간 항체인, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 템플릿 인간 항체는 완전한 길이의 항체인, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 스크리닝 단계(e)에서 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성은, 상기 템플릿 인간 항체와 비교하여, (1) 잠재 돌연변이에 대한 스크리닝과, (2) 미스센스(missense) 돌연변이에 대한 스크리닝 중 하나 이상을 포함하는, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 완전한 길이의 항체는 템플릿 인간 항체와 비교하여 상향-돌연변이 인간 항체를 발생시키기 위해 Fc 및 Fv; 골격(framework); 및 하나 이상의 CDR들로부터 선택된 하나 이상의 영역들에서 변형되는, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 상기 스크리닝 단계(e)는, 상기 적어도 하나의 미리 결정된 특성, 특징 또는 활성에 대해 돌연변이 인간 단백질들의 세트를 스크리닝하는 단계와, 변형된 발현에 대해 동시에 스크리닝하는 단계를 포함하는, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  25. 제17항에 있어서, 상기 템플릿 인간 단백질은, 효소 사이토킨, 수용체, DNA 결합 단백질, 킬레이팅제 또는 호르몬으로부터 선택되는, 인간 단백질을 진화 및 제조하는 방법.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
KR1020127003948A 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법 KR101823872B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27116809P 2009-07-17 2009-07-17
US61/271,168 2009-07-17
PCT/US2010/042302 WO2011009058A2 (en) 2009-07-17 2010-07-16 Simultaneous, integrated selection and evolution of antibody/protein performance and expression in production hosts

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187002028A Division KR20180010347A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120069664A KR20120069664A (ko) 2012-06-28
KR101823872B1 true KR101823872B1 (ko) 2018-01-31

Family

ID=43450243

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197004078A KR20190017070A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
KR1020217042385A KR20220002712A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
KR1020217002264A KR20210013294A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
KR1020187002028A KR20180010347A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
KR1020127003948A KR101823872B1 (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197004078A KR20190017070A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
KR1020217042385A KR20220002712A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
KR1020217002264A KR20210013294A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
KR1020187002028A KR20180010347A (ko) 2009-07-17 2010-07-16 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법

Country Status (19)

Country Link
US (5) US8859467B2 (ko)
EP (6) EP3636759B1 (ko)
JP (3) JP6193570B2 (ko)
KR (5) KR20190017070A (ko)
CN (2) CN102625848A (ko)
AU (5) AU2010273974B2 (ko)
BR (2) BR112012001171B1 (ko)
CA (2) CA3034484A1 (ko)
DK (5) DK3636759T3 (ko)
ES (3) ES2701931T3 (ko)
HK (1) HK1210623A1 (ko)
HU (1) HUE029328T2 (ko)
IN (1) IN2012DN00737A (ko)
MX (2) MX347654B (ko)
MY (2) MY160472A (ko)
PL (2) PL3042957T3 (ko)
PT (1) PT3042957T (ko)
SG (3) SG177687A1 (ko)
WO (1) WO2011009058A2 (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3636759B1 (en) 2009-07-17 2023-10-11 BioAtla, Inc. Simultaneous, integrated selection and evolution of antibody/protein performance and expression in production hosts
WO2011109726A2 (en) * 2010-03-05 2011-09-09 Bioatla Llc Homologous multi-specific antibodies
EP2593797B1 (en) 2010-07-16 2019-05-08 Bioatla, LLC Novel methods of protein evolution
AU2015242961B2 (en) * 2010-07-16 2017-03-02 Bioatla, Llc Novel methods of protein evolution
JP6121904B2 (ja) 2010-09-08 2017-04-26 ハロザイム インコーポレイテッド 条件的活性治療用タンパク質を評価および同定する、または発展させる方法
US20140302999A1 (en) * 2011-11-03 2014-10-09 Magdalena Leszczyniecka Method for determination of pharmacological properties of recombinant proteins
US10156574B2 (en) 2013-04-29 2018-12-18 Adimab, Llc Polyspecificity reagents, methods for their preparation and use
WO2015105888A1 (en) * 2014-01-07 2015-07-16 Bioatla, Llc Proteins targeting orthologs
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
CA2947605A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Bioatla, Llc Conditionally active biological proteins
CA2954066A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-07 Stc Biologics, Inc. A method for development of recombinant proteins with fingerprint like similarity to the reference product
RU2764074C2 (ru) * 2014-08-28 2022-01-13 Байоатла, Ллк Условно активные химерные антигенные рецепторы для модифицированных т-клеток
US10513699B2 (en) 2014-09-03 2019-12-24 Bioatla, Llc Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts
CA2977687C (en) 2015-02-24 2024-02-13 Hwai Wen Chang Conditionally active proteins
TWI748962B (zh) * 2015-09-23 2021-12-11 美商建南德克公司 抗ｖｅｇｆ抗體之最佳化變異體
US11472876B2 (en) 2015-11-02 2022-10-18 Bioatla, Inc. Conditionally active polypeptides
SI3455261T1 (sl) 2016-05-13 2023-01-31 Bioatla, Inc. Protitelesa proti ROR2, fragmenti protitelesa, njihovi imunokonjugati in uporabe le-teh
PE20200757A1 (es) 2017-07-11 2020-07-27 Compass Therapeutics Llc Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
US11046769B2 (en) 2018-11-13 2021-06-29 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
WO2020227515A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
CN111048154B (zh) * 2019-12-10 2023-06-06 上海药明生物技术有限公司 一种抗体表位作图的方法
CN111462815B (zh) * 2020-03-27 2023-05-02 上海祥耀生物科技有限责任公司 一种抗体库的构建方法及装置
US11506060B1 (en) * 2021-07-15 2022-11-22 Honeywell International Inc. Radial turbine rotor for gas turbine engine
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4361549A (en) 1979-04-26 1982-11-30 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells, and methods of preparing same
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US4883750A (en) 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
AU622104B2 (en) 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
AU622426B2 (en) 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
EP0359789B1 (en) 1988-01-21 1993-08-04 Genentech, Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
WO1989009284A1 (en) 1988-03-24 1989-10-05 University Of Iowa Research Foundation Catalytic hybridization systems for the detection of nucleic acid sequences based on their activity as cofactors in catalytic reactions in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
PT672145E (pt) 1992-11-24 2003-08-29 Searle & Co Polipeptideos de interleucina-3(il-3) com multiplas mutacoes
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US20030219752A1 (en) * 1995-12-07 2003-11-27 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
US8137906B2 (en) 1999-06-07 2012-03-20 Sloning Biotechnology Gmbh Method for the synthesis of DNA fragments
US7033781B1 (en) 1999-09-29 2006-04-25 Diversa Corporation Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
BR0207267A (pt) 2001-02-19 2004-02-10 Merck Patent Gmbh Proteìnas artificiais com imunogenicidade reduzida
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
WO2002092780A2 (en) * 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
US7647184B2 (en) * 2001-08-27 2010-01-12 Hanall Pharmaceuticals, Co. Ltd High throughput directed evolution by rational mutagenesis
WO2005003345A2 (en) * 2003-06-27 2005-01-13 R. Crea & Co. Look-through mutagenesis
GB0520169D0 (en) * 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1943332A4 (en) * 2005-10-14 2011-04-13 Medimmune Inc CELLULAR DISPLAY OF ANTIBODY LIBRARIES
WO2008118476A2 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 Codon Devices, Inc. Cell surface display, screening and production of proteins of interest
US7947495B2 (en) 2007-11-01 2011-05-24 Abbott Biotherapeutics Corp. Immunoglobulin display vectors
CA2704494A1 (en) 2007-11-02 2009-05-14 The Scripps Research Institute Directed evolution using proteins comprising unnatural amino acids
US8312249B1 (en) 2008-10-10 2012-11-13 Apple Inc. Dynamic trampoline and structured code generation in a signed code environment
EP3636759B1 (en) 2009-07-17 2023-10-11 BioAtla, Inc. Simultaneous, integrated selection and evolution of antibody/protein performance and expression in production hosts
FR2957821B1 (fr) 2010-03-24 2014-08-29 Inst Francais Du Petrole Nouvelle zone de regeneration du catalyseur divisee en secteurs pour unites catalytiques regeneratives

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ho 등. PNAS. Vol 103, No. 25, 페이지 9637-9642 (2006.06.08.)*

Also Published As

Publication number Publication date
EP2907873A1 (en) 2015-08-19
US20180371452A1 (en) 2018-12-27
HK1210623A1 (zh) 2016-04-29
JP2015211672A (ja) 2015-11-26
EP2454376B1 (en) 2015-12-02
EP3042957A1 (en) 2016-07-13
AU2010273974A1 (en) 2012-02-09
AU2017203243A1 (en) 2017-06-08
IN2012DN00737A (ko) 2015-06-19
CA3034484A1 (en) 2011-01-20
SG10201700096VA (en) 2017-02-27
AU2019203813B2 (en) 2021-03-11
US10920216B2 (en) 2021-02-16
US10106788B2 (en) 2018-10-23
US11976381B2 (en) 2024-05-07
EP3042957B1 (en) 2017-09-13
EP2454376A4 (en) 2013-07-10
EP3636759B1 (en) 2023-10-11
KR20190017070A (ko) 2019-02-19
EP2907873B1 (en) 2016-04-06
EP3406717A1 (en) 2018-11-28
PT3042957T (pt) 2017-12-21
AU2015243076B2 (en) 2017-02-23
WO2011009058A2 (en) 2011-01-20
DK3156485T3 (en) 2019-01-07
AU2010273974A8 (en) 2012-02-23
JP2017205110A (ja) 2017-11-24
AU2017203243B2 (en) 2019-07-11
ES2652340T3 (es) 2018-02-01
EP3156485B1 (en) 2018-09-12
US20210207129A1 (en) 2021-07-08
BR112012001171B1 (pt) 2021-09-21
JP6193570B2 (ja) 2017-09-13
US20150024944A1 (en) 2015-01-22
AU2010273974B2 (en) 2016-01-14
SG177687A1 (en) 2012-02-28
US20120165201A1 (en) 2012-06-28
MY160472A (en) 2017-03-15
WO2011009058A3 (en) 2011-04-14
MX2012000803A (es) 2012-06-01
US10047357B2 (en) 2018-08-14
SG10201505075TA (en) 2015-07-30
CA2768247A1 (en) 2011-01-20
KR20120069664A (ko) 2012-06-28
US8859467B2 (en) 2014-10-14
AU2021203220B2 (en) 2023-05-04
DK3406717T3 (da) 2020-03-16
CN107090031A (zh) 2017-08-25
EP3636759A1 (en) 2020-04-15
AU2015243076A1 (en) 2015-11-05
JP2012533307A (ja) 2012-12-27
BR112012001171A2 (pt) 2017-06-13
BR122015012748A2 (pt) 2020-01-07
CA2768247C (en) 2019-04-09
JP6681131B2 (ja) 2020-04-15
AU2021203220A1 (en) 2021-06-10
KR20220002712A (ko) 2022-01-06
MX347654B (es) 2017-05-05
EP2454376A2 (en) 2012-05-23
HUE029328T2 (en) 2017-02-28
CN102625848A (zh) 2012-08-01
KR20210013294A (ko) 2021-02-03
PL3042957T3 (pl) 2018-03-30
MY173037A (en) 2019-12-20
ES2701931T3 (es) 2019-02-26
ES2581318T3 (es) 2016-09-05
EP3406717B1 (en) 2019-12-11
DK2907873T3 (en) 2016-06-13
AU2019203813A1 (en) 2019-06-20
KR20180010347A (ko) 2018-01-30
PL2907873T3 (pl) 2016-10-31
US20120245036A1 (en) 2012-09-27
JP6193913B2 (ja) 2017-09-06
DK3042957T3 (en) 2018-01-02
DK3636759T3 (da) 2023-10-23
EP3156485A1 (en) 2017-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101823872B1 (ko) 생산 숙주에서 항체/단백질 성능과 발현을 동시에 통합 선택하고 진화시키는 방법
US11639365B2 (en) Methods of protein evolution
AU2018226408B2 (en) Novel methods of protein evolution

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant