BR122015012748A2

BR122015012748A2 - Métodos de evolução, identificação e produção de uma proteína

Info

Publication number: BR122015012748A2
Application number: BR122015012748-3A
Authority: BR
Inventors: Jay Milton Short
Original assignee: Bioatla, Llc
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2020-01-07
Also published as: EP2907873A1; US20180371452A1; HK1210623A1; JP2015211672A; EP2454376B1; EP3042957A1; AU2010273974A1; AU2017203243A1; IN2012DN00737A; CA3034484A1; SG10201700096VA; AU2019203813B2; US10920216B2; US10106788B2; US11976381B2; EP3042957B1; EP2454376A4; EP3636759B1; KR20190017070A; EP2907873B1

Abstract

métodos de evolução, identificação e produção de uma proteína a presente descrição fornece métodos de integrar proteína terapêutica e geração de anticorpo e/ou seleção, evolução e expressão em um hospedeiro eucariótico para a fabricação em um sistema simples. as proteínas terapêuticas, incluindo anticorpos, são geradas, otimizadas e fabricadas no mesmo sistema de hospedeiro eucariótico. o sistema descrito da comprehensive integrated antibody optimization (ciao!tm) permite a evolução simultânea do desempenho da proteína e otimização da expressã

Description

“MÉTODOS DE EVOLUÇÃO, IDENTIFICAÇÃO E PRODUÇÃO DE

UMA PROTEÍNA”

Dividido do BR 11 2012 001171 5, depositado em 16/07/2010 [001] Este pedido está sendo depositado em 16 de julho de 2010, como um Pedido de Patente Internacional PCT no nome de BioAtla, LLC, uma corporação nacional U.S., requerente para a designação de todos os países exceto os E.U.A. e Jay Milton Short, um cidadão dos E.U.A., requerente para a denominação dos E.U.A. apenas e prioridade das reivindicações com relação ao Pedido Condicional U.S. N°: 61/271.168, depositado em 17 de julho de 2009, cujos conteúdos totais são incorporados aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] Em um aspecto particular, a presente invenção é relevante quanto a proteínas e quanto à sua otimização pela evolução da proteína. Os produtos terapêuticos de proteína são descobertos, evoluídos e fabricados no mesmo hospedeiro usando-se os mesmos sistemas genéticos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] Uma variedade de anticorpo e de outros sistemas de proteína que geram moléculas de proteína terapêuticas de proteína candidatas foram projetadas, desenvolvidas e implementadas. Mais recentemente, muitos sistemas de evolução foram desenvolvidos para intensificar a função das proteínas. Separadamente, os sistemas de expressão de mamífero foram desenvolvidos para a produção de rendimento alto de anticorpos e outras proteínas para aplicações terapêuticas. Até hoje, nenhum grupo desenvolveu um sistema para permitir a geração, evolução de um anticorpo ou proteína e produção/fabricação de proteína em um sistema de expressão de mamífero eficiente.

[004] Muitos anticorpos são desenvolvidos usando-se sistemas de exibição de fago bacteriano em bactérias, enquanto a expressão de anticorpos de comprimento total é realizada primariamente em células de mamífero. Esta / 140 perda de similaridade realiza a evolução ou a seleção de clones para a expressão impossível. As barreiras adicionais incluem o requerimento tradicional para números grandes de variantes a serem triadas usando-se tecnologias tradicionais e os sistemas de expressão de mamífero de alto nível foram otimizados para a expressão, não clonagem de números grandes de variantes. Uma seleção de anticorpo/proteína integrada, evolução e sistema de expressão de mamífero não foram previamente projetados. O uso de exibição de superfície em células de mamífero para o manuseio de grandes números, combinados com evolução não estocástica do anticorpo/proteína dentro de uma célula hospedeira de mamífero otimizada, aumenta a probabilidade de sucesso e acelera grandemente o processo for gerar um anticorpo/proteína otimizados que expressará, em níveis bastante altos, em células e mamífero desejados na fabricação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005] A presente descrição fornece métodos de integrar a geração e/ou seleção de proteína terapêutica (incluindo anticorpos), evolução e expressão em um hospedeiro eucariótico, tal como um hospedeiro de célula de mamífero ou um hospedeiro de célula de levedura, para a fabricação em um sistema simples. As proteínas terapêuticas, incluindo anticorpos, são gerados, otimizados e fabricados no mesmo sistema de hospedeiro eucariótico. O sistema descrito da Compreensivo Integrated Antibody Optimization (CIAO!^TM) permite a evolução simultânea de desempenho de proteína e otimização de expressão.

[006] Em uma forma de realização, a descrição fornece um método de seleção, evolução e expressão de um anticorpo em um hospedeiro de produção de célula de mamífero; o método compreendendo gerar uma biblioteca de anticorpo anti-antígeno em um hospedeiro de produção de célula de mamífero com exibição de superfície celular de anticorpo; triar a biblioteca por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada;

/ 140 selecionar um anticorpo padrão da biblioteca; desenvolver o anticorpo padrão para a produção de um conjunto de anticorpos mutantes in o hospedeiro de produção de célula de mamífero com exibição de superfície celular de anticorpo; triar os anticorpos mutantes para a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; selecionar um anticorpo de mutante ativado do conjunto de anticorpos mutantes com base na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada quando comparado com o anticorpo padrão e expressar o anticorpo de mutante ativado no mesmo hospedeiro de produção de célula de mamífero como usado na etapa de geração. Em um aspecto, o antígeno é pré-selecionado. Em um outro aspecto, a biblioteca de anticorpo anti-antígeno é uma biblioteca de anticorpo anti-antígeno humanizada.

[007] Em um aspecto, o hospedeiro de produção de célula de mamífero é selecionado de células de fibroblasto de camundongo 3T3; células de fibroblasto de hamster sírio BHK21; MDCK, células epiteliais caninas; Células epiteliais humanas Hela; Células epiteliais de rato canguru PtK1; células de plasma de camundongo SP2/0 e células de plasma de camundongo NSO; células renais embriônicas humanas HEK 293; células renais de macaco COS; CHO, células de ovário de hamster chinês CHO-S; células embriônicas de camundongo R1; células embriônicas de camundongo E14.1; células embriônicas humanas H1; células embriônicas humanas H9; PER C.6, células embriônicas humanas; células de levedura S. Cerevisiae ou células de levedura picchia. Em um aspecto particular, o sistema mamífero é CHO-S ou HEK293. Em um aspecto, as etapas de triagem utilizam classificação celular ativada por fluorescência (FACS).

[008] Em um outro aspecto, a etapa de evolução compreende produzir um conjunto de anticorpos mutantes formados a partir do anticorpo padrão tendo regiões determinadoras de complementaridade m (CDR), em que m é um número inteiro selecionado de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, cada dito CDR / 140 compreendendo n resíduos de aminoácido, o método compreendendo gerar m x n conjuntos de anticorpos separados, cada conjunto compreendendo anticorpos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada simples do CDR; em que cada conjunto de anticorpos difere na posição predeterminada simples e o número de anticorpos membros diferentes gerado é equivalente a m x n x X. Em um aspecto particular, m é 6.

[009] Em um aspecto, a etapa de evolução compreende gerar n-1 conjuntos separados de polipeptídeos mutantes do anticorpo padrão, cada conjunto compreendendo polipeptídeos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada simples do polipeptídeo; em que cada conjunto de polipeptídeos difere na posição predeterminada simples e o número de polipeptídeos membros diferentes gerado é equivalente a [n-1] x X. Em um aspecto, X representa o 19 resíduos de aminoácido de ocorrência natural não presentes em uma dada posição do polipeptídeo padrão.

[0010] Em um outro aspecto, a etapa de triagem compreende ensaiar cada polipeptídeo membro a ensaio quanto a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; identificar qualquer mudança na dita propriedade característica ou atividade do polipeptídeo membro com relação ao polipeptídeo padrão; criar um mapa funcional em que o mapa funcional é usado para identificar posições e mutações no polipeptídeo mutante que resultam em um mutante ativado e/ou uma mutação silenciosa em comparação com o polipeptídeo padrão.

[0011] Em um outro aspecto, o mapa funcional é usado para identificar um ou mais dos grupos que consiste de (a) posições e mutações que não afetam a atividade do polipeptídeo mutante em comparação com o polipeptídeo padrão; (b) locais totalmente mutáveis em comparação com o polipeptídeo padrão e (c) posições e mutações que resultam em um mutante / 140 ativado em comparação com o polipeptídeo padrão.

[0012] Em um outro aspecto, o fragmento de anticorpo é selecionado de uma cadeia pesada, cadeia leve, domínio variável, domínio constante, região hipervariável, região determinadora de complementaridade 1 (CDR1), região determinadora de complementaridade 2 (CDR2) e região determinadora de complementaridade 3 (CDR3).

[0013] Em um outro aspecto, a etapa de geração compreende submeter um polinucleotídeo contendo códon que codifica quanto ao dito polipeptídeo padrão com relação à amplificação com base em polimerase usando-se um oligonucleotídeo degenerado de 64 vezes para o códon a ser mutageneizado, em que cada um dos ditos oligonucleotídeos degenerado de 64 vezes é compreendido de uma primeira sequência homóloga e uma sequência de tripleto N,N,N degenerada, a fim de gerar um conjunto de polinucleotídeos de progênie e submeter dito conjunto de polinucleotídeos de progênie à amplificação clonal de modo que os polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos de progênie são expressados.

[0014] Método de acordo com a reivindicação 1 em que a propriedade, característica ou atividade predeterminada é selecionada de redução de agregação de proteína-proteína, intensificação da estabilidade de proteína, solubilidade de proteína aumentada, introdução de locais de glicosilação, introdução de locais de conjugação, redução de imunogenicidade, intensificação de expressão de proteína, aumento na afinidade de antígeno, diminuição na afinidade de antígeno, mudança na afinidade de ligação, mudança na imunogenicidade ou intensificação de especificidade.

[0015] Em uma outra forma de realização, a descrição fornece um método de evolução e expressão de um anticorpo em um hospedeiro de produção de célula de mamífero; o método compreendendo selecionar um anticorpo padrão; desenvolver o anticorpo padrão para a produção de um conjunto de anticorpos mutantes em um hospedeiro de produção de célula de / 140 mamífero com exibição de superfície celular de anticorpo; triar os anticorpos mutantes para a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; selecionar um anticorpo de mutante ativado do conjunto de anticorpos mutantes com base na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada em comparação com o anticorpo padrão e expressar o anticorpo de mutante ativado no mesmo hospedeiro de produção de célula de mamífero usado na etapa de evolução.

[0016] Em um aspecto, a etapa de triagem compreende criar um mapa funcional em que o mapa funcional é usado para identificar posições e mutações no polipeptídeo mutante que resultam em um mutante ativado e/ou uma mutação silenciosa em comparação com o polipeptídeo padrão. Em um outro aspecto, as etapas de triagem compreendem classificação celular ativada por fluorescência (FACS).

[0017] Em um aspecto, o hospedeiro de produção de célula de mamífero é selecionado de células de fibroblasto de camundongo 3T3; células de fibroblasto de hamster sírio BHK21; MDCK, células epiteliais caninas; Células epiteliais humanas Hela; Células epiteliais de rato canguru PtK1; células de plasma de camundongo SP2/0 e células de plasma de camundongo NSO; células renais embriônicas humanas HEK 293; células renais de macaco COS; CHO, células de ovário de hamster chinês CHO-S; células embriônicas de camundongo R1; células embriônicas de camundongo E14.1; células embriônicas humanas H1; células embriônicas humanas H9 e PER C.6, células embriônicas humanas. Em um aspecto particular, o sistema mamífero é CHO-S ou HEK293. Em um outro aspecto, o hospedeiro de produção celular é selecionado de linhagens de célula hospedeira CHOK1 SV ou NSO.

[0018] Em uma outra forma de realização, a descrição fornece um método de evolução e expressão de uma proteína em um hospedeiro de produção de célula eucariótica; o método compreendendo selecionar um anticorpo padrão; desenvolver o anticorpo padrão para a produção de um / 140 conjunto de anticorpos mutantes em um hospedeiro de produção de célula eucariótica; triar os anticorpos mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; selecionar um anticorpo de mutante ativado do conjunto de anticorpos mutantes com base na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada em comparação com o anticorpo padrão e expressar o anticorpo de mutante ativado no mesmo hospedeiro de produção de célula eucariótica as na etapa de evolução para qualquer escala comercial.

[0019] Em uma forma de realização, a descrição fornece um método de evolução e de fabricação de uma proteína humana em um hospedeiro de produção celular; o método compreendendo gerar uma biblioteca de proteína humana em um hospedeiro de produção celular selecionada de um dos grupos que consiste de um hospedeiro de produção bacteriana ou eucariótica; triar a biblioteca por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; selecionar uma proteína humana padrão da biblioteca com base na pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; evoluir a proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes no hospedeiro de produção celular; triar o conjunto de proteínas humanas mutantes para a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triar quanto à expressão modificada; selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base (1) na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (2) expressão modificada quando comparado com a proteína humana padrão e fabricar a proteína humana compreendendo expressar a proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de produção como na etapa de geração. Em um aspecto, a expressão modificada na etapa de seleção é expressão melhorada.

[0020] Em um outro aspecto, a etapa de evolução compreende uma / 140 técnica de evolução selecionada de um de evolução posicionai compreensiva (CPE); evolução de inserção posicionai compreensiva (CPI); evolução de deleção posicionai compreensiva (CPD); evolução posicional compreensiva (CPE) seguido por síntese de proteína combinatória (CPS); evolução de deleção posicional compreensiva (CPD) seguido por síntese de proteína combinatória (CPS) ou evolução de deleção posicional compreensiva (CPD) seguido por síntese de proteína combinatória (CPS).

[0021] Em um aspecto, a proteína humana é um anticorpo. Em um outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.

[0022] Em um outro aspecto, a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada na etapa de triagem (e) compreende um ou mais de (1) triagem para uma mutação silenciosa e (2) triagem quanto a uma mutação sem sentido; em comparação com o anticorpo padrão.

[0023] Em um outro aspecto, uma ou mais porções do anticorpo selecionadas de Fc e Fv; estrutura e um ou mais CDRs são modificados no anticorpo humano mutante ativado em comparação com o anticorpo humano padrão são desenvolvidos.

[0024] Em um outro aspecto, a etapa de triagem compreende triar o conjunto de proteínas humanas mutantes para a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triar quanto à expressão modificada simultaneamente.

[0025] Em um outro aspecto, a proteína humana para a evolução e a fabricação é selecionada de uma citocina de enzima, receptor, proteína de ligação de DNA, agente quelante ou hormônio.

[0026] Em um outro aspecto, o hospedeiro de produção celular é um hospedeiro de produção eucariótica e a etapa de evolução compreende evoluir a proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes no hospedeiro de produção de célula eucariótica com / 140 exibição de superfície celular.

[0027] Em uma outra forma de realização, a descrição fornece um método de evolução para a expressão intensificada e fabricação de uma proteína humana em um hospedeiro de produção de célula eucariótica; o método compreendendo selecionar uma proteína humana padrão para a evolução; evoluir a proteína humana padrão compreendendo geração de códons mutantes que codificam a proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes no hospedeiro de produção; triar o conjunto de proteínas humanas mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triagem quanto à expressão intensificada quando comparado com a proteína humana padrão; selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base na (1) retenção ou otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (2) expressão intensificada quando comparado com a proteína humana padrão e fabricação da proteína humana mutante ativada compreendendo expressar a proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de produção as na etapa de evolução.

[0028] Em um aspecto, os códons mutantes da proteína humana mutante ativada resulta em pelo menos uma mutação silenciosa e/ou mutação sem sentido. Em um outro aspecto, os códons mutantes da proteína humana mutante ativada resulta em pelo menos uma mutação silenciosa.

[0029] Em um outro aspecto, a proteína humana padrão é um medicamento terapêutico de proteína ética aprovado e a proteína humana mutante ativada é um biossimilar.

[0030] Em um outro aspecto, a etapa de seleção compreende selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base (1) na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (2) expressão / 140 intensificada quando comparado com a proteína humana padrão.

[0031] Em uma outra forma de realização, a descrição fornece um método de identificar e produzir a proteína alvo humana, o método compreendendo gerar um biblioteca de proteína humana em um hospedeiro de produção de célula eucariótica com exibição de superfície celular de proteína; triar a biblioteca por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; identificar uma proteína humana alvo da biblioteca com base na pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e expressar a proteína alvo humana no mesmo hospedeiro de produção de célula eucariótica como na etapa de geração para a produção de uma proteína alvo humana. Em um aspecto, a proteína alvo humana é um anticorpo. Em um outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.

[0032] Em uma outra forma de realização, a descrição fornece um método de evolução de uma proteína humana em um hospedeiro de fabricação, o método compreendendo mutar uma proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes em um hospedeiro de fabricação e triar o conjunto de proteínas de progênie mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada. Em um aspecto, o método compreende adicionalmente selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base em pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada. Em um outro aspecto, o método compreende adicionalmente fabricar a proteína humana mutante ativada compreendendo expressar a proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de produção como na etapa de mutação. Em um outro aspecto, a etapa de seleção compreende adicionalmente selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base (1) na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada quando comparado com a proteína humana padrão e (2) expressão modificada quando / 140 comparado com a proteína humana padrão. Em um aspecto, a expressão modificada é expressão intensificada.

[0033] Em uma outra forma de realização, a descrição fornece um método de evolução e de fabricação de uma proteína humana em um hospedeiro de fabricação celular; o método compreendendo mutar uma proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes em um hospedeiro de fabricação; triar o conjunto de proteínas humanas mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triar quanto à expressão modificada; selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base (1) na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (2) expressão modificada quando comparado com a proteína humana padrão e fabricar a proteína humana compreendendo expressar a proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de fabricação como na etapa de mutação.

[0034] Em uma forma de realização adicional, a descrição fornece um método de evolução para a expressão intensificada e fabricação de uma proteína humana em um hospedeiro de produção de célula eucariótica; o método compreendendo mutar uma proteína humana padrão compreendendo geração de códons mutantes que codificam a proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes em um hospedeiro de fabricação; triar o conjunto de proteínas humanas mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triagem quanto à expressão intensificada quando comparado com a proteína humana padrão; selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base na (1) retenção ou otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (2) expressão intensificada quando comparado com a proteína humana padrão e fabricação da proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de fabricação / 140 como na etapa de mutação.

[0035] Em um aspecto, a etapa de triagem compreende triar o conjunto de proteínas humanas mutantes para a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triagem quanto à expressão intensificada simultaneamente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0036] A Figura 1 fornece um esquema da geração e/ou seleção do método de integrar proteína terapêutica CIAO!^TM (por exemplo, anticorpo), evolução e expressão em um hospedeiro eucariótico, tal como um hospedeiro de célula de mamífero ou um hospedeiro de célula de levedura, para a fabricação de um sistema simples.

[0037] A Figura 2 ilustra como a evolução posicional compreensiva (CPE^TM) é usada para gerar um banco de dados específico de molécula (EvoMap^TM).

[0038] A Figura 3 mostra um esquema de Compreensivo Positional Synthesis (CPS^TM) que pode ser usado para combinar mutantes ativados de CPE^TM.

[0039] A Figura 4 mostra um esquema de evolução de Compreensivo Positional Insertion (CPI^TM).

[0040] A Figura 5 ilustra uma combinação de métodos de evolução: um ácido nucleico estendido de evolução CPI^TM é submetido a Evolução posicional compreensiva (CPE^TM) e usado para gerar um banco de dados específico de molécula (EvoMap^TM).

[0041] A Figura 6 mostra um esquema de evolução Compreensivo Positional Deletion (CPD^TM).

[0042] A Figura 7 ilustra uma outra combinação de métodos de evolução: um ácido nucleico encurtado de evolução de CPD^TM é submetido à Evolução Posicional Compreensiva (CPE^TM) e usada para a geração de um banco de dados específico de molécula (EvoMap^TM) / 140

DEFINIÇÃO DE TERMOS [0043] A fim de facilitar o entendimento dos exemplos fornecidos aqui, certos métodos e/ou termos de ocorrência frequente serão descritos.

[0044] O termo “agente” é usado aqui para indicar um polipeptídeo, uma mistura de polipeptídeos, um conjunto de compostos espacialmente localizados (por exemplo, um conjunto de peptídeo VLSIPS, conjunto de polinucleotídeo e/ou conjunto de molécula pequena combinatorial), macromolécula biológica, uma biblioteca de exibição de peptídeo de bacteriófago, uma biblioteca de exibição de anticorpo de bacteriófago (por exemplo, scFv), uma biblioteca de exibição de polissoma ou um extrato feito de materiais biológicos, tais como células ou tecidos de bactérias, plantas, fungos ou animais (particularmente mamíferos). Os agentes são triados quanto à atividade potencial como antineoplásticos, anti-inflamatórios ou moduladores da apoptose pela inclusão em ensaios de triagem descritos mais abaixo. Os agentes são triados quanto à atividade potencial como inibidores de interação de proteína específicos (isto é, um agente que inibe seletivamente uma interação de ligação entre dois polipeptídeos predeterminados mas que não interfere substancialmente com a viabilidade celular) pela inclusão em ensaios de triagem descritos mais abaixo.

[0045] O termo “aminoácido” como usado aqui refere-se a qualquer composto orgânico que contenha um grupo amino (--NH2) e um grupo carboxila (--COOH); preferivelmente como grupos livres ou, alternativamente após a condensação como parte de ligações de peptídeo. Os “vinte alfaaminoácidos que formam polipeptídeo naturalmente codificado” são entendidos na técnica e referem-se a: alanina (ala ou A), arginina (arg ou R), asparagina (asn ou N), ácido aspártico (asp ou D), cisteína (cis ou C), ácido glutâmico (glu ou E), glutamina (gin ou Q), glicina (gli ou G), histidina (his ou H), isoleucina (ile ou I), leucina (leu ou L), lisina (lis ou K), metionina (met ou M), fenilalanina (fe ou F), prolina (pro ou P), serina (ser ou S), treonina (tr ou T), triptofano (trp ou W), tirosina (tir ou I) e valina (val ou V).

/ 140 [0046] O termo “amplificação” significa que o número de cópias de um polinucleotídeo é aumentado.

[0047] O termo “anticorpo”, como usado aqui, refere-se a moléculas de imunoglobulina intactas, bem como fragmentos de moléculas de imunoglobulina, tais como fragmentos de Fab, Fab', (Fab')2, Fv e SCA, que são capazes de ligação a um epítopo de um antígeno. Stes fragmentos de anticorpo que retém, alguma capacidade de ligação seletiva a um antígeno (por exemplo, um antígeno de polipeptídeo) do anticorpo a partir do qual estes são derivados, podem ser feitos usando-se métodos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow and Lane, supra) e ainda são descritos como segue. Os anticorpos podem ser usados para isolar as quantidades preparativas do antígeno por cromatografia de imunoafinidade. Vários outros usoa s de tais anticorpos são para diagnosticar e/ou classificar a doença (por exemplo, neoplasia) e para a aplicação terapêutica para o tratamento da doença, tal como, por exemplo,: neoplasia, doença autoimune, AIDS, doença cardiovascular, infecções e outros. Anticorpos quiméricos, semelhantes a humanos, humanizados ou totalmente humanos são particularmente úteis para a administração a pacientes humanos.

[0048] Um fragmento Fab consiste de um fragmento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo e pode ser produzido pela ingestão de uma molécula de anticorpo total com a enzima papaína, para produzir um fragmento que consiste de uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada.

[0049] Um fragmento Fab’ de uma molécula de anticorpo pode ser obtido pelo tratamento de uma molécula de anticorpo total com pepsina, seguido pela redução, para a produção de uma molécula que consiste de uma cadeia leve intacta e uma porção e uma cadeia pesada. Dois fragmentos Fab' são obtidos por molécula de anticorpo tratada desta maneira.

[0050] Um fragmento (Fab')2 de um anticorpo pode ser obtido pelo / 140 tratamento de uma molécula de anticorpo total com a enzima pepsina, sem redução subsequente. Um fragmento (Fab’)2 é um dímero de dois fragmentos de Fab', mantidos juntos por duas ligações de bissulfeto.

[0051] Um fragmento Fv é definido como um fragmento geneticamente projetado contendo a região variável de uma cadeia leve e a região variável de uma cadeia pesada expressada como duas cadeias.

[0052] Um anticorpo de eadeia simples (“SCA”) é uma molécula de cadeia simples geneticamente projetada contendo a região variável de uma cadeia leve e a região variável de uma cadeia pesada, ligada por um revestimento de polipeptídeo flexível adequado.

[0053] O termo “biossimilar”, também denominado “follow-on biológico”, refere-se a versões novas oficialmente aprovadas de produtos biofarmacêuticos inovadores, seguindo a expiração de patente ou exclusividade.

[0054] O termo “hospedeiro de produção celular” ou “hospedeiro de fabricação”, refere-se a uma linhagem celular usada para a produção ou fabricação de proteínas. As células eucarióticas, tais como células de mamífero, que incluem, mas não limitam-se a linhagens celulares humanas, camundongo, hamster, rato, macaco, bem como linhagens celulares de levedura, de inseto e vegetal. As células procarióticas podem ser alternativamente utilizadas. Em um aspecto, um hospedeiro de produção celular de mamífero é selecionado de um membro do grupo que consiste de células de fibroblasto de camundongo 3T3; células de fibroblasto de hamster sírio BHK21; MDCK, células epiteliais caninas; Células epiteliais humanas Hela; Células epiteliais de rato canguru PtK1; células de plasma de camundongo SP2/0 e células de plasma de camundongo NSO; células renais embriônicas humanas HEK 293; células renais de macaco COS; CHO, células de ovário de hamster chinês CHO-S; células embriônicas de camundongo R1; células embriônicas de camundongo E14.1; células embriônicas humanas H1;

/ 140 células embriônicas humanas H9; PER C.6, células embriônicas humanas. Em um outro aspecto, o hospedeiro de produção celular é uma linhagem celular GS-NSO ou GS-CHOK1. Em um outro aspecto, o hospedeiro de produção celular é selecionado de células de levedura S. cerevisiae e células de levedura picchia. Em um outro aspecto, o hospedeiro de produção celular é uma linhagem celular bacteriana.

[0055] Uma molécula que tem uma “propriedade quimériea” é uma molécula que é: 1) em parte homóloga e em parte heteróloga a uma primeira molécula de referência; enquanto 2) no mesmo período sendo, em parte, homólogo e em parte heterólogo a uma segunda molécula de referência; sem 3) impedir a possibilidade de ser ao mesmo tempo em parte homólogo e em parte heterólogo ainda a uma ou mais moléculas de referência adicionais. Em uma forma de realização não limitante, uma molécula quimérica pode ser preparada pela montagem de um reagrupamento de sequências moleculares parciais. Em um aspecto não limitante, uma molécula de polinucleotídeo quimérica pode ser preparada pela sintetização do polinucleotídeo quimérico usando-se uma pluralidade de padrões moleculares, de modo que os polinucleotídeos quiméricos resultantes tenham propriedades de uma pluralidade de padrões.

[0056] O termo “eognado” como usado aqui refere-se a uma sequência genética que é evolucionária e funcionalmente relacionada entre as espécies. Por exemplo, mas sem limitação, no genoma humano, o gene CD4 humano é o gene cognado ao gene 3d4 de camundongo, visto que as sequências e estruturas destes dois genes indicam que estes são altamente homólogos e ambos os genes codificam uma proteína que funciona na sinalização da ativação de célula T através do reconhecimento de antígeno restrito II de classe MHC.

[0057] O termo “escala comercial” significa a produção de uma proteína ou anticorpo em uma escala apropriada para revenda.

/ 140 [0058] Uma “janela de comparação”, eomo usado aqui, refere-se um segmento conceituai de pelo menos 20 posições de nucleotídeo contínuas em que uma sequência de polinucleotídeo pode ser comparada a uma sequência de referência de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos e em que a porção da sequência de nucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou anulações (isto é, fendas) de 20 por cento ou menos em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou anulações) para o alinhamento ótimo das duas sequências. O alinhamento ótimo de sequências para o alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 pelo algoritmo de alinhamento e homologia de Needlemen and Wuncsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa de similaridade de Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), pelas implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou pela inspeção e pelo alinhamento melhor (isto é, resultante da porcentagem mais alta de homologia sobre a janela de comparação) gerada pelos vários métodos é selecionado.

[0059] Como usado aqui, o termo “região determinadora de complementaridade” e “CDR” refere-se ao termo reconhecido na técnica como exemplificado por Kabat and Chothia. As definições são, em geral, conhecidas como regiões supervariáveis ou arcos hipervariáveis (Chothia and Leks, 1987; Clothia et al., 1989; Kabat et al., 1987 e Tramontano et al., 1990). Os domínios de região variável tipicamente compreendem os aproximadamente 105 a 115 aminoácidos de terminal amino de uma cadeia de imunoglobulina de ocorrência natural (por exemplo, aminoácidos 1 a 110), embora os domínios variáveis algumas vezes mais curtos ou mais longos também são adequados para formar anticorpos de cadeia simples. Os CDRs / 140 são partes de imunoglobulinas que determinam a especificidade das ditas moléculas e fazem contato com um ligante específico. Os CDRs são a parte mais variável da molécula e contribuem com a diversidade destas moléculas. Existem três regiões de CDR CDR1, CDR2 e CDR3 em cada domínio V. O CDR-H descreve uma região de CDR de uma cadeia pesada variável e o CDR-L diz respeito a uma região de CDR de uma cadeia leve variável. H significa a cadeia pesada variável e L significa uma cadeia leve variável. As regiões CDR de uma região derivada de Ig pode ser determinada como descrito em Kabat (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° edição., Publicação NIH n° 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 and Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.

[0060] O termo “compreensivo” é usado aqui para referir-se a uma técnica de evolução em que cada mudança possível é feita em cada posição de um polinucleotídeo padrão ou polipeptídeo padrão e o polinucleotídeo ou polipeptídeo são testados para confirmar que as mudanças pretendidas foram realizadas.

[0061] As “Substituições de aminoácido conservatives” referem-se à intercambeabilidade de resíduos tendo cadeias secundárias similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias secundárias alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias secundárias de hidroxila alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias secundárias contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias secundárias aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias secundárias básicas é lisina, arginina e histidina e um grupo de aminoácidos tendo cadeias secundárias contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferidos são: valina-leucinaisoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina / 140 glutamina.

[0062] O termo “corresponde a” é usado aqui para significar que uma sequência de polinucleotídeo é homóloga (isto é, é idêntica, são estritamente, relacionados evolucionariamente) a todos ou uma porção de sequência de polinucleotídeo de referência ou que uma sequência de polipeptídeo é idêntica a uma sequência de polipeptídeo de referência. Em contraste, o termo “complementaridade a” é usado aqui para significa que a sequência de complementaridade é homóloga a todos ou a uma porção de uma sequência de polinucleotídeo de referência. Para ilustração, a sequência de nucleotídeo “TATAC” corresponde a um “TATAC” de referência e é a complementaridade a uma sequência de referência “GTATA.” [0063] O termo quantidade de “degradação eficaz” refere-se à quantidade de enzima que é requerida para o processo de pelo menos 50 % do substrato, em comparação com o substrato não contatado com a enzima. Preferivelmente, pelo menos 80 % do substrato é degradado.

[0064] Como usado aqui, o termo “estrutura de sequência definida” refere-se a um conjunto de sequências definidas que são selecionadas em uma base não aleatória, em geral, na base dos dados experimentais ou dados estruturais; por exemplo, uma estrutura de sequência definida pode compreender um conjunto de sequências de aminoácido que são descritas para formar a estrutura de lâmina α,β ou podem compreenderum motivo de repetição heptad de zíper de leucina, um domínio de dedo de zinco, entre outras variações. Um “kernal de sequência definida” é um conjunto de sequências que abrange um escopo limitado de variabilidade. Visto que (1) uma sequência 10-mero completamente aleatória dos 20 aminoácidos convencionais pode ser qualquer uma das (20)10 sequências e (2) uma sequência 10-mero pseudo aleatória dos 20 aminoácidos convencionais pode ser qualquer uma das (20)10 sequências mas apresentará um desvio para certos resíduos em certas composições e/ou total, (3) um núcleo de sequência / 140 definido é um subconjunto de sequências se cada posição de resíduo for deixada ser dos 20 aminoácidos convencionais admissíveis 20 (e/ou amino/imino ácidos não convencionais admissíveis). Um núcleo de sequência definido, em geral, compreende posições de resíduo variantes e invariantes e/ou compreendem posições de resíduo variantes que podem compreender um resíduo selecionado de um subconjunto definido de resíduos de aminoácido) e outros, segmentarmente ou no comprimento total da sequência de membro de biblioteca selecionado individualmente. Os núcleos de sequência definidos podem referir-se a sequências de aminoácido ou sequências de polinucleotídeo. De ilustração e não de limitação, as sequências (NNK)10 e (NNM)10, em que N representas A, T, G, ou C; K representa G ou T e M representa A ou C, são núcleos de sequência definidos.

[0065] O termo “desimunização” eomo usado aqui diz respeito à produção de uma variante da molécula de ligação padrão, que é modificada em comparação com uma molécula do tipo selvagem original tornando a dita variante não imunogênica ou menos imunogênica em humana. As moléculas desimunizadas de acordo com a invenção diz respeito a anticorpos ou partes destes (como estruturas e/ou CDRs) de origem não humana. Os exemplos correspondentes são anticorpos ou fragmento destes como descrito no US 4,361,549. O termo “desimunizado” também diz respeito a moléeulas, e exibem propensidade reduzida para a geração de epítopos de célula T. De aeordo eom esta invenção, o termo “propensidade reduzida para a geração de epítopos de eélula T” diz respeito à remoção de epítopos de eélula T que levam à ativação de célula T específica.

[0066] Além disso, a propensão reduzida para a geração de epítopos significa a substituição de aminoácidos que contribuem com a formação de epítopos de célula T, isto é substituição de aminoácidos, que são essenciais para a formação d um epítopo de célula T. Em outras palavras, a propensão reduzida para a geração de epítopos de célula T diz respeito à / 140 imunogenicidade reduzida ou à capacidade reduzida de induzir a proliferação de célula T independente de antígeno. Além disso, a propensão reduzida para a geração de epítopos de célula diz respeito à desimunização, que significa a perda ou a redução de epítopos de célula T potenciais de sequências de aminoácido que induzem a proliferação de célula T independente de antígeno. [0067] O termo “epítopo de célula T” eomo usado aqui diz respeito à sequências de peptídeo curto que podem ser liberados durante a degradação de peptídeos, polipeptídeos ou proteínas dentro das células e subsequentemente ser exibido pela moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) a fim de disparar a ativação de células T; ver inter alia WO 02/066514. para peptídeos exibidos para MHC classe II tal ativação de células T pode então induzir uma resposta de anticorpo pelo estímulo direto de células B para a produção dos ditos anticorpos.

[0068] A “digestão” de DNA refere-se à clivagem catalítica do DNA com uma enzima de restrição que atua apenas em certas sequências no DNA. As várias enzimas de restrição usadas aqui estão comercialmente disponíveis em suas condições de reação, cofatores e outros requerimentos que foram usados como deve ser conhecido pelo técnico habilitado na técnica comum. Para os propósitos analíticos, tipicamente 1 pg de plasmídeo ou fragmento de DNA é usado com cerca de 2 unidades de enzima em torno de 20 pl da solução de tampão. Para o propósito de isolar fragmentos de DNA para a construção de plasmídeos, tipicamente, de 5 a 50 pg de DNA são digeridos com 20 a 250 unidades de enzima em um volume grande. Os tampões apropriados e as quantidades de substrato para as enzimas de restrição particulares são especificados pelo fabricante. Os tempos de incubação de cerca de 1 hora a 37°C são comumente usados, mas podem variar de acordo com as instruções dos fornecedores. Após a digestão, a reação é submetida à eletroforese diretamente em um gel para o isolamento do fragmento desejado.

[0069] O termo “mistura de DNA” é usado aqui para indicar / 140 recombinação entre sequências substancialmente homólogas mas não idênticas, em algumas formas de realização, a mistura de DNA pode envolver passagem por intermédio da recombinação não homóloga, tal como por intermédio de sistemas cer/lox e/ou flp/frt e outros. A mistura de DNA pode ser aleatória ou não aleatória.

[0070] Como usado nesta invenção, o termo “epítopo” refere-se a um determinante antigênico em um antígeno, tal como um polipeptídeo fitase, ao qual o parátropo de um anticorpo, tal como um anticorpo específico de fitase, liga-se. Os determinantes antigênicos usualmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias secundárias de açúcar e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Como usado aqui “epítopo” refere-se àquela porção de um antígeno ou outra macromolécula capaz de formar uma interação de ligação que interage com o corpo de ligação de região variável de um anticorpo. Tipicamente, tal interação de ligação é manifestada como um contato intermolecular com um ou mais resíduos de aminoácido de um CDR.

[0071] O termo “evolução” refere-se a uma mudança em pelo menos uma propriedade característica ou atividade de uma proteína ou anticorpo genética ou sinteticamente modificados quando comparados com uma proteína ou anticorpo padrão.

[0072] O termo “fragmento”, “derivado” e “análogo” quando referese a um polipeptídeo de referência compreende um polipeptídeo que retém pelo menos uma função ou atividade biológica que é pelo menos essencialmente a mesma como aquela do polipeptídeo de referência. Além disso, os termos “fragmento”, “derivado” ou “análogo” são exemplificados por uma molécula “pró-forma”, tal como uma pró-proteína de atividade baixa que pode ser modificada por clivagem para a produção de uma enzima madura com atividade significantemente mais alta.

/ 140 [0073] Um método é fornecido aqui para produzir, a partir de um polipeptídeo padrão, um conjunto de polipeptídeo de progênie em que uma “faixa total de substituições de aminoáeido simples” é representada em eada posição de aminoáeido. Como usado aqui, “faixa total de substituições de aminoáeido simples” está em referêneia a 20 alfa-aminoácidos naturalmente codificados que formam polipeptídeo naturalmente codificado, como descrito aqui.

[0074] O termo “gene” signifíea o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo; este inclui regiões precedentes e que seguem a região codificadora (condutor e conduzido) bem como sequências de intervenção (íntrons) entre os segmentos codificadores individuais (éxons). [0075] “Instabilidade genétiea”, eomo usado aqui, refere-se à tendência natural de que sequências altamente repetitivas sejam perdidas através do processo de eventos de redução que, em gera, envolvem a simplificação de sequência através da perda de sequências repetidas. As anulações tendem a envolver a perda de uma cópia de uma repetição e tudo entre as repetições.

[0076] O termo “heterólogo” signifiea que uma sequência de ácido nucleico de filamento simples é incapaz de hibridizar-se a uma outra sequência de ácido nucleico de filamento simples ou seu complemento. Desta maneira, as áreas de heterologia significam que áreas de polinucleotídeos ou os polinucleotídeos têm áreas ou regiões dentro de sua sequência que são incapazes de hibridizar a um outro ácido nucleico ou polinucleotídeo. Tais regiões ou áreas são, por exemplo, áreas de mutações.

[0077] O termo “homólogo” signifiea que uma sequêneia de áeido nucleico de filamento simples pode hibridizar-se a uma sequência de ácido nucleico de filamento simples complementar. O grau de hibridização pode depender de diversos fatores incluindo a quantidade de entre as sequências e as condições de hibridização, tal como a temperatura e as concentrações de / 140 sal como debatido depois. Preferivelmente, a região de identidade é maior do que cerca de 5 bp, mais preferivelmente a região de identidade é maior do que bp.

[0078] O termo “humanizado” é usado para descrever os anticorpos naquelas regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) de um animal mamífero, por exemplo, um camundongo, são combinados com uma região de estrutura humana. Frequentemente os polinucleotídeos que codificam os CDRs isolados serão enxertados nos polinucleotídeos que codificam uma estrutura de região variável adequada (e, opcionalmente, regiões constantes) para formar polinucleotídeos que codificam anticorpos completos (por exemplo, humanizados ou totalmente humanos), fragmentos de anticorpo e outros. Em um outro aspecto, além dos anticorpos de camundongo, outras espécies podem ser humanizadas, tais como, por exemplo, outros roedores, camelo, coelho, gato, cão, cavalo, vaca, peixe, lhama e tubarão. Em um aspecto amplo, quaisquer espécies que produzam anticorpos podem ser utilizadas na produção de anticorpos humanizados. Adicionalmente, os anticorpos da invenção podem ser quiméricos, semelhantes a humano, humanizados ou totalmente humanos, a fim de reduzir sua antigenicidade potencial, sem reduzir sua afinidade quanto a seu alvo. Os anticorpos quiméricos, semelhantes a humano e humanizados, em geral, foram descritos na técnica. Incorporando-se tão pouca sequência estranha quanto possível no anticorpo híbrido, a antigenicidade é reduzida. A preparação destes anticorpos híbridos pode ser realizada pelos métodos bem conhecidos na técnica.

[0079] Em um aspecto alternativo, os anticorpos humanos ou de camundongo são adaptados a uma espécie de receptor diferente, tal como uma espécie em perigo, a fim de fornecer produtos terapêuticos para as espécies receptoras enquanto as protege de uma resposta imune negativa. Neste aspecto, as estruturas de uma espécie de receptor são utilizadas em / 140 combinação com CDRs a partir de uma segunda espécie de anticorpo ou conhecida.

[0080] Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina consiste de uma região de “estrutura” interrompida pelas três regiões hipervariáveis, também denominadas CDR's. A extensão da região de estrutura e os CDR's foram precisamente definidos (ver, “Sequences of Proteins of immunological interest”, Kabat et al., 1987). As sequências das regiões de estrutura de cadeias leves ou pesadas diferentes são relativamente conservadas dentro de uma espécie. Como usado aqui, a “região de estrutura humana” é uma região de estrutura que é substancialmente idêntica (cerca de 85 ou mais, usualmente 90 a 95 ou mais) à região de estrutura de uma imunoglobulina humana de ocorrência natural.

[0081] A região de estrutura de um anticorpo, que são as regiões de estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar a alinhar os CDR's. Os CDR's são primariamente responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. De acordo com a esta invenção, uma região de estrutura diz respeito a uma região no domínio (domínio VH ou VL) de imunoglobulinas que fornecem uma estrutura de proteína para as regiões determinadoras de complementaridade hipervariáveis (CDRs) que fazem contato com o antígeno. Em cada domínio V, existem quatro regiões de estrutura denominadas FR1, FR2, FR3 e FR4. A estrutura 1 abrange a região do terminal N do domínio V até o início do CDR1, a estrutura 2 diz respeito à região entre CDR1 e CDR2, a estrutura 3 abrange a região entre o CDR2 e o CDR3 e a estrutura 4 significa a região da extremidade de CDR3 até o terminal C do domínio V; ver, inter alia, Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5° ed. Desta maneira, as regiões de estrutura abrangem todas as regiões fora das regiões de CDR nos domínios VH ou VL.

[0082] A pessoa habilitada na técnica está facilmente em uma posição para deduzir, a partir de uma dada sequência, as regiões estruturais, os CDRs;

/ 140 ver Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° edição.,

NIH Publication n° 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services,

Chothia (1987) J. Mol. Biol. 196, 901 917 and Chothia (1989) Nature, 342,

877-883.

[0083] Os benefícios desta invenção estendem-se a “aplicações industriais” (ou processos industriais), cujo termo é usado para incluir as aplicações na industria comercial apropriada (ou simplesmente indústria) bem como aplicações industriais não comerciais (por exemplo, pesquisa biomédica em uma instituição sem fins lucrativos). As aplicações relevantes incluem aquelas em áreas de diagnóstico, medicina, agricultura, fabricação e acadêmica.

[0084] O termo “idêntico” ou “identidade” significa que duas sequências de ácido nucleico têm a mesma sequência ou uma sequência complementar. Desta maneira, “áreas de identidade” significam que as regiões ou áreas de um polinucleotídeo ou o polinucleotídeo total são idênticos ou complementares às áreas de um outro polinucleotídeo ou o polinucleotídeo.

[0085] O termo “isolado” significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se este ocorrer naturalmente). Por exemplo, um polinucleotídeo ou enzima de ocorrência natural presentes em um animal vivente não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou enzima separados de alguns ou de todos o materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeo ou enzimas podem ser parte de uma composição a ainda serem isolados em que tal vetor ou composição não é parte de seu ambiente natural.

[0086] Por “ácido nucleico isolado” é entendido um ácido nucleico, por exemplo, uma molécula de DNA ou RNA, que não é imediatamente contígua com as sequências flanqueadoras 5' e 3' com as quais esta, / 140 normalmente, é imediatamente contígua quando presente no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual este é derivado. O termo, desta maneira, descreve, por exemplo, um ácido nucleico que é incorproado em um vetor, tal como um vetor de plasmídeo ou viral; um ácido nucleico que é incorporado no genoma de uma célula heteróloga (ou o genoma de uma célula homóloga, mas em um local diferente daquele em que este naturalmente ocorre) e um ácido nucleico que existe como uma molécula separada, por exemplo, um fragmento de DNA produzido pela amplificação de PCR ou digestão da enzima de restrição ou uma molécula de RNA produzida pela transcrição in vitro. O termo também descreve um ácido nucleico recombinante que forma parte de um gene híbrido que codifica sequências de polipeptídeo adicionais que podem ser usadas, por exemplo, na produção de uma proteína de fusão.

[0087] Como usado aqui “ligante” refere-se a uma molécula, tal como uma sequência de peptídeo ou de segmento variável aleatória, que é reconhecida por um receptor particular. Como uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá, uma molécula (ou complexo macromolecular) pode ser tanto um receptor quanto um ligante. Em geral, o parceiro de ligação tendo um peso molecular menor é referido como o ligante e o parceiro de ligação tendo um peso molecular maior é referido como um receptor.

[0088] “Ligação” refere-se ao processo de formar ligações de fosfodiéster entre os dois fragmentos de ácido nucleico de filamento duplo (Maniatis et al., 1982, p. 146). A não ser que de outra maneira fornecido, a ligação pode ser realizada usando-se tampões conhecidos e configurações eom 10 unidades de T4 DNA ligase (“ligase”) por 0,5 -g de quantidades aproximadamente equimolares dos fragmentos de DNA a serem ligados.

[0089] Como usado aqui, “ligador” ou “espaçador” referem-se a uma molécula ou grupo de moléculas que conectam duas moléculas, tais como uma proteína de ligação de DNA e um peptídeo aleatório e serve para colocar / 140 as duas moléculas em uma configuração preferida, por exemplo, de modo que o peptídeo aleatório possa ligar-se a um receptor com impedimento estérico mínimo da proteína de ligação de DNA.

[0090] O termo “exibição de superfície de célula de mamífero” referese a uma técnica, desse modo, uma proteína ou um anticorpo ou uma porção de um anticorpo, é expressada e exibida em uma superfície de célula de hospedeiro mamífero para os propósitos de triagem; por exemplo, pela triagem quanto à ligação de antígeno específico por uma combinação de pérolas magnéticas e classificação celular ativada por fluorescência. Em um aspecto, os vetores de expressão de mamífero são usados para a expressão simultânea de imunoglobulinas como uma forma de ligação secretada e de superfície como em DuBridge et al., US 2009/0136950, que é incorporado aqui por referência. Em um outro aspecto, as técnicas de Gao et al. São utilizados para um vetor viral que codifica quanto a uma biblioteca de anticorpos ou os fragmentos de anticorpo são exibidos nas membranas celulares quando expressado em uma célula como em Gao et al., US 2007/0111260, incorporado aqui por referência. A exibição de superfície de IgG total em células de mamífero é conhecida. Por exemplo, a Akamatsuu et al. Desenvolveu uma exibição de vetor de superfície de célula de mamífero, adequado para isolar diretamente as moléculas de IgG com base em sua afinidade de ligação de antígeno e atividade biológica. Usando-se um vetor epissomal derivado do vírus de Epstein-Barr, as bibliotecas de anticorpo foram exibidas como moléculas de IgG totais na superfície celular e triadas quanto à ligação e antígeno específica por uma combinação de pérolas magnéticas e classificação celular ativada por fluorescência. Os plasmídeos que codificam anticorpos com características de ligação desejadas foram recuperados a partir e células classificadas e convertidas à forma para a produção de IgG solúvel. Akamatsuu et al. J. Immunol. Methods 2007 327(12):40-52; incorporado aqui por referência. Ho et al. Usaram células 293T / 140 renais embriônicas humanas que foram amplamente usadas para a expressão transitória de proteína para a exibição de superfície celular de anticorpos Fv de cadeia simples. As células que expressam um anticorpo mutante raro com afinidade mais alta foram enriquecidos 240 vezes por uma classificação celular de passagem simples a partir de um grande excesso de células que expressam o anticorpo WT com uma afinidade levemente menor. Além disso, um mutante altamente enriquecido foi obtido com afinidade de ligação aumentada para CD22 após uma seleção simples de uma biblioteca combinatória que realiza a aleatorização de uma irradiação de anticorpo intrínseco. Ho et al. Isolation of antiCD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells, Proc Natl Acad Sci U S A 2006 June 20; 103(25): 9637-9642; incorporado aqui por referência.

[0091] Beerli et al. Usaram células B para um antígeno de interesse que foi diretamente isolado a partir de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de doadores humanos. As bibliotecas de Fv de cadeia simples específico de antígeno recombinante, (scFv) são geradas a partir deste grupo de células B e triadas pela exibição de superfície de célula de mamífero usando-se um sistema de expressão viral Sindbis. Este método permite o isolamento de anticorpos específicos de antígeno por um conjunto simples de FACS. As regiões variáveis (VRs) das cadeias pesadas (HCs) e cadeias leves (LCs) foram isoladas a partir de clones positivos e anticorpos humanos totalmente recombinantes produzidos como fragmentos de IgG ou Fab. Desta maneira, diversos anticorpos de afinidade alta hipermutados que ligam a partícula semelhante a vírus QP (VLP), um antígeno viral modelo, bem como os anticorpos específicos para nicotina foram isolados. Todos os anticorpos mostram níveis de expressão altos na cultura celular. Os mAbs específico de nicotina humanos foram validados pré-clinicamente em um modelo de camundongo. Beerli et al., Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display, Proc Natl Acad Sci U S A. 23 de setembro de 2008; 105(38): 14336-14341; incorporado aqui por referência.

/ 140 [0092] A exibição de superfície celular de levedura também é conhecida, por exemplo, ver Kondo e Ueda 2004, Yeast cell-surface displayapplications of molecular display, Appl. Microbiol. Biotechnol., 64(1): 28-40, que descreve, por exemplo, um sistema de projeto de superfície celular usando-se a levedura Saccharomyces cerevisiae. Diversos sistemas de exibição representativos para a expressão em levedura S. cerevisiae são descritos em Lee et al, 2003, Microbial cell-surface display, TRENDS in Bitechnol. 21(1): 45-52. Também Boder and Wittrup 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnol., 15(6): 553.

[0093] O termo “fabricação” refere-se à produção de uma proteína em uma quantidade suficiente para permitir pelo menos o teste clínico de Fase I de uma proteína terapêutica ou quantidade suficiente para a aprovação reguladora de uma proteína de diagnóstico.

[0094] O termo “mutação sem sentido” refere-se a uma mutação de ponto onde um nucleotídeo simples é mudado, resultando em um códon que codifica um aminoácido diferente. As mutações que mudam um aminoácido para um códon de parada são denominadas mutações sem sentido.

[0095] Como usado aqui, uma “propriedade molecular a ser evoluída” inclui referências a moléculas compreendidas de uma sequência de polinucleotídeo, moléculas compreendidas de uma sequência de polipeptídeo e moléculas compreendidas em parte de uma sequência de polinucleotídeo e em parte de uma sequência de polipeptídeo. Os exemplos particularmente relevantes -- mas não limitantes - de propriedades moleculares a serem evoluídas incluem atividades enzimáticas em condições especificadas, tal como relacionado com a temperatura; salinidade; pressão; pH; e concentração de glicerol, DMSO, detergente, e/ou qualquer outra espécie molecular e com a qual o contato é feito em um ambiente de reação. Particularmente relevante adicional -- mas não por meio de exemplos limitantes de propriedades / 140 moleculares a serem evoluídas incluem estabilidades -- por exemplo, a quantidade de uma propriedade molecular residual que está presente após um tempo de exposição especificado em um ambiente especificado, tal como pode ser encontrado durante o armazenamento.

[0096] O termo “mutação” refere-se à criação de uma mutação em uma sequência de ácido nucleico; no evento onde a mutação ocorre dentro da região codificadora de uma proteína, levará uma mudança de códon que pode ou pode não levar a uma mudança de aminoácido.

[0097] O termo “mutações” significa mudanças de uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem ou mudanças na sequência de um peptídeo ou polipeptídeos. Tais mutações podem ser mutações de ponto, tais como transições ou transversões. As mutações podem ser anulações, inserções ou duplicações.

[0098] Como usado aqui, o nucleotídeo “N,N,G/T” degenerado representa 32 ripletos possíveis, onde “N” pode ser A, C, G ou T.

[0099] Como usado aqui, a sequência de nucleotídeo “N,N,N” degenerada representa 64 tripletos possíveis, onde “N” pode ser A, C, G ou T. [00100] O termo “de ocorrência natural” como usado aqui quando aplicado ao objetivo refere-e ao fato que um objeto pode ser encontrado em estado natural. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou de polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada a partir de uma fonte em estado natural e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural. Em geral, o termo de ocorrência natural refere-se a um objeto quando presente em um indivíduo não patológico (não doente), tal como deve ser típico para a espécie.

[00101] Como usado aqui, uma “molécula de ácido nucleico” é compreendida de pelo menos uma base ou um par de base, dependendo se esse é de filamento simples ou de filamento duplo, respectivamente. Além / 140 disso, uma molécula de ácido nucleico pode pertencer exclusiva ou quimericamente a qualquer grupo de moléculas contendo nucleotídeo, como exemplificado por, mas não limitado aos seguintes grupos de moléculas de ácido nucleico: RNA, DNA, ácidos nucleicos genômicos, ácidos nucleicos não genômicos, ácidos nucleicos de ocorrência natural e de ocorrência não natural e ácidos nucleicos sintéticos. Este inclui, por meio de exemplo não limitante, ácidos nucleicos associados com qualquer organela, tal como a mitocôndria, RNA ribossômico e moléculas de ácido nucleico compreendidos quimericamente de um ou mais componentes que não são de ocorrência natural junto com componentes de ocorrência natural.

[00102] Adicionalmente, uma “molécula de áeido nucleico” pode conter, em parte um ou mais componentes com base em não nucleotídeo como exemplificado por, mas não limitado a, aminoácidos e açúcares. Desta maneira, por meio de exemplo, mas não limitação, uma ribozima que é, em parte com base em nucleotídeo e em parte com base em proteína é considerada uma “molécula de áeido nucleico”.

[00103] Além disso, por meio de exemplo, mas não limitação, a molécula de ácido nucleico que é rotulada com uma porção detectável, tal como um rótulo radioativo ou, alternativamente, um rótulo não radioativo, também é considerada uma “molécula de ácido nucleico”.

[00104] Os termos “sequência de ácido nucleico que codifica quanto a” ou uma “sequência codificadora de DNA de” ou “sequência de nucleotídeo que codifica” uma proteína particular -- bem como outros termos sinônimos referem-se a uma sequência de DNA que é transcrita e traduzida em uma enzima quando colocado sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Uma “sequência de promotor” é uma região reguladora de DNA capaz de ligar a RNA polimerase em uma célula e início da transcrição de uma sequência codificadora a jusante (direção 3'). O promotor é parte da sequência de DNA. Esta região de sequência tem um códon inicial em seu / 140 terminal 3’. A sequêneia de promotor inclui o número mínimo de bases onde os elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima no fundamento. Entretanto, após a RNA polimerase ligar-se à sequência e a transcrição ser iniciada no códon de partida (terminal 3' com um promotor), a transcrição procede a jusante na direção 3'. Dentro da sequência de promotor será observado um local de início de transcrição (convenientemente definido pelo mapeamento com nuclease Si) bem como domínios de ligação de proteína (sequências de consenso) responsável pela ligação de RNA polimerase.

[00105] O termo “áeido nueleieo que eodifíea uma proteína” ou “DNA que eodifíea uma proteína” ou “polinueleotídeo que eodifíea uma proteína” e outros termos sinônimos abrangem um polinucleotídeo que inclui apenas a sequência codificadora para a proteína, bem como um polinucleotídeo que inclui sequência codificadora e/ou não codificadora adicional.

[00106] Em uma forma de realização preferida, uma “espéeie de moléeula de áeido nueleieo espeeífiea” é definida por sua estrutura química, como exemplificado por, mas não limitado a sua sequência primária. Em uma outra forma de realização preferida, uma “espéeie de moléeula de áeido nueleieo” espeeífiea é definida por uma função da espéeie de áeido nueleieo ou por uma função de um produto derivado das espécies de ácido nucleico. Desta maneira, por meio de exemplo não limitante, uma “espéeie de moléeula de áeido nueleieo espeeífiea” pode ser definida por uma ou mais atividades ou propriedades atribuíveis a esta, incluindo atividades ou propriedades atribuíveis a seu produto expressado.

[00107] A presente definição de “montagem de uma amostra de áeido nueleieo de trabalho em uma biblioteea de áeido nueleieo” inelui o proeesso de incorporar uma amostra de ácido nucleico em uma coleção com base em vetor, tal como pela ligação em um vetor e transformação de um hospedeiro. Uma descrição de vetores relevantes e de outros agentes, bem como exemplos / 140 não limitantes específicos destes são fornecidos a seguir. A presente definição de “montagem de uma amostra de ácido nucleico de trabalho em uma biblioteca de áeido nucleico” também inclui o processo de incorporar uma amostra de áeido nucleico em uma coleção que não com base em vetor, tal como pela ligação a adaptadores. Preferivelmente, os adaptadores pode recozer os iniciadores de para facilitar a amplificação por PCR.

[00108] Consequentemente, em uma forma de realização não limitante, a “biblioteca de ácido nucleico” é compreendida de uma coleção com base em vetor de uma ou mais moléculas de ácido nucleico. Em uma outra forma de realização preferida a “biblioteca de ácido nucleico” é compreendida de uma coleção que não com base em vetor de moléculas de ácido nucleico. Ainda, em uma outra forma de realização preferida, a “biblioteca de ácido nucleico” é compreendida de uma coleção combinada de moléculas de ácido nucleico que são, em parte com base em vetor e em parte que não com base em vetor. Preferivelmente, a coleção de moléculas compreendendo uma biblioteca é pesquisável e separável de acordo com as espécies de molécula de ácido nucleico individuais.

[00109] A presente invenção fornece uma “construção de ácido nucleico” ou alternativamente uma “construção de nucleotídeo” ou alternativamente uma “construção de DNA”. O termo “construção” é usado aqui para descrever uma molécula, tal como um polinucleotídeo (por exemplo, uma fitase polinucleotídeo) pode, opcionalmente, ser quimicamente ligado a uma ou mais porções moleculares adicionais, tal como um vetor ou partes de um vetor. Em um aspecto específico -- mas por nenhum meio limitante --, uma construção de nucleotídeo é exemplificado por uma construção de expressão de DNA adequada para a transformação de uma célula hospedeira.

[00110] Um “oligonucleotídeo” (ou sinonimamente um “oligo”) referese a um polinucleotídeo de filamento simples ou dois filamentos de / 140 polinucleotídeo complementares que podem ser quimicamente sintetizados. Tais oligonucleotídeos sintéticos podem ou podem não ter um 5' fosfato. Aqueles que não se ligarão a um outro oligonucleotídeo sem a adição de um fosfato com um ATP na presença de uma cinase. Um oligonucleotídeo sintético ligar-se-á um fragmento que não foi desfosforilado. Para a amplificação fundamentada em polimerase (tal como com PCR), um “oligonucleotídeo que se degenera 32 vezes que é compreendido de, em conjunto, de pelo menos uma primeira sequência homóloga, uma sequência N,N,G/T degenerada e uma segunda sequência homóloga” é mencionada. Como usado neste contexto, “homólogo” é em referência à homologia entre o polinucleotídeo oligo e o precursor que é submetido à amplificação com base em polimerase.

[00111] Como usado aqui, o termo “operacionalmente ligado” referese a uma ligação de elementos de polinucleotídeo em uma relação funcional. Um ácido nucleico é “operacionalmente ligado” quando este é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se este afetar a transcrição da sequência codificadora. Operacionalmente ligado significa que as sequências de DNA sendo ligadas são tipicamente contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificadoras de proteína, contíguas e na estrutura de leitura.

[00112] Uma sequência codificadora é “operacionalmente ligada a” uma outra sequência codificadora quando a RNA transcreverá as duas sequências codificadoras em um mRNA simples, que é então traduzido em um polipeptídeo simples tendo aminoácidos derivados de ambas as sequências codificadoras. As sequências codificadoras não necessitam ser contíguas umas às outras contanto que as sequências expressadas sejam ultimamente processadas para a produção da proteína desejada.

[00113] Como usado aqui o termo “condições fisiológicas” referem-se / 140 a temperatura, pH, força iônica, viscosidade, e outros parâmetros bioquímicos que são compatíveis com um organismo viável e/ou que tipicamente existe de maneira intracelular em uma célula de levedura ou célula de mamífero cultivadas viáveis. Por exemplo, as condições intracelulares em um desenvolvimento de célula de levedura sob condições de cultura de laboratório típicas são condições fisiológicas. As condições de reação in vitro adequadas para o coquetel de transcrição in vitro são, em geral condições fisiológicas. Em geral, as condições fisiológicas in vitro compreendem de 50 a 200 mM de NaCl ou KCl, pH 6,5 a 8,5, 20 a 45°C e cátion bivalente de 0,001 a 10 mM (por exemplo, Mg++, Ca++); preferivelmente cerca de 150 mM NaCl ou KCl, pH 7,2 a 7,6, cátion bivalente de 5 mM e frequentemente inclui de 0,01 a 1,0 por cento de proteína não específica (por exemplo, BSA). Um detergente não iônico (Tween, NP-40, Triton X-100) pode estar frequentemente presente, usualmente em torno de 0,001 a 2 %, tipicamente de 0,05 a 0,2 % (v/v). As condições aquosas particulares podem ser selecionadas pelo técnico de acordo com os métodos convencionais. Para orientação geral, as seguintes condições aquosas tamponadas podem ser aplicáveis: 10 a 250 mM de NaCl, 5 a 50 mM de Tris HCl, pH 5 a 8, com a adição opcional de cátions bivalentes e/ou quelantes metálicos e/ou detergentes não iônicos e/ou frações de membrana e/ou agentes anti-espuma e/ou cintilantes.

[00114] O termo “população” eomo usado aqui significa uma coleção de componentes tais como polinucleotídeos, porções ou polinucleotídeos ou proteínas. Uma “população mista” significa uma coleção de componentes que pertencem à mesma família de ácidos nucleicos ou proteínas (isto é, são relacionados) mas que difere em sua sequência (isto é, não são idênticos) e em consequência, em sua atividade biológica.

[00115] Uma molécula tendo uma “pró-forma” refere-se a uma molécula que sofre qualquer combinação de uma ou mais modificações químicas covalentes e não covalentes (por exemplo, glicosilação, clivagem /140 proteolítica, dimerização ou oligomerização, mudança conformacional induzida por temperatura ou induzida por pH, associação com um co-fator, etc.) na direção para ligar uma forma molecular mais madura tendo uam diferença de propriedade (por exemplo, um aumento na atividade) em comparação com a molécula pró-forma de referência. Quando duas ou mais modificações químicas (por exemplo, duas clivagens proteolíticas ou uma clivagem proteolítica e uma desglicosilação) podem ser distinguidas na direção da produção de uma molécula madura, a molécula precursora de referência pode ser denominada uma moléeula “pré-pró-forma” [00116] Uma “propriedade” pode deserever qualquer earaeterístiea, incluindo uma propriedade física, química ou de atividade característica de uma proteína ou anticorpo a ser otimizado. Por exemplo, em certos aspectos, a propriedade, característica ou atividade predeterminada a ser otimizada podem ser selecionados de redução de agregação de proteína-proteína, intensificação da estabilidade de proteína, solubilidade de proteína aumentada, estabilidade de pH de proteína aumentada, estabilidade de temperatura de proteína aumentada, estabilidade de solvente e proteína aumentada, seletividade aumentada, seletividade diminuída, introdução de locais de glicosilação, introdução de locais de conjugação, redução de imunogenicidade, intensificação de expressão de proteína, aumento na afinidade de antígeno, diminuição na afinidade de antígeno, mudança na afinidade de ligação, mudança na imunogenicidade, mudança na atividade catalítica, otimização de pH ou intensificação de especificidade. Uma propriedade “otimizada” refere-se a uma mudança desejável em uma propriedade particular em uma proteína, anticorpo ou célula mutantes em comparação com uma proteína, anticorpo ou célula padrão, respectivamente.

[00117] Como usado aqui, o termo “pseudoaleatório” refere-se a um conjunto de sequências que têm variabilidade limitada, tal que, por exemplo, o grau de variabilidade de resíduo em uma outra posição, mas qualquer / 140 posição pseudoaleatória é deixada em algum grau de variação de resíduo, entretanto circunscrito.

[00118] “Unidades quase repetidas”, eomo usado aqui, refere-se às repetições a serem re-agrupadas e são, por definição, não idênticas. De fato, o método é proposto não apenas para unidades de codificação praticamente idênticas produzidas pela mutagênese de sequência inicial idêntica, mas também a redisposição de sequências similares ou relacionadas que podem divergir de maneira significante em algumas regiões. Entretanto, se as sequências contiverem homologias suficientes a serem redispostas por este método, estes podem ser referidos eomo unidades “quase-repetidas” [00119] Como usado aqui “biblioteea de peptídeo aleatória” refere-se a um conjunto de sequências de polinucleotídeo que codificam um conjunto de peptídeos aleatórios e para o conjunto de peptídeos aleatórios codificados por aquelas sequências de polinucleotídeo, bem como as proteínas de fusão contêm aqueles peptídeos aleatórios.

[00120] Como usado aqui, “sequêneia de peptídeo aleatória” refere-se a uma sequência de aminoácido composta de dois ou mais monômeros de aminoácido e podem ser construídos por um processo estocástico ou aleatório. Um peptídeo aleatório pode incluir motivos de estrutura ou armação, que podem compreender sequências invariantes.

[00121] Como usado aqui, “reeeptor” refere-se a uma molécula que tenha uma afinidade para um dado ligante. Os receptores podem ser moléculas de ocorrência natural ou sintética. Os receptores podem ser utilizados em um estado inalterado ou como agregados com outras espécies. Os receptores podem ser ligados de maneira não covalente ou covalente, a um membro de ligação, diretamente ou por intermédio de uma substância de ligação específica. Os exemplos de receptores incluem, mas não são limitados a, anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e anti-soros reativos com determinantes antigênicos específicos (tais como em vírus, células ou outros / 140 materiais), os receptores de membrana celular, carboidratos complexos e glicoproteínas, enzimas e receptores de hormônio.

[00122] Proteínas “reeombinantes” referem-e a proteínas produzidas por técnicas de DNA recombinantes, isto é, produzidas a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógena que codifica a enzima desejada. As proteínas “sintétieas” são aquelas preparadas pela síntese química.

[00123] O termo “polinueleotídeos relaeionados” signifiea aquelas regiões ou áreas dos polinucleotídeos que são idênticos e regiões ou áreas dos polinucleotídeos são heterólogos.

[00124] “Redisposição redutora”, eomo usado aqui, refere-se ao aumento na diversidade molecular que resulta através de eventos de deleção (e/ou inserção) que são mediados por sequências repetidas.

[00125] Os seguintes termos são usados para descrever as relações de sequêneia entre dois ou mais polinueleotídeos: “sequêneia de referêneia”, “janela de eomparação”, “identidade de sequêneia”, “porcentagem de identidade de sequêneia” e “identidade substaneial.” [00126] A “sequêneia de referêneia” é uma sequêneia definida usada como uma base para uma comparação de sequência; a sequência de referência pode ser uma sub-conjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de um DNA de comprimento total ou sequência genética dada em uma listagem de sequência ou pode compreender uma sequência de cDNA ou genética completa. Em geral, a sequência de referência é de pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento, frequentemente pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento e frequentemente pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento. Visto que dois polinucleotídeos podem, cada um (1) compreender uma sequência (isto é, uma porção da sequência de polinucleotídeo completa) e é similar entre os dois polinucleotídeos e (2) ainda podem compreender uma sequência que é divergente entre os dois polinucleotídeos, comparações de / 140 sequência entre dois (ou mais) polinucleotídeos são, tipicamente, realizados pelas sequências de comparação dos dois polinucleotídeos em uma “janela de comparação” para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência.

[00127] “índice repetitivo (Rí)”, como usado aqui, é o número médio de cópias das unidades quase-repetidas contidas no vetor de clonagem.

[00128] O termo “saturação” refere-se a uma técnica de evolução em que cada mudança possível é feita em cada posição de um polinucleotídeo padrão ou polipeptídeo padrão; entretanto, a mudança em cada posição não é confirmada por teste, mas meramente assumiu estatisticamente que a maioria de mudanças possíveis ou quase toda mudança possível é estimada ocorrer em cada posição de um padrão.

[00129] O termo “identidade de sequência” significa que duas sequências de polinucleotídeo são idênticas (isto é, em uma base de nucleotídeo-por-nucleotídeo) na janela de comparação. O termo “porcentagem de identidade de sequência” é calculado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas na janela de comparação, determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ocorre em ambas as sequências para a produção do número de posições comparadas, dividindo o número de posições comparadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela) e multiplicação do resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Esta “identidade substancial”, como usado aqui, indica uma característica de uma sequência de polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência tendo pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 85 por cento de identidade, frequentemente de 95 por cento de identidade de sequência e mais comumente de pelo menos 99 por cento de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência de / 140 uma janela de comparação de pelo menos 25 a 50 nucleotídeos, em que a porcentagem de identidade de sequência é calculada pela comparação da sequência de referência à sequência de polinucleotídeo que pode incluir anulações ou adições cujo total de 20 por cento ou menos da sequência de referência na janela de comparação.

[00130] O termo “mutação silenciosa” refere-se a uma mudança de códon que não resulta em uma mudança de aminoácido em um polipeptídeo expressado e é fundamentado na redundância do uso de códon para a inserção de aminoácido.

[00131] Como conhecido na técnica a “similaridade” entre duas enzimas é determinada pela comparação da sequência de aminoácido e de seus substitutos de aminoácido conservados de uma proteína para a sequência de uma segunda proteína. A similaridade pode ser determinada pelos procedimentos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, um programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool no National Center for Biological Information).

[00132] Como usado aqui, o termo “anticorpo de cadeia simples” refere-se a um polipeptídeo compreendendo um domínio VH e um domínio VL na ligação de polipeptídeo, em geral, ligado por intermédio de um peptídeo espaçador (por exemplo, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]X) e que pode compreender sequências de aminoácido adicionais nos terminais amino e/ou carbóxi. Por exemplo, um anticorpo de cadeia simples pode compreender um segmento limite para a ligação de acordo com o polinucleotídeo codificador para a ligação ao polinucleotídeo codificador. Como um exemplo, um scFv é um anticorpo de cadeia simples. Os anticorpos de cadeia simples são, em geral, proteínas que consistem de um ou mais segmentos de polipeptídeo de pelo menos 10 aminoácidos contíguos substancialmente codificados por genes da superfamília de imunoglobulina (por exemplo, ver Williams and Barclay, 1989, pp. 361-368, que é incorporado aqui por referência), mais / 140 frequentemente codificado por uma sequência genética de cadeia pesada ou de cadeia leve de roedor, primata não humano, ave, porcino, bovino, ovino, cabra. Um anticorpo de cadeia simples funcional, em geral, contém uma porção suficiente de um produto de gene da superfamília de imunoglobulina a fim de reter a propriedade de ligação a uma molécula alvo específica, tipicamente um receptor ou antígeno (epítopo).

[00133] Os membros de um par de moléculas (por exemplo, um antígeno de anticorpo ou um par de áeido nueleieo) são ditos “ligar espeeifieamente” um ao outro se estes ligarem-se um ao outro com afinidade maior do que as outras moléculas não específicas. Por exemplo, um anticorpo promovido contra um antígeno que liga-se mais eficientemente do que a uma proteína não específica pode ser descrito como ligação específica ao antígeno. (Similarmente, uma sonda de ácido nucleico pode ser descrita como ligação específica a um alvo de ácido nucleico se este formar um duplex específicos com o alvo por interações em pares de base (ver acima).

[00134] “Hibridização espeeífiea” é definida aqui eomo a formação de híbridos entre um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência distinta mas substancialmente idêntica ao primeiro polinucleotídeo), em que sequências de polinucleotídeo substancialmente não relacionadas não forma híbridos na mistura.

[00135] O termo “polinueleotídeo espeeífieo” signifiea um polinucleotídeo tendo certos pontos finais e tendo uma certa sequência de ácido nucleico. Dois polinucleotídeos em que um polinucleotídeo tem a sequência idêntica como uma porção do segundo polinucleotídeo mas as extremidades diferentes compreendem dois polinucleotídeos específicos diferentes.

[00136] As “eondições de hibridização estringentes” signifiea que a hibridização ocorrerá apenas se houver pelo menos 90 % de identidade, preferivelmente pelo menos 95 % de identidade e mais preferivelmente pelo / 140 menos 97 % de identidade entre as sequências. Ver Sambrook et al., 1989, que é incorporado desse modo, por referência, em sua totalidade.

[00137] Também estão incluídos na invenção polipeptídeos tendo sequências que são “substancialmente idênticas” à sequência de um polipeptídeos, tal como uma de qualquer SEQ ID N° descrita neste. uma sequência de aminoácido “substaneialmente idêntica” é uma sequência que difere da sequência de referência apenas por substituições de aminoácido conservativas, por exemplo, substituições de aminoácido por um outro da mesma classe (por exemplo, substituição de aminoácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina, por um outro ou substituição de um aminoácido polar por um outro, tal como substituição de arginina no lugar de lisina, ácido glutâmico no lugar de ácido aspártico ou glutamina no lugar de asparagina).

[00138] Adicionalmente uma sequência de aminoácido “substancialmente idêntica” é uma sequência que difere da sequência de referência ou por uam ou mais substituições, anulações ou inserções não conservativas, particularmente quando uma tal substituição ocorre em um local que não o local ativo da molécula contanto que o polipeptídeo essencialmente retém suas propriedades comportamentais. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser anulados a partir de um polipeptídeo de fitase, que resulta na modificação da estrutura do polipeptídeo, sem alterar significantemente sua atividade biológica. Por exemplo, aminoácidos de terminal amino ou carboxila que não são requeridos para a atividade biológica de fitase podem ser removidos. Tais modificações podem resultar no desenvolvimento de polipeptídeos de fitase ativos menores.

[00139] A presente invenção fornece uma “enzima substancialmente pura”. O termo “enzima substancialmente pura” é usada aqui para descrever uma molécula, tal com um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo de fitase ou um fragmento destes) que é substancialmente isento de outras proteínas, lipídeos, carboidratos, ácidos nucleicos e outros materiais / 140 biológicos com os quais este está naturalmente associado. Por exemplo, uma molécula substancialmente pura, tal como um polipeptídeo, pode ser de pelo menos 60 %, em peso seco, a molécula de interesse. A pureza dos polipeptídeos podem ser determinadas usando-se métodos padrão incluindo, por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida (por exemplo, SDS-PAGE), cromatografia de coluna (por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e análise de sequência de aminoácido de terminal amino.

[00140] Como usado aqui, “substaneialmente puro” significa uma espécie de objetivo que é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar que é mais abundante do que qualquer outra espécie macromolecular individual na composição) e preferivelmente fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie de objetivo compreende pelo menos cerca de 50 por cento (em uma base molar) de todas as espécies macromolares presentes. Em geral, uma composição substancialmente pura compreenderá mais do que cerca de 80 a 90 por cento de todas as espécies macromolares presentes na composição. Mais preferivelmente, a espécie de objetivo é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente de uma espécie macromolecular simples. As espécies de solvente, moléculas pequenas (<500 Daltons) e espécies iônicas elementares não são consideradas espécies macromoleculares.

[00141] Como usado aqui, “oligopeptídeo padrão” significa uma proteína para a qual uma biblioteca secundária de variantes é desejada. Como será estimado por aqueles habilitados na técnica, qualquer número de padrões encontra uso na presente invenção. Especificamente incluído dentro da definição de “proteínas” ou “oligopeptídeos” são fragmentos e domínios de proteínas conhecidas, incluindo domínios funcionais, tais como domínios enzimáticos, domínios de ligação, etc e fragmentos menores, tais como / 140 revoluções, arcos, etc. Isto é, porções de proteína também podem ser usadas.

Além disso, “proteína” eomo usado aqui inclui proteínas, oligopeptídeos e peptídeos. Além disso, as variantes de proteína, isto é, estruturas análogas de proteína de ocorrência não natural, podem ser usadas.

[00142] As proteínas adequadas incluem, mas não são limitadas a proteínas industriais e farmacêuticas, incluindo ligantes, receptores de superfície celular, antígenos, anticorpos, citocinas, hormônios, fatores de transcrição, módulos de sinalização, proteínas e enzimas citoesqueletais. As classes adequadas de enzimas incluem, mas não limitam-se a, hidrolases, tais como proteases, carboidrases, lipases; isomerases, tais como racemases, epimerases, tautomerases ou mutases; transferases, cinases, oxidoredutases e fosfatases. As enzimas adequadas são listadas no banco de dados de enzima Swiss-Prot. As cadeias principais de proteína adequadas incluem, mas não são limitadas a todas aquelas encontradas nos bancos de dados de proteína compilados e trabalhados pelo Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB, formerly the Brookhaven National Lab).

[00143] Como usado aqui, o termo “segmento variável” refere-se a uma porção do peptídeo nascente que compreende uma sequência de núcleo aleatório, pseudoaleatório ou definido. A “segmento variável” refere-se a uma porção do peptídeo nascente que compreende uma sequência de núcleo aleatório, pseudoaleatório ou definido. Um segmento variável pode compreender posições de resíduo tanto variantes quanto invariantes e o grau de variação de resíduo em uma posição de resíduo variante pode ser limitado: ambas as opções são selecionadas na discrição do técnico. tipicamente, os segmentos variáveis são de cerca de 5 a 20 resíduos de aminoácido de comprimento (por exemplo, 8 a 10), embora os segmentos variáveis possam ser mais longos e possam compreender porções de anticorpo ou proteínas receptoras, tal como um fragmento de anticorpo, uma proteína de ligação de ácido nucleico, uma proteína receptora e outros.

/ 140 [00144] O termo “tipo selvagem”, significa que o polinucleotídeo não compreende quaisquer mutações. Uma proteína “tipo selvagem” significa que a proteína será ativa em um nível de atividade encontrado na natureza e compreenderá a sequência de aminoácido em estado natural.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00145] A descrição fornece um método de integrar proteína terapêutica (incluindo anticorpos) geração e/ou seleção, evolução e expressão em um hospedeiro mamífero para a fabricação de um sistema simples. Em uma forma de realização do método CIAO, as proteínas terapêuticas, incluindo anticorpos, são geradas, otimizadas e fabricadas no mesmo sistema de hospedeiro mamífero. Em uma outra forma de realização, os produtos terapêuticos de proteína são descobertos e fabricados no mesmo hospedeiro. Este otimiza a fabricação a partir dos custos de economia muito iniciais (tempo e recursos).

[00146] Historicamente, a descoberta de anticorpos foi realizada em hospedeiros eucarióticos (euk) e procarióticos (prok). Tipicamente, em bactérias (E.coli), os anticorpos de comprimento parcial são descobertos; por exemplo, nas tecnologias de exibição de fago, os Fabs são recuperados e algumas vezes convertidos a jusante de comprimento total. Existem diversas desvantagens potenciais para estes métodos.

[00147] Em um exemplo, existe alguma evidência que as regiões Fc e Fv comunicam-se para realizar as propriedades do anticorpo, tais como ligação e expressão. Portanto, quando um fragmento de anticorpo é otimizado para uma propriedade tal como expressão, a melhora nem sempre traduz a expressão melhorada no anticorpo montado de comprimento total. Por exemplo, uma biblioteca de Fc's foi criada nas tentativas de encontra Fc “santo gral” que pode ser ligado a qualquer Fv para melhorar a expressão em qualquer hospedeiro.

[00148] Em um aspecto, a mutagênese de códon foi realizada na / 140

Região Constante para a otimização de expressão de célula de mamífero. Especificamente 326 foram criados na região constante e expressados em células HEK 293 e CHO-S. A triagem foi realizada por ELISA. Diversos Fc's satisfazem os critérios de expressão melhorada e certos Fc's otimizados ainda foram identificados transferindo efeitos positivos através de linhagens celulares múltiplas; entretanto, quando um Fv diferente foi ligado ao Fc, a melhora na expressão não se traduziu. Isto demonstra que os Fc's e Fv's comunicam-se.

[00149] A fim de evitar resultados inesperados na recombinação de fragmentos de anticorpo, em um aspecto preferido, o método CIAO é usado para descobrir as moléculas de anticorpo de comprimento total. Em um outro aspecto preferido, o método CIAO utiliza hospedeiros euk.

[00150] Em uma forma de realização, o sistema eucariótico é um sistema de mamífero é selecionado de um do grupo que consiste de linhagens celulares CHO, HEK293, IM9, DS-1, THP-1, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MMl, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDA-MB-468, LnCAP, NRK-49F e SP2/0 e esplenócitos de camundongo e PBMC de coelho. Em um aspecto, o sistema de mamífero é selecionado de uma linhagem celular de CHO ou HEK293. Em um aspecto específico, o sistema mamífero é uma linhagem de célula CHO-S. Em um outro aspecto específico, o sistema mamífero é uma linhagem celular HEK293. Em uma outra forma de realização, o sistema eucariótico é um sistema de célula de levedura. Em um aspecto, o sistema eucariótico é selecionado de células de levedura S. cerevisiae ou células de levedura picchia.

[00151] Em uma outra forma de realização, a criação de linhagem celular de mamífero pode ser realizada comercialmente por uma pesquisa contratada ou organização e fabricação de costume. Por exemplo, para / 140 anticorpos recombinantes ou outras proteínas, Lonza (Lonza Group Ltd,

Basel, Suíça) pode criar vetores para expressar produto usando-se a tecnologia GS Gene Expression System™ em linhagens de célula hospedeira

CHOK1SV ou NSO.

[00152] Em uma outra forma de realização, a evolução pode ser realizada em hospedeiros prok (tais como E.coli) e as triagens podem ocorrer em hospedeiros euk (por exemplo, CHO), de modo que a triagem ocorre no mesmo hospedeiro como o hospedeiro de fabricação.

Seleção de Proteínas Candidatas Precedentes [00153] Uma variedade de métodos pode ser usada para descobrir, gerar e/ou selecionar um ou mais candidatos de proteína terapêutica a serem evoluídos. As moléculas selecionadas podem ser proteínas recombinantes existentes ou podem vir de coleções de proteínas recombinantes, incluindo enzimas, hormônios e anticorpos. As proteínas terapêuticas podem incluir enzimas humanas clonadas e hormônios. Os anticorpos recombinantes podem ser descobertos usando-se qualquer número de geração e plataformas de triagem disponíveis. Os anticorpos podem estar em qualquer forma, incluindo anticorpos de cadeia simples, totalmente humanos, Fab, Fv, Fc, bifuncionais, quiméricos, humanizados ou totalmente humanos ou fragmentos destes. Em um aspecto preferido, o método CIAO é usado para descobrir as moléculas de anticorpo de comprimento total. As bibliotecas de anticorpos recombinantes podem ser gerados e triados usando-se sistemas de seleção ou de triagem em hospedeiros mamíferos otimizados ou não otimizados para produzir candidatos para a evolução. Diversos sistemas de expressão eucariótica são publicados, por exemplo, sistemas de célula de mamífero ou de levedura.

[00154] No método da presente invenção, tais sistemas de expressão de mamífero, em sistemas particulares usando-se a exibição de superfície celular de moléculas para a triagem e seleção, são utilizados para identificar e selecionar os candidatos para a fabricação ou evolução seguido pela / 140 fabricação. Preferivelmente, tais hospedeiros mamíferos são células de Fibroblasto (3T3, camundongo; BHK21, hamster sírio) células epiteliais (MDCK, cão; Hela, humano; PtKl, canguru trato) células de plasma ((SP2/0 e NSO, camundongo) células renais (293, humano; COS, macaco) células de ovário (CHO, hamster chinês) células embriônicas (R1 e E14.1, camundongo; H1 e H9, humano; PER C.6, humano). A tecnologia de exibição de superfície celular é utilizada para exibir proteínas na superfície de células de mamífero para a triagem. As proteínas são clonadas como fusões com moléculas de membrana que quando expressadas exibem as proteínas na superfície das células para a triagem de resposta alta rápida, por exemplo.

[00155] Em certas concretizações, a descrição fornece um método de fornecer um anticorpo otimizado. Em uma forma de realização, um antígeno é selecionado e uma biblioteca de anticorpo humano é gerada e expressada em um sistema de mamífero, por exemplo, células de CHO-S. A biblioteca é triada para identificar acertos de anticorpo totalmente humano, por exemplo, pela classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Os acertos de anticorpo totalmente humanos são então, ainda triados/caracterizados por qualquer ensaio relevante, por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada. Em um aspecto, as moléculas evoluídas são triadas quanto a características múltiplas simultaneamente, por exemplo, função e expressão melhoradas. O ensaio relevante pode compreender, por exemplo, ELISA, ou uma tecnologia de estrutura ordenada. Um anticorpo padrão é selecionado dos acertos de anticorpo humano. Qualquer método devolução é realizado no anticorpo padrão ou um polipeptídeo de fragmento deste, para a preparação de um conjunto de anticorpos mutantes. Em um aspecto, a evolução é realizada por um método de projeto de proteína compreensiva para a produção do conjunto de anticorpos mutantes. O método de projeto de proteína compreensiva pode ser selecionado, por exemplo, a partir de uma combinação de Evolução posicional compreensiva (CPE^TM), Síntese de / 140 proteína compreensiva (CPS™), Evolução Flexível, Evolução por sinergia,

Evolução de inserção posicional compreensiva (CPI™) ou Evolução de deleção posicional compreensiva (CPD^TM). Em um outro aspecto, os anticorpos mutantes são expressados no mesmo sistema de mamífero usado para a geração da biblioteca de anticorpo humano.

[00156] O conjunto de anticorpos mutantes são caracterizadas/triadas por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada. Em um aspecto, o conjunto de anticorpos mutantes é triada simultaneamente, por exemplo, para a função e para a expressão melhoradas. Em um aspecto, um banco de dados específico de molécula na forma de um mapa de posição funcional (um EvoMap^TM) é usado para a otimização adicional por uma ou mais técnicas de evolução de proteína conhecidas na técnica; seguido por identificação e caracterização de mutantes ativados. Um anticorpo otimizado é selecionado pela comparação com o anticorpo padrão com respeito a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada.

[00157] Em um aspecto, a expressão em escala gram do anticorpo otimizado selecionado é realizado; seguido por toxicologia sem GLP. A transfecção de linhagem celular estável, desenvolvimento de processo e geração de uma Master Cell Bank é realizado. A fabricação de GMP é realizada no mesmo sistema de mamífero usado para a geração da biblioteca de anticorpo humano, por exemplo, células CHO-S, que resultam em um mABs recombinante terapêutico otimizado.

[00158] Em uma outra forma de realização, o método CIAO começa a partir da seleção de um hibridoma padrão ou anticorpo recombinante; evolução do anticorpo para fornecer um conjunto de anticorpos mutantes que são triados pelo uso de exibição de superfície celular de anticorpo em um sistema de célula de mamífero e a fabricação é realizada no mesmo sistema de célula de mamífero usado para a triagem.

[00159] Em uma outra forma de realização, o anticorpo de / 140 hibridoma/recombinante padrão é humanizado e triado no hospedeiro de fabricação, seguido pela produção no hospedeiro de fabricação, em que a etapa de otimização (evolução) é omitida completamente.

[00160] Em outros aspectos da presente invenção, a otimização de expressão a jusante nos hospedeiros de fabricação é realizada evoluindo-se a região Fc do anticorpo, os códons silenciosos no anticorpo e/ou o vetor e/ou genes hospedeiros usados na expressão de proteína. Em um aspecto, uma biblioteca de Fc é gerada por qualquer técnica evolucionária. Em um aspecto específico da otimização de expressão, o CPE é transformado no domínio Fc de um anticorpo para a criação de uma biblioteca de mutantes Fc que podem ser usados para selecionar um parceiro ótimo para qualquer Fv. A otimização é projetada para a ligação rápida de todas as variantes Fc CPE a cada nova região de Fv. Alternativamente, um subconjunto dos mesmos Fcs pode ser usada para a ligação de Fvs diferentes. Cada uma destas combinações de Fc CPE variante/Fv é triada como um anticorpo de comprimento total em células de mamífero (por exemplo CHO, média efetiva de custo) para a expressão ótima. Além disso, o CPS pode ser realizado para triar todas as permutas teóricas de até 12 ou mais destes acertos de CPE nas células de mamífero para a melhora de expressão. As mudanças de códon desejáveis específicas também podem ser selecionadas para identificar os clones com a expressão aumentada. Os códons silenciosos são identificados e o CPE é realizado nestes posições. Esta biblioteca de CPE é triada para identificar os acertos de expressão ótima. Além disso, todas as permutas teóricas de até 12 ou mais acertos de CPE podem ser usados no processo de CPS para a geração de uma nova biblioteca que pode ser triada em células de mamífero para a melhora de expressão. Os acertos de mutação silenciosa de CPS superior são usados para customizar a proteína para a expressão ótima em uma linhagem e meio celular específicos. Isto fornece a oportunidade quanto ao controle de estrutura fina biossimilar.

/ 140 [00161] Outras áreas para a intensificação de expressão incluem: otimização do vetor, incluindo promotor, locais de união, terminais 5’ e 3’, sequências de flanqueamento, redução de deleção e redisposição de gene, melhora das atividades de gene de célula hospedeira, otimização de enzimas glicosilantes de hospedeiro e mutagênese e seleção de célula hospedeira de cromossomo amplo. Foi demonstrado que as sequências de aminoácido 5' são importantes para a intensificação da expressão.

Evolução de candidatos precedentes [00162] Qualquer método de evolução de proteína pode ser utilizado para a evolução simultânea de otimização do desempenho e expressão de proteína. A otimização do desempenho de proteína pode inclui a melhora de várias características, tais como afinidade, características farmacocinéticas, alvejamento de tecido, agregação de proteína-proteína, tratar a variabilidade de ensaio alta e modificar outras características in vivo.

[00163] Os métodos para evoluir as moléculas, incluindo os candidatos selecionados da presente invenção, incluem métodos estocásticos e não estocásticos. Os métodos publicados incluem métodos de mutagênese aleatórios e não aleatórios. Qualquer um destes métodos pode ser utilizado para evoluir as propriedades das proteínas terapêuticas da presente invenção com relação a uma característica desejada, tal como estabilidade menor em temperatura diferente ou ambientes de pH ou expressão melhor em uma célula hospedeira. Outras propriedades potencialmente desejáveis, tais como atividade catalítica melhorada, estabilidade de proteína melhorada em várias condições, os resultados e seletividade e/ou expressão melhoradas e de expressão melhorada pela melhora de características, tais como agregação reduzida podem ser selecionados para os experimentos de evolução.

[00164] A evolução é realizada diretamente em um hospedeiro eucariótico, tal como um hospedeiro de célula de mamífero ou um hospedeiro de célula de levedura, que será usado para a produção a jusante a proteína / 140 terapêutica. Os candidatos podem ser evoluídos para a expressão ótima no mesmo hospedeiro usado para triagem e/ou evolução e para a fabricação. A otimização da expressão pode ser atingida pela otimização dos vetores usados (componentes de vetor, tais como promotores, locais de união, terminais 5' e 3' e sequências de flanqueamento), a modificação genética para a redução das anulações e redisposições genéticas, evolução das atividades genéticas de célula hospedeira por métodos in vivo ou in vitro de evolução de genes relevantes, otimização de enzimas de glicosilação de hospedeiro pela evolução de genes relevantes e/ou pela mutagênese de célula hospedeira de cromossomo amplo e estratégias de seleção para selecionar as células com capacidades de expressão intensificadas. As células hospedeiras ainda são descritas aqui.

[00165] A tecnologia de expressão e triagem de exibição de superfície celular (por exemplo, como definido acima) pode ser utilizada para triar as bibliotecas de proteínas evoluídas para candidatos a serem fabricados.

[00166] Os métodos correntes em uso difundido para a criação de proteínas alternativas para uma molécula de partida são tecnologias de mutagênse direcionadas ao oligonucleotídeo, cadeia de polimerase propensa ao erro e mutagênese de cassete, em que a região específica a ser otimizada é substituída por um oligonucleotídeo sinteticamente mutageneizado. Nestes casos, diversos locais de mutantes são gerados em torno de certos locais na sequência original.

[00167] Na mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, uma sequência curta é substituída por um oligonucleotídeo sinteticamente mutageneizado. O PCR propenso ao erro usa condições de polimerização de fidelidade baixa para a introdução de um nível baixo de mutaçõesde ponto aleatoriamente em uma sequência longa. Em uma mistura de fragmentos de sequência desconhecida, o PCR propenso ao erro pode ser usado para mutageneizar a mistura. Na mutagênese de cassete, um bloco de sequência de um padrão simples é tipicamente substituído por uma sequência aleatorizada / 140 (parcialmente).

[00168] Os genes quiméricos foram feitos pela união de 2 fragmentos de polinucleotídeo usando-se extremidades adesivas compatíveis geradas por enzimas de restrição, onde cada fragmento é derivado de uma molécula progenitora separada (ou precursora). Um outro exemplo é a mutagênese de uma posição de códon simples (isto é, para atingir uma substituição, adição ou deleção de códon) em um polinucleotídeo precursor para a geração de um polinucleotídeo de progênie simples que codifica quanto a um polipeptídeo mutageneizado de local simples.

[00169] Além disso, os sistemas de recombinação específicos de local in vivo foram utilizados para a geração de híbridos de genes, bem como métodos aleatórios e recombinação in vivo e recombinação homóloga, mas genes truncados em um plasmídeo. A mutagênese também foi relatada pela extensão de sobreposição e PCR.

[00170] Os métodos não aleatórios foram usados para atingir números maiores de mutações de ponto e/ou quimerizações, por exemplo, métodos compreensivo ou exaustivos foram usados para gerar todas as espécies moleculares dentro de um agrupamento particular de mutações, para atribuir a funcionalidade a grupos estruturais específicos em uma molécula padrão (por exemplo, uma posição de aminoácido simples específico ou uma sequência compreendida de duas ou mais posições de aminoácido) e para categorizar e comparar os agrupamentos específicos de mutações. Patente U. S. Número 7033781 intitulada “Projeto de eélula total por mutageneização de uma porção substancial de um genoma de partida, combinar mutações e, opcionalmente, repetição” desereve um método de evoluir um organismo em torno das características desejadas. Patente U. S. Número 6764835 intitulada “Mutagênese de saturação na evolução direeionada” e Patente U. S. Número 6562594 intitulada “Reagrupamento de ligação sintétiea na evolução direeionada” desereve métodos de evoluir e triar exaustivamente quanto a / 140 características desejadas de moléculas. Quaisquer tais métodos podem ser usados no método da presente invenção.

[00171] Existe uma diferença entre os métodos previamente conhecidos de “mutagênese de saturação” e técnicas de evolução “compreensiva” preferidas aqui. A mutagênese de saturação refere-se a uma técnica de evolução em que cada mudança possível é feita em cada posição de um polinucleotídeo padrão ou polipeptídeo padrão; entretanto, a mudança em cada posição não é confirmada por teste, mas, simplesmente, assumida de maneira estatística. A evolução compreensiva refere-se a uma técnica de evolução em que cada mudança possível é feita em cada posição de um polinucleotídeo padrão ou polipeptídeo padrão e o polinucleotídeo ou polipeptídeo é testado para confirmar se a mudança pretendida foi realizada.

[00172] Os métodos de saturação são inerentemente estatísticos, os métodos não compreendidos nunca foram totalmente compreensivos através de todas as etapas (por exemplo, através da geração de mutante, expressão de proteína mutante, triagem de proteína mutante e geração mutante ativada recombinada, identificação, expressão e triagem). Nas técnicas de evolução compreensivas, cada molécula é triada e confirmada tanto na primeira etapa de mutagênese quanto em uma segunda etapa de recombinação dos mutantes ativados ou acertos.

[00173] A não ser que a mutagênese de saturação seja confirmada pelo sequenciamento ou por algum outro método, a técnica não pode ser considerada ser compreensiva por diversas razões possíveis. Por exemplo, 1) o sistemas de clonagem não são 100 % eficientes devido aos erros de clonagem ou de síntese ou difícil para clonar moléculas ou 2) algumas proteínas são tóxicas quando expressadas e desta maneira, não pode ser eficientemente expressada. Portanto, é importante a confirmação por sequenciamento ou algumas outras técnicas, em cada etapa. E útil registrar cada etapa a fim de triar quanto à expressão, de modo que a não expressão de / 140 clones não seja designada eomo “negativa” eomo no trabalho prévio, estes logo são registrados como não expressável. as técnicas compreensivas são, portanto, consideradas serem o sistema não estocástico mais puro do que as técnicas de saturação, eomo confirmado pela etapa de “confirmação”.

Evolução posicionai compreensiva [00174] Referindo-se à Figura 1, usando-se um peptídeo linear como um exemplo simples, em uma primeira etapa, um conjunto de variantes de aminoácido de ocorrência natural (ou um subconjunto dos mesmos ou derivados de aminoácido) para cada códon da posição 1 a n (n correspondendo ao número de resíduos na cadeia de polipeptídeo) é gerado por um processo referido aqui como Evolução posicional compreensiva (CPE^TM). Este procedimento é repetido para cada cadeia de polipeptídeo da molécula alvo. Um conjunto mínima de mutações de aminoácido contém apenas um códon para cada um dos 19 aminoácidos naturais. Entretanto, é reconhecido que cada sistema de expressão pode sofrer de desvio de códon, em que grupos de tRNA insuficientes tRNA podem levar à simulação de tradução, terminação de tradução prematura, mudança de estrutura de tradução e má incorporação de aminoácido. Portanto, para a otimização da expressão, cada conjunto contém até 63 códons diferentes, incluindo códons de interrupção. Na etapa a seguir, as mutações confirmadas pelo sequenciamento de cada nova molécula. Outros métodos de confirmação também podem ser utilizados.

[00175] Cada conjunto de aminoácido é então triado quanto a pelo menos um de:

Função melhorada

- Mutações Neutras

- Mutações inibidoras

- Expressão

- Compatibilidade do clone com o sistema de hospedeiro.

/ 140 [00176] Preferivelmente, as características múltiplas são triadas de maneira simultânea, tais como, por exemplo, função e expressão melhoradas.

[00177] Os dados para cada conjunto são combinados para as cadeias de polipeptídeo totais e um mapa funcional detalhado (referido aqui como um EvoMap^TM) da molécula alvo é gerado. Este mapa contém informação detalhada de como cada mutação afeta o desempenho/expressão e/ou capacidade de clonagem da molécula alvo. Isto permite a identificação de todos os locais onde nenhuma mudança pode ser feita sem a perda da função da proteína (por exemplo, ligação de antígeno/receptor no caso de anticorpos). Este também mostra onde as mudanças podem ser feitas sem afetar a função. Este ainda identifica as mudanças que resultam em moléculas que não expressam no sistema de hospedeiro e, portanto não estimam o efeito da mutação.

[00178] Um esquema de um EvoMap^TM hipotético é mostrado na Figura 1. Cada posição no padrão é identificada como um local restrito (não mutável), um local totalmente mutável, um local parcialmente mutável ou um mutante ativado para uma substituição de aminoácido específica. Cada local parcialmente mutável ainda pode ser projetado como responsável para a substituição com, por exemplo, um resíduo carregado ou uma substituição de resíduo não polar e um clone e/ou molécula sem expressão que não pode ser clonado no sistema de hospedeiro.

[00179] É possível utilizar o EvoMap^TM a fim de reconhecer e recombinar as substituições de aminoácido benéficas simples e triagem para ainda otimizar as características desejadas na molécula alvo. Entretanto, a evolução de certas características pode requerer que duas ou mais mutações simultâneas tornem-se observáveis. O EvoMap^TM pode ser explorado quanto à produção, eficiente e efetiva no custo, de um conjunto de polipeptídios mutante de local múltiplo de uma maneira não aleatória. O conjunto de polipeptídeos mutantes de local múltiplo podem ser então triados quanto a / 140 mutantes ativados de local múltiplo.

[00180] O CPE permite o mapa de mutação de proteína confirmada in vivo completo. A identificação do conjunto total de mutantes ativados permite as etapas de evolução combinatórias adicionais. O CPE pode ser utilizado a fim de reduzir o risco de imunogenicidade de proteínas evoluídas pela seleção de mutações que não de superfície; eliminação de epítopos de célula T e mimetismo de mutações somáticas.

[00181] Em um aspecto, o CPE pode ser usado para a geração de uma biblioteca de até 5, 10 ou 15 aminoácidos ou até todos os 19 aminoácidos. As mudanças são feitas em cada posição na proteína e triadas quanto a uma característica desejável, tais como afinidade de ligação ou expressão e o Evomap^TM é criado. Conjuntos posteriores de mutação e triagem podem ser usados para gerar os dados para todos os 19 aminoácidos. A partir do mapa, os locais totalmente mutáveis são identificados. Estes locais são úteis para identificar posições que podem ser modificadas para a criação de uma nova coleção de moléculas que podem ser feitas e testadas quanto a novas características. Por exemplo, informática pode ser utilizada para identificar os haplotipos podem se rutilizados para identificar os haplotipos HLA na sequência e as mudanças desejadas podem ser feitas para evitar que estes haplotipos pela realização de mudanças alvejadas específicas em locais “neutros” (“totalmente mutáveis”) identificados a partir do mapa, onde a característica primária não será afetada. Isto pode reduzir potencialmente o risco de imunogenicidade (pode-se selecionar mutações que não de superfície, eliminar os epítopos de célula t, imitação de mutações hipersomáticas). Além disso, o mapa pode mostrar locais para as modificações específicas de local (glicosilação e conjugação química) para melhorar várias características. Também, a otimização de mutações silenciosas por melhorar a expressão de proteína em uma variedade de hospedeiros.

Evolução de sinergia / 140 [00182] Em uma forma de realização da presente invenção, um EvoMap^TM é gerado e utilizado para a evolução de sinergia como mostrado na Figura 2. Na evolução de sinergia, a mutação simultânea em 2 a 20 locais selecionados pode ser combinada para a produção de um efeito combinatório. O EvoMap^TM do polipeptídeo padrão é usado para selecionar as mutações de ponto de aminoácido simples específico para montar as mutações de polipeptídeo de local múltiplo.

[00183] Na evolução de sinergia, as mutações de ponto de aminoácido não desativadoras são selecionadas de dentro de locais parcialmente mutáveis que estão próximos a locais não mutáveis no EvoMap^TM. Em um aspecto, as mutações de ponto não desativadoras selecionadas são adjacentes a locais não mutáveis. Na evolução de sinergia, a mutação simultânea de aminoácidos de 2 a 20 dos locais selecionados é realizada para efeitos combinatórios. Em um aspecto, a recombinação de 2 a 20 mutações selecionadas é usada para a produção de uma biblioteca variante de códon que codifica quanto a uma população de polipeptídeos mutantes de local múltiplo. Seguindo a clonagem e a expressão, os polipeptídeos mutantes de local múltiplo produzidos são então triados por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada em comparação com o polipeptídeo padrão. Desta maneira, os polipeptídeos mutantes ativados de local múltiplo podem ser identificados. Em um aspecto, polipeptídeos mutantes de local único são produzidos pela síntese de proteína combinatória. Uma vantagem de evolução de sinergia é que este não requer uma estrutura cristalina de raio x de proteína para direcionar a evolução do polipeptídeo padrão. Esta técnica á particularmente útil para proteínas com variação e ensaio alta e outros efeitos secundários múltiplos.

[00184] De acordo com a presente invenção, s aplicações de evolução de sinergia incluem, mas não são limitados à evolução de mudanças mecanísticas do complexo, evolução de proteínas com a variação de ensaio / 140 alto, evolução de especificidade de proteína, melhora da expressão em vários hospedeiros de expressão, melhora de atividade catalítica de proteína, estabilidade e otimização de pH. A evolução de sinergia é aplicável a todos os tipos de proteína terapêutica que incluem, mas não limitam-se a, hormônios, enzimas, citocinas e anticorpos.

[00185] Em um aspecto da presente invenção, a evolução de sinergia pode ser usada para otimizar um ou mais aspectos de um polipeptídeo que é uma porção de uma molécula de proteína. A molécula de proteína pode ser montada pela ligação de um ou mais ácidos nucleicos mutantes que codificam quanto a polipeptídeos com zero, um ou mais ácidos nucleicos que codificam quanto a polipeptídeos de estrutura para a criação de uma proteína variante pelas técnicas de clonagem, tradução e expressão conhecidas na técnica. Em um aspecto, o polipeptídeo de estrutura é derivado de uma molécula de proteína do tipo selvagem. Neste aspecto, a evolução de sinergia pode ser usada em conjunção com técnicas de humanização de anticorpo. Por exemplo, um anticorpo monoclonal de camundongo pode ser selecionado para a evolução e humanização. As regiões de CDR do anticorpo são clonadas e sequenciadas e as regiões de CDR individuais (CDR1, CDR2, CDR3) podem ser sintetizadas ou ligadas a outros nucleotídeos que codificam quanto a polipeptídeos de estrutura de anticorpo humano, seguido para a produção de uma biblioteca de IgG variante humana. A biblioteca de IgG variante humana é então triada quanto a pelo menos uma propriedade, por exemplo, duas ou mais propriedades incluindo função e expressão melhoradas, em comparação com o mAb de camundongo. Em um outro aspecto, o polipeptídeo de estrutura é um polipeptídeo de estrutura artificial. As técnicas específicas de preparação de fragmento de DNA, ligação e montagem de ácidos nucleicos, clonagem, transfecção, expressão, síntese de fase sólida de bibliotecas, síntese de fase de solução de bibliotecas, evolução posicional compreensiva, síntese de proteína combinatória, quantificação de expressão pela quantificação de / 140

ELISA e ensaio de β-galactosidase e ELISA funcional são exibidos na seção de exemplos.

[00186] Em uma outra forma de realização da invenção, evolução de sinergia pode ser usada para intensificar a afinidade de ligação de um anticorpo. Nesta forma de realização, a otimização da região variável de anticorpo pode se realizada. Por exemplo, para a produção de mutantes de anticorpo, CPE é realizado para regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de regiões variáveis de anticorpo selecionado e um EvoMap^TM é gerado. Os mutantes são selecionados para a remontagem; por exemplo, as variantes da cadeia leve são selecionadas e as variantes da cadeia pesada são selecionadas para a montagem. As mutações de ponto de aminoácido não desativadoras são selecionadas de dentro de locais parcialmente mutáveis que estão próximos a locais não mutáveis. A tecnologia de remontagem que utiliza CPS pode ser usada para a criação de uma biblioteca de cadeias pesadas. As variantes de cadeia leve podem ser combinadas com as variantes de cadeia pesada, clonadas, expressadas e as variantes são triadas como IgGs totais de sobrenadantes de linhagem celular eucariótica. A afinidade de ligação para certas variantes é estimada por, por exemplo, uso de ensaios de instrumentação ELISA, BIAcore e/ou Sapidyne ou outras técnicas conhecidas por uma pessoa habilitada na técnica.

Evolução Flex [00187] Em uma outra forma de realização, o CPE/EvoMap pode ser usado para identificar e explorar os locais totalmente mutáveis. Em um aspecto, a exploração de locais múltiplos totalmente mutáveis é denominado Evolução flex e é usado para realizar mudanças alvejadas tais como introdução de locais para a glicosilação (por exemplo, códons para aminoácidos para a glicosilação ligada por N ou O; Asn dentro da sequência de consenso Asn-Aa-Ser-Thr ou Ser/Thr) e conjugação química. A Evolução flex também pode ser usada no projeto de locais de clivage de protease, / 140 introdução de rótulos para purificação e/ou detecção, rotulação específica de local e outros. Além disso, a otimização de códon de mutações silenciosas pode ser utilizada para a melhora da expressão de proteína. Nesta forma de realização, a denominada Evolução Flex, seguindo a expressão de proteína, as bibliotecas de polipeptídeos mutantes produzidas são retriadas quanto a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada em comparação com o polipeptídeo padrão. Em um aspecto, a propriedade predeterminada inclui redução de agregação de proteína-proteína, intensificação da estabilidade de proteína ou solubilidade de proteína aumentada. Em um aspecto, as bibliotecas de polipeptídeo mutantes são triadas quanto a duas ou mais propriedades simultaneamente. Em um outro aspecto, qualquer sistema de expressão eucariótico que os glicosilados podem ser usados para a introdução de locais de glicosilação, tais como, por exemplo, linhagens celulares de mamífero, vegetal, levedura e inseto.

[00188] Na Evolução flex, a triagem de bioinformática e estruturas cristalinas de raio x de proteína de proteínas relacionadas ou a proteína ou polipeptídeo padrão, é útil para a otimização padrão. Em um aspecto, os locais selecionados não estão em resíduos de contato. Em um outro aspecto, a seleção de mutações de proteína que não de superfície permitem o risco de imunogenicidade reduzida.

[00189] As aplicações de Evolução flex incluem, mas não se limitam à redução de agregação de proteína-proteína, melhora de solubilidade de proteína, otimização de farmacocinética por intermédio das bibliotecas de glicosilação, otimização de estrutura secundária e terciária de proteína e desimunização de locais antigênicos diretamente por intermédio dos conjuntos de mutação ou indiretamente através da dissimulação de glicosilação.

[00190] Em um aspecto da Evolução flex, um EvoMap^TM é utilizado para identificar locais totalmente mutáveis, a geração de CPS é realizada com / 140 a inserção de resíduos de glicosilação a locais totalmente mutáveis (ou mutações silenciosas para efeitos de tradução) e triagem de biblioteca glicosilada combinatória é realizada pela análise analítica (por exemplo análise de espectroscopia de massa, dispersão de luz dinâmica), redução de imunogenicidade (por bioinformática ou ensaio) e/ou análise de farmacocinética (por exemplo em camundongos Foxn1nu).

[00191] Em um aspecto, a evolução Flex pode ser usada para a desimunização para eliminar a imunogenicidade enquanto mantém-se a função. A desimunização por Evolução flex pode ser realizada pela dissimulação da imunogenicidade com glicosilação, identificação das substituições de aminoácido de espectros de mutação hipersomática humanos que podem eliminar a imunogenicidade enquanto mantém-se a função, redução de dose para evasão do potencial de imunogenicidade e minimização de mudanças de aminoácido que não de superfície. Além disso, os bancos de dados imunogenicidade e algoritmos podem ser usados para identificar e substituir os epítopos de ligação de MHC potenciais. Em um aspecto, a predição de modificação in silico é ligada com dados CPE/CPS para a geração de variantes.

[00192] A propensão reduzida para a geração de epítopos de célula T e/ou desimunização pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica. Preferivelmente, a desimunização de proteínas pode ser testada in vitro pelo ensaio de proliferação de célula T. Neste ensaio os PBMCs de doadores que representam > 80 % de alelos de HLA-DR do mundo são triados quanto à proliferação em resposta a peptídeos do tipo selvagem ou desimunizados. Idealmente, a proliferação celular é apenas detectada na carga das células que exibem antígeno com peptídeos do tipo selvagem. Os ensaios adicionais para a desimunização incluem ensaios de reestímulo de PBMC in vitro humano (por exemplo, interferon gama (TH1) ou IL4 (TH2) ELISA. Alternativamente, pode-se testar a desimunização pela expressão de / 140 tetrâmeros de HLA-DR que representam todos os haplotipos. A fim de testar se os peptídeos desimunizados são representados em haplotipos HLA-DR, ligação de, por exemplo, peptídeos rotulados por fluorescência em PBMCs podem ser medidos. A medição de camundongos transgênicos HLA Classe I e Classe II para respostas a antígeno alvo (por exemplo, interferon gama ou IL4). Alternativamente, a triagem de biblioteca de epítopo com células T educadas (MHCI 9mer; MHCII 20mer) de PBMC e/ou ensaios de camundongos transgênicos. Além disso, a desimunização pode ser fornecida pela determinação se os anticorpos contra as moléculas desimunizadas foram geradas após a administração em pacientes.

[00193] Em uma outra forma de realização, as técnicas de Evolução flex da presente invenção podem ser utilizadas para a otimização da expressão. Em um aspecto, a presente invenção divulga a utilização de métodos de engenharia de proteína para o desenvolvimento de variantes de Fc otimizadas por códon de mutação silenciosa com a expressão melhorada em células eucarióticas. Uma mutação silenciosa é uma em que a variação da sequência de DNA não resulta em uma mudança na sequência de aminoácido da proteína. Em um aspecto, a mutagênese de códon é realizada na região constante para a otimização de expressão de célula eucariótica. Uma variante Fc otimizada por códon com propriedades de expressão melhoradas enquanto retém-se a capacidade de mediar as funções atuadoras melhora a produção de anticorpos terapêuticos. Neste aspecto, por exemplo, uma região constante de uma molécula de anticorpo pode ser evoluída para a triagem em hospedeiros de expressão diferentes, por exemplo, expressão de linhagens celulares de mamífero que triam a utilização de CHO, HEK293 e COS-7. Um exemplo de otimização de expressão pela mutagênese de códon na região constante para a expressão de célula de mamífero é mostrado na Figura 3 e descrito no Exemplo 19. Os níveis de expressão mostrados são, cada um, uma média de 4 pontos de dados e confirmados em experimentos múltiplos. A capacidade da / 140 linhagem celular múltipla foi demonstrada para o primeiro mutante testado em sistema de expressão de linhagem de célula HEK293 e CHO.

[00194] Além disso, o EvoMap^TM pode ser usado para a geração de modelos moleculares computacionais de 3 dimensões do oligopeptídeo ou suas regiões específicas, para a exploração dos mecanismos estruturais envolvidos em, por exemplo, especificidade e estabilidade de epítopo de anticorpo. Um EvoMap^TM tri-dimensional hipotético é mostrado na Figura 13.

[00195] A informação em EvoMap também pode ser combinada com a informação estrutural (se disponível) para selecionar, por exemplo, apenas resíduos de superfície para mutações para aumentar a solubilidade/diminuição da agregação.

Evolução de inserção posicionai compreensiva [00196] Em uma forma de realização, a descrição fornece métodos de identificar e mapear polipeptídeos mutantes formados de ou com base em, um polipeptídeo padrão. Referindo-se à Figura 8, usando-se um peptídeo linear como um exemplo simples, em uma primeira etapa, um conjunto de variantes de aminoácido de ocorrência natural (ou uma sub-conjunto destes ou derivados de aminoácido) para cada códon da posição 2 a n (n correspondendo ao número de resíduos na cadeia de polipeptídeo) é gerado por um processo referido aqui como evolução de Inserção Posicional Compreensiva (CPI^TM).

[00197] Em CPI^TM, um aminoácido é inserido após cada aminoácido completamente, um polipeptídeo padrão em um período para a geração de um conjunto de polipeptídeos estendidos. O CPI pode ser usado para inserir 1, 2, 3, 4, ou até 5 novos locais de uma vez. Cada um dos 20 aminoácidos é adicionado em cada nova posição, um de cada vez, criando um conjunto de 20 moléculas diferentes em cada posição adicionada no padrão. Neste caso, a posição 1, que é metionina e invariante é omitida. Este procedimento é repetido para cada cadeia de polipeptídeo da molécula alvo. Um conjunto / 140 mínima de aminoácidos contém apenas um códon para cada um dos 20 aminoácidos naturais.

[00198] A presente invenção diz respeito a métodos de identificar e mapear polipeptídeos mutantes formados de ou com base em um polipeptídeo padrão. Tipicamente, o polipeptídeo compreenderá n resíduos de aminoácido, em que o método compreende (a) gerar n+[20 x (n-1)] polipeptídeos separados, em que em que cada polipeptídeo difere do polipeptídeo padrão em que este foi inserido após cada posição no padrão de cada um dos 20 aminoácidos um de cada vez (como ilustrado na Figura 1); submetendo cada polipeptídeo a ensaio por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (b) para cada membro identificar qualquer mudança na dita propriedade característica ou atividade com relação ao polipeptídeo padrão.

[00199] Em uma forma de realização, uma ou mais regiões são selecionadas para a mutagênese para adicionar uma posição de uma vez como descrito acima. Em tal caso, n representa um subconjunto ou região do polipeptídeo padrão. Por exemplo, quando o polipeptídeo é um anticorpo, o anticorpo total ou uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) do anticorpo são submetidos à mutagênese para adicionar uma posição de uma vez no polipeptídeo padrão após cada posição.

[00200] A invenção, desta maneira, inclui métodos de mapear um conjunto de anticorpos mutantes formados a partir e um anticorpo padrão tendo pelo menos um e preferivelmente seis regiões determinadoras de complementaridade (CDRs), os CDRs juntos compreendendo n resíduos de aminoácido, o método compreendendo (a) gerar n+[20 x (n-1)] anticorpos separados, em que cada anticorpo difere do anticorpo padrão em que este inseriu uma posição predeterminada simples, uma de cada vez, após cada posição na sequência padrão; (b) estimar cada conjunto por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (c) para cada / 140 membro identificar cada mudança em uma propriedade característica ou atividade com relação ao polipeptídeo padrão. Para anticorpos, a propriedade predeterminada, característica ou propriedade podem ser afinidade de ligação e/ou imunogenicidade, por exemplo.

[00201] Além disso, são fornecidos métodos de produzir um conjunto de anticorpos mutantes formados a partir de um anticorpo padrão tendo pelo menos uma região determinadora de complementaridade (CDR), o CDR compreendendo n resíduos de aminoácido, o método compreendendo: (a) gerar n+[20 x (n-1)] anticorpos separados, em que cada anticorpo difere do anticorpo padrão em que este tem um aminoácido extra adicionado em uma posição predeterminada simples do CDR. Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende seis CDRs e juntos, os CDRs compreendem n resíduos de aminoácido.

[00202] Em uma outra forma de realização, os novos polipeptídeos estendidos descritos acima ainda são mutados e mapeados após a triagem para identificar uma mudança em uma propriedade característica ou atividade relativa ao polipeptídeo encurtado. Tipicamente, o polipeptídeo estendido compreenderá n resíduos de aminoácido, em que o método compreende (a) gerar n (n-1 no caso onde o resíduo inicial é metionina) conjuntos separadas de polipeptídeos, cada conjunto compreendendo polipeptídeos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada simples do polipeptídeo; em que cada conjunto de polipeptídeos difere na posição predeterminada simples; estimar cada conjunto por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; (b) para cada membro identificar qualquer mudança na dita propriedade característica ou atividade com relação ao polipeptídeo padrão; e opcionalmente (c) criar um mapa funcional que reflete tais mudanças. Preferivelmente, o número de polipeptídeos membros diferentes gerados é equivalente a n x X (ou [n-1] x X, como o caso pode ser).

/ 140 [00203] Na alternativa, o método compreende gerar uma população simples compreendendo os conjuntos de polipeptídeos mutados a partir de polipeptídeos estendidos. Nesta forma de realização, a nova população inteira é triada, os membros individuais identificados e o mapa funcional gerado.

[00204] Tipicamente, quando cada aminoácido de ocorrência natural é usado, X será 19 (representando os 20 resíduos de aminoácido de ocorrência natural e excluindo o resíduo particular presente em uma dada posição do polipeptídeo padrão). Entretanto, qualquer subconjunto de aminoácidos pode ser usado completamente e cada conjunto de polipeptídeos pode ser substituído por todos ou por um subconjunto do X total usado para a população toda.

[00205] Entretanto, é reconhecido que cada sistema de expressão pode sofrer de desvios de códon, em que os grupos de tRNA insuficientes podem levar à simulação de tradução, terminação de tradução prematura, mudança de estrutura de tradução e má incorporação de aminoácido. Portanto, para a otimização de expressão cada conjunto contém até 63 códons diferentes.

[00206] Cada conjunto de aminoácido é então triado por pelo menos uma, e preferivelmente duas ou mais, características desejáveis, tal como função melhorada; mutações neutras, mutações inibidoras e expressão.

[00207] Em um aspecto, os polipeptídeos estendidos podem ser mapeados para identificar uma mudança na propriedade ou atividade características que resulta nos polipeptídeos encurtados eom relação ao “tipo selvagem”. Os dados para cada conjunto são combinados para o polipeptídeo total ou “molécula alvo”. Os acertos da triagem dos polipeptídeos estendidos (moléculas alvo) ainda podem ser usados para as cadeias de mutagênese compreensivas e triagem como descrito aqui. Os dados da mutagênese fornecem um mapa funcional detalhado (referido aqui como um EvoMap^TM) da molécula alvo é gerada. Este mapa contém informação detalhada de como cada mutação afeta o desempenho/expressão da molécula alvo. Isto permite a / 140 identificação de todos os locais onde nenhuma mudança pode ser feita sem uma perda na função de proteína (ou ligação de antígeno/receptor no caso de anticorpos). Ito também mostra onde as mudanças podem ser feitas sem afetar a função.

[00208] Em um outro aspecto, o CPE pode ser usado para a geração de uma biblioteca de 5, 10 até 15 ou até todos os 19 aminoácidos em cada posição de interesse.

Evolução de deleção posicionai compreensiva [00209] A Evolução de deleção posicional compreensiva (CPD^TM) diz respeito a métodos de identificar e mapear polipeptídeos mutantes formados de ou com base em, um polipeptídeo padrão. A evolução de CPD anula cada aminoácido através da proteína em uma posição de cada vez. Tipicamente, o polipeptídeo compreenderá n resíduos de aminoácido, em que o método compreende (a) gerar n-1 (n-2 no caso onde o resíduo inicial é metionina) polipeptídeos separados, em que em que cada polipeptídeo difere do polipeptídeo padrão em que este precisa de uma posição predeterminada simples; submetendo cada polipeptídeo a ensaio por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (b) para cada membro identificar qualquer mudança na dita propriedade característica ou atividade com relação ao polipeptídeo padrão.

[00210] Em uma forma de realização da evolução CPD, uma ou mais regiões são selecionadas para a mutagênese para remover uma posição em um tempo. Em tal caso, n representa um subconjunto ou região do polipeptídeo padrão. Por exemplo, onde o polipeptídeo é um anticorpo, o anticorpo total ou uma ou mais região determinadora de complementaridade (CDRs) do anticorpo são submetidos à mutagênese para remover uma posição em um tempo no polipeptídeo modelo.

[00211] Em uma forma de realização, CPD deste modo inclui os métodos do mapeamento de um conjunto de anticorpos mutantes formados a / 140 partir de um anticorpo modelo tem pelo menos um e preferivelmente seis, região determinadora de complementaridade (CDRs), os CDRs juntos compreendendo n resíduos de aminoácido, o método compreendendo (a) gerar (n-1) anticorpos separados, em que cada anticorpo difere-se do anticorpo padrão em que a necessidade de uma posição predeterminada simples; (b) submetendo ao ensaio cada conjunto por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (c) para cada membro identificando qualquer mudança em uma propriedade característica ou atividade com relação ao polipeptídeo padrão. Para os anticorpos, a propriedades predeterminada, característica ou propriedade pode ser afinidade de ligação e/ou imunogenicidade, por exemplo.

[00212] Um aspecto da evolução CPD inclui os métodos de produzir um conjunto de anticorpos mutantes formados a partir de um anticorpo modelo tendo pelo menos uma região de determinação complementar (CDR), o CDR compreendendo n resíduos de aminoácido, o método compreendendo: (a) gerando n-1 anticorpos separados, em que cada anticorpo difere-se do anticorpo padrão em que a necessidade de uma posição predeterminada simples do CDR. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende seis CDRs e junto com os CDRs que compreendem n resíduos de aminoácido.

[00213] Em outra forma de realização da evolução CPD, os novos polipeptídeos mais curtos descritos acima ainda são mutados e mapeados após a triagem para identificar uma mudança em uma propriedade característica ou atividade relativa ao polipeptídeo mais curto. Tipicamente, o polipeptídeo mais curto compreenderá n resíduos de aminoácido, em que o método compreende (a) gerando n (n-1 no caso onde o resíduo inicial é metionina) conjuntos separadas de polipeptídeos, cada conjunto compreendendo polipeptídeos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada simples do polipeptídeo; em que cada conjunto de polipeptídeos difere na posição / 140 predeterminada simples; submetendo ao ensaio cada conjunto por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; (b) para cada membro identificar qualquer mudança na dita propriedade característica ou atividade com relação ao polipeptídeo padrão e (c) criar um mapa funcional refletindo tais mudanças. Preferivelmente, o número de membros de polipeptídeos diferentes gerados é equivalente a n x X (ou [n-1] x X, como possivelmente o caso).

[00214] No alternativo, o método CPD compreende gerar uma população simples compreendendo os conjuntos de polipeptídeos mutados as partir dos polipeptídeos mais curtos. Nesta forma de realização, a nova população inteira é triada, os membros individuais identificados e o mapa funcional gerado. Tipicamente, onde cada aminoácidos de ocorrência natural é usado, X será 19 (representando os 20 resíduos de aminoácido de ocorrência natural e excluindo o resíduo particular presente em uma dada posição do polipeptídeo padrão). Entretanto, qualquer subconjunto de aminoácidos podem ser usados em toda parte de cada conjunto de polipeptídeos podem ser substituídos com todos ou um subconjunto do X total usado para a população inteira.

[00215] Qualquer meio sintético ou mutacional pode ser usado para gerar o conjunto de mutantes na evolução CPD. Em uma forma de realização, a geração de polipeptídeos compreende (i) ensaiar um polinucleotídeo contendo códon codificado pelo polipeptídeo modelo para a amplificação com base em polimerase usando-se um oligonucleotídeo degenerado de 64 vezes para códon a ser mutageneizado, em que cada um dos oligonucleotídeos degenerados de 64 vezes é compreendido de uma primeira sequência homóloga e uma sequência de tripleto N,N,N degenerada, a fim de gerar um conjunto de polinucleotídeos de progênie e (ii) submetendo um conjunto dos polinucleotídeos de progênie à amplificação clonal tal que os polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos de progênie são expressados.

/ 140 [00216] Em uma forma de realização da evolução CPD, o polipeptídeo inteiro mais curto é submetido à mutagênese de saturação. Em outra forma de realização, uma ou mais regiões são selecionadas para a mutagênese de saturação. Em tal caso, n representa um subconjunto ou região do polipeptídeo padrão. Por exemplo, onde o polipeptídeo é um anticorpo, o anticorpo inteiro ou uma ou mais região determinadora de complementaridade (CDRs) do anticorpo são submetidos à mutagênese de saturação.

[00217] A evolução CPD divulga deste modo incluir os métodos de mapeamento de um conjunto de anticorpos mutantes formados a partir de um anticorpo modelo mais curto tendo pelo menos um e preferivelmente seis, regiões determinadora de complementaridades (CDRs), os CDRs juntos compreendendo n resíduos de aminoácido, o método compreendendo (a) gerando n conjuntos separadas de anticorpos, cada conjunto compreendendo anticorpos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada simples do CDR; em que cada conjunto de anticorpos diferem-se na posição predeterminada simples e o número de anticorpos membros diferentes gerados é equivalente a n x X; (b) submetendo ao ensaio cada conjunto por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; (c) para cada membro identificando qualquer mudança em uma propriedade característica ou atividade com relação ao polipeptídeo padrão e (d) criando um mapa posicional estrutural de tais mudanças. Para os anticorpos, a propriedade predeterminada, característica ou propriedade pode ser afinidade de ligação e/ou imunogenicidade.

[00218] Como exibido acima, na alternativa, uma população simples compreendendo todos os conjuntos de anticorpos mutados pode ser gerada.

[00219] Além disso, fornecidos são os métodos de produzir um conjunto de anticorpos mutantes formados a partir de um anticorpo modelo mais curto tendo pelo menos um região determinadora de complementaridade / 140 (CDR), o CDR compreendendo n resíduos de aminoácido, o método compreendendo: (a) gerando n conjuntos separadas de anticorpos, cada conjunto compreendendo anticorpos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada simples do CDR; em que cada conjunto de anticorpos diferem-se na posição predeterminada simples e o número de anticorpos membros diferentes gerado é equivalente a n x X. Em outra forma de realização, anticorpo compreende seis CDRs e juntos os CDRs compreendem n resíduos de aminoácido.

[00220] O método de evolução CPD^TM inclui um mapa posicional funcional (EvoMap^TM) feito pelos métodos descritos neste. Em uma forma de realização adicional, certos resíduos particularmente sensíveis para mudar pode ser deste modo indicado em EvoMap^TM. A otimização adicional pode ser implementada pela fabricação das mudanças mutacionais adicionais nas posições externas destas posições sensíveis. É também possível utilizar o EvoMap^TM a fim de reconhecer e recombinar as substituições de aminoácidos simples benéficos e triar ainda para otimizar as características adequadas na molécula alvo, em um processo denominado a síntese de proteína combinatória (CPS^TM).

Síntese de proteína combinatória [00221] Síntese de proteína combinatória (CPS^TM) envolve a combinação dos acertos individuais de CPE, CPI, CPD, ou qualquer outra técnica evolucionária para combinar duas ou mais mutações. O CPS é usado para sintetizar as proteínas com as mutações combinadas que são então triadas pelo gene otimizado e características de proteína. Um esquemático de CPS^TM é mostrado na Figura 3. Em um aspecto, duas ou mais mutações de ponto que resultam nas mutações neutras ou mutantes ativados são combinadas em CPS.

[00222] Em uma forma de realização CPE é combinado com CPS para criar mutantes, que são triados para a propriedade desejada. Em um aspecto, tempo e recursos podem ser salvos no processo CPE pela mudança 2 aa ou 3 / 140 aa ou 4 aas em um tempo versus um em um tempo; de modo se o número de aa's na proteína é N, o número total gerado e triado por 2 aa em um tempo seria (20²) x 1/2N; 3 em um tempo seria (20³) x 1/3N, etc. Por exemplo, em um aspecto específico, (no exemplo 2aa): 1” aa na posição 1” aa é combinado com todos os 20 na 2° posição aa e todos os outros aa's permanecem os mesmos, então o 2° aa na 1° posição aa é combinado com todos os 20 na 2° posição aa e todos os outros aa's permanecem o mesmo. A população total é triada pelo mutantes ativados e então mutação no segundo conjunto dos próximos dois aa's abaixo da linhagem é realizado. Em um aspecto similar, este pode ser realizado por 3aas em um tempo ou 4aas em um tempo. Em outro aspecto, opcionalmente seguem o processo CPE com CPS de mutantes ativados (incluindo qualquer subconjunto deste).

[00223] Em um aspecto, aminoácidos não naturais podem ser incorporados no processo (de modo que todos os 19 outros aminoácidos, ou um subconjunto dos mesmos, mais os aminoácidos não naturais) pelo uso de novas tecnologias tal como o códon quádruplos descritos nos papéis relatados e ligados. Neumann et al. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome Nature 464, 441-444 (14 February 2010). Neste aspecto CPE/CPS é realizado para a incorporação dos aminoácidos não naturais.

[00224] Em um aspecto adicional, a biblioteca inteira CPE é sinteticamente criada (sintetizar todas as moléculas nas máquinas comercialmente disponíveis). No evento da máquina de síntese não deve criar os filamentos suficientemente amplo, fragmentos são sintetizados e então ligado para gerar as moléculas de comprimento total. Esta biblioteca é triada e seguido com CPS para combinar as mutações desejadas. Este é um processo de duas etapas em que CPE é seguido por CPS, não uma etapa de apenas CPE.

[00225] Em outro aspecto, uma biblioteca CPE é gerada e triada, então / 140 seguido pela combinação CPS mutantes ativados como seguem: se existe 10 mutantes ativados, teste uma molécula simples com todas as 10 mudanças, então o teste de todas as versões de 9 mutações, então 8, 7, 6, 5 etc. até um dos grupos não observa uma molécula melhorada em qualquer grupo prévio. Uma vez que uma molécula melhorada é identificada no processo pode ser terminado.

[00226] Em um aspecto adicional, CPE é realizado para identificar os mutantes ativados e mutações neutras para a afinidade e expressão, então CPS é realizado com combinações de mutantes ativados e mutações neutras e a biblioteca é triada novamente pelos melhoramentos adicionais nas características tal como função, afinidade e/ou expressão.

[00227] Em um aspecto adicional, CPE é realizado em códons de Fc ou outro domínio para as mudanças de glicosilação.

[00228] Em outro aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS de microRNA's ou íntrons podem ser realizados.

[00229] Em um aspecto adicional, CPE ou CPE combinado com CPS de CDRs de anticorpos roedores é realizado, então triado por mutantes ativados, seguido pela humanização.

[00230] Em um aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS é realizado para produzir nucleotídeos intermediários alternativos que levam à mutação desejada na reação final, por exemplo, uma citocina metilada que converte a uma uracila.

[00231] Em um aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS está além da informática é utilizado para converter os CDR's de camundongo aos CDR's humanos e vice versa.

[00232] Em um aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS é utilizado com 2 e 3 mutações espaçadas através da proteína.

[00233] Em outro aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS são usados em um vetor de cadeia dupla para a triagem da sensibilidade / 140 aumentada.

[00234] Em um aspecto adicional, CPE ou CPE combinado com CPS é utilizado para a seleção das mudanças alostéricas.

[00235] Qualquer uma das técnicas de diversas avaliações podem ser usadas para triar os mutantes CPE/CPS. Em um aspecto CPE ou CPE combinado com mutantes CPS podem ser secretados e exibidos nos hospedeiros eucarióticos. Alternativamente, CPE ou CPE combinado com mutantes CPS podem ser produzidos em E.coli e triados nos hospedeiros eucarióticos. Em outro aspecto, CPE é realizado iniciando em 15aa ou 10aa e seguido por CPS; então seguido com o restante do 19 aa remanescente. Em outro aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS é utilizado para envolver as proteínas especificamente com as mudanças de aminoácidos de não superfície. Em um aspecto, CPE pode ser utilizado pelo mapeamento de epítopo multi-dimensional. Em outro aspecto, CPE ou CPE combinado com triagem CPS podem ser realizados aleatoriamente nas células eucarióticas. Em um aspecto adicional, CPE ou CPE combinado com CPS é realizado, então sequenciamento e ensaio de todos os clones é realizado, por exemplo, em um chip baseado ou formato bem baseado para a expressão e triagem. Em outro aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS é utilizado para envolver a coordenação de íon metálico pela seleção na variação das concentração de íon. Em um aspecto adicional, CPE ou CPE combinado com CPS é realizado e as proteínas são expressadas e triadas nas condições livres de célula e nos organismos vivos não humanos.

[00236] Em um aspecto, CPE ou CPE combinado com triagem CPS das células tronco é realizado pela variação dos efeitos na diferenciação e proteína e RNA e expressão mRNA. Em um aspecto adicional, CPE ou CPE combinado com triagem multiplex CPS é realizado para as características de proteína múltipla semelhantes a expressão e ligação. Em outro aspecto, CPE ou CPE combinado com CPS é realizado nas moléculas modelo envolvidas no / 140 transporte cerebral e reticulação de membrana; e mutantes são triadas para as características melhoradas. Em um aspecto, CPE ou CPE combinado com mutantes CPS são triados para as características higroscópica de proteína. Em outro aspecto, CPE ou CPE combinado com mutantes CPS são submetidos ao ensaio para a seleção das proteínas dinâmicas. Em um aspecto, CPE ou CPE combinado com triagem CPS é realizado fora da condição alvo para identificar os mutantes dentro da condição alvo e vice versa.

[00237] Em uma forma de realização, qualquer um dos aspectos acima de CPE ou CPE combinado com CPS são utilizados em combinação com um método selecionado de CPI, CPD e CPD com a combinação CPI.

[00238] Em outra forma de realização, qualquer um dos aspectos acima de CPE ou CPE combinado com CPS são utilizados em combinação com um método selecionado de evolução Flex e evolução Synergy realizados a partir de um modelo.

[00239] O termo “modelo” pode referir-se a um polipeptídeo base ou um polinucleotídeo codificando tal polipeptídeo. Como seria apreciado por uma pessoa habilitada nesta técnica, qualquer modelo pode ser usado nos métodos e composições da presente invenção. Os modelos que podem ser mutados e portanto envolvidos podem ser usados para guiar a síntese de outro polipeptídeo ou biblioteca de polipeptídeos como descrito na presente invenção. Como descrito em mais detalhes neste, o modelo capaz de evolução da síntese de um polipeptídeo e pode ser usado por último para decifrar o histórico sintético do polipeptídeo, para indiretamente amplificar o polipeptídeo e/ou para evoluir (isto é, diversificar, selecionar e amplificar) o polipeptídeo. O modelo capaz de evolução é, em certas formas de realização, um ácido nucleico. Em certa forma de realização da presente invenção, o modelo é baseado em um ácido nucleico. Em outras formas de realização, o modelo é um polipeptídeo.

[00240] Os modelos de ácido nucleico usados na presente invenção são / 140 feitos de DNA, RNA, um híbrido de DNA e RNA, ou um derivado de DNA e RNA e pode ser filamentado simples ou duplo. A sequência do modelo é usado para codificar a síntese de um polipeptídeo, preferivelmente um composto que não é, ou não parecido com, um ácido nucleico ou análogo de ácido nucleico (por exemplo, um polímero não natural ou uma molécula menor). No caso de certos polímeros não naturais, o modelo de ácido nucleico é usado para alinhar as unidades de monômero em uma sequência aparecerá no polímero e para conduzir na proximidade com as unidades de monômero adjacente junto com o modelo de modo que estes reagem e tornam-se unidos por uma ligação covalente. Em certas outras formas de realização, o modelo pode ser utilizado para gerar os polímeros não naturais para a amplificação PCR de uma biblioteca de modelo de DNA sintético que consiste de uma região aleatória de nucleotídeos.

[00241] Será apreciado que o modelo por variar mais no número de bases. Por exemplo, em certas formas de realização, o modelo pode ser 10 a 10.000 bases de comprimento, preferivelmente entre 10 e 1.000 bases de comprimento. O comprimento do modelo dependerá do curso dos códons, a complexidade da biblioteca, comprimento do polímero não natural a ser sintetizado, complexidade da molécula menor a ser sintetizada, uso das sequências de espaço, etc. A sequência de ácido nucleico pode ser preparada usando qualquer método conhecido na técnica para preparar as sequências de ácido nucleico. Estes métodos incluem tanto os métodos in vivo quanto in vitro incluindo PCR, preparação de plasmídeo, digestão de endonuclease, síntese de fase sólida, transcrição in vitro, separação padrão, etc. Em certas formas de realização, o modelo de ácido nucleico é sintetizado usando um sintetizador de DNA automático.

[00242] Como debatido acima, em certas formas de realização da invenção, o método é usado para sintetizar os polipeptídeos que não são, ou não reunido, ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico. Deste modo, em / 140 certas formas de realização da presente invenção, o modelo de ácido nucleico compreende as sequências de bases que codificam a síntese de um polímero não natural ou molécula menor. A mensagem codificada no modelo de ácido nucleico preferivelmente começa com um códon específico que realiza a colocação em um local quimicamente reativo que a polimerização pode acontecer, ou nenhum caso de sintetizar uma molécula menor do códon de “partida” pode codificar por um anti-códon associado com uma estrutura de molécula menor ou um primeiro reagente. O códon de “partida” da presente invenção é análogo ao códon de “partida”, ATG, que codifica-se pelo aminoácido de metionina.

[00243] Já em outras formas de realização da invenção, o modelo de ácido nucleico por si só pode ser modificado para incluir um local de iniciação para a síntese de polímero (por exemplo, um nucleófilo) ou uma estrutura de molécula menor. Em certas formas de realização, o modelo de ácido nucleico inclui um arco grampo de cabelo em um deste final terminando em um grupo reativo usado para iniciar a polimerização das unidades de monômero. Por exemplo, um modelo de DNA podem compreender um arco grampo de cabelo terminando em um grupo 5'-amino, que pode ser protegido ou não. A partir da polimerização do grupo amino do polímero não natural pode iniciar. O grupo amino reativo também pode ser usado para ligar uma estrutura de molécula menor no modelo de ácido nucleico a fim de sintetizar uma biblioteca de molécula menor.

[00244] Para terminar uma síntese de polímero não natural um códon de “interrupção” deve ser incluído no modelo de ácido nucleico preferivelmente no final da sequência codificadora. O códon de “interrupção” da presente invenção é análogo aos códons de “interrupção” (isto é, TAA, TAG, TGA) observados nos transcritos mRNA. Estes códons levam ao término da síntese de proteína. Em certas formas de realização, a códon de “interrupção” é selecionado que é compatível com o código genético artificial / 140 usado para codificar o polímero não natural. Por exemplo, o códon de “interrupção” não deve eonflitar eom quaisquer outros eódons usados para codificar a síntese e este deve ser do mesmo formato geral como os outros eódons usados nos modelo. O eódon de “interrupção” pode eodifiear para uma unidade ^Ade monômero que conclui a polimerização por não fornecer um grupo reativo para a ligação adicional. Por exemplo, uma unidade de monômero de interrupção pode conter um grupo reativo bloqueado tal como uma acetamida antes do que uma amina primária. Já em outras formas de realização, a unidade de monômero de interrupção compreende um terminal biotinilado fornecendo uma maneira conveniente de terminar a etapa de polimerização e purificação do polímero resultante.

[00245] Em uma forma de realização, os produtos de DNA mutageneizados são usados diretamente como o modelo para a síntese in vitro das proteínas mutantes correspondentes. Por causa da eficiência alta com o qual todas as 19 substituições de aminoácidos podem ser gerados em um resíduo simples, é possível realizar a mutagênese de saturação em resíduos numerosos de interesse, independentemente ou em combinação com outras mutações dentro da proteína. Como usado neste, a mutagênese de “saturação eompleta” é definida eomo substituição de um dado aminoáeido dentro da proteína, com os outros 19 aminoácidos de ocorrência natural. Por exemplo, a mutagênese de saturação de local do gene, que sistematicamente explora minimamente todas as substituições de aminoácidos simples possíveis junto a uma sequência de proteína, é descrita em Kretz et al., Methods in Enzymology, 2004, 388:3-11; Short, Patente U.S. N° 6.171.820; e Short, Patente U.S. N° 6.562.594, cada um de que é incorporado neste por referência.

[00246] Em um aspecto, esta invenção fornecido para o uso dos iniciadores de códon (contendo uma sequência N,N,G/T degenerada) para introduzir as mutações de ponto em um polinucleotídeo, a fim de gerar um / 140 conjunto de polipeptídeos de progênie em que uma faixa total de substituições de aminoácidos simples é representada em cada posição de aminoácido (ver Patente U.S. N°. 6.171.820; ver também, Patente U.S. N°. 5.677.149, cada um incorporado neste por referência). Os oligos usados são compreendidos continuamente de uma primeira sequência homóloga, uma sequência N,N,G/T degenerada e preferivelmente mais não necessariamente uma segunda sequência homóloga. A progênie a jusante dos produtos de tradução a partir do uso de tais oligos incluem todas as possíveis mudanças de aminoácidos em cada local de aminoácido junto com o polipeptídeo, por causa da degeneração da sequência N,N,G/T incluindo os códons para todos os 20 aminoácidos.

[00247] O uso do códon é um dos fatores importantes na expressão do gene eucariótico. As frequências com o qual os códons diferentes são usados significantemente variam entre hospedeiros diferentes e entre as proteínas expressadas nos níveis altos e baixos dentro do mesmo organismo. A razão mais semelhante para esta variação é que os códons preferidos correlacionam com abundância de tRNAs cognatos disponíveis dentro da célula. É possível que o uso de códon e concentrações aceitantes RNA tem co-evoluídos e que a pressão da seleção para a co-evolução é mais pronunciado para os genes altamente expressados do que os genes expressados nos níveis baixos.

[00248] Em um aspecto, um tal oligo degenerado (compreendido de um cassete N,N,G/T degenerado) é usado para ensaiar cada códon original em um modelo de polinucleotídeo parental a uma faixa total de substituições de códon. Em outro aspecto, pelo menos dois cassetes N,N,G/T degenerados são usados - no mesmo oligo ou não, para ensaiar pelo menos dois códons originais em um modelo de polinucleotídeo parental em uma faixa total de substituições de códons. Deste modo, mais do que uma sequência N,N,G/T pode ser contida em um oligo para introduzir as mutações de aminoácidos em mais do que um local. Esta pluralidade das sequências N,N,G/T pode ser diretamente contínua ou separada por uma ou mais sequências de nucleotídeos / 140 adicionais. Em outro aspecto, oligos úteis para a introdução das adições e anulações podem ser usados sozinho ou em combinação com os códons contendo uma sequência N,N,G/T, para introduzir qualquer combinação ou troca de adições, anulações e/ou substituições de aminoácidos.

[00249] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de cassetes degenerados tendo degeneração menor do que a sequência N,N,G/T. Por exemplo, pode ser desejável em alguns exemplos para usar (por exemplo, em um oligo) uma sequência de tripleto degenerado compreendida de apenas um N, onde o dito N pode ser na primeira, segunda ou terceira posição do tripleto. Quaisquer outras bases incluindo quaisquer combinações e trocas destes podem ser usados nas duas posições remanescentes do tripleto. Alternativamente, pode ser desejável em alguns exemplos usar (por exemplo, em um oligo) uma sequência de tripleto N,N,N degenerado.

[00250] É estimado que, entretanto, que o uso de um tripleto N,N,G/T degenerado como descrito neste é vantajoso por diversas razões. Em um aspecto, esta invenção fornece um meio para gerar facilmente, de maneira sistêmica e regular, a substituição da faixa total dos aminoácidos possíveis (por um total de 20 aminoácidos) em cada e ainda a posição de aminoácido em um polipeptídeo. Deste modo, por um polipeptídeo de 100 aminoácidos, a presente invenção fornece uma maneira para gerar facilmente, de maneira sistêmica e regular de 2000 espécies distintas (isto é, 20 aminoácidos possíveis por posição X 100 posições de aminoácidos). É estimado que é fornecido, através do uso de um oligo contendo um tripleto N,N,G/T degenerado, 32 sequências individuais que codificam por 20 aminoácidos possíveis. Deste modo, em um recipiente de reação em que uma sequência de polinucleotídeo parental é submetido à mutagênese de saturação usando um tal oligo, existem 32 polinucleotídeos distintos gerados de progênie que codifica 20 polipeptídeos distintos. Em contraste, o uso de um oligo não degenerado na mutagênese direcionada ao local leva apenas um produto de / 140 polipeptídeo de progênie pelo recipiente de reação.

[00251] Deste modo, em uma forma de realização preferida, cada recipiente de reação de mutagênese de saturação contém polinucleotídeos que codificam pelo menos 20 moléculas de polipeptídeo de progênie de modo que todos os 20 aminoácidos sejam representados em uma posição de aminoácido específico correspondente à posição de códon mutageneizado no polinucleotídeo parental. Os polipeptídeos de progênie degenerado de 32 vezes gerados a partir de cada recipiente de reação de mutagênese de saturação pode ser submetido à amplificação clonal (por exemplo, clonado em um hospedeiro de E. coli adequado usando um vetor de expressão) e submetido à triagem de expressão. Quando um polipeptídeo de progênie individual é identificado pela triagem da exibição de uma mudança na propriedade (quando em comparação com o polipeptídeo padrão), pode ser sequenciado para identificar a substituição de aminoácido responsável para tal mudança contida neste.

[00252] O polipeptídeo modelo pode ser qualquer proteína, entretanto as proteínas que tem um ensaio conveniente para a atividade tal como atividade catalítica ou ligação de ligante são preferidos. Como usado neste, um ligante é qualquer molécula que liga-se especificamente a um amplo, tal como ligação de molécula menor a uma proteína. Os exemplos representativos de interações alvos incluem catálise, interações de substrato de enzima, interações de ácido nucleico de proteína, interações de ligantereceptor, interações de metais-proteína e interações de antígeno-anticorpo. As proteínas alvos representativos incluem enzimas, anticorpos, citocinas, receptores, proteína de ligação de DNA, agentes de quelação e hormônios.

[00253] Qualquer método mutagênico recombinante sintético ou recombinante pode ser usado para gerar a população de mutantes de polipeptídeos. A prática da presente invenção pode utilizar, a não ser de outra maneira indicada, técnicas convencionais da biologia celular, cultura celular, / 140 biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro da pessoa habilitada na técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2° Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames &

S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Cabs eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymnology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-N (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embiyo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

[00254] Em uma forma de realização, o polipeptídeo modelo é um anticorpo. O anticorpo é submetido aos métodos descritos neste, por exemplo, mapa e compreendido que as posições dentro do efeito CDR da afinidade de ligação. As técnicas para a preparação e uso de várias construções com base em anticorpo e fragmentos destes são bem conhecidos na técnica. Um aspecto importante da presente invenção é a identificação dos resíduos que apresentam, ou são semelhantes para desempenhar um papel na interação de interesse (por exemplo, interação de anticorpo-antígeno, quelação metálica, ligação receptor, ligação de substrato, etc). Qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser usado de acordo com a presente invenção.

/ 140 [00255] Em uma forma de realização, qualquer uma da plataforma de evolução CPE, CPI, CPD e CPS podem ser utilizados para gerar os anticorpos agonistas, isto é anticorpos de ativação. Estas tecnologias de evolução capazes de gerar os anticorpos agonistas além da proteína mais simples da ativação do tipo de reticulação e em particular permite a ativação dos receptores tal como GPL-1 ou 2 que são tradicionalmente ativados por peptídeos.

[00256] Em um aspecto, os anticorpos são selecionados por FACS ou microscopia ou equivalente para os anticorpos de ativação fraca pelo uso de células com sinais fluorescentes que a fluorescência quando o receptor de superfície celular é ativado. Subsequentemente, as ferramentas de evolução são usadas para intensificar esta ativação. A tecnologia CPS é então utilizada para combinar os mutantes ativados.

[00257] Em outro aspecto, um anticorpo é selecionado que liga-se ao local de ativação do receptor como determinado pelo mapeamento de epítopo. As técnicas CPE, CPI e/ou CPD são usadas para selecionar para os mutantes que causam o estímulo do receptor como determinado por uma leitura intracelular tal como fluorescência em resposta à liberação de íon de cálcio ou outros ensaios que são bem conhecidos na técnica. A tecnologia CPS é então utilizada para combinar os mutantes ativados.

[00258] Em um aspecto particular, algumas destas mudanças chaves de CPI com inserções de aminoácidos simples, duplas ou triplas são aquelas destes aminoácidos inseridos que podem estendidos no bolso de ligação do receptor para ativar o receptor. Em outro aspecto particular, CPD pode remodelar e/ou aminoácidos de reposição interagindo com o receptor para melhorar ou efetuar a ativação e finalmente CPE pode realizar relativamente mudanças menores para efetuar a ativação receptora.

[00259] A especificidade de um anticorpo é determinada pela região determinadora de complementaridades (CDRs) dentro das regiões variáveis de cadeia leve (VL) e regiões variáveis de cadeia pesada (VH). O fragmento / 140

Fab de um anticorpo, que é cerca de um terceiro do tamanho de um anticorpo completo contém as regiões variáveis de cadeia leve e pesada, a região constante de cadeia leve completa e uma porção da região constante de cadeia pesada. As moléculas Fab são estáveis e associadas bem devido a contribuição das sequências de região constante. Entretanto, o rendimento do Fab funcional expressado nos sistemas bacterianos é menos do que aquele do fragmento Fv menor que contém apenas as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas. O fragmento Fv é a porção menor de um anticorpo que ainda permanece um local de ligação de antígeno funcional. O fragmento Fv tem as mesmas propriedades de ligação como o Fab, entretanto sem a estabilidade conferida pelas regiões constantes, as duas cadeias de Fv pode dissociar facilmente relativo as condições diluídas.

[00260] Em um aspecto, regiões VH e VL podem ser fundidas por um ligador de polipeptídeo (Huston et al., 1991) para estabilizar o local de ligação do antígeno. Este fragmento de polipeptídeo Fv simples é conhecido como um anticorpo de cadeia simples (scFv). O VH e VL pode estar disposto com o primeiro domínio. O ligado une o terminal carbóxi da primeira cadeia ao terminal amino da segunda cadeia.

[00261] Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que a cadeia simples Fv, Fv de cadeia leve ou pesada ou fragmento Fabs pode ser usado com este sistema. Uma cadeia leve ou pesada pode ser mutageneizada seguido pela adição da cadeia complementar a solução. As duas cadeias são então deixadas combinar e formar um fragmento de anticorpo funcional. A adição das sequências de cadeia leve ou pesada não específica aleatória permite para a produção de um sistema combinatorial para gerar uma biblioteca de diversos membros.

[00262] Geralmente, um polinucleotídeo de expressão de cadeia simples é gerada. Este polinucleotídeo de expressão contém: (1) um cassete de anticorpo de cadeia simples que consiste de um domínio VH, peptídeo / 140 espaçador e domínio Vl operavelmente ligado para codificar um anticorpo de cadeia simples, (2) um promotor adequado para a transcrição in vitro (por exemplo, promotor T7, promotor SP6 e outros) operavelmente ligado para garantir a transcrição in vitro do cassete de anticorpo de cadeia simples formando um mRNA que codifica um anticorpo de cadeia simples e (3) uma sequência de terminação de transcrição adequado para o funcionamento em uma reação de transcrição in vitro. Opcionalmente, o polinucleotídeo de expressão também pode compreender uma origem de replicação e/ou um marcador selecionável. Um exemplo de um polinucleotídeo de expressão adequado é pLM166.

[00263] As sequências Vh e Vl podem ser convenientemente obtidos de uma biblioteca das sequências Vh e Vl produzidas pela amplificação PCR usando os iniciadores específicos pela família do gene V ou iniciadores específicos do gene V (Nicholls et al., J. Immunol. Meth., 1993, 165: 81; W093/12227) ou são projetados de acordo com os métodos conhecidos na técnica padrão com base na informação de sequência adequada. Tipicamente, sequências Vh e Vl camundongo ou humano são isolados. As sequências Vh e Vl então são ligadas, usualmente com uma sequência espaçadora de intervenção (por exemplo, codificando um espaçador de peptídeo flexível em estrutura), formando um cassete codificando um anticorpo de cadeia simples. Tipicamente, uma biblioteca compreendendo uma pluralidade das sequências Vh e Vl é usado (algumas vezes também com uma pluralidade de espécies de peptídeos espaçadores representados), em que a biblioteca é construída com um ou mais das sequências Vh e Vl mutadas para aumentar a diversidade da sequência particularmente nos resíduos CDR, algumas vezes nos resíduos de estrutura. As sequências de região V podem ser convenientemente clonado como os produtos de amplificação de cDNAs ou PCR para as células que expressam imunoglobulina. Por exemplo, as células a partir do hibridoma humano, ou linfoma, ou outra linhagem da célula que sintetiza outra / 140 superfície celular ou imunoglobulina secretada pode ser usado para o isolamento de polyA+ RNA. O RNA é então usado para uma síntese de cDNA iniciado oligo dT usando a transcriptase reversa de enzima (para os métodos gerais ver, Goodspeed et al., Gene 1989, 76: 1; Dunn et al., J. Biol. Chem., 1989, 264: 13057). Uma vez que a região V CDNA ou produto PCR é isolado, é clonado em um vetor para formar um cassete de anticorpo de cadeia simples.

[00264] Para acompanhar a construção de anticorpos e fragmentos de anticorpo, os genes que codificam são isolados e identificados. Os genes podem ser modificados para permitir a clonagem em um vetor de expressão ou em transcrição/tradução in vitro. Embora os métodos possam ser usados tal como sondagem de DNA para VH e VL a partir do cDNA de hibridoma (Maniatis et al., 1982) ou construir um gene sintético para VH e VL (Barbas et al., 1992), um modo conveniente é usar os métodos direcionados ao modelo para amplificar as sequências de anticorpo. Uma população diversa de genes de anticorpos podem ser amplificados a partir de uma amostra de modelo pelo projeto dos iniciadores das sequências conservadas na extremidades finais 3' e 5' da região variável conhecido como as regiões constantes ou estrutura do anticorpo (Iverson et al., 1989). Dentro dos iniciadores, os locais de restrição podem ser colocados para facilitar a clonagem em um vetor de expressão. Para direcionar os iniciadores destas regiões conservadas, a diversidade da população de anticorpo é mantida para permitir para a construção de diversas bibliotecas. As espécies específicas e classe do anticorpo podem ser definidos pela seleção das sequências iniciadoras como ilustrado pelo número amplo de sequências para todos os tipos de anticorpos dados em Kabat et al., 1987, incorporado neste por referência.

[00265] O RNA mensageiro isolado do baço ou sangue periférico de um animal pode ser usado como o modelo para a amplificação de uma biblioteca de anticorpo. Em certas circunstâncias, onde é desejável exibir uma / 140 população homogênea dos fragmentos de anticorpo na superfície celular, mRNA pode ser isolado a partir de uma população dos anticorpos monoclonais. O RNA mensageiro a partir da fonte pode ser preparada pelos métodos padrões e usados diretamente ou para a preparação de um modelo CDNA. A geração de mRNA para os propósitos de anticorpo de clonagem é prontamente acompanhado por seguir os procedimentos bem conhecidos para a preparação e caracterização de anticorpos (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988; incorporado neste por referência).

[00266] Geração dos anticorpos monoclonais (MAbs) seguem geralmente os mesmos procedimentos como aqueles para a preparação dos anticorpos policlonais. Brevemente, um anticorpo policlonal é preparado para imunizar um animal com uma composição imunogênica de acordo com e coleta de anti-soro a partir daquele animal imunizado. Uma faixa ampla de espécies animais pode ser usada para a preparação do anti-soro. Tipicamente o animal usado para a produção de anti-antisoro é um coelho, um camundongo, um rato, um hamster, um porquinho da índia ou uma cabra. Por causa do volume de sangue relativamente amplo de coelhos, os coelhos são usualmente preferidos para a produção dos anticorpos policlonais.

[00267] As composições imunogênicas frequentemente variam na imunogenicidade. É frequentemente necessário portanto para intensificar o sistema imune hospedeiro, como pode ser atingido para ligar um imunogênio de polipeptídeo ou peptídeo a um carregador. Os carregadores preferidos e exemplares são hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH) e albumina de soro bovino (BSA). Outras albuminas tal como ovalbumina, albumina de soro de camundongo ou albumina de soro de coelho também pode ser usado como carregadores. Os meios reconhecidos para a conjugação de um polipeptídeo a uma proteína carregadora são bem conhecidos e incluem glutaraldeído, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimidas e bis-benzidina diazotizada.

/ 140 [00268] A imunogenicidade de uma composição de imunogênio particular pode ser intensificada pelo uso de estimuladores não específicos da resposta imune, conhecido como adjuvantes. Adjuvantes preferidos e exemplares incluem adjuvante de Freund completo (um estimulador não específico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis mortos), adjuvantes de Freund incompletos e adjuvantes de hidróxido de alumínio.

[00269] A quantidade da composição de imunogênio usado na produção de anticorpos policlonais variam na natureza de imunogênio bem como o animal usado para a imunização. Uma variedade de vias podem ser usadas para administrar o imunogênio (subcutâneo, intramuscular, intradérmico, intravenoso e intraperitoneal). A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada pela amostra sanguínea do animal imunizado em vários pontos seguindo a imunização. Uma segunda injeção intensificada, também pode ser dada. O processo de intensificação e titulação é repetido até um titulador adequado é atingido. Quando um nível desejado de imunogenicidade é obtido, o animal imunizado pode ser sangrado e o soro isolado, armazenado e o baço coletado para o isolamento de mRNA a partir da resposta policlonal ou o animal pode ser usado para gerar MAbs para o isolamento de mRNA a partir de uma população de anticorpo homogêneo.

[00270] MAbs podem ser prontamente preparados através do uso das técnicas bem conhecidas, tal como aqueles exemplificados na Patente U.S. N°. 4.196.265, incorporado neste por referência. Tipicamente, esta técnica envolve a imunização de um animal adequado com uma composição imunogênio, por exemplo, um hapteno de molécula menor conjugado a um carregador, uma proteína purificada ou parcialmente purificada, polipeptídeo ou peptídeo. A imunização da composição é administrada em uma maneira efetiva para estimular as células que produzem o anticorpo. Os roedores tal como camundongos e ratos são frequentemente usados os animais; entretanto, o uso células de coelho, ovelha e sapo também é possível. O uso de ratos pode fornecer certas vantagens (Goding, / 140 pp. 60-61, 1986), mas camundongos foram preferidos, particularmente o camundongo BALB/c como este é mais rotineiramente usado e geralmente dá uma porcentagem maior de fusões estáveis.

[00271] Seguindo a imunização, as células somáticas com o potencial para a produção de anticorpos, especialmente os linfócitos B (células B), são selecionados para um uso no protocolo gerando Mab. Estas células podem ser obtidas a partir de baços submetidos à biopsia, linfonodos ou amídalas, ou de amostras sanguíneas. As células de baço e células sanguíneas são preferíveis, o formador por causa destes são uma fonte rica de células que produzem anticorpo que são no estágio de divisão plasma blast e o último por causa do sangue é facilmente acessível. Frequentemente, um painel de animais foram imunizados e o baço do animal com o titulador de anticorpo maior será removido e os linfócitos de baço obtidos pela homogeneização do baço com uma seringa. Tipicamente, um baço a partir de um camundongo imunizado contém aproximadamente 5 x 107 a 2 x 108 de linfócitos.

[00272] O anticorpo que produz os linfócitos B a partir do animal imunizado então são fundidos com as células de uma célula de mieloma imortal, geralmente um da mesma espécie como o animal que foi imunizado. As linhagens de mieloma adequadas para o uso nos procedimentos de fusão de produção de hibridoma preferivelmente não são produção de anticorpo, tem a eficiência de fusão alta e deficiências de enzima que rendem então incapaz de desenvolver em certo meio seletivo que suporta o desenvolvimento de apenas as células fundidas desejadas (hibridomas).

[00273] Qualquer um de um número de células de mieloma podem ser usadas, como são conhecidos aquela pessoa habilitada na técnica (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, 1984). Por exemplo, onde o animal imunizado é um camundongo, um pode usar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S 194/5XX0 Bul; para ratos, um pode usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210; e / 140

U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6 são todos úteis na conexão com fusões de célula humana.

[00274] Uma célula de mieloma de murino preferido é a linhagem de célula de mieloma NS-1 (também denominado P3-NS-1-Ag4-1), que é prontamente disponível a partir do NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository para requerer o número repositório de linhagem celular GM3573. Outra linhagem celular de mieloma de camundongo que pode ser usado é o mieloma de murino de camundongo resistente de 8-azaguanina SP2/0 não produz a linhagem celular.

[00275] Os métodos para gerar os híbridos do baço que produz o anticorpo ou células de linfonodo e células de mieloma usualmente compreende a mistura de células somáticas com as células de mieloma em uma proporção 2:1, embora a proporção pode variar cerca de 20:1 a cerca de 1:1, respectivamente, na presença de um agente ou agentes (químico ou elétrico) que promovem a fusão de membranas celulares. Os métodos de fusão usando o vírus Sendai foram descritos por Kohler & Milstein (1975; 1976) e aqueles usando o polietileno glicol (PEG), tal como 37 % (v/v) PEG, por Gefter et al., 1977). O uso dos métodos de fusão eletricamente induzido também é apropriado (Goding pp. 71-74, 1986).

[00276] Os procedimentos de fusão usualmente produz os híbridos viáveis nas frequências baixas, cerca de 1x 10^-6 a l x 10^-8. Entretanto, este não apresenta um problema, como os híbridos fundidos, viáveis são diferenciados a partir das células não fundidas, parentais, (particularmente as células de mieloma não fundidas que normalmente continuam dividir indefinida) para a cultura em um meio seletivo. O meio seletivo é geralmente um que contém um agente que bloqueia a síntese nova de nucleotídeos no meio de cultura de tecido. Os agentes preferidos e exemplares são aminopterina, metotrexato e azaserina. Um bloco de aminopterina e metotrexato de síntese nova tanto de purinas quanto pirimidinas, considerando os blocos de azaserina apenas a / 140 síntese de purina. Onde aminopterina ou metotrexato é usado, o meio é suplementado com hipoxantina e timidina como uma fonte de nucleotídeos (meio HAT). Onde azaserina é usado, o meio é suplementado com hipoxantina.

[00277] O meio de seleção preferido é HAT. Apenas as células capazes de operar os caminhos de recuperação de nucleotídeo são capazes de sobreviver no meio HAT. As células de mieloma são defeituosas nas enzimas chaves do caminho de recuperação, por exemplo, hipoxantina fosforibosil transferase (HPRT) e estes podem não sobreviver. As células B podem operar este caminho, mas estas tem uma triagem da vida média limitada na cultura e geralmente morrem dentro de cerca de duas semanas. Portanto, apenas as células que podem sobreviver no meio seletivo são aqueles híbridos a partir do mieloma e as células B.

[00278] Esta cultura fornece uma população de hibridomas de que os hibridomas específicos são selecionados. Tipicamente, a seleção de hibridomas é realizado bela cultura das células pela diluição de clone simples nas placas microtituladoras, seguido para testar os sobrenadantes clonais individuais (após cerca de duas a três semanas) para a reatividade desejada. Os ensaios rápidos e simples incluem radioimunoensaios, imunoensaios de enzima, ensaios de citotoxicidade, ensaios de placa, ligações de imunoligação de ponto e outros.

[00279] Os hibridomas selecionados seriamente diluídos e clonados nas linhagens de célula de produção de anticorpo individual que os clones então podem ser propagados indefinidamente para fornecer MAbs. As linhagens celulares podem ser exploradas para a produção MAb em dois caminhos básicos. Uma amostra de hibridoma pode ser injetada (frequentemente na cavidade peritoneal) em um animal histocompatível do tipo que foi usado para fornecer as células somáticas e mieloma para a fusão original. O animal injetado desenvolve os tumores secretam o anticorpo / 140 monoclonal específico produzido pelo híbrido de célula fundida. Os fluidos corporais do animal, tal como fluido de soro ou ascite, pode então ser puncionados para fornecer MAbs na concentração alta. As linhagens celulares individuais também devem ser cultivadas in vitro, onde os MAbs são naturalmente secretados no meio de cultura a partir de que estes podem ser prontamente obtidos nas concentrações altas. Os MAbs produzidos pelos meios podem ainda ser purificados, se desejado, usando filtração, centrifugação e vários métodos cromatográficos tal como HPLC ou cromatografia de afinidade.

[00280] Seguindo o isolamento e caracterização do anticorpo monoclonal desejado, o mRNA pode ser isolado usando as técnicas bem conhecidas na técnica e usadas como um modelo para a amplificação da sequência alvo.

[00281] Um número de processos dependentes do modelo são disponíveis para amplificar a sequência alvo antes e depois da mutagênese. Um dos melhores métodos de amplificação conhecidos é a reação de cadeia de polimerase (referido como PCR) que é descrito no detalhe na Patente U.S. N°. 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159 e em Innis et al., 1990, cada um de que é incorporado neste por referência em sua totalidade. Brevemente, em PCR, duas sequências iniciadoras são preparadas que são complementares as regiões nos filamentos complementares da sequência alvo. Um excesso de desoxinucleosídeo trifosfatos são adicionados a uma mistura de reação junto com uma polimerase de DNA, por exemplo, polimerase Taq. Se a sequência alvo está presente em uma amostra, os iniciadores ligarão ao alvo e a polimerase causará os iniciadores a serem estendidos junto com a sequência alvo pela adição de um nucleotídeo. Para aumentar e diminuir a temperatura da mistura de reação, os iniciadores estendidos dissociarão a partir do alvo para formar os produtos de reação, o excesso de iniciadores ligarão o alvo e os produtos de reação e o processo é repetido. Preferivelmente um / 140 procedimento de amplificação de transcriptase reversa PCR pode ser realizado a fim de quantificar a quantidade do alvo amplificado. As metodologias de reação de cadeia de polimerase são bem conhecidas na técnica. Usando as técnicas de amplificação enzimática tal como PCR, elementos de controle desejado podem ser projetados no iniciador e deste modo, será incorporado no produto de DNA.

[00282] Outro método para a amplificação é a reação de cadeia de ligase (“LCR”), descrita em EPA N°. 320 308, incorporado neste por referência em sua totalidade. Em LCR, dois pares de sonda complementar são preparados e na presença da sequência alvo, cada par ligará os filamentos complementares opostos do alvo de modo que estes estejam em contato. Na presença de uma ligase, os dois pares de sonda ligarão para formar uma unidade simples. Para o ciclo de temperatura, como em PCR, unidades ligadas dissociamse ao alvo e então servem como as “sequências alvos” para a ligação do excesso de pares de sonda. Patente U.S. N°. 4.883.750 descreve um método similar ao LCR para os pares de sonda de ligação à sequência alvo.

[00283] Qbeta Replicase, descrito em Pedido PCT N°. PCT/US87/00880, também pode ser usado como um método de amplificação. Neste método, uma sequência replicativa de RNA que tem uma região complementar aquele de um alvo é adicionado a uma amostra na presença de uma polimerase RNA. A polimerase copiará a sequência replicativa que então pode ser detectada.

[00284] Um método de amplificação isotérmico, em que a endonucleases e ligases de restrição são usados para atingir a amplificação das moléculas alvos que contém nucleotídeo 5'-[alfa-tio]-trifosfatos em um filamento de um local de restrição também pode ser útil na amplificação dos ácidos nucleicos (Walker et al., 1992).

[00285] Amplificação de substituição de filamento (SDA) é outro método que realiza a amplificação isotérmica dos ácidos nucleicos envolve os / 140 ciclos múltiplos de substituição e síntese de filamento, isto é, tradução de corte. Um método similar, denominado reação de cadeia de reparo (RCR) envolve a anelação de diversas sondas em toda parte de uma região alvejada para a amplificação, seguido por uma reação de reparo em que apenas dois destas quatro bases estão presentes. A outras duas bases podem ser adicionadas como derivados biotinilados para fácil detecção. Um método similar é usado em SDA. As sequências específicas alvos também podem ser detectadas usando-se uma reação de sonda cíclica (CPR). Em CPR, uma sonda tendo as sequências 3' e 5' de DNA não específico e a sequência média de RNA específico é hibridizado ao DNA que está presente em uma amostra. Na hibridização, a reação é tratada com RNaseH e os produtos da sonda identificados como produtos distintos que são liberados após digestão. O modelo original é anelado ao ciclo da sonda e a reação é repetida.

[00286] Outros métodos de amplificação são descritos em Pedido GB N°. 2 202 328 e no Pedido PCT N°. PCT/US89/01025, cada um de que é incorporado neste por referência em sua totalidade, pode ser usado de acordo com a presente invenção. Na aplicação formadora, os iniciadores “modificados” são usados em um PCR igual, modelo e síntese dependente de enzima. Os iniciadores podem ser modificados pela rotulação com uma porção de captura (por exemplo, biotina) e/ou uma porção detectora (por exemplo, enzima). Na última aplicação, um excesso das sondas rotuladas é adicionado a uma amostra. Na presença da sequência alvo, a sonda liga-se e é cataliticamente clivada. Após a clivagem, a sequência alvo é liberada intacta a ser ligada pelo excesso da sonda. A clivagem dos sinais de sonda rotulados da presença da sequência alvo.

[00287] Outros procedimentos de amplificação do ácido nucleico incluem os sistemas de amplificação com base na transcrição (TAS), incluindo amplificação com base na sequência de ácido nucleico (NASBA) e 3SR (Kwoh et al., 1989). Em NASBA, os ácidos nucleicos podem ser / 140 preparados para a amplificação para a extração de clorofórmio/fenol padrão, desnaturação de calor de uma amostra clínica, tratamento com o tampão de lise e colunas de minispina para o isolamento de DNA e RNA ou extração de cloreto de guanidínio de RNA. Estas técnicas de amplificação envolvem a anelação de um iniciador que tem as sequências específicas alvos. Seguindo a polimerização, os híbridos DNA/RNA são digeridos com RNase H enquanto as moléculas de DNA filamentadas duplas são desnaturados por calor novamente. No caso do DNA filamentado simples é feito filamentado totalmente duplo pela adição do segundo iniciador específico alvo, seguido para a polimerização. As moléculas de DNA filamentadas duplas são então multiplicadas, transcritas por uma polimerase tal como T7 ou SP6. Em uma reação cíclica isotérmica, os RNAs são reversos transcritos em DNA filamentado duplo e transcritos uma vez contra com uma polimerase tal como T7 ou SP6. Os produtos resultantes, se truncado ou completo, indicam as sequências específicas alvos.

[00288] Davey et al., EPA N°. 329 822 (incorporado neste por referência em sua totalidade) divulga um processo de amplificação de ácido nucleico que envolve o RNA filamentado simples ciclicamente sintetizados (“ssRNA”), ssDNA e DNA filamentado duplo (dsDNA), que pode ser usado de acordo com a presente invenção. O ssRNA é um primeiro modelo para um primeiro oligonucleotídeo iniciador, que é alongado pela transcriptase reversa (polimerase de DNA dependente por RNA). O RNA é então removido a partir do duplex de DNA:RNA resultante pela ação de ribonuclease H (RNase H, um RNase específico para RNA em duplex com DNA ou RNA). O ssDNA resultante é um segundo modelo para um segundo iniciador, que também inclui uma sequência de um promotor de polimerase RNA (exemplificado pela polimerase de T7 RNA) 5' a sua homologia ao modelo. Este iniciador é então estendido pela polimerase de DNA (exemplificado pelo fragmento “Kienow” amplo de polimerase de E. eoli DNA I), resultando eomo uma molécula de DNA filamentado duplo (“dsDNA”), tendo a sequêneia idêntiea / 140 aquele do RNA original entre os iniciadores e tendo adicionalmente, em um final, uma sequência promotora. Esta sequência promotora pode ser usada pela polimerase de RNA apropriada para fabricar muitas cópias de RNA do DNA. Estas cópias podem então entrar novamente no ciclo que leva à amoplificação muito rápida. Com a própria seleção de enzimas, esta amplificação pode ser feita isotermicamente sem adição das enzimas em cada ciclo. Por causa da natureza cíclica deste processo, a sequência de partida pode ser selecionada na forma de DNA ou RNA.

[00289] Miller et al., Pedido PCT WO 89/06700 (incorporado neste por referência em sua totalidade) divulga um esquema de amplificação da sequência de ácido nucleico com base na hibridização de uma sequência promotora/inieiadora a um DNA filamentado simples alvo (“ssDNA”) seguido pela transcrição de muitas cópias de RNA da sequência. Este esquema não é cíclico, isto é, novos modelos não são produzidos a partir dos transcritos de RNA resultantes. Outros métodos de amplificação incluem “race”” e “PCR de lado únieo” (Frohman, 1990; O'Hara et al., 1989).

[00290] Os métodos com base na ligação de dois (ou mais) oligonueleotídeos na presença de áeido nueleieo tendo uma sequêneia do “dioligonueleotídeo” resultante, portanto amplifieando o di-oligonucleotídeo, também pode ser usado na etapa de amplificação (Wu et al., 1989).

[00291] Os produtos de amplificação podem ser analisados por agarose, agarose-acrilamida ou eletroforese em gel de poliacrilamida usando os métodos padrões (ver, por exemplo, Maniatis et al., 1982). Por exemplo, um pode usar um gel de agarose a 1 % tingido com brometo de etídio e visualizado sob luz UV. Alternativamente, os produtos de amplificação podem ser integralmente rotulados com radio- ou fluorometricamente rotulados por nucleotídeos. Os géis podem então ser expostos a película de raio x ou visualizados sob o espectro de estimulação apropriado, respectivamente.

[00292] Os procedimentos mutagênicos da presente invenção podem / 140 compreender qualquer método mutagênico que pode ser ajustado em um local particular em um gene, isto é, direcionado ao local ou mutagênese específica ao local. Por causa da presente invenção alivia na mutagênese compreensiva, a presente invenção considerada como as formas de realização preferidas aqueles procedimentos mutagênicos que são rápidos, eficientes e de custo efetivo.

[00293] Em uma forma de realização, o procedimento mutagênico utiliza as técnicas de síntese. Ao fazê-lo, é possível exatamente colocar a substituição em uma ou mais localizações particulares dentro do gene e também especificamente definir a natureza das alterações. Os métodos de síntese química para DNA são bem conhecidos dentro da técnica. As técnicas de fase sólida são preferidas nesta relação.

[00294] Uma vantagem ao método de fase sólida da síntese do gene é a oportunidade para a mutagênese usando técnicas de síntese combinatoriais. As técnicas de síntese combinatoriais são definidas como aquelas técnicas produzindo as coleções ou bibliotecas de compostos simultaneamente, para ligar sequencialmente os blocos de construção diferentes. As bibliotecas podem ser construídas usando os compostos livres em solução, mas preferivelmente o composto é ligado a um suporte sólido tal como uma pérola, partícula sólida ou ainda exibida na superfície de um microorganismo. [00295] Diversos métodos existem para a síntese combinatória (Holmes et al., 1995; Burbaum et al., 1995; Martin et al., 1995; Freier et al., 1995; Pei et al., 1991; Bruce et al., 1995; Ohlmeyer et al., 1993), incluindo síntese de união ou síntese paralela. A síntese de união pode ser usada para produzir as quantidades menores de um número amplo de compostos, quanto a síntese paralela produzirá quantidades amplas de um número relativamente menor de compostos. Em termos gerais, usando a síntese de união, os compostos são sintetizados na superfície de uma micropartícula. Em cada etapa, as partículas são fracionadas em diversos grupos para a adição do

100 / 140 próximo componente. Os grupos diferentes são então recombinandos e fracionados para formar novos grupos. O processo é repetido até o composto ser finalizado. Cada partícula mantem diversas cópias do mesmo compostos permitindo a separação e a purificação fácil. A síntese de união pode apenas conduzir usando um suporte sólido.

[00296] Uma técnica alternativa conhecida como síntese paralela pode ser conduzida na fase sólida ou solução. Usando a síntese paralela, compostos diferentes são sintetizados nos receptáculos separados, frequentemente usando automático. A síntese paralela pode ser conduzida na placa microtituladora onde os reagentes diferentes podem ser adicionados em cada reservatório em uma maneira pré-definida para a produção de uma biblioteca combinatorial. A síntese paralela é o método preferido para o uso com as técnicas enzimáticas. Será bem entendido que muitas modificações desta técnica existem e podem ser adaptadas para o uso com a presente invenção. Usando-se os métodos combinatoriais, um número amplo de modelos dos genes podem ser sintetizados.

[00297] Os genes mutantes podem ser gerados para os métodos semisintéticos conhecidos na técnica (Barbas et al., 1992). Usando as regiões conservadas de um fragmento de anticorpo como uma estrutura, regiões variáveis podem ser inseridas em combinações aleatórias uma ou mais em um tempo para alterar a especificidade do fragmento de anticorpo e gerar os locais de ligação novos, especialmente na geração de anticorpos aos antígenos não condutivos a imunização tal como compostos tóxicos ou instáveis. Juntos com as mesmas linhagens, uma sequência de anticorpo conhecida pode ser variada pela introdução aleatória. Este pode ser acompanhado pelos métodos bem conhecidos na técnica tal como o uso de PCR propenso ao erro.

[00298] Usando os iniciadores de oligonucleotídeos apropriados, PCR é usado para a síntese rápida do modelo de DNA contendo uma ou mais mutações no gene de proteína de ligação. A mutagênese específica por local é

101 / 140 uma técnica útil na preparação dos peptídeos individuais, ou proteínas biologicamente funcionais ou peptídeos, através da mutagênese específica do DNA subjacente. A técnica ainda fornece uma capacidade pronta para preparar e testar as variantes da sequência, incorporando uma ou mais das considerações precedentes, pela introdução de uma ou mais mudanças na sequência de nucleotídeo no DNA. A mutagênese específica por local permite a produção de mutantes através do uso das sequências de oligonucleotídeo específicas que codificam a sequência de DNA da mutação desejada, bem como um número suficiente dos nucleotídeos adjacentes dos nucleotídeos adjuvantes, para fornecer uma sequência iniciadora do tamanho suficiente e complexidade da sequência para formar um duplex estável em ambos lados da junção de deleção sendo transversa. Tipicamente, um iniciador de cerca de 17 a 25 nucleotídeos em comprimento é preferido, com cerca de 5 a 10 resíduos em ambos lados da junção de uma sequência sendo alterada.

[00299] A técnica tipicamente utiliza um vetor bacteriófago que existe tanto na forma filamentada dupla quanto filamentada simples. Os vetores típicos úteis na mutagênese direcionada ao local incluem os vetores tal como o fago M13. Estes fatores de fago são comercialmente disponíveis e seu uso é geralmente bem conhecido aquele habilitado na técnica. Os plasmídeos filamentados duplos também são rotineiramente utilizados na mutagênese direcionada, que elimina a etapa de transferência do gene de interesse a partir de um fago a um plasmídeo.

[00300] Em geral, a mutagênese direcionada ao local é realizada para primeiro obter um vetor filamentado simples, ou fundir de dois filamentos de um vetor filamentado duplo incluindo dentro desta sequência uma sequência de DNA que codifica a proteína desejada. Um iniciador de oligonucleotídeo conduz a sequência mutada desejada é sinteticamente preparada. Este iniciador é então anelado com a preparação de DNA filamentado simples, levando em conta o grau de desacordo quando seleciona as condições de

102 / 140 hibridização e submete as enzimas de polimerização de DNA tal como fragmento E. coli polimerase I Klenow, a fim de completar a síntese de filamento que conduz a mutação. Deste modo, um heteroduplex é formado em que um filamento codifica a sequência não mutada original e o segundo filamento conduz a mutação desejada. Este vetor heteroduplex é então usado para transformar as células apropriadas, tal como as células E. coli e clones são selecionados que incluem os vetores recombinantes que conduzem a colocação da sequência mutada.

[00301] A preparação das variantes de sequência do gene selecionado usando a mutagênese direcionada ao local é fornecido como um meio de produzir as espécies potencialmente úteis e não é significado limitar, como existe outros caminhos em que as variantes de sequência dos genes podem ser obtidos. Por exemplo, vetores recombinantes que codificam o gene desejado pode ser tratada com os agentes mutagênicos, tal como hidroxilamina, para obter as variantes de sequência.

[00302] Em certas aplicações, a substituição dos aminoácidos dos aminoácidos pela mutagênese direcionada ao local, é apreciado que as condições de estringência inferior são requeridos. Sob estas condições, a hibridização pode ocorrer ainda através das sequências de sonda e o filamento alvo não são preferivelmente complementar, mas são propensos ao erro em uma ou mais posições. As condições podem ser retribuídas menos estringente para o aumento da concentração salina e diminuição da temperatura. Por exemplo, uma condição de estringência média deve ser fornecida por cerca de 0,1 a 0,25 M de NaCl em temperaturas de cerca de 37°C a cerca de 55°C, quanto uma condição de estringência baixa deve ser fornecido por cerca de 0,15 M a cerca de 0,9 M de sal, em temperaturas que variam de cerca de 20°C a cerca de 55°C. Deste modo, as condições de hibridização podem ser prontamente manipuladas e deste modo será geralmente um método de seleção dependente dos resultados desejados.

103 / 140 [00303] Em outras formas de realização, a hibridização pode ser atingida sob condições de, por exemplo, 50 mM de Tris-HC1 (pH 8,3), 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 10 mM de ditiotreitol, em temperaturas entre aproximadamente 20°C a cerca de 37°C. Outras condições de hibridização utilizadas devem incluir aproximadamente 10 mM de Tris-HC1 (pH 8,3), 50 mM de KC1, 1,5 pM de MgC12, em temperaturas que variam de aproximadamente 40°C a cerca de 72°C. A formamida e SDS também podem ser usados para alterar as condições de hibridização.

[00304] Em uma forma de realização particular, a sobreposição PCR pode ser utilizada. Brevemente, um plasmídeo é usado como um apadrão para o primeiro conjunto de PCR. Os produtos de PCR do primeiro conjunto são purificados e usados, junto com iniciadores externos, na reação de PCR de extensão de sobreposição. Os produtos finais continham a substituição direcionada ao local de um dado aminoácido com todos os outros resíduos de aminoácido possíveis.

[00305] O modelo DNA mutageneizado para o polipeptídeo de interesse pode ser clonado em um plasmídeo para a transcrição/tradução in vitro ou na forma de realização preferida, os elementos de controle apropriados são incluídos dentro do produto PCR para a transcrição/tradução direta in vitro. A transcrição/tradução in vitro dos genes usa os extratos livres de células para fornecer as enzimas requeridas, os ribossomos e fatores de proteína. A síntese de proteínas é direcionada por mRNA sintetizado a partir dos modelos de DNA desejados. O modelo de DNA contém os elementos de controle apropriados para o sistema usado incluindo um local de ligação de ribossomo e a sequência promotora. Uma pessoa habilitada na técnica claramente reconhecerá os elementos requeridos apropriados para cada sistema.

[00306] As técnicas procarióticas in vitro para a produção de proteína foram o primeiro a ser usado (Zubay et al., 1970). Os sistemas subsequentemente eucarióticos foram desenvolvidos usando o germe de trigo

104 / 140 (Roberts, 1973) e reticulócitos de coelho (Pelham, 1976). Diversos novos desenvolvimentos têm aumentado a eficiência destas técnicas. Os exemplos incluem, o desenvolvimento das cepas deficientes de nuclease de E. coli para melhorar os resultados usando modelos de DNA lineares (Yang, 1980) e tratamento de lisados reticulócitos com nuclease microcócica a qualquer expressão de fundamento inferior a partir do sistema.

[00307] Os sistemas mais recentes desenvolvidos para transcrição/tradução in vitro são com base na transcrição pelas polimerases de RNA de fago incluindo SP6 e SP7 (Krieg, 1987, Studier, 1990). O DNA colocado sob controle dos elementos promotores T7 podem ser usados como um modelo para a transcrição in vitro pela polimerase T7 RNA ou para a transcrição/tradução completa in vitro com a polimerase adicionada ao sistema de síntese de proteína procariótica ou eucariótica. Quanto os métodos da presente invenção podem ser usados com qualquer sistema de transcrição/tradução in vitro, o sistema T7 é preferido para a transcrição e o uso de um sistema de tradução procariótica é preferido que nenhuma cobertura de RNA seja requerida.

[00308] Usando-se os métodos in vitro para a tradução, derivados de aminoácidos podem ser incorporados na proteína pela adição do aminoácido derivado a mistura do sistema de síntese de proteína. A variação da concentração dos derivados, com relação ao aminoácido normal, permite um para criar uma população misturada e mede os efeitos relativos.

[00309] Os polipeptídeos mutantes gerados pela presente invenção podem ser caracterizados usando-se uma variedade de técnicas. Em geral, os produtos de proteína podem ser analisados para o peso molecular aparente correto usando SDS-PAGE. Este fornece uma indicação inicial que o polipeptídeo foi, de fato, sintetizado. Quando comparado à molécula natural, também indica se a dobra ou processamento normal acontece com o mutante. Com referência, este pode mostrar-se útil para a rotulação do polipeptídeo.

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Alternativamente, o polipeptídeo pode ser identificado pelo tingimento do gel. [00310] Além da síntese simples, as proteínas podem ser caracterizadas de acordo com várias propriedades e uma faixa extensiva de funções. As propriedades incluem ponto isoelétrico, estabilidade térmica, taxa de sedimentação e dobra. Uma maneira de examinar a dobra é a capacidade de ser reconhecida por um associado de ligação de cognato. O exemplo do iniciador desta função é a interação do anticorpo-antígeno. Uma ampla variedade dos formatos de imunoensaio diferente estão disponíveis para este propósito e são bem conhecidos na técnica. Principalmente, as mudanças na afinidade ou especificidade podem ser determinadas quando a proteína é contatada com um ligante específico ou painéis dos ligantes relatados.

[00311] Os imunoensaios podem ser geralmente divididos em dois tipos: ensaios heterogêneos requerendo as etapas de separação múltipla e ensaios homogêneos que são diretamente realizados. Os imunoensaios heterogêneos em geral envolvem um ligante ou anticorpo imobilizado em uma matriz sólida. Uma amostra contendo um ligante é contatado com o anticorpo imobilizado e a quantidade do complexo formado no suporte de matriz é determinado a partir de um rótulo ligado diretamente ou indiretamente no complexo imobilizado. Como usado no contexto da presente invenção, o ligante é definido como uma espécie que interage com uma molécula não idêntica para formar uma ligação firme, complexo estável. Para os propósitos práticos, a afinidade de ligação é usualmente maior do que cerca de 106 M^-1 e é preferivelmente na faixa de 109 -10¹⁵ M^-1. O ligante pode ser qualquer um dos tipos diversos das moléculas orgânicas, incluindo hidrocarbonetos alicíclicos, aromáticos polinucleares, compostos halogenados, benzenóides, hidrocarbonetos polinucleares, heterocíclicos de nitrogênio, heterocíclicos de enxofre, heterocíclicos de oxigênio e alcano, hidrocarbonetos de alqueno alquino, etc. As moléculas biológicas são de interesse particular, incluindo aminoácidos, peptídeos, proteínas, lipídeos, sacarídeos, ácidos nucleicos

106 / 140 e combinações destes. É claro será entendido que estes são por meio do exemplo apenas e que os métodos de imunoensaios considerados são aplicáveis para detectar uma ampla faixa extraordinária, de modo como um pode obter um anticorpo que liga-se com o ligante de interesse.

[00312] Os imunoensaios heterogêneos podem ser realizados como os ensaios de sanduíche em que uma molécula de interesse é reagido com um anticorpo imobilizado que especificamente liga-se aquela molécula com a afinidade alta. Em uma segunda etapa, um conjugado formado a partir do mesmo ou anticorpo diferente ao antígeno e uma molécula marcadora é reagida com o complexo de antígeno-anticorpo na matriz de imobilização. Após a remoção do excesso o conjugado marcador livre, o conjugado marcador de ligação, que é proporcional a quantidade de ligante na amostra, é medido.

[00313] A detecção da formação de imunocomplexo é bem conhecido na técnica e pode ser atingido através da aplicação dos métodos numerosos. Estes métodos são tipicamente baseados na detecção de um rótulo ou marcador, tal como qualquer um do radioativo, fluorescente, quimioluminescente, eletroquimioluminescente, rótulos ou etiquetas enzimáticas ou biológicas conhecidas na técnica. Patentes U.S. com relação ao uso de tais rótulos incluem Patente U.S. N°. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241, cada um incorporado neste por referência. É claro, um pode observar as vantagens adicionais através do uso de um ligante de ligação secundário tal como um segundo anticorpo ou uma colocação de ligação de ligante de biotina/avidina, como é conhecido na técnica.

[00314] Os métodos preferidos para a detecção incluem a radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunosorvente ligado por enzima (ELISA) com ELISA sendo mais preferido devido a sensibilidade geralmente aumentada. ELISAs são extensivamente usadas nas aplicações de

107 / 140 biotecnologia, particularmente como imunoensaios para uma ampla faixa de substâncias antigênicas. A sensibilidade de ELISA é baseada na amplificação enzimática do sinal.

[00315] Outras proteínas preferidas consideradas para o uso de acordo com a presente invenção são aqueles que tem um ensaio conveniente para a atividade. Exemplos representativos das interações alvos incluem catálise, interações de substrato-enzima, interações de ácido nucleico-proteína, interações de receptor-ligante e interações de proteína-metal. Nestes ensaios das proteínas mutantes podem ser comparados com a proteína de tipo selvagem para as mudanças na capacidade para realizar qualquer uma das funções precedentes.

[00316] Como usado neste, o termo “contatar” é definido eomo os componentes de reação em proximidade próximo o bastante em cada outro para permitir a interação desejada para ocorrer. O contato pode ser acompanhado pela mistura dos componentes na solução, por exemplo, ou a interação heterogênea tal como pelo contato de fluxo através da coluna ou matriz de imobilização que liga-se a um dos componentes.

[00317] Para as proteínas mutantes tendo uma atividade catalítica, a reação apropriada pode ser monitorada para uma mudança na taxa catalítica ou uma alteração em especificidade.

[00318] Os anticorpos produzidos e isolados pelo método da invenção são selecionados para ligar um alvo pré-determinado. Tipicamente, o alvo pré-determinado será selecionado em vista de sua aplicabilidade como um alvo diagnóstico e/ou terapêutico. O alvo pré-determinado pode ser os anticorpos de epítopo conhecidos ou não conhecidos geralmente ligam-se a um antígeno predeterminado (por exemplo, o imunogênio) com uma afinidade de cerca de pelo menos 1 x 10⁷ M^-1 preferivelmente com uma afinidade de cerca de pelo menos 5 x 10⁷ M^-1 mais preferivelmente com uma afinidade de pelo menos l x 10⁸ M^-1 a 1 x 109 M^-1 ou mais, algumas vezes até 1 x 10¹⁰ M^-1

108 / 140 ou mais. Frequentemente, o antígeno pré-determinado é uma proteína humana, tal como por exemplo, um antígeno de superfície celular humana (por exemplo, CD4, CD8, receptor IL-2, receptor EGF, receptor PDGF), outra macromolécula biológica humana (por exemplo, trombomodulina, proteína C, antígeno de carboidrato, antígeno de sialila de Lewis, L-selectina), ou macromolécula associada a doença não humana (por exemplo, LPS bacteriana, vírion proteína de capsídeo ou glicoproteína de envelope) e outros. [00319] Em outro exemplo, diversos relatórios da utilidade diagnóstica e terapêutica de scFv foram publicadas (Gruber et al., 1994 op.cit.; Lilley et al., 1994 op.cit.; Huston et al., Int. Rev. Immunol 1993, 10:a 195, Sandhu JS, Crit. Rev. Biotechnol., 1992,12: 437).

[00320] Os anticorpos de afinidade alta da especificidade desejada podem ser projetados e expressados em uma variedade dos sistemas. Por exemplo, scFv foram produzidos em plantas (Firek et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23: 861) e podem ser prontamente feitos nos sistemas procarióticos (Owens RJ and Young RJ, J. Immunol. Meth., 1994,168: 149; Johnson S and Bird RE, Methods Enzymol., 1991, 203: 88). Além disso, os anticorpos de cadeia simples podem ser usados como uma base para a construção de anticorpos totais ou vários fragmentos destes (Kettleborough et al., Euro J. Immunol., 1994, 24: 952). A região variável que codifica a sequência pode ser isolada (por exemplo, pela amplificação ou subclonagem de PCR) e unido a uma sequência de uma região constante humana para codificar um anticorpo de sequência humana mais adequado para os usos terapêuticos humanos onde a imunogenicidade é preferivelmente minimizada. Os polinucleotídeos tendo as sequências que codificam humanos totalmente resultantes podem ser expressados em uma célula hospedeira (por exemplo, a partir de um vetor de expressão em uma célula eucariótica) e purificado para a formulação farmacêutica.

[00321] As construções da expressão de DNA tipicamente incluirão

109 / 140 uma sequência de DNA de controle de expressão operavelmente ligado as sequências codificadoras, incluindo regiões promotoras heterólogas ou naturalmente associadas. Preferivelmente, as sequências de controle de expressão serão sistemas promotores eucarióticos nos vetores capazes de transformar ou transfectar as células hospedeiras eucarióticas. Uma vez que o vetor foi incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para a expressão de alto nível das sequências de nueleotídeos e a coleta e purificação dos anticorpos “projetados” mutantes. [00322] Como estado previamente, as sequências de DNA serão expressadas nos hospedeiros após uma sequências foram operavelmente ligados a uma sequência de controle de expressão (isto é, posicionado para garantir a transcrição e tradução do gene estrutural). Estes vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomos ou como uma parte integral do DNA cromossomal hospedeiro. Geralmente, os vetores de expressão conterão os marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina ou neomicina, para permitir a detecção daquelas células transformadas com as sequências de DNA desejadas (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 4.704.362, que é incorporado neste por referência).

[00323] Além disso aos microorganismos eucarióticos tal como levedura, cultura celular de tecido de mamífero também pode ser usado para produzir os polipeptídeos da presente invenção (ver, Winnacker, “From Genes to Clones,” VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987), que é incorporado neste por referência). As células eucarióticas são preferidas, por causa de um número de linhagens de células hospedeiras adequadas capazes de secretar as imunoglobulinas intactas que foram desenvolvidas na técnica e incluindo as linhagens de células CHO, várias linhagens de células COS, células HeLa, linhagens de células de mieloma, células B ou hibridomas. Os vetores de expressão para estas células podem incluir as sequências de controle de expressão, tal como uma origem de replicação, um promotor, um

110 / 140 intensificador (Queen et al., Immunol. Rev. 1986, 89: 49) e os locais de informação de processamento necessário, tal como locais de ligação de ribossomo, locais de união RNA, locais de poliadenilação e sequências terminadoras transcripcionais. As sequências de controle de expressão preferidas são promotores derivados dos genes de imunoglobulina, citomegalovírus, SV40, Adenovírus, vírus de papiloma bovino e outros. [00324] A transcrição de DNA eucariótico pode ser aumentado para a inserção de uma sequência intensificadora no vetor. Os intensificadores são as sequências de atuação de cis entre 10 a 30 obp que aumentam a transcrição por um promotor. Os intensificadores podem efetivamente aumentar a transcrição quanto 5' ou 3' na unidade de transcrição. Este também são efetivos se localizado dentro de um íntron ou dentro da sequência codificadora por si só. Tipicamente, os intensificadores virais são usados, incluindo intensificadores SV40, intensificadores de citomegalovírus, intensificadores de polioma e intensificadores de adenovírus. As sequências intensificadoras a partir dos sistemas de mamífero também são comumente usados, tal como o intensificador de cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.

[00325] Os sistemas de vetor de expressão de mamífero também tipicamente incluirão um gene marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, o gene de redutase de diidrofolato (DHFR), o gene de timidina cinase (TK), ou genes procarióticos que conferem a resistência ao medicamento. Os primeiros dois genes marcadores preferidos ao uso das linhagens da célula mutantes que necessitam a capacidade de desenvolver sem a adição de timidina ao meio de desenvolvimento. As células transformadas então podem ser identificadas por sua capacidade de desenvolver no meio não suplementado. Exemplos dos genes de resistência de medicamento procariótico úteis como os marcadores incluem os genes que conferem a resistência a G418, ácido micofenólico e

111 / 140 higromicina.

[00326] Os vetores contendo os segmentos de DNA de interesse podem ser transferidos na célula hospedeira por métodos bem conhecidos, dependendo do tipo do hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizado para as células procarióticas, considerando o tratamento de fosfato de cálcio. A lipofecção, ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares. Outros métodos usados para transformar as células de mamíferos incluem o uso de Polibreno, fusão de protoplast, lipossomos, eletroporação e microinjeção (ver, geralmente, Sambrook et al., supra).

[00327] Uma vez expressado, os anticorpos, cadeias de imunoglobulina mutadas individuais, fragmentos de anticorpo mutado e outros polipeptídeos de imunoglobulina da invenção podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de coluna de fração, eletroforese em gel e outros (ver, geralmente, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Uma vez purificado, parcialmente ou para homogeneidade como desejado, os polipeptídeos então podem ser usados terapeuticamente ou no desenvolvimento e realização dos procedimentos de ensaio, tingimentos imunofluorescentes e outros (ver, geralmente, Immunological Methods, Vols. I and II, Eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, N.Y. N.Y. (1979 and 1981).

[00328] Os oligopeptídeos da presente invenção podem ser usados para o diagnóstico e terapia. Por meio da ilustração e não limitação, os anticorpos podem ser usados para tratar o câncer, doenças autoimunes, ou infecções virais. Para o tratamento de câncer, os anticorpos tipicamente ligarão a um antígeno expressado preferencialmente nas células cancerígenas, tal como erbB-2, CEA, CD33 e muitos outros antígenos bem conhecidos aqueles habilitados na técnica. Para o tratamento da doença autoimune, os anticorpos tipicamente ligarão a um antígeno expressado nas células T, tal como CD4, o receptor IL-2, os vários

112 / 140 receptores de antígeno de célula T e muitos outros a antígenos bem conhecidos aqueles habilitados na técnica (por exemplo, ver Fundamental Immunology, 2° ed., W. E. Paul, ed., Raven Press: Nova Iorque, N.Y., que é incorporado neste por referência). Para o tratamento das infecções virais, os anticorpos tipicamente ligarão a um antígeno expressado nas células infectadas por um vírus particular tal como as várias glicoproteínas (por exemplo, gB, gD, gE) do vírus de herpes simples e citomegalovírus e muitos outros antígenos bem conhecidos aqueles habilitados na técnica (por exemplo, ver Virology, 2° ed., B. N. Fields et al., eds., (1990), Raven Press: Nova Iorque, N.Y.).

[00329] As composições compreendendo os anticorpos da presente invenção são úteis para a administração parenteral, isto é, subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. As composições para a administração parenteral comumente compreenderá uma solução do anticorpo ou um coquetel deste dissolvido em um carregador aceitável, preferivelmente um carregador aquoso. Uma variedade de carregadores aquosos pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada, 0,4 % de solução salina, 0,3 % de glicina e outros. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de substância particulada. Estas composições podem ser esterilizadas pelas técnicas de esterilização bem conhecidas, convencionais. As composições podem conter as substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requeridos para aproximar as condições fisiológicos tal como ajuste de pH e agentes de tamponação, agentes de ajuste de toxicidade e outros, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. A concentração dos anticorpos mutantes nestas formulações podem variar amplamente, isto é, de menos do que cerca de 0,01 %, usualmente pelo menos cerca de 0,1 % tanto quanto 5 % em peso e será principalmente selecionado nos volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular da administração selecionada.

[00330] Deste modo, uma composição farmacêutica para a injeção

113 / 140 intramuscular deve ser feita até conter 1 ml de água tamponada estéril e cerca de 1 mg do anticorpo do anticorpo mutante. Uma composição típica para a infusão intravenosa pode ser feita até conter 250 ml de solução de Ringer estéril e 10 mg de anticorpo mutante. Os métodos atuais para a preparação de composições administráveis parenteralmente serão conhecidas ou evidentes aquelas pessoas habilitadas na técnica e são descritas em mais detalhes em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 20° Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (2000), que é incorporado neste por referência.

Fabricação de candidatos e/ou candidatos evoluídos [00331] Em uma forma de realização, o sistema eucariótico é um sistema de mamífero selecionado de um dos grupos que consiste de CHO, HEK293, IM9, DS-1, THP-1, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MMl, Ovcar 3, HT 1080, Pane-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDAMB-468, LnCAP, NRK-49F e linhagens células SP2/0; e esplenócitos de camundongo e coelho PBMC.

[00332] Em uma forma de realização, uma variedade de células hospedeiras de mamífero podem ser usadas na fabricação de candidato, incluindo células de Fibroblasto (3T3, camundongo; BHK21, hamster sírio) células epiteliais (MDCK, cão; Hela, humano; PtKl, canguru rato) células de plasma ((SP2/0 e NSO, camundongo) células de rim (293, humano; COS, macaco) células de ovário (CHO, hamster Chinês) células embriônicas (R1 e E14.1, camundongo; H1 e H9, humano; PER C.6, humano).

[00333] Em certos aspectos, os anticorpos recombinantes são produzidos em CHO e NSO e linhagens celulares SP2/0. Em um aspecto específico, o sistema mamífero é uma linhagem celular CHO-S. Os sistemas de vetor de expressão mais frequentemente usados são sistemas de expressão de glutamina sintetase e outros com base nos genes de diidrofolato redutase. [00334] Em outra forma de realização, o sistema eucariótica é um

114 / 140 sistema de célula de levedura. Em um aspecto, o sistema de célula de levedura é selecionado de S. cerevisiae ou células picchia.

[00335] No método da presente invenção, os hospedeiros usados para a triagem das moléculas evoluídas são os mesmos como hospedeiros usados para a fabricação a jusante de acertos. Em outro aspecto da presente invenção, o sistema genético usado para a descoberta e evolução de proteínas é exatamente o mesmo como o sistema genético usado para a fabricação da proteína para as aplicações comerciais.

Biossimilares [00336] Os biossimilares são terapêuticos com base em proteína que tem uma sequência de aminoácido idêntico (isto é composição química) como um medicamento ético aprovado que não é mais protegido por Patente. Em um aspecto, o método CIAO é particularmente relevante para biossimilares. Enquanto é essencial para produzir a proteína terapêutica em uma formulação equivalente e composição, a ser competitiva no mercado o biossimilar deve ser feito rapidamente e como mais barato como possível. O meio de cultura celular e desenvolvimento do processo são alguns dos mais caros e partes de consumo de tempo de preparação e produção de um biossimilar.

[00337] A mudança dos códons de mutação silenciadores dentro de uma mudança terapêutica de proteína usada para a tradução de proteína mas preserva a sequência de aminoácido dentro da proteína. Estas mudanças de códon em uma variedade de posições dentro da molécula, particularmente no terminal amino pode ter impacto significante na expressão e em alguns casos ainda a glicosilação. Em um aspecto, o método CIAO é usado para selecionar e evoluir os códons de mutação silenciador em uma proteína dentro da células hospedeira similar a um ultimamente usado para a fabricação. Portanto o tempo de processo pode ser reduzido devido o rendimento da proteína e o fato que a proteína foi selecionada para expressar na linhagem de célula hospedeira, de modo que ordens de fabricação mais tradicionais foram

115 / 140 selecionadas foram da molécula. Ainda, para selecionar as moléculas em baratas, meio de cultura livre de soro, as moléculas podem ser selecionadas com os códons que permitem a fabricação barata e purificação.

[00338] Sem a elaboração adicional, acredita-se que uma pessoa habilitada na técnica pode, usando a descrição precedente, utilizar a presente invenção a sua extensão total. Os seguintes exemplos serão considerados ilustrativos e deste modo não são limitantes do remanescente da descrição em qualquer forma.

Exemplos

Exemplo 1. Geração e triagem de uma biblioteca de anticorpo [00339] Este exemplo descreve o método de gerar e triar uma biblioteca de anticorpo humano de exibição da superfície de célula de mamífero para isolar os anticorpos humanos com a atividade de ligação a um antígeno alvo usando a combinação de classificação citométrica de fluxo e ELISA.

1. Gerar as bibliotecas de anticorpo humano estavelmente integrado nas células de mamíferos tal como descrito em Apêndice 1.2, 1.3 e 1.4 abaixo.

2. Expandir os clones de biblioteca de anticorpo humano totalmente estável antes da análise de citometria de fluxo.

3. No dia da análise de citometria de fluxo, lavar células 1 x 107 com 1 x PBS

4. Separar a célula com meio de separação de célula de Detachin e coletar as células em 1 x PBS

5. Rotacionar as células a 3000 rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante.

6. Recolocar em suspensão no grânulo celular em 1 ml de 1 x PBS frio e rotacionar a 3000 rpm por 5 minutos.

7. Remover o sobrenadante e recolocar em suspensão no grânulo celular a 500 pl de 2 pg/ml da proteína 001 humana purificada em 1 x PBS frio.

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8. Rotacionar as células a 3000 rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante.

9. Recolocar em suspensão no grânulo celular em 1 ml de 1 x PBS frio e rotacionar a 3000 rpm por 5 minutos.

10. Repetir as etapas 7 e 8.

11. Remover o sobrenadante e recolocar em suspensão no grânulo celular a 500 pl de 1 pg/ml de anticorpo policlonal 001 anti-humano de coelho em 1 x PBS frio com 10 % de soro de cabra.

12. Incubar no gelo por 30 minutos com mistura ocasional por manuseio.

13. Rotacionar as células a 3000 rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante.

14. Recolocar em suspensão no grânulo celular em 1 ml de 1 x PBS frio e rotacionar a 3000 rpm por 5 minutos.

15. Repetir as etapas 7 e 8.

16. Remover o sobrenadante e recolocar em suspensão no grânulo celular a 500 pl de conjugado de anticorpo anti-coelho de cabra com FITC e conjugado de anticorpo Fc anti-humano de cabra com piroertrina em 1 x PBS frio com 10 % de soro de cabra.

17. Incubar no gelo por 30 minutos com mistura ocasional por manuseio.

18. Rotacionar as células a 3000 rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante.

19. Recolocar em suspensão no grânulo celular em 1 ml de 1 x PBS frio e rotacionar a 3000 rpm por 5 minutos.

20. Repetir as etapas 7 e 8.

21. Remover o sobrenadante e recolocar em suspensão no grânulo celular em 1 ml de 1 x PBS frio com 2 % de soro de cabra.Proceder com a análise de citometria de fluxo usando Dako MoFlo.

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22. Retirar uma janela de classificação para incluir a parte superior 0,1 % das células totais em termos da razão de fluorescência

PE/FITC. Coletar as células que divergem dentro da janela de classificação em placas de 96 reservatórios com 100 pl do meio de desenvolvimento.

Recuperação das Sequências de região variável de cadeia leve e pesada

1. Expandir os clones a partir das placas de 96 reservatórios a placas de 6 reservatórios. Quando as células atingem 80 % de confluência nas placas de 6 reservatórios, proceder ao isolamento de DNA genômico usando kit Qiagen DNeasy Tissue.

2. Aspirar o meio a partir das células. Adicionar 500 ml de 1 x PBS a cada 6 reservatório. Raspar as células das placas com pontas de pipeta estéreis. Transferir as células raspadas em PBS e um tubo de micro-centrífuga estéril.

3. Centrifugar as células por 5 minutos a 3000 rpm.

4. Remover o sobrenadante e recolocar em suspensão no grânulo celular em 200 pl 1 x PBS.

5. Adicionar 20 pl de proteinase K e tampão 200 pl AL a amostra, misturar cuidadosamente por turbilhonamento e incubar a 56°C por 10 minutos.

6. Adicionar 200 pl de etanol a amostra e misturar cuidadosamente por turbilhonamento.

7. Pipetar a mistura a partir da etapa 6 em uma coluna de rotação. Centrifugar a 8000 rpm por um minuto. Descartar o fluxo completo.

8. Adicionar 500 pl de tampão AW1 e centrifugar por um minuto a 8000 rpm. Descartar o fluxo completo.

9. Adicionar 500 pl de tampão AW2 e centrifugar por 2 minutos a 14.000 rpm. Descartar o fluxo completo. Centrifugar novamente por um minuto a 14.000 rpm. Certificar-se a membrana ser completamente seca.

10. Colocar a coluna de rotação em um tubo de microcentrífuga estéril e pipeta 200 pl de tampão AE diretamente em uma

118 / 140 membrana.

11. Incubar em temperatura ambiente por um minuto e centrifugar por um minuto a 8000 rpm para eluir o DNA genômico.

12. QC o DNA genômico pelo ajuste das reações seguintes em tubos de micro-centrífuga de 1,5 ml:

gDNA 5 μΐ x Tampão de carregamento de amostra 5 μΐ

Volume total 10 μΐ

Carregar em um gel TAE de agarose a 0,8 % com 0,5 μg/ml de Brometo de etídio. Usar a escala de DNA de 1 kB como padrão.

Usar o gel a 100 V por 20 a 30 minutos no tampão 1 X TAE.

13. Estabelecer as reações de PCR seguintes nos tubos PCR estéreis:

[00340] gDNA 1 μl

Misturar 2 x HotStar Taq Master 12,5 μl

Iniciador avançado de domínio variável* * 0,5 μl

Iniciador reverso de domínio variável* 0,5 μl

H2O__________________________________10,5 pl

Volume total 25 pl *ver anexo 1.2

14. Colocar os tubos PCR no circulador térmico e iniciar o programa de ciclo.

Etapa de ativação inicial: 15 minutos, 95°C ciclo de 3 etapas

Desnaturação: 40 segundos, 94°C

Anelação: 40 segundos, 55°C

Extensão: 2 minutos, 72°C

Número de ciclos: 30

Etapa de extensão final: 10 minutos, 72°C

15. QC as reações PCR pelo ajuste das reações seguintes em tubos de micro-centrífuga 1,5 ml:

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Reação PCR 5 μΐ x Tampão de carregamento de amostra 5μ1

Volume total 10 μΐ

Carregar em um 1 % de gel agarose TAE com 0,5 μg/m1 de Brometo de etídio. Usar escala de DNA de 1 kB como padrão. Realizar o gel a 100V por 20 a 30 minutos no tampão 1X TAE.

16. Exibir as reações de clonagem seguinte nos tubos de micro-centrífuga 1,5 ml usando kit Invitrogen TOPO 2.1:

Reação PCR 4μ1

Solução salina 1μ1

Vetor TOPO 1μ1

Volume total 6μ1

17. Misturar gentilmente as reações e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.

18. Adicionar 2 ol da reação de clonagem TOPO a partir da etapa 17 em um frasco de E. coli quimicamente competente de uso único e misturar gentilmente.

19. Incubar no gelo por 30 minutos.

20. Choque por calor das células por 30 segundos a 42°C.

21. Transferir os tubos em gelo e incubar por 2 minutos.

22. Adicionar 250 μ1 de meio de S.O.C. temperatura ambiente.

23. Agitar os tubos horizontalmente a 37°C por uma hora a 200 rpm.

24. Expandir 10 da transformação em uma placa de carbenicilina LB aquecida novamente.

25. Incubar a placa durante a noite a 37°C.

26. Selecionar 6 clones a partir de cada transformação para o sequenciamento.

27. Analisar as sequências de região variável de cadeia simples e cadeia pesada. Realizar o segundo ciclo da triagem usando o método

120 / 140

ELISA.

Digerir o vetor e clones de anticorpo humano com enzimas de restrição [00341] As reações dependerão das enzimas de restrição selecionadas e de acordo com as instruções do fabricante; exemplos são fornecidos neste: Preparar as reações de digestão seguintes em um tubo de microcentrífuga no gelo:

1. Misturar gentilmente e rotacionar brevemente (5 segundos) em microfuga

2. Incubar a reação a 37°C durante a noite

Digerir CIP o vetor e purificar com o kit de purificação QIAquick PCR

1. Adicionar 2 μΐ de fosfatase Apex ao tubo de microcentrífuga contendo a reação de digestão do vetor.

2. Incubar a 37°C por 10 minutos

3. Aquecer a 70°C por 5 minutos para inativar a fosfatase Apex

4. Adicionar 500 μL de tampão PBI a microcentrífuga

5. Misturar por turbilhonamento e centrifugar rápido

6. Carregar 750 μL em um tempo em uma coluna

7. Centrifugar a 12.000 x g por 1 minuto e decantar o líquido a partir do tubo de coleta

8. Repetir até todas as amostras serem processadas.

9. Lavar com 750 μL de tampão PE (Etanol adicionado)

10. Centrifugar a 12.000 x g por 1 minuto e decantar o líquido a partir do tubo de coleta

11. Colocar na coluna novamente no tubo de coleta e centrifugar novamente

12. Colocar a coluna em novos tubos de microcentrífuga e eluir-se com tampão 50 pl EB.

Clones de anticorpo humano 1 digeridos por enzima de restrição de purificação em gel.

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1. Estabelecer as reações seguintes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml:

Clones de anticorpo humano totalmente100 μΐ digeridos Rest Enz

10x Tampão de carregamento de amostra______3 μΐ

Volume total 103 μΐ

2. Carregar em um 1 % em gel de agarose TAE com 0,5 og/ml de Brometo de etídio. Usar escala de DNA de 1 kB como padrão. Realizar o gel em 100 V por 20 a 30 minutos no tampão 1 X TAE.

3. Cortar os grupos correspondentes as regiões variáveis de cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC) e purificado usando o kit de extração em gel QlAquick.

4. Adicionar 3 volume de tampão QG a 1 volume de gel.

5. Incubar a 50°C por 10 minutos até a fatia de gel ser completamente dissolvida. Adicionar 1 volume em gel de isopropanol da amostra e misturar.

6. Colocar uma coluna de agitação QlAquick em um tubo de coleta de 2 ml.

7. Aplicar o meso a coluna QlAquick e centrifugar por 1 minuto.

8. Descartar através do fluxo e colocar a coluna QlAquick novamente no mesmo tubo de coleta.

9. Adicionar 0,75 ml de tampão PE à coluna QlAquick e centrifugar por 1 minuto.

10. Descartar o fluxo completo e centrifugar a coluna QlAquick por 1 minuto adicional a 17.900 x g (13.000 rpm).

11. Colocar a coluna QlAquick em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo.

12. Adicionar 52 μ! de tampão EB ao centro da membrana QlAquick e centrifugar a coluna por 1 minuto. Deixar a coluna repousar por 1 minuto e então centrifugar por 1 minuto.

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Ligar o domínio variável HC e LC humano em DNA de vetor digerido [00342] Preparar a seguinte reação de ligação em um tubo de microcentrífuga no gelo:

DNA de vetor digerido (100 ng) x μΐ

Domínio variável HC e LC humano y μΐ

Tampão de 5X T4 ligase 4 μΐ

Água livre de nuclease QS a 19 μl

T4 ligase (2.000 U/μΡ__________________________________1 μl

Volume de reação total 20 oL

1. Misturar gentilmente e rotacionar brevemente (5 segundos) em microfuge

2. Incubar em temperatura ambiente por 2 horas ou 16°C durante a noite

3. Transformar cada uma das misturas de reação de ligação nas células E. coli supercompetentes

4. Pré-refrigerar tubos de parte funda cilíndrico de polipropileno 14 ml BD Falcon no gelo. Preparar o meio SOC a 42°C

5. Descongelar as células supercompetentes no gelo. Quando descongelado, misturar gentilmente e alíquota 100 ul das células em cada um dos tubos pré-resfriados.

6. Adicionar 1,7 μl de β-mercaptoetanol em cada um das alíquotas de células. Incubar as células no gelo por 10 minutos, rotacionar gentilmente a cada 2 minutos.

7. Adicionar 2 ol da mistura de reação de ligação em uma alíquota das células. Agitar os tubos gentilmente.

8. Incubar os tubos no gelo por 30 minutos.

9. Ensaiar os tubos a pulso de calor em um banho de água 42°C por 45 segundos.

10. Incubar os tubos no gelo por 2 minutos

11. Adicionar 900 μl do meio SOC pré-aquecido e incubar os tubos a 37°C por 1 hora com agitação a 225-250 rpm.

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12. Colocar 20 μΐ e 200 μΐ da mistura de transformação em placas de ágar LB contendo carbenicilina.

13. Incubar as placas a 37°C durante a noite.

14. Contar as colônias nas placas e selecionar 6 colônias para a triagem e sequenciamento PCR.

15. Selecionar um clone com a sequência correta, preparar o DNA de plasmídeo e proceder a transfecção nas células 293 F.

Transfecção das células 293F

1. Uma semana antes da transfecção, transferir as células 293F a cultura de monocamada no meio de Eagle modificado por Dulbecco's suplementado com soro (D-MEM).

2. Um dia antes da transfecção, a placa 0,1 x 10⁵ células em 100 ol de D-MEM suplementado com soro para a amostra de transfecção nos formatos de 96 reservatórios.

3. Para cada amostra de transfecção, preparar os complexos de lipofectamina DNA.

4. Diluir 0,2 pg de DNA em 50 ol de meio de soro reduzido Opti-MEM. Misturar gentilmente.

5. Diluir 0,125 pl de Lipofectamina em 50 pl de meio de soro reduzido Opti-MEM.

Misturar gentilmente e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.

6. Combinar o DNA diluído com a Lipofectamina diluída. Misturar gentilmente e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.

7. Adicionar 100 ol dos complexos de lipofectamina de DNA a cada reservatório contendo as células e meio. Misturar gentilmente agitando-se a placa de um lado para o ouro.

8. Incubar as células a 37°C em uma incubadora de 5 % de CO2.

9. Adicionar 100 ol de D-MEM suplementado com soro a cada

124 / 140 reservatório após 6 horas. Incubar as células a 37°C em uma incubadora de 5 % de CO2 durante a noite.

10. Aspirar o meio em cada reservatório. Lavar cada reservatório com 100 μΐ de 293 SFM II com 4 mM de L-Glutamina. Adicionar 100 μΐ de 293 SFM II com 4 mM de L-Glutamina a cada reservatório.

11. Coletar o sobrenadante por ELISA a 96 horas após transfecção.

Anexo 1.1: Receitas de tampão x P3BS com 2 % de soro de objetivo • 2 ml de soro de cabra • 98 ml de 1 x PBS

Tampão 50 X TAE • base 242 g Tris • 57,1 ml de ácido acético glacial • 37,2 g de Na2EDTA-2H2O • Adicionar H2O destilado a um volume final de 1 litro

Tampão 1X TAE • 20 ml de tampão 50 X TAE • 800 ml de H2O destilado • 0,8 % de gel de agarose com o brometo de etídio • 0,8 g de agarose LE • 100 ml de tampão TAE • Fundir a agarose em um forno de micro-ondas e rotacionar para garantir ainda a mistura • Esfriar a agarose a 55°C • Adicionar 2,5 μl de 20 mg/ml de brometo de etídio a agarose • Verter uma plataforma em gel • 1 % de gel de agarose com o brometo de etídio

125 / 140 • 1 g de agarose LE • 100 ml de tampão IX TAE • Fundir a agarose em um forno de micro-ondas e rotacionar para garantir ainda a mistura • Esfriar a agarose a 55°C • Adicionar 2,5 de 20 mg/ml de Brometo de etídio a agarose • Verter em uma plataforma em gel

LB • 10 g de NaCl • 10 g de triptona • 5 g de extrato de levedura • Adicionar H2O destilada a um volume final de 1 litro • Ajustar o pH 7,0 com 5 N de NaOH • Autoclave • Ágar de LB-carbenicilina • 10 g de NaCl • 10 g de triptona • 5 g de extrato de levedura • 20 g de ágar • Adicionar H2O destilada a um volume final de 1 litro • Ajustar o pH 7,0 com 5 N de NaOH • Autoclave • Esfriar a 55 °C • Adicionar 10 ml de 10 mg/ml de carbenicilina esterilizada por filtro • Verter em discos de petri (placa 25 ml/100 mm) [00343] Meio SOC • 0,5 g de NaCl • 20 g de triptona • 0,5 g de extrato de levedura

126 / 140 • 2 ml de glicose a 20 % esterilizada por filtro • Adicionar H2O destilada a um volume final de 1 litro • Autoclave • Adicionar 10 ml de 1 M de MgCl₂ esterilizada por filtro e 10 ml de 1 M de MgSO esterilizada por filtro, antes do uso

Solução de lavagem • 0,05 % de Tween-20 em PBS

Solução de bloqueio • 2 % de leite desnatado Carnation em PBS

Soro bovino fetal inativado por calor • 500 ml de soro bovino fetal inativado por calor no frasco fornecedor original • Calor por 30 minutos a 56°C com mistura a cada 5 minutos • Preparar 50 ml de alíquotas e armazenar a -20°C

Meio Eagle modificado por Dulbecco's suplementado com soro • 500 ml de meio Eagle modificado por Dulbecco's • 50 ml de soro bovino fetal inativado por calor • 5 ml de 10 mM de aminoácidos não essenciais MEM

293 SFM II com 4 mM de L-Glutamina • 500 ml de SFM II • 10 ml de 200 mM de L-Glutamina

Solução de DEAF-Dextrano • 1 g de DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano) • Dissolver em 100 ml de água destilada • Filtro de esterilizar

Anexo 1.2: Construção de biblioteca de anticorpo totalmente humano [00344] Todas as regiões V de cadeia leve capa (Vk) e cadeia pesada (VH) da linhagem germinativa humana funcional podem ser obtidas de base V (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) e alinhado. Os alinhamentos então podem

127 / 140 ser analisados com relação a diversidade, especialmente na estrutura de três regiões. O número desejado dos genes Vh e Vk a partir dos agrupadores de sequência resultante então pode ser selecionado para uma construção de biblioteca.

Clonagem da região V [00345] Os genes de região V de cadeia leve e pesada (incluindo estruturas 1, 2 e 3 e CDR1, CDR2 e CDR3) são amplificados a partir do DNA genômico humano em duas partes usando os iniciadores específicos pelo gene. Os genes de região V parcial são então combinados pela sobreposição de PCR. Um ligador é adicionado às regiões V LC de comprimento total PCR antes da clonagem no vetor de expressão de mamífero. Os domínios variáveis LC clonados são as sequências confirmadas (produzindo os clones LC V). Os domínios variáveis de cadeia pesada são TOPO clonados e sequência confirmada (clones HC V TOPO). A sequência confirma as regiões HC V que são amplificadas a partir dos plasmídeos correspondentes, um ligador é adicionado a extremidade 3' e os produtos PCR resultantes são clonados nos clones do domínio variável LC V para formar as combinações Vk/VH e em um vetor mamífero.

Expressão de IgGs de comprimento total [00346] A expressão da cadeia pesada IgG1 e cadeia leve de cada de comprimento total no vetor de mamífero desejado pode ser conduzido a partir de um promotor simples, por exemplo, promotor CMV. Cada cadeia é precedida por um alvejamento de sinal de secreção da cadeia de polipeptídeo nascente ao retículo endoplasmático (ER). Um sinal de ancoragem pode ser fundido ao terminal C da cadeia pesada. Este sinal é clivado e substituído com uma âncora que liga ao IgG de comprimento total foram da membrana da célula após a secreção.

Anexo 1.3: geração da biblioteca de anticorpo humano totalmente estável nas células de mamífero pela transfecção

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1. Uma semana antes da transfecção, transferir as células CHO-S pela cultura de monocamada no meio Eagle modificado Dulbecco's suplementado com soro (D-MEM).

2. Um dia antes da transfecção, a placa 6 x 106 células em 15 ml de D-MEM suplementado com soro pela amostra de transfecção em uma placa de cultura de tecido 10-cm. Preparar dez placas 10-cm

3. Para cada placa 10-cm, preparar complexos de DNALipofectamina seguindo as etapas 4-7.

4. Diluir 25 pg de DNA de plasmídio de biblioteca de anticorpo totalmente humano maxi-prep em 1,5 ml de meio de soro reduzido Opti-MEM. Misturar gentilmente.

5. Diluir 60 pl de Lipofectamina em 1,5 ml de meio de soro reduzido Opti-MEM. Misturar gentilmente e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.

6. Combinar o DNA diluído com a Lipofectamina diluída. Misturar gentilmente e incubar por 20 min em temperatura ambiente.

7. Adicionar os complexos de DNA-Lipofectamina 3 ml em cada placa contendo as células e o meio. Misturar gentilmente agitando-se a placa de um lado para o ouro.

8. Incubar as células a 37°C em uma incubadora a 5 % de CO2 durante a noite.

9. A mudança do meio em cada placa com 15 ml de D-MEM suplementado com soro. Incubar as células a 37°C em uma incubadora 5 % de CO2 por 48 horas.

10. Separar as células com meio de separação da célula Detachin e as células recolocadas em suspensão no D-MEM suplementado com soro.

11. Colocar as células 0,4 x 10⁶ em 10 ml de D-MEM suplementado com soro com 800 pg/ml G418 em uma placa de cultura de

129 / 140 tecido de 10-cm. Transferir todas as células transfectadas resultando em placas de 150 x 10-cm.

12. Colocar 0,4 x 106 células CHO-S não transfectadas em 10 ml de DMEM suplementado com soro com 800 pg/ml de G418 em uma placa de cultura de tecido 10-cm.

13. Alimentar as células com D-MEM suplementado com soro com 800 pg/ml G418 a cada 4 dias.

14. Após 14 dias, examinar as placas com células CHO-S não transfectadas. Não devem haver células vivas na placa.

15. Separar as células transfectadas remanescentes com o meio de separação da célula e congelar as células no meio de congelamento a 1 x 10⁷ células /ml.

Anexo 1.4: geração da biblioteca de anticorpo totalmente humano estável nas células de mamíferos pela infecção retroviral

1. Um dia antes da transfecção, a placa das células 6 x 106 EcoPack-2 293 em 15 ml de D-MEM suplementado por soro pela amostra de transfecção em uma placa de cultura de tecido 10-cm. Preparar dez placas 10cm.

2. Preparar o meio contendo MBS. Este é feito imediatamente antes da transfecção. Para cada placa de cultura de tecido 10-cm, 12 ml de meio contendo MBS deve ser preparado.

3. Adicionar 12 ml de meio contendo MBS em cada placa de 10 cm e retorna as placas pelas placas a incubadora 37°C. Este deve ser feito 20-30 minutos antes da adição da suspensão de DNA.

4. Recolocar em suspensão 10 pg de grânulo de DNA de plasmídeo de biblioteca de anticorpo totalmente humano maxi-prep em H2O estéril 450 Al estéril e transferir o DNA para separar 5-ml de tubos de parte inferior de poliestireno BD Falcon.

5. Adicionar 50 pl de solução I e 500 pl de solução II a partir

130 / 140 do kit de transfecção de mamífero MBS de transfecção Stratagene ao DNA.

6. Recolocar em suspensão gentilmente qualquer precipitado na suspensão de DNA para pipetar a suspensão para cima e para baixo com uma pipeta exibida a 500 ol.

7. Incubar a suspensão DNA em temperatura ambiente por 10 minutos.

8. Remover as placas 10-cm a ser transfectadas a partir da incubadora e adicionar a suspensão de DNA nas placas em uma maneira às gotas, rotacionando gentilmente para evitar as células sendo erguidas a partir da placa e para distribuir a suspensão de DNA eventual.

9. Retornar as placas de cultura de tecido à incubadora 37°C.

10. Após incubar por 3 horas, remover o meio para as placas e substituir com 4 ml de 4 ml -MEM suplementado com soro suplementado com 25 oM de cloroquina. Retornar as placas à incubadora a 37°C.

11. Após incubação por 6-7 horas adicionais, remover o meio de desenvolvimento contendo 25 μΜ de cloroquina e substituir com 4 ml de DMEM suplementado com soro sem cloroquina.

12. Incubar a placa na incubadora 37°C durante a noite.

13. Remover o meio a partir das placas e substituir com 3,0 ml de D-MEM suplementado com soro fresco. Retornar as placas à incubadora 37°C.

14. Remover as células embaladas que produzem o vírus a partir da incubadora.

15. Coletar o sobrenadante contendo o vírus a partir da primeira placa e filtrar este através de um filtro de 0,45 μm em um tubo cônico estéril de 50-ml.

16. Fazer alíquota do sobrenadante viral em criofrascos 1,5 ml e congelamento rápido no banho de etanol/gelo seco. Armazenar o sobrenadante viral a -80°C.

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17. Colocar 0,5 x 10⁶ células NIH-3T3 em 10 ml de D-MEM suplementado com soro em uma placa de cultura de tecido 10-cm. Colocar as placas de cultura de tecido 102 x 10-cm.

18. Rapidamente congelar o sobrenadante pela agitação rápida em um banho de H2O a 37°C.

19. Diluir o vírus no DMEM suplementado com soro de bezerro com solução de DEAE-dextrano no titulador de 0,3 x 10⁵ partícula viral/ml. Preparar os vírus diluídos 3 ml por placa 100-mm a ser infectada (20 % das células serão infectadas). O “coquetel mock” preparado do meio de desenvolvimento mais DEAE-dextrano a ser usado como o controle negativo.

20. Aspirar o meio das células NIH-3T3. Para cada placa, expandir 3,0 ml de vírus diluído eventualmente nas células. Retornar as placas ao incubador 37°C por 3 horas.

21. Após 3 horas de incubação, adicionar um D-MEM suplementado com soro de bezerro 7,0 ml em cada placa e retornar as placas a incubadora 37°C. Incubar a placa por 48 horas.

22. Substituir o meio com 10 ml de D-MEM suplementado com soro de bezerro com 800 pg/ml de G418 em cada placa de cultura de tecido 10-cm.

23. Alimentar as células com D-MEM suplementado com soro de bezerro com 800 pg/ml de G418 a cada 4 dias.

24. Após 14 dias, examinar as placas com células NIH-3T3 infectadas por mock. Não deve haver células vivas na placa.

25. Separar as células transfectadas remanescentes com meio de separação de célula Detachin e congelas as células no meio de congelamento nas 1 x 10⁷ células /ml.

Exemplo 2. Reações para a evolução posicionai compreensiva (CPE) Reação mutagênica [00347] Um par de iniciadores (iniciador de mistura 1 e iniciador de

132 / 140 mistura 2) é projetado para cada códon a ser inserido. O projeto dependerá da sequência do gene e os bancos de dados da análise de sequência tal como Sequencher (Gene Codes Corporation) ou VectorNTl® (Life Technologies) podem ser usados para projetar os iniciadores. Por CPE, um par de iniciadores é projetado para cada códon a ser mutado. Um códon alvo degenerado (NNK ou NNN) é no meio, flanqueado por 20 bases em cada lado (comprimento iniciador total: 43 bases, 9f clones para o sequenciamento para identificar os mutantes únicos). O DNA modelo é o vetor de DNA com os genes alvos.

[00348] Preparar as reações seguintes nas placas PCR de parede fina em 96 reservatórios ou 0,2 ml tubos PCR de parede fina no gelo:

Iniciador de mistura 1 (2,5 μΜ)	5 μί
Iniciador de mistura 2 (2,5 μΜ)	5 μί
Tampão de polimerase de DNA 10X Pfu turbo	2,5 μl
Modelo de DNA (5, 10, 25 ng)	X μl
dNTPs	2 μί
Água livre de nuclease	QS a 24,5 μl
Polimerase de DNA Pfu turbo (2,5 Πμί)	0,5 μl
Volume de Reação Total	25 ol

1. Preparar uma reação de controle negativo por uma placa de reservatórios (substitir iniciadores com tampão TE)

2. Misturar gentilmente e rotacionar brevemente (5 segundos) na centrífuga da tabela superior

3. Colocar em ciclo de reações usando os parâmetros do ciclo resumido abaixo:

Segmento	Ciclos	Temperatura	Tempo
1	1	95 °C	30 segundos
2	18	95 °C	30 segundos
55 °C	1 minuto
68 °C	16 minutos

Análise de controle de qualidade

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1. Ao QC as reações de amplificação, estabelece as reações seguintes nas placas de PCR da parede fina de 96 reservatórios ou 0,2 ml de tubos PCR de parede fina:

Reação de mutagênese 5pl

Água 4pl

Tampão de carregamento de amostra 1pl

Volume10 pl [00349] 1. Carregar 10 pl em um gel TAE de agarose a 1 % agarose com 0,5 pg/ml de Brometo de etídio. Usar escala de 1 kb mais DNA como padrão. Realizar o gel a 100V por 20 a 30 minutos no tampão 1X TAE.

Digerir as reações de mutagênese com enzimas de restrição apropriadas para a clonagem no vetor DNA - Exemplo para a enzima de restrição Dpnl

1. Adicionar 0,5 pl da enzima de restrição Dpnl (10 U/pl) diretamente a cada reação.

2. Misturar gentilmente e rotacionar brevemente (5 segundos) em uma centrífuga da tabela superior

3. Incubar a 37°C nas máquinas de PCR por horas.

4. Transformar as misturas de 6 reações a partir de cada placa de 96 reservatórios nas células supercompetentes XLI Blue. Armazenar o restante das reações a -20°C.

5. Pré-esfriar os tubos PCR 0,2 ml no gelo. Aquecer o meio SOC a 42°C

6. Descongelar as células supercompetentes XLI Blue no gelo. Quando descongelado, misturar gentilmente e alíquota 50 pl das células em cada um dos tubos pré-resfriados.

7. Adicionar 0,8 pl de beta-mercaptoetanol em cada um das alíquotas de células. Incubar as células no gelo por 10 minutos, rotacionar gentilmente a cada 2 minutos.

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8. Adicionar 2 μΐ da mistura de reação em uma alíquota das células. Agitar os tubos gentilmente.

9. Incubar os tubos em blocos gelados por 30 minutos.

10. Submeter os tubos ao pulso de calor em um banho de água a 42°C por 45 segundos.

11. Incubar os tubos no gelo por 2 minutos

12. Adicionar 100 ql do meio SOC pré-aquecido e incubar os tubos a 37°C por 1 hora com agitação a 225-250 rpm.

13. Colocar a mistura de transformação inteira nas placas de ágar LB contendo carbenicilina.

14. Incubar as placas a 37°C durante a noite.

15. Contar as colônias em placas e selecionar 12 colônias a partir de cada reação de transformação para miniprep e sequenciamento. Transformação de ampla escala

1. Descongelar as células supercompetentes XLI Blue no gelo. Descongelar 20 tubos das células competentes para as 96 reações. Quando descongelado, adicionar 4 ql de β -mercaptoetanol a cada tubo de células competentes 250 ul. Incubar as células no gelo por 10 minutos, rotacionar gentilmente a cada 2 minutos.

2. Pré-esfriar 0,2 ml de tubos PCR no gelo. Aquecer SOC a 42°C.

3. Colocar em alíquota 50 ql as células em cada um dos tubos pré-resfriados.

4. Adicionar 2 μl da mistura de reação em uma alíquota das células. Agitar os tubos gentilmente.

5. Incubar os tubos nos blocos frios por 30 minutos.

6. Submeter os tubos ao pulso de calor em um banho de água 42°C por 45 segundos.

7. Incubar os tubos no gelo por 2 minutos.

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8. Adicionar 100 μΐ do meio SOC pré-aquecido e incubar os tubos a 37°C por 1 hora com agitação a 225-250 rpm.

9. Colocar a mistura de transformação inteira nas placas de ágar LB contendo carbenicilina.

10. Incubar as placas a 37°C durante a noite.

11. As células de desenvolvimento para os blocos em 96 reservatórios para miniprep

12. Preparar o DNA miniprep usando kit QIAVac 96 seguindo o protocolo dos fabricantes.

Exemplo 3. Triagem para a transfecção de melhoramento de afinidade de anticorpo [00350] Uma semana antes da transfecção, a transferências das células 293F a cultura de monocamada no meio Eagle modificado por Dulbecco's suplementado com soro (D-MEM). Uma dia antes da transfecção, a placa 0,2 x 10⁵ e 0,4 x 10⁵ células em 100 pl de D-MEM suplementado com soro pela amostra de transfecção em 96 formatos de reservatórios.

1. Para cada amostra de transfecção, preparar os complexos de DNA-Lipofectamina.

2. Diluir 0,2 pg de DNA em 50 pl de meio de soro reduzido Opti-MEM. Misturar gentilmente.

3. Diluir 0,125 pl de Lipofectamina em 50 ol de meio de soro reduzido Opti-MEM.

4. Misturar gentilmente e incubar por 5 min em temperatura ambiente.

5. Combinar o DNA diluído com a Lipofectamina diluída. Misturar gentilmente e incubar por 20 min em temperatura ambiente.

6. Adicionar 100 pl dos complexos de DNA-Lipofectamina em cada reservatórios contendo as células e o meio. Misturar gentilmente agitando-se a placa de um lado para o ouro.

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7. Incubar as células a 37°C em uma incubadora a 5 % de CO2.

8. Adicionar 100 μl de D-MEM suplementado com soro a cada reservatório após 6 horas. Incubar as células a 37°C em uma incubadora a 5 % de CO2 durante a noite.

9. Aspirar meio em cada reservatório. Lavar cada reservatório com 100 μΐ de 293 SFM II com 4 mM de L-Glutamina. Adicionar 100 μΐ de 293 SFM II com 4 mM de L-Glutamina em cada reservatório.

10. Coletar o sobrenadante para ELISA em 96 horas após transfecção.

ELISA funcional

1. Revestir 9 placas de 6 reservatórios Nunc-Immuno Maxisorp com 100 ol de 2 μg/ml de antígeno na solução de revestimento.

2. Revestir as placas com seladores e incubar durante a noite a 4°C.

3. Decantar as placas e retirar o resíduo líquido.

4. Adicionar 200 μl de solução de lavagem. Agitar a 200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.

5. Decantar as placas e retirar o resíduo líquido.

6. Adicionar 200 ol de solução de bloqueio. Agitar a 200 rpm por 1 hora em temperatura ambiente.

7. Decantar as placas e retirar o resíduo líquido.

8. Adicionar duplicatas de 100 μl/reservatório de anticorpo de controle (2 μg/ml) na solução de bloqueio das placas.

9. Adicionar duplicatas de 100 ol do sobrenadante a partir da transfecção (SOP 5A) as placas.

10. Agitar a 200 rpm por uma hora em temperatura ambiente.

11. Decantar as placas e retirar o líquido residual.

12. Adicionar 200 μl de solução de lavagem. Agitar a 200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.

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13. Repetir a etapa 11-12 3 vezes.

14. Adicionar 100 μΐ da diluição 1:5000 do conjugado de anticorpo anti-humano de cabra purificado por afinidade com HRP na solução de bloqueio a cada reservatório.

15. Agitar a 200 rpm por uma hora em temperatura ambiente.

16. Decantar as placas e retirar o líquido residual.

17. Adicionar 200 pl da solução de lavagem. Agitar a 200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.

18. Repetir a etapa 17-18 3 vezes.

19. Adicionar 100 μl de substrato Sigma TMB a cada reservatório. Incubar em temperatura ambiente e checar a cada 2-5 minutos.

20. Adicionar 100 pl de 1N HCl para interromper a reação.

21. Ler a 450 nm.

Quantificação ELISA

1. Revestir 9placas de 6 reservatórios Nunc-Immuno Maxisorp com 100 pl de IgG anti-humano de cabra específico por Fc purificado por afinidade 10 μg/ml na solução de revestimento.

2. Revestir as placas com seladores e incubar durante a noite a 4°C.

3. Decantar as placas e retirar o resíduo líquido.

5. Decantar as placas e retirar o resíduo líquido.

6. Adicionar 200 pl de solução de bloqueio. Agitar a 200 rpm por 1 hora em temperatura ambiente.

7. Decantar as placas e retirar o resíduo líquido.

8. Adicionar duplicatas de 100 μl/reservatório da concentração padronizada do IgG de soro humano purificado IgG na solução de bloqueio das placas.

138 / 140

9. Adicionar duplicatas de 100 μΐ do sobrenadante a partir da transfecção (SOP 5A) as placas.

10. Agitar a 200 rpm por uma hora em temperatura ambiente.

11. Decantar as placas e retirar o líquido residual.

12. Adicionar 200 ol de solução de lavagem. Agitar a 200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.

13. Repetir a etapa 11-12 3 vezes.

14. Adicionar 100 ol da diluição 1:5000 do conjugado de anticorpo anti-humano de cabra purificado por afinidade com HRP na solução de bloqueio a cada reservatório.

15. Agitar a 200 rpm por uma hora em temperatura ambiente.

16. Decantar as placas e retirar o líquido residual.

17. Adicionar 200 pl de solução de lavagem. Agitar a 200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.

18. Repetir a etapa 17-18 3 vezes.

19. Adicionar 100 ol de substrato Sigma TMB a cada reservatório. Incubar em temperatura ambiente e checar a cada 2-5 minutos.

20. Adicionar 100 pl de 1N HC1 para interromper a reação.

21. Ler a 450 nm.

Exemplo 4. Geração e triagem por uma biblioteca variante de códon Fc para a ótima expressão de anticorpo [00351] O presente exemplo fornece os métodos para gerar uma biblioteca de variante de códon Fc e métodos de triagem para obter as variantes Fc com otimizado para a expressão melhorada na produção das células hospedeiras como comparado a forma parental do polipeptídeo Fc.

A. Projeto e construção de uma biblioteca variante de códon Fc [00352] Para cada códon na área alvo (neste caso a parte Fc da molécula IgG1 humana) um par dos iniciadores degenerados (avançado e reverso) é projetado que inclui o códon alvo e 20 bases em cada lado. A 3°

139 / 140 posição do códon alvo (posição de agitação) contém as bases misturadas (Tabela 3) que permite a geração de todas as mutações silenciadoras na posição alvo usando o mesmo códon (exemplo A). Um segundo conjunto do iniciador degenerado é projetado pela mesma posição de códon se o aminoácido correspondente pode ser codificado por outro códon (exemplo B). Os iniciadores degenerados avançados e reversos são misturados 1:1, anelados ao modelo e estendidos aos produtos de comprimento total pela colocação do filamento usando-se uma polimerase de DNA termoestável. O modelo é digerido com DpnI e produtos de extensão de comprimento total são transformados em E. coli. Até as 12 colônias para a reação de mutagênese são sequenciadas. A sequência confirma os mutantes que são submetidos ao ensaio nas 9 placas de 6 reservatórios e glicerol estocado. Os estoques de glicerol são usados para miniprep o DNA de plasmídeo para a transfecção das células de mamíferos e triagem.

Tabela 3: Códigos para as bases degeneradas nos oligos sintéticos

Símbolo	Base misturada
R	A,G
Y	C,T
M	A,C
K	G,T
S	C,G
W	A,T
H	A,C,T
B	C,G,T
V	A,C,G
D	A,G,T
N	A,C,G,T

Exemplo A: códon alvo = CCC (prolina) > iniciador avançado: CCD, iniciador reverso: HGG

Exemplo B; códon alvo = TCG (serina) > iniciador avançado 1: TCH, iniciador reverso 1: DGA > iniciador avançado 2: AGY, iniciador reverso 2: RCT bases flanqueiam o códon alvo e não são mostradas. O comprimento iniciador total: 43 bases.

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B. Expressão e triagem baseada em ELISA da biblioteca variante de códon Fc [00353] Clones a partir da biblioteca variante de códon Fc foram transfectados em uma linhagem celular de mamífero. Os IgGs de comprimento total foram produzidos e secretados no meio. Os sobrenadantes das variantes de códon Fc expressados foram triados pelo nível de expressão IgG maior do que o clone usando ensaio ELISA. O dado ELISA foi normalizado com o ensaio beta-galactosidase medindo a eficiência de transfecção. Os acertos superiores identificados na triagem primária foram transfectados novamente e triados novamente três vezes para confirmar o nível de expressão aumentado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de evolução de uma proteína humana em um hospedeiro de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. mutar uma proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas de progênie humanas mutantes em um hospedeiro de fabricação; e

b. triar o conjunto de proteínas de progênie mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada;

c. selecionar uma proteína de progênie humana mutante ativada do conjunto de proteínas de progênie humanas mutantes com base em pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; e

d. fabricar a proteína de progênie humana mutante ativada slecionada utilizando um método compreendendo uma etapa de expressão da proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro empregado na etapa de mutação (a).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro de fabricação é selecionado de células de fibroblasto de camundongo 3T3; células de fibroblasto de hamster sírio BHK21; MDCK, células epiteliais caninas; células epiteliais humanas Hela; células epiteliais de rato canguru PtK1; células de plasma de camundongo SP2/0 e células de plasma de camundongo NS0; células renais embrionárias humanas HEK 293; células renais de macaco COS; células de ovário de hamster chinês, CHO, CHO-S; células embrionárias de camundongo R1; células embrionárias de camundongo E14.1; células embrionárias humanas H1; células embrionárias humanas H9; células embrionárias humanas, PER C.6; células de levedura S cerevisiae e células de levedura picchia.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro de fabricação é CHO.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

2 / 7 fato de que a etapa de triagem compreendem classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de mutação permite a produção de um conjunto de anticorpos mutantes formados a partir do anticorpo padrão tendo m regiões determinantes de complementaridade (CDR), em que m é um número inteiro de 1 a 6, cada dito CDR compreendendo n resíduos de aminoácido, a etapa de mutação compreendendo as etapas de:

a. gerar m x n conjuntos de anticorpos separados, cada conjunto compreendendo anticorpos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada única do CDR; em que cada conjunto de anticorpos difere na posição predeterminada única; e o número de anticorpos membros diferentes gerado é equivalente a m x n x X.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que m é 6.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de mutação (a) compreende as etapas de:

h. gerar n-1 conjuntos separados de polipeptídeos mutantes do anticorpo padrão, cada conjunto compreendendo polipeptídeos membros tendo número X de resíduos predeterminados diferentes de aminoácido em uma posição predeterminada única do polipeptídeo; em que cada conjunto de polipeptídeos difere na posição predeterminada única; e o número de polipeptídeos membros diferentes gerados é equivalente a [n-1] x X;

e em que a etapa de triagem (c) compreende as etapas de:

i. ensaiar cada polipeptídeo membro quanto a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada;

j. identificar qualquer mudança na dita propriedade característica ou atividade do polipeptídeo membro com relação ao

3 / 7 polipeptídeo padrão; e

k. criar um mapa funcional em que o mapa funcional é usado para identificar posições e mutações no polipeptídeo mutante que resultam em um mutante ativado e/ou uma mutação silenciosa em comparação com o polipeptídeo padrão.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que X representa os 19 resíduos de aminoácido de ocorrência natural não presentes em uma dada posição do polipeptídeo padrão.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de geração compreende as etapas de:

i. submeter um polinucleotídeo contendo códon que codifica quanto ao dito polipeptídeo padrão para a amplificação com base em polimerase usando-se um oligonucleotídeo degenerado de 64 vezes para cada códon a ser mutageneizado, em que cada um dos ditos oligonucleotídeos degenerado de 64 vezes é compreendido de uma primeira sequência homóloga e uma sequência de tripleto N,N,N degenerada, a fim de gerar um conjunto de polinucleotídeos de progênie; e ii. submeter o dito conjunto de polinucleotídeos de progênie à amplificação clonal de modo que tais polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos de progênie sejam expressados.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o mapa funcional é usado para identificar um ou mais das (a) posições e mutações que não afetam a atividade do polipeptídeo mutante em comparação com o polipeptídeo padrão; (b) sítios totalmente mutáveis em comparação com o polipeptídeo padrão; e (c) posições e mutações que resultam em um mutante ativado em comparação com o polipeptídeo padrão.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a propriedade, característica ou atividade predeterminada é selecionada de redução de agregação de proteína-proteína, melhora da

4 / 7 estabilidade de proteína, solubilidade de proteína aumentada, introdução de locais de glicosilação, introdução de sítios de conjugação, redução de imunogenicidade, intensificação de expressão de proteína, aumento na afinidade de antígeno, diminuição na afinidade de antígeno, mudança na afinidade de ligação, mudança na imunogenicidade, e melhora da especificidade.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda as etapas de:

a1. gerar uma biblioteca de proteína humana em um hospedeiro de produção celular selecionado de um dos grupos que consiste em um hospedeiro de produção bacteriano ou eucariótico;

a2. triar a biblioteca para a proteína humana padrão baseada em pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de mutação compreende um de evolução posicional compreensiva (CPE); evolução de inserção posicional compreensiva (CPI); evolução de deleção posicional compreensiva (CPD); evolução posicional compreensiva (CPE) seguido por síntese de proteína combinatória (CPS); evolução de deleção posicional compreensiva (CPD) seguido por síntese de proteína combinatória (CPS) ou evolução de deleção posicional compreensiva (CPD) seguido por síntese de proteína combinatória (CPS).
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína humana é um anticorpo.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada na etapa de triagem (e) compreende um ou mais de (1) triagem para uma mutação silenciosa e (2) triagem quanto a uma mutação sem

5 / Ί sentido; em comparação com o anticorpo padrão.

1Ί. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos grupos selecionados da estrutura Fc e Fv; e um ou mais CDRs são modificados no anticorpo humano mutante ativado em comparação com o anticorpo humano padrão.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de triagem (b) compreende triar o conjunto de proteínas humanas mutantes para a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triar quanto à expressão modificada simultaneamente.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína humana é selecionada de uma enzima citocina, receptor, proteína de ligação de DNA, agente quelante ou hormônio.
20. Método de evolução para expressão intensificada e fabricação de uma proteína humana em um hospedeiro de produção de célula eucariótica, caracterizado pelo fato de compreender:

a. selecionar uma proteína humana padrão para a evolução;

b. evoluir a proteína humana padrão compreendendo geração de códons mutantes que codificam a proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes no hospedeiro de produção;

c. triar o conjunto de proteínas humanas mutantes quanto a pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triar quanto a expressão intensificada quando comparado com a proteína humana padrão;

d. selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base na (1) retenção ou otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (2) expressão intensificada quando comparado com a proteína humana padrão; e

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e. fabricar a proteína humana mutante ativada compreendendo expressar a proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de produção como na etapa de evolução.
21. Método para identificar e produzir uma proteína humana alvo, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. gerar um biblioteca de proteína humana em um hospedeiro de produção de célula eucariótica com exibição de superfície celular de proteína;

b. triar a biblioteca por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada;

c. identificar uma proteína humana alvo da biblioteca com base na pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada; e

d. expressar a proteína alvo humana no mesmo hospedeiro de produção de célula eucariótica como na etapa de geração para a produção de uma proteína alvo humana.
22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de seleção (c) compreende adicionalmente selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base (1) na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada quando comparado com a proteína humana padrão e (2) expressão modificada quando comparado com a proteína humana padrão.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a expressão modificada é expressão intensificada.
24. Método de evolução e fabricação de uma proteína humana em um hospedeiro de fabricação celular, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. mutar uma proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes em um hospedeiro de fabricação;

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b. triar o conjunto de proteínas humanas mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triar quanto à expressão modificada;

c. selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base (1) na otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada, e (2) expressão modificada quando comparado com a proteína humana padrão; e

d. fabricar a proteína humana compreendendo expressar o proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de fabricação como na etapa a.
25. Método de evolução para expressão intensificada e fabricação de uma proteína humana em um hospedeiro de produção de célula eucariótica, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. mutar uma proteína humana padrão compreendendo geração de códons mutantes que codificam a proteína humana padrão para a produção de um conjunto de proteínas humanas mutantes em um hospedeiro de fabricação;

b. triar o conjunto de proteínas humanas mutantes por pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e triagem quanto à expressão intensificada quando comparado com a proteína humana padrão;

c. selecionar uma proteína humana mutante ativada do conjunto de proteínas humanas mutantes com base na (1) retenção ou otimização da pelo menos uma propriedade, característica ou atividade predeterminada e (2) expressão intensificada quando comparado à proteína humana padrão; e

d. fabricar a proteína humana mutante ativada no mesmo hospedeiro de fabricação como na etapa (a).