KR101822836B1

KR101822836B1 - 약제학적 사용에 적합한, 보조제를 요구하지 않는, 동결건조물로부터 준비된 현탁액 내의 메타뉴모바이러스 (hmpv)의 항원을 발현하는 재조합 생 bcg를 함유하는, 면역원성 제제

Info

Publication number: KR101822836B1
Application number: KR1020167011372A
Authority: KR
Inventors: 라미레즈 수잔 마르셀라 부에노; 파라 알렉시스 마이크 칼레르기스; 보몬트 크리스티앙 팔라베시노
Original assignee: 폰티피씨아 유니베르시다드 까똘리까 데 칠레
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2018-01-29
Also published as: MX2016003783A; UY35765A; EP3054013B1; US9999663B2; US20160220662A1; DE112014004530T5; BR112016006989B1; EP3054013A1; WO2015049633A1; GB201605054D0; RU2016111978A; PE20160536A1; GB2532699B; CA2925369A1; ZA201602148B; ES2853355T3; CN105745323A; EP3054013A4; CL2013002829A1; RU2665848C2

Abstract

본 발명은 사람 메타뉴모바이러스 (hMPV (유전자군 A1, A2, B1 및 B2))의 바이러스성 단백질 P를 발현하는 재조합 BCG의 1x10⁹ufc/ml의 동결건조물로 구성된,사람 메타뉴모바이러스에 대하여 포유류에서 사용될 수 있는, 면역원성 제제에 관한 것이다. 백신은 hMPV의 P 유전자의 전체 또는 일부 산물로부터 유래하고, 보조제를 요구하지 않는 용액 내에서 사용될 수 있고, 안정화될 수 있고, 투여될 수 있다. 또한, 제제는 전술한 제제의 조합을 함유할 수 있다. 제제는 사용 전 무-보조제 식염수 용액 내에서 연속적으로 재구성되기 위하여 동결건조 (4℃ 및 8℃ 사이의 보관 범위)의 수단에 의해 안정화된다.

Description

약제학적 사용에 적합한, 보조제를 요구하지 않는, 동결건조물로부터 준비된 현탁액 내의 메타뉴모바이러스 (HMPV)의 항원을 발현하는 재조합 생 BCG를 함유하는, 면역원성 제제{IMMUNOGENIC FORMULATION CONTAINING RECOMBINANT LIVE BCG THAT EXPRESS ANTIGENS OF METAPNEUMOVIRUS (HMPV), IN A SUSPENSION PREPARED FROM A LYOPHILISATE, WITHOUT REQUIRING AN ADJUVANT, SUITABLE FOR PHARMACEUTICAL USE}

본 발명은 면역학 및 생물공학의 영역에 관한 것이고, 구체적으로 사람 메타뉴모바이러스 (hMPV)에 대한 백신을 준비하기 위해 사용될 재조합 약독화 박테리아에 기반한 면역원성 제제를 목적으로 한다. 이 제제는 hMPV 바이러스로부터 항원성 펩티드 P-단백질을 발현하는 재조합 바실러스 칼메트-게렝 (BCG)을 함유한다.

사람 메타뉴모바이러스 (이하 hMPV)는 특히 영아, 노인 및 면역저하된 개체에서 상부 및 하부 호흡기의 급성 호흡기 감염에 연관된 높은 백분율의 입원 및 이환율의 병인체이다. 이 바이러스로의 감염은 높은 사회-경제적 영향을 갖는 증상인 세기관지염 및 폐렴인 광범위의 질환과 연관된다. 추가적으로, 위장염 및 각막결막염과 연관되어 있다. Calvo et al. (2008)은 3년간의 연구에서 호흡기 바이러스 RSV, ADV 및 hMPV에 의해 유발된 급성 호흡기 감염의 누적 발생률이 2세 이하 아동의 병원 입원의 64.5%를 차지하고, 각 바이러스의 발생률이 각각 35.4%, 19.3% 및 9.8% 임을 입증하였다. hMPV가 다른 고발생률의 호흡기 바이러스와 공유하는 하나의 흥미로운 특징은 아동기 동안 반복된 감염의 산물, 인생의 초기 몇 개월 동안 첫 감염에 대한 보호적인 면역 반응의 구축에 있어서의 실패와 아마도 연관되어 있을지 모르는 현상이다. 이 최신 현상은 공중 보건 시스템에 있어 호흡기 감염의 매년 유행을 조절하기 위한 능력을 갖춘 백신의 신규 프로토타입을 보유하기 위한 긴급한 요구를 촉진하고, 그렇게 함으로써 헬스케어 기관의 체증 및 궁극적으로 이 감염과 연관된 사회-경제적 영향을 완화하는 것을 가능하게 한다. 지금까지, hMPV 감염의 구체적인 경제적 영향에 대한 연구는 없었으나, hMPV로 인한 입원의 발생률은 인간 호흡기성 세포융합 바이러스 (human respiratory syncytial virus, hRSV)로 인한 입원의 발생률의 1/3인 것으로 추산된다. 선진국에서 수행된 연구는 hRSV 감염의 개인 비용은 상한선이 최대 8,400 유로 (오백이십만 칠레 페소 달러)인, 약 3,000 유로 (백팔십육만 칠레 페소 달러)인 것으로 추산한다. 개인 입원에 연관된 비용은 근사치이고 입원을 요구하는 비슷한 특징의 병리학적 과정에 기반한다.

hMPV 바이러스는 hRSV가 분류되는 동일한 과인 파라믹소바이러스 (Paramyxoviridae) 과 뉴모바이러스 (Pneumovirinae) 아과로 분류됨에도 불구하고 각각은 메타뉴모바이러스 및 뉴모바이러스 속으로 각각 그룹화된다. HMPV 게놈은 비분절, 단일-가닥, 음성-센스 리보핵산 (ssRNA)을 포함하고 있어서, 바이러스성 단백질은 3'에서 5' 방향 (이들 서열에 따름)으로 다음과 같이 배열된다: N, P, M, F, M2 (ORF1 및 2), SH, G, 및 L. 이들 단백질 중의 다섯은 유전성 물질을 포장하고, 뉴클레오캡시드 단백질 N 및 매트릭스 단백질 M에 상응하는 바이러스성 입자의 구조를 각각 막투과 당단백질 F, G 및 SH와 함께 한정한다. 다른 네 단백질, M2-1, M2-2, P 및 L은 바이러스성 복제 및 전사에 관여한다. hMPV의 두 아형은 주로 단백질 F 및 G의 서열 차이에 기반한 두 항원성 그룹에 관하여 A 및 B로 분류된다. 이들 단백질이 어느 정도 차이가 있음에도 불구하고, 바이러스성 게놈에 의해 코딩된 다른 단백질에 비하면 높은 동일성이 있다.

호흡기 바이러스에 대한 백신의 개발은 면역화 프로그램에서의 사용을 방지하는, 중대한 부작용을 보유한 포르말린-불활성화 바이러스에 기반한 hRSV 백신의 첫 프로토타입 (hRSV-FI)으로 1960년대 시작되었다. 수산화알미늄 보조제와 함께 근육 내 제제는 백신 접종한 영아에서 비백신 접종한 감염된 개체의 증상에 비해 더 심각한 증상을 초래하였다. 이 효과는 다형핵 세포, 호산구 및 호중구의 광범위한 실질 침윤 및 보체-고정 항체의 높은 역가를 특징으로 하는, 감염에 대한 면역 반응의 과민-반응과 연관된다.

사람 메타뉴모바이러스 (hMPV)에 있어 오직 소수의 백신만 개발되었고 현재까지 어느 것도 만족스러운 결과를 갖지 않는다. 또한, 포르말린-불활성화 바이러스 (hMPV-FI)의 동일한 이전 디자인을 사용한 프로토타입은 목화쥐 (Sigmodon hispidus) 감염 모델에서 hRSV에 대한 백신에 의해 초래된 것과 동일한 특징을 동반한 염증성 과민-반응 증상을 초래하였다 (Yim et al., 2007). hRSV에서 관찰된 과민-반응 과정과 대조적으로, 호흡기 계로부터 바이러스의 부분적 제거가 입증되었다. hRSV-FI에 노출된 쥐 (mice) 및 목화쥐에서 관찰된 질환은 Th2-유형 항체 및 NF-kB의 과장된 활성에 기반한 면역병리학적 반응과 연관된다. 증가된 NF-kB 전사 활성은 추가적으로 IL-8과 같은 전-염증성 사이토카인의 분비에 관한 것이다. 더구나, hMPV 감염 이후 폐 조직의 과민 반응은 Th1 및 Th2 유형의 병리적 반응 또는 병리적 Th2 반응에 동반되는 Th1-유형 세포에 기반한 불충분한 반응에 의한 만성 염증을 강력하게 시사하는, 기관지 폐포 세척액 내의 IFN-γ 및 IL-4의 존재 및 병든 쥐 혈청 내 IgG1 및 IgG2a 중화 항체의 감지를 특징으로 하는 면역반응과 연관되어 있다. 후자의 가정으로서, 일부 저자는 증가된 Th1 반응은 또한 질환을 악화시킬 수 있음을 제안하였다.

이들 사실은 면역 과정의 진행을 제한할 수 있게 하고, 차례로 감염된 조직으로부터 이들 바이러스의 적절한 제거를 유도할 수 있게 하는, 균형되고 효과적인 면역 반응 구축의 중요성을 강조한다.

hMPV에 의해 유발된 호흡기 질환이 세포성 면역의 유도에 있어 실패와 연관되어 있는, hSRV에서 이전에 관찰된 것과 유사하기 때문에, 둘 다 IFN-γ 생산 인자인, CD8+ 세포독성 T 세포 및 CD4+ 헬퍼 T 세포의 우수한 유도 인자인 프로토타입 백신을 생성하는 것이 필수적이다. 최근 실험적 접근은 분자 유전학 및 면역학의 다른 기술을 사용하여, 하나의 바이러스 종에 대한 백신을 개발하는 데에만 그들의 노력을 집중하고 있다. 이들 연구가 관심 있는 각 바이러스에 대한 항원으로서 제한된 수의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 사용하고 있음을 언급하는 것은 중요하다. hSRV에 있어서, 이들의 일부는 설치류 및 비-인간 영장류의 감염 모델에서 F 또는 G 단백질의 전체 서브유닛 또는 분절, 또는 이들의 혼합물과 같은 개별 바이러스성 단백질의 사용에 기반하고 있다. hSRV에 대한 일부 백신 프로토타입은 1상 및 2상 임상에서 사용되어 왔으나, 결과는 장-기간 보호적인 능력을 보여주지 못하며, 백신은 감염의 예방에 있어 광범위한 사용에 전혀 적합하지 않다 (Denis et al., 2005; Karron et al., 2005).

제안되어 온, 유전자를 제거하여 개발되어 온 약독화 hMPV 균주는 바이러스의 병원성에 관한 것이다. SH, G, 및 M2-1 및 M2-2 단백질을 코딩하는 유전자가 결여된 HMPV 균주는 백신 후보로서 제안되어 왔다 (Biacchesi et al., 2005). 이들 후보는 동물 모델에서 우수한 결과를 보였으나 사람에서는 아직 연구된 바 없다. 이 대안이 가능할지라도, 인체 사용을 위해 허가된 세포 배양에서의 바이러스 생산을 요구하므로 매우 고가이다. 또 다른 백신의 공급원은 중화 항체 생성을 위해 보조제와 커플링한 hMPV F-단백질과 같은 이종성 (heterologous) 시스템에 의한 바이러스성 단백질의 과발현이나, 이 방안의 단점은 초단기간의 시간 동안 면역을 제공한다는 것이다 (Herfst et al., 2008).

보호적인 면역을 생성할 수 있는 프로토타입의 개발이 실패해왔기 때문에, hMPV에 대한 백신 후보의 임상 연구는 없다. 지금까지, 동물 모델에서 평가된 프로토타입은 비장기간 또는 비효과적인 감염 예방인, Th2-유형 항체-기반 면역을 생성한다. 이들 프로토타입으로 백신 접종한 동물은 체외 (in vitro)에서 중화 항체를 생성하지만, 감염에 대해 보호되지 못하거나 쥐 (Cseke et al., 2007) 또는 마카크 원숭이 (Herfst et al., 2008b)에서 hMPV 감염에 의해 유도되는 질환의 임상 증상이 감소된다. 항체-기반 면역은 체내 (in vivo)에서 바이러스를 중화하는데 효과적이지 않다. 체외에서 hMPV를 중화할 수 있는 항체는 수동 면역을 통한 치료로 사용했을 때, hMPV에 의해 유발되는 감염 또는 질환을 예방할 수 없다 (Hamelin et al., 2008). 더구나, 바이러스 증상의 해결은 Th1-유형 세포-기반 면역 반응의 참가를 요구한다는 것이 관찰되었다. CD4+ 및 CD8+ 림프구의 활성이 질환의 면역병리에도 책임이 있을지라도, 바이러스 증상의 해결 및 바이러스 입자의 제거는 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 활성에 의존한다는 것이 밝혀졌다 (Kolli et al., 2008). 보다 최근에 CD4+ 헬퍼 T 림프구가 조절성 개입을 보유하더라도, 바이러스 증상의 해결의 주요 유효 인자는 CD8+-유형 세포독성 세포임이 발견되었다. 그러므로 Th1-유형 세포의 균형잡힌 면역 반응은 염증성 과민반응 유발 없이 바이러스 증상의 해결을 초래하기 위해 필요하다. 요약하자면, 현재로서 주요 부작용 없이 유효한 보호를 제공할 수 있는 사람 메타뉴모바이러스 (hMPV)에 대한 백신은 없으며, 사실, 이 바이러스에 대하여 이용할 수 있는 상업 백신도 없다.

놀랍게도 발명자들은 사람 메타뉴모바이러스로부터 P-단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 균주의 사용이 기도 내 염증성 과민반응과 같은 수용불가한 부작용 유발없이 호흡기성 메타뉴모바이러스 바이러스에 의해 초래되는 감염에 대하여 보호적인 면역 생성을 가능하게 함을 발견했다. 본 발명은 선행 기술에서 미해결된 채로 남아 있던 기술적 문제를 해결하고, hMPV에 의한 감염에 대하여 보호를 제공하고 염증성 과민반응을 생성하지 않는, 면역원성 제제로 구성된다.

본 발명은 사람 메타뉴모바이러스로부터 P-단백질을 발현하는 재조합 BCG 균주를 포함하는 hMPV에 대한 면역원성 제제로 구성된다. 이 제제는 hMPV에 의한 감염에 대하여 효과적인 보호를 제공하고 염증성 과민-반응을 생성하지 않는다.

본 발명의 제제는 단독으로 또는 hMPV 및 SRV와 연관된 감염 및/또는 합병증에 대하여 보호를 전달할 수 있는 혼합 투여량으로, SRV에 대한 면역원성 제제와 같은 다른 백신과 혼합하여 전달될 수 있다.

본 발명에서 설명되는 면역원성 제제는 투여량 당 1x10⁴ CFU 내지 1x10¹⁰ CFU 사이의 투여량에서, 바람직하게는 투여량 당 1x10⁸ CFU 투여량으로, 무균 배양으로부터, 생 약독화 재조합 박테리아를 함유하는 백신을 준비하기 위해 사용될 수 있다. 보조제가 재조합 박테리아의 세포외막 (cell envelope) 조성물이기 때문에, 제제는 보조제를 요구하지 않는 재구성 용액으로 동결건조된 채 존재할 것이다. 본 발명의 동결건조된 면역원성 제제는 4 및 8℃ 사이에서 보관되어야 하고, 직사일광 및 간접일광으로부터 보호되어야 하고, 투여 전 혼합을 위해 하나는 동결건조 재조합 박테리아를 함유하고 또 다른 것은 재구성 식염수 용액으로 두 개의 분리된 바이알에 제제화되어야 한다.

1921년 도입 이래로, 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis ) 바실러스 칼메트-게렝 (BCG)에 기반한 백신은 10억 명 이상 사람들에 사용되어 왔고 현재 전세계적으로 결핵에 사용되고 있다.

발명자들은 보호가 시간에 따라 안정하지 않은 Th-2 유형 전-염증성 반응으로부터 구체적으로 CD8⁺ 세포독성 T 세포 및 CD4⁺ 헬퍼 T 세포의 Th1-유형 세포-기반 반응으로 면역 반응의 균형을 이동하는 방식이 마이코박테리움 세포벽의 성분과 같은 보조제의 사용임을 발견했다. 구체적으로, 마이코박테리움 보비스 바실러스 칼메트-게렝 (BCG)으로부터 면역원성 단백질을 발현한다.

hMPV로부터 F 및 G 단백질은 바이러스 입자의 표면에서 발견되고 그러므로 순환 항체에 접근 가능하다. 그러므로 이들 단백질은 hMPV 감염을 예방하기 위한 항체 생산에 기반을 둔 백신을 위한 명확한 선택일 수 있다.

전술한 것에도 불구하고, 본 발명 내에서 우리는 면역원으로서, 비노출된 캡시드 단백질, 구체적으로 P-단백질을, 약독화한 마이코박테리움 보비스 BCG 박테리아와 같은 Th1-유형 세포-기반 반응을 촉진하는 보조제와 함께, 사용하는 것을 선택하였다. hMPV M2.1과 같은 캡시드 단백질이 세포독성 림프구 (CTL)의 활성을 촉진하는 것이 발견되었다. 놀랍게도, 본 발명 내에는 백신 또는 면역원성 조성물로써 사용되었을 때 염증성 과민 반응과 같은 원하지 않는 부작용 없이 효과적인 보호를 제공하고, 마이코박테리움에 의해 발현되는 면역원성 단백질로 사용되었을 때 면역원성 조성물을 제제화하는 것을 가능하게 하는, hMPV 바이러스로부터 비노출된 단백질인 P-단백질의 사용이 기술되었다.

여기서 사용되는, 박테리아 벡터에 의해 발현되는 재조합 단백질은 모든 시판되는 원핵성 발현 벡터 내의 그룹 A hMPV로부터 동일한 것을 코딩하는 유전자를 클로닝함으로써 획득된다. 메타뉴모바이러스 (hMPV) 게놈은 이전에 기술되었고 기탁 번호 AB503857.1, DQ843659.1, DQ843658.1, EF535506.1, GQ153651.1, AY297749.1, AY297748.1, AF371337.2, FJ168779.1, FJ168778.1, NC_004148.2 및 AY525843.1으로 GenBank 데이터베이스에서 접근 가능하다. 여기에 기술된 재조합 박테리아 균주의 획득은 숙주 내 박테리아 복제 동안 바이러스성 단백질의 이종성 발현을 포함한다. 이종성 DNA 서열은 발현 벡터 pMV361을 통해 박테리아 염색체 DNA에 융합된다. 이들 hMPV 단백질은 펩티드 서열 또는 글리코실화 도메인의 혼입 및/또는 비오틴-스트렙타비딘 시스템 (상업적 비오티닐화 키트 및 박테리아 단백질 스트렙타비딘에 커플링 또는 원핵성 및/또는 진핵성 이종성 발현 시스템을 위해 이전에 기술된 기술을 사용하여, 재조합 단백질 또는 단백질 분절 내의 비오티닐화 신호로 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 유전적 서열의 도입에 의한 바이러스 단백질의 유전적 변형을 사용)을 사용한 자연적인 리간드에 대한 항원제시세포들의 커플링에 의해 항원 제시 세포들의 내포 작용의 또는 포식 작용의 수용체에 대한 연속적인 목적지와 같이 유전적으로 조작될 수 있다.

본 발명의 면역원성 제제는 마이코박테리움의 약독화 균주에서 완전한 분절 또는 이들의 면역원성 분절인 hMPV P-단백질의 발현을 포함한다. 특히 바람직한 것은 바실러스 칼메트-게렝 (BCG) 균주로부터 유래한 재조합 약독화 마이코박테리움 균주이다. HMPV P-단백질은 메타뉴모바이러스 아형 A 또는 B로부터 P-단백질일 수 있다.

본 발명의 재조합 약독화 마이코박테리움 균주는 하나 이상의 카피로 박테리아 게놈 또는 염색체외 플라스미드에 삽입되는 hMPV P-단백질 또는 이들의 면역원성 분절을 코딩하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 단백질 발현은 마이코박테리움 BCG로부터 구성적인 또는 유도적인, 내생의 또는 외생의 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.

HMPV P-단백질 또는 이들의 면역원성 분절은 세포 외로 분비되거나 막-결합 단백질로서 가용성, 세포질-가용성 형태로 발현될 수 있다.

본 발명의 면역원성 제제는 마이코박테리움의 둘 이상의 재조합 약독화 균주를 포함할 수 있고, 균주로부터 hMPV P-단백질의 단백질 또는 면역원성 분절이 다른 수의 카피를 생성하기 위해 발현되고, 구성적 또는 유도적으로 발현 및/또는 다른 세포 장소에 위치한다.

여기서 개시된 면역원성 제제는 hSRV 및 hMPV의 다른 바이러스에 대한 추가의 항원 제제를 포함하는 다른 면역원성 제제, BCG의 약독화 균주 및 인플루엔자 A 및 B에 대한 계절성 백신과 함께 사용될 수 있다.

상기 기술한 면역원성 제제는 완충 식염수 (PBS, 인산나트륨 완충제) 또는 식염수 용액과 함께 피하/진피하 형태로 개인에게 적용될 수 있다.

hMPV P-단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 박테리아를 개발하기 위해, 첫째 우리는 상기 단백질을 발현하는 벡터를 생성해야 한다. 임의의 공지된 마이코박테리아성 발현 벡터가 사용될 수 있고, hMPV 바이러스로부터 P-단백질을 코딩하는 유전자는 프로모터 영역으로 페이즈 (phase)에 삽입되어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 분리된 사람 메타뉴모바이러스로부터 RNA로부터 보편적인 프라이머로 역전사가 수행된다. 연속적으로 P-단백질 유전자는 구체적인 프라이머로 증폭된다 (도 1A). 증폭 산물은 발현 벡터에 삽입된다. 본 발명에서 우리는 벡터 pMV361-P-hMPV를 생성하는 마이코박테리아 발현 벡터 pMV361을 사용했다 (도 1B).

일단 획득된 벡터는 마이코박테리움 BCG와 같은, 마이코박테리움 균주를 형질전환하기 위해 사용되었다. 본 발명의 목적을 위해 BCG Pasteur 또는 BCG Danish 와 같은 임의의 공지된 BCG 균주가 사용될 수 있다. 형질전환의 방법은 가능한 임의의 방법일 수 있고, 특히 바람직한 것은 전기형질전환이다. 연속적으로, hMPV P-단백질을 발현하는 형질전환된 세포가 선택되어야 한다.

이들 재조합 세포는 약제학적으로 적합한 식염수 완충제 내에 10⁴ 내지 10⁹ CFU/투여량 사이의 양으로 제공되는 본 발명의 면역원성 제제이다.

추가로, 본 발명의 제제는 호흡기성 세포융합 바이러스 (RSV)로부터 면역원성 단백질을 발현하는 재조합 BCG 균주와의 조합으로 제제화된다. 바람직한 실시양태에서, hMPV P-단백질을 발현하는 재조합 BCG 박테리아는 RSV로부터 N, P, M, F, M2 (ORF1 및 2), SH, G 또는 L 단백질을 발현하는 재조합 BCG 박테리아와 함께 제공된다. 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 제제는 RSV로부터 N 유전자를 재조합한 BCG 균주와의 조합으로 사용된다. 특히, hMPV 아형 A로부터 P 유전자를 재조합한 BCG 및 RSV 아형 A의 N 유전자를 재조합한 BCG의 조합이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서 BCG 균주는 hMPV P-단백질을 발현하는 벡터에 의해 형질전환되고, 이후 형질전환된 세포는 호흡기성 세포융합 바이러스 (RSV)의 단백질을 발현하는 벡터에 의해 재-형질전환된다. RSV 단백질은 N, P, M, F, M2 (ORF1 및 2), SH, G 또는 L로부터 선택된다. 특히 첫째로, 바람직한 hMPV 아형 A로부터 P-단백질을 발현하는 벡터로 형질전환, 그리고 둘째로, 이 형질전환된 균주를 RSV 아형 A의 N 유전자를 발현하는 벡터로 두 번째 형질전환에 종속시키고, hMPV 아형 A로부터 P-단백질 및 SRV 아형 A로부터 N-단백질을 동시에 발현하는 BCG 균주를 획득한다.

본 발명의 면역원성 제제는 재구성 용액의 1x10⁹ CFU/ml를 획득하기 위해, 부착된 식염수 용액의 1ml 내에 재구성을 위해 준비된 다회 투여 제형으로 동결건조되어 제공될 수 있다. 재현탁된 용액의 각 0.1ml는 투여를 위해 1x10⁸ CFU의 적합한 투여량을 포함할 것이다.

동결건조 용액을 준비하기 위해 본 발명의 형질전환된 균주는 임의의 적합한 동결건조 용액, 예를 들어 4% (w/v) 만니톨, 0.05% (w/v) 티록사폴, 0.25% 수크로오스 및 5mM 히스티딘을 포함하는 LYO C 완충제 내에 현탁될 수 있고 사용될 수 있다. 이후 동결건조될 수 있고 25℃에서 보관될 수 있다.

재구성 용액은 기술분야에서 가능한 임의의 것으로, 하나의 실시양태에서 -80℃에서 희석 사우톤 SSI 용액 (1ml H₂O 내에 125μg MgSO₄, 125μg K₂HPO₄, 1mg L-아스파라긴, 12.5μg 2가 철 암모늄 시트르산, 18.4mg 85% 글리세롤, 0.5mg 시트르산)이 바람직하다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제제는 PBS (137mM NaCl; 2.7mM KCl; 4.3mM Na₂HPO₄; 1.47mM KH₂PO₄, pH 7.4)에서 현탁될 수 있고, 100μl 당 10⁸ 박테리아의 최종 농도에서 20% 글리세롤, 0.02% Tween 80이 첨가되고 -80℃에서 보관될 수 있다. 둘 모두 0.1% Tween 80 또는 0.05% 티록사폴과 같은 비이온화 세제의 존재하에 있다.

본 발명의 제제는 재구성 이전 및 이후 4-8℃ 사이에 보관되어야 하고, 직사일광 및 간접 일광으로부터 언제나 떨어져 있어야 하고 재구성되면 그날의 끝에 폐기되어야 한다.

바이러스 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 박테리아에 기반한 hMPV에 대한 면역원성 제제를 생성하고 사용하기 위한 하기의 실시예는 예를 들기 위한 것일 뿐이고 본 발명의 생산 또는 적용 범위를 제한하기 위해 의도되는 것이 아니다. 구체적인 용어가 하기 실시예에 사용되었을지라도, 이의 사용은 구체화만을 위한 것이고 이에 한정되지 않는다.

도 1: pMV361 -P- hMPV 컨스트럭트의 생성. 메타뉴모바이러스로부터 RNA 역전사가 보편적인 프라이머로 수행되었고, 이후 P 유전자의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)으로부터 P-hMPV-Fw 및 P-hMPV-Rv 프라이머로 증폭되었다. 양단에서의 EcoRI 사이트가 증폭 산물에 혼입되었고, 이후 컨스트럭트 벡터 pMV361-P-hMPV를 생성하기 위해 pMV361 마이코박테리아성 벡터의 EcoRI 사이트에 삽입되었다. 도 1A는 hMPV 게놈 및 P-단백질을 코딩하는 유전자를 도시하며, 도 1B는 P-단백질을 코딩하는 상기 유전자를 혼입하는 pMV361-P-hMPV 벡터를 도시한다.
도 2. 마이코박테리움 BCG의 재조합 균주에 의해 hMPV로부터 P-단백질 또는 M2.1 단백질의 발현. 마이코박테리움 BCG Danish 균주는 플라스미드 pMV361-P-hMPV으로 전기형질전환되었고, 올레인산, 알부민, 덱스트로스 및 20μg/ml의 카나마이신을 함유하는 카탈라아제가 첨가된 Middlebrook 7H10 한천 배지 상에서 선택되었다. SDS-PAGE (CB) 전기영동 및 웨스턴 블랏 (WB)은 단일클론 항-hMPV P-단백질 항체를 사용하여 수행되었다 (WB). 도 2A: 단일클론 항-hMPV P-단백질 항체를 사용한 웨스턴 블랏 및 도 2B: 단일클론 항-hMPV M2.1 단백질 항체를 사용한 웨스턴 블랏. SDS-PAGE에서, rBCG-P-hMPV (도 2A)의 네 개의 클론 또는 rBCG-M2.1-hMPV (도 2B)로부터 다섯 개 클론으로부터 준비된 25μg의 전체 P-단백질이 로딩되었다. 양성 대조군으로서, 5ng의 재조합 hMPV P-단백질 또는 25μg의 불활성화 hMPV가 적절하게 로딩되었다. 음성 대조군으로서, BCG의 야생형 균주로부터 전체 단백질이 로딩되었고, 또한, rBCG-P-MPV의 경우 SRV (N-5 균주)로부터 N 유전자가 재조합된 BCG가 로딩되었다. 분석된 모든 클론은 클로닝된 플라스미드 단백질, 게다가 P-단백질, 도 2A, 또는 M2.1 단백질, 도 2B를 발현하는 것으로 평가될 수 있다.
도 3. hMPV감염에 대하여 보호하는 재조합 rBCG -P- hMPV에 의한 면역. 4 내지 8주 BALB/c 쥐의 그룹이 1x10⁸ 콜로니 형성 단위 (CFU)의 진피하 투여량의 rBCG-M2.1-hMPV, rBCG-P-hMPV 또는 WT-BCG (야생형)을 투여받았고, 또한, 생 바이러스 (생-hMPV) 또는 UV-비활성화 바이러스 (UV-hMPV)의 1x10⁶ 플라크 형성 단위 (PFU)로 백신 접종받았다. 이후 모든 그룹은 1x10⁶PFU의 hMPV로 경비로 감염되었다. 대조 그룹으로서, 비백신 접종한 동물 및 비감염된 동물의 다른 하나의 그룹이 포함되었다. 감염 이후 6일 동안 동물의 체중이 기록되었고, 각 실험 종료시에 희생되었으며 기관지 폐포 세척액 (BAL)과 폐가 각각으로부터 획득되었다. 심벌은 개별 동물을 나타내고, 수평 막대는 평균이다. (도 3A) 감염에 따른 각 그룹의 동물들에 있어 체중 손실의 그래프 표시. (도 3B) 기도에 침윤한 세포의 합계. (도 3C) BAL 내에서 CD11b 및 Gr1에 의한 이중 염색에 양성으로 반응한 세포의 백분율. (도 3D) 정량적인 PCR에 의해 감염된 쥐의 폐 내 hMPV RNA의 측정. 희생된 각 동물의 폐로부터 전체 RNA가 획득되었고 역전사에 의해 cDNA를 생성하기 위해 사용되었다. 연속적으로, 생성된 cDNA는 β-액틴 RNA의 카피의 수에 비례하는 샘플 내에 존재하는 바이러스 RNA의 카피 수를 측정하기 위한 정량화 PCR 반응에 사용되었다. 도 3A에서 P (ㆍ) 단백질 및 M2 (u) 단백질에 대한 재조합 BCG 백신은 비감염 동물 (▼)의 체중과 유사한 체중을 획득하는, 감염에 따른 동물의 체중 손실을 보호하였다. 더구나, 비면역 동물(p) 또는 야생형 BCG (WT-BCG) (<), 생-hMPV (<) 또는 UV-hMPV (ㆍ)로 면역된 동물은 감염에 따른 동물 체중 손실을 겪었다. 도 3B 및 도 3C는 P-단백질에 대한 재조합 BCG 백신이 비감염 동물과 유사한 침윤을 획득하는, 감염에 따른 동물의 기도 내 면역 세포의 침윤을 예방하는 것을 도시한다. 더구나, 비면역 동물 또는 야생형 BCG, WT-BCG, 생-hMPV 또는 UV-hMPV로 면역된 동물은 그들의 기도에서 후-감염 면역 세포 침윤을 겪었다. rBCG-M2로의 백신 접종은 불완전한 보호를 제공한다. 도 3D는 감염된 비면역 동물의 폐에 존재하는 β-액틴의 5000카피 당 N-hMPV 유전자 카피 내에 발현되는 hMPV 바이러스의 수가 WT-BCG, 생-hMPV 또는 UV-hMPV로 면역된 감염된 동물의 것과 동일한 것을 도시하며, 즉, 보호를 제공하지 않고, 반면에 rBCG-P-MPV로 면역된 감염된 동물은 비감염 동물처럼 실질적으로 바이러스를 갖고 있지 않다. rBCG-M2로의 면역은 불완전한 보호를 제공한다.
도 4. hMPV 챌린지 (challenge) 이후 염증에 대하여 보호하는 rBCG -P- hMPV로의 면역. 1x10⁶ PFU의 hMPV로의 챌린지 6일 뒤 동물의 폐는 제거되어 파라포름알데히드에 고정되고 파라핀에 임베딩 (embedded)되고 7mm 섹션이 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다. 비면역 동물 또는 rBCG-M2.1-hMPV 또는 WT-BCG로 면역된 동물에서 다형 핵 세포의 상당한 침윤이 관찰되었다. 그러나 rBCG-P-hMPV로 면역된 동물에서 획득된 폐에서는 염증 신호가 관찰되지 않았다. 이미지는 대표적인 여섯 개의 독립적인 실험이다. HSP는 동물의 그룹당 염증 스코어의 정량화를 나타낸다 (조직병리학 스코어). 이는 비면역 동물과 유사하게, rBCG-P-MPV로 면역된 동물 내의 염증 및 감염이 매우 낮거나 비-존재하는 것으로 평가될 수 있다.
도 5. Th1 -유형 사이토카인 프로파일을 생산하는 rBCG -P- hMPV로의 면역화. rBCG-P-hMPV 면역성에 책임이 있는 면역 반응의 유형을 측정하기 위해, hMPV P-단백질 (그래프에서 rBCG-P-hMPV: rBCG-P)에 대한 재조합 BCG 균주로 면역된 BALB/cj의 비장 세포의 사이토카인 프로파일이 분석되었다. rBCG-P-hMPV로 면역된 네 마리의 BALB/cj의 비장이 회복되었고 비장 세포는 10μg의 P-단백질 hMPV 또는 PBS (그래프에서 U/S)로의 인큐베이션에서 7일 동안 자극되었다. 대조군으로, WT-BCG로 면역된 BALB/cj의 비장 세포는 동일한 조건하에 배양되었다. 자극된 및 비자극된 rBCG-P-hMPV 및 WT-BCG 비장 세포의 상등액은 ( A) IFN-g, ( B) IL-2, ( C) IL-5 및 (D) IL-4의 수준을 측정하기 위해 ELISA에 의해 4일 및 7일의 배양에서 분석되었다. P-단백질-hMPV (rBCG-P)로 자극된 rBCG-P-hMPV로부터 유래한 비장 세포는 WT-BCG 또는 비-자극 세포 (rBCG-P U/S)로 면역된 동물로부터의 세포에 비교했을 때 상당히 더 높은 양의 IFN-g를 분비하였다 (*** p <0,001, Student's　t　test), 도 5A. 더구나, IFN-g 양은 4 내지 7일 사이에 증가하였다 (* p <0,05, Student's　t　test), 도 5A. rBCG-P-hMPV (rBCG-P)로 면역된 쥐로부터 자극된 비장 세포는 비자극 세포 (rBCG-P U/S)에 비교할 때 4일에 상당히 높은 양의 IL-2을 생산하였고, 7일에 기초 수준이 감소하였다 (**, p <0,001; ns = non-significant, Student's　t　test), 도 5B. 비장 세포는 WT-BCG 또는 비-자극된 비장 세포에 비해 증가를 보여주지 않고 낮은 양의 IL-5 및 IL-4를 분비하였다 (ns = non-significant, Student's　t　test), 도 5C.
도 6. rBCG -P- hMPV로 면역된 쥐로부터 나이브 (naive) 쥐에서 hMPV 감염에 대한 저항을 제공하는 T 림프구의 전달. 재조합 바이러스 단백질에 의해 자극 및 비-자극된 비장 세포로부터 CD4⁺ T 림프구 및 CD8⁺T 세포가 정제되었다. 독립적으로, 이백만 개의 자극된 또는 비-자극된 CD4⁺　또는 CD8⁺ T 림프구가 rBCG-P-MPV 또는 WT-BCG로 면역된 동물로부터 나이브 쥐의 꼬리 정맥을 통해 전달되었다. 전달 이후 24시간 뒤, 쥐는 1x10⁶ PFU의 hMPV로 경비로 감염되었다. 도 6A에서, rBCG-P-MPV로 면역된 동물로부터 CD4⁺　및/또는 CD8⁺ T 림프구가 전달된 쥐는 비감염된 쥐에 비하여 체중에 있어 차이를 보이지 않았다. 대조적으로, 우리는 WT-BCG로 면역된 동물로부터 CD4⁺　및/또는 CD8⁺ T림프구를 전달받은 쥐는 비감염 동물에 비하여 상당히 체중이 더 손실된 것을 관찰하였다 (p<0.0001) (도 6B). 도 6C는 (P-CD8, P-CD4, P-CD8/4)로 면역된 동물로부터 CD4⁺및/또는 CD8⁺ T 림프구가 이전에 전달된 나이브 쥐로부터 기관지 폐포 세척액, BAL은 WT-BCG (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4)로부터 T 림프구가 전달된 쥐에 비해 상당히 낮은 과립구의 침윤을 보였다 (*** p <0,0001, Student's t　test). WT-BCG로부터 T 림프구가 전달된 쥐 또는 비면역 쥐의 BAL 내의 과립구 침윤은 T 림프구를 받지 않은 쥐의 침윤과 상당한 차이를 보이지 않았다 (NS = no　significant,　Student's t　test). 도 7D는 rBCG-P-hMPV로 면역된 쥐로부터 T 림프구 (P-CD8, P-CD4, P-CD8/4)가 전달된 쥐의 폐 내의 바이러스 로드 (load)가 WT-BCG 균주로 면역된 동물 및 비면역 동물로부터 T 림프구 (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4)가 전달된 쥐의 바이러스 로드에 비하여 낮았다 (***, p <0,0001, Student's t　test). WT-BCG로부터 T 림프구 (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4)가 전달된 쥐의 폐 내의 바이러스 로드는 비면역 쥐와 상당한 차이를 보이지 않았다 (ns = non-significant,　Student's t　test). 바이러스 로드는 상기에 기술된 대로 RT-qPCR에 의해 N-hMPV의 유전자 카피로서 측정되었다.

실시예

실시예 I: 마이코박테리움 BCG 내에서 hMPV P-단백질의 발현을 가능하게 하는 재조합 벡터의 생성

메타뉴모바이러스 P 유전자의 코딩 영역은 RNA로부터 하기 프라이머를 사용하여 증폭되었다:

P-hMPV_Fw: 밑줄 친 서열이 도 1A의 증폭 산물의 양단에서 EcoRI 사이트에 혼입된 GAATTCATGTCATTCCCTGAAGGAAA (서열번호 1) 및 P-hMPV_Rv: GAATTCCTACATAATTAACTGGTAAA (서열번호 2). 마이코박테리아성 벡터 pMV361은 hMPV로부터 P 유전자에 상응하는 서열을 삽입할 수 있게 EcoRI 사이트로 선형화되었다:

GAATTC ATGTCATTCCCTGAAGGAAAAGATATTCTTTTCATGGGTAATGAAGCGGCAAAATTGGCAGAAGCTTTCCAAAAATCATTAAGAAAACCTAGTCATAAAAGATCTCAATCTATTATAGGAGAAAAAGTGAACACTGTATCTGAAACATTGGAATTACCTACTATCAGTAGACCTACCAAACCGACCATATTGTCAGAGCCGAAGTTAGCATGGACAGACAAAGGTGGGGCAATCAAAACTGAAGCAAAGCAAACAATCAAAGTTATGGATCCTATTGAAGAAGAAGAGTTTACTGAGAAAAGGGTGCTGCCCTCCAGTGATGGGAAAACTCCTGCAGAAAAGAAGTTGAAACCATCAACCAATACTAAAAAGAAGGTCTCATTTACACCAAATGAACCAGGAAAATACACAAAGTTGGAGAAAGATGCTCTAGACTTGCTTTCAGACAATGAAGAAGAAGATGCAGAATCCTCAATCTTAACCTTCGAAGAAAGAGATACTTCATCATTAAGCATTGAAGCCAGACTAGAATCGATTGAGGAGAAATTAAGCATGATATTAGGGCTATTAAGAACACTCAACATTGCTACAGCAGGACCCACAGCAGCAAGAGATGGGATCAGAGATGCAATGATTGGCATAAGGGAGGAACTAATAGCAGACATAATAAAAGAAGCCAAGGGAAAAGCAGCAGAAATGATGGAAGAAGAAATGAACCAGCGGACAAAAATAGGAAACGGTAGTGTAAAATTAACTGAAAAGGCAAAGGAGCTCAACAAAATTGTTGAAGACGAGAGCACAAGTGGTGAATCCGAAGAAGAAGAAGAACTAAAAGACACACAGGAAAATAATCAAGAAGATGACATTTACCAGTTAATTATGTAGGAATTC (서열번호 3)

hMPV P 유전자의 오픈-프레임 (open-frame)의 벡터 pMV361의 EcoRI 사이트로의 삽입은 hsp60 프로모터의 조절 하에 위치하게 하고 pMV361-P-hMPV의 제조로 이어지게 하였다 (도 1B).

실시예 II: hMPV 아형 A로부터 P 유전자를 재조합한 BCG Danish 균주의 각 1x10 ⁸ CFU의 10 투여량을 포함하는 면역원성 제제

hMPV 아형 A로부터 P 유전자는 단백질 발현을 위해 마이코박테리움 BCG로부터 내인성 구성적 hsp60 프로모터의 조절하에 박테리아 게놈에 한 카피로 삽입되었다.

마이코박테리움 BCG Danish 균주 (ATCC 35733)는 박테리아 게놈에 한번 삽입되는, 플라스미드 pMV361 (Stover et al., 1991)로부터 유래한 플라스미드 pMV361-P-hMPV의 전기형질전환에 의해 형질전환되었다. 이 플라스미드는 BCG로부터 hsp60 유전자의 내인성 구성적 프로모터 하에 발현되는 hMPV 아형 A으로부터 P-단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다. 결과적인 재조합 콜로니는 최대 OD_600nm= 1까지 키워졌고 (첨가된 Middlebrock 7H9 배양 배지 (4.9g/L) 내에서 37℃), 20분간 4000rpm에서 원심분리되었고 (Eppendorf rotor model 5702/R A-4-38), 100μl 당 10⁸ 박테리아의 최종 농도까지 20% 글리세롤 및 0.02% Tween 80이 첨가된 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄　, pH 7.4) 내에서 재현탁되고 -80℃에서 보관되었다.

유사하게도, 균주는 동결건조될 수 있게 25% 락토오스 부피 및 글루코오스 및 Tween 80이 첨가된 Proskauer 및 Beck 배지 (PBGT: 증류수 1리터당 0.5g 아스파라긴, 5.0g 인산칼륨, 1.5g 마그네슘 시트레이트, 0.5g 황산칼륨, 0.5ml Tween 80 및 10.0g 글루코오스)의 부피 용액 내에서 재현탁될 수 있고 이후 25℃에서 보관될 수 있다.

웨스턴 블랏 및 hMPV P-단백질에 대한 항체 사용으로, BCG의 이 균주가 세포질 내에서 구성적으로 hMPV 아형 A의 P-단백질을 발현하는 것이 관찰될 수 있다 (도 2A).

백신으로서, rBCG-P-hMPV의 1x10⁸ 콜로니 형성 단위 (CFU)의 진피하 투여량으로 BALB/c 쥐의 면역화는 이들 동물에게 hMPV 아형 A의 10⁶플라크 형성 단위에 의한 경비 감염에 대한 보호를 제공한다 (도 3). 본 발명인 rBCG-P-hMPV의 백신의 효과는 hMPV로부터 또 다른 단백질인 M2단백질을 발현하는 rBCG 백신과 비교되었고, 비형질전환된 BCG와 비교되었다; 비면역 그룹이 대조군으로 사용되었고, 모든 그룹은 hMPV로 경비로 감염되었고, 또한 비면역, 비감염 대조군이 포함되었다. 감염 이후 동물의 체중 변화가 분석되었고, 결과는 도 3A에 도시되었다. hMPV로부터 P (ㆍ) 단백질 및 M2 (u) 단백질이 재조합된 BCG 백신은 비감염 동물 (▼)과 유사한 체중을 획득하여 동물 감염에 이어지는 체중 손실에 보호적이었다. 더구나, 비면역 동물 (p) 또는 야생형 BCG (WT-BCG) (<), 생-hMPV (<) 또는 UV-hMPV (ㆍ)로 면역된 동물은 감염 이후 체중 손실을 겪었다.

또한, 질환 발병의 표시 변수인, 감염 이후 동물의 기도 내 면역 세포 침윤이 분석되었다. 이는 기도로의 침윤된 세포의 수 (도 3B)에 의해 그리고 과립구에 대응하는 CD11b 및 Gr1에 양성인 침윤중인 세포 (도 3C)를 통해 분석되었다. 도 3b는 발명 rBCG-P-hMPV의 백신만이 비감염 동물과 유사한 침윤을 야기하는, 기도 내 림프구 침윤을 예방하는 것을 도시한다. 더구나, 비면역 동물 또는 야생형 BCG (WT-BCG) 또는 rBCG-M2-hMPV 백신으로 면역된 동물은 감염 이후 기도 내 면역 세포의 침윤을 겪었다. rBCG-M2의 백신 접종은 면역 세포 침윤에 있어 동물 기도 내 불완전한 보호를 제공한다.

추가적으로, 연구중인 다른 그룹의 폐 세포 내 N-hMPV 유전자 RNA의 다수의 카피가 분석되었다. hMPV 바이러스 RNA의 대다수의 카피는 대규모 감염을 시사하며, 결과는 β-actin 카피 당 표준화되었다. 결과는 도 3D에 도시되었다. 비면역 감염된 동물의 폐 내에 존재하는 hMPV 바이러스의 수는 WT-BCG, 생-hMPV 또는 UV-hMPV에 의해 면역된 감염된 동물의 것과 유사한 것으로 평가되었다 (즉, 이들 면역화가 보호를 제공하지 않음). rBCG-M2로의 면역화가 불완전한 보호를 제공하는 것으로 관찰되었다. 추가적으로, 비감염 동물의 그룹과 유사한 결과로, 실질적으로 발명 rBCG-P의 백신으로 면역된 감염된 동물 내에서 바이러스가 없었다. 이는 본 발명의 제제가 효과적으로 hMPV 감염에 대해 보호하는 것을 입증한다.

실시예 III: hMPV 아형 A로부터 P 유전자가 재조합된 마이코박테리움 BCG Danish 균주로부터 5x10 ⁷ 박테리아 및 RSV 아형 A로부터 N 유전자가 재조합된 마이코박테리움 BCG Danish 균주로부터 5x10 ⁷ 박테리아를 포함하는 면역원성 제제

면역원성 제제를 구성하는 각 박테리아에서, hMPV 및 RSV로부터 유전자가 BCG로부터 내인성 구성적인 hsp60 프로모터의 조절 하에 한 카피로 박테리아 게놈에 삽입되었고 단백질 발현은 세포질성이었다. 면역원성 제제는 100μl 당 10⁸ 박테리아의 최종 농도에서 20% 글리세롤 및 0.02% Tween 80이 첨가된 PBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄, 1.47mM KH₂PO₄, pH 7.4) 내에서 보존되었고 -20℃에서 보관되었다.

BCG Danish 균주 (ATCC 35733)는 발명 rBCG-P-MPV의 균주를 제공하기 위해 hMPV로부터 플라스미드 pMV361-P로 전기형질전환에 의해 형질전환되었고, 추가로 두 번째 그룹은 형질전환된 균주 rBCG-N SRV를 획득하기 위해 SRV로부터 pMV361-N로 형질전환되었고, 이들 플라스미드는 박테리아 게놈에 한번 삽입되는 pMV361 (Stover et al., 1991)로부터 유래하였다. 결과적인 재조합 콜로니는 첨가된 Middlebrock 7H9 배양 배지 내에서 37℃에서 최대 OD_{600 nm} =1까지 키워졌고, 4000 rpm에서 20분간 원심분리되었고 (Eppendorf rotor model 5702/R A-4-38) 100μl 당 10⁷ 박테리아의 최종 농도까지 20% 글리세롤 및 0.02% Tween 80이 첨가된 PBS (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na₂HPO₄, 1.47mM KH₂PO₄, pH 7.4) 내에서 재현탁되었고, -20℃에서 보관되었다. 균주들은 4% (w/v) 만니톨, 0.05% (w/v) 티록사폴, 0.25% 수크로오스 및 5mM 히스티딘을 포함하는 LYO C 완충제 내에서 재현탁되었고, 이후 동결건조되고 4℃에서 보관되었다. 웨스턴 블랏 분석 및 hMPV P-단백질 또는 RSV N-단백질에 대한 특이 항체를 사용하여 BCG Danish 균주가 각각 hMPV로부터 P-단백질 또는 SRV 아형 A로부터 N-단백질을 재조합적으로 발현하는 것이 관찰되었다 (도2). 두 형질전환 균주를 포함하는 면역원성 제제는 동시에 hMPV 및 RSV 바이러스에 대한 면역을 제공한다.

실시예 IV: hMPV 아형 A로부터 P 유전자가 재조합된 BCG Danish 균주로부터 10 ⁴ 박테리아의 면역원성 제제

hMPV 아형 A로부터 P 유전자로 형질전환된 BCG Danish 균주는 일산화질소, 낮은 산소 농도 및 정지된 성장기에 대한 반응에서 활성인 내인성 유도적인 acr 프로모터의 조절하에 유전자가 BCG로부터 한 카피로 박테리아 게놈에 삽입되었다. 단백질 발현은 세포질성이다. 면역원성 제제는 4% (w/v) 만니톨, 0.05% (w/v) 티록사폴, 0.25% 수크로오스 및 5mM 히스티딘을 포함하는 LYO C 완충제 내에서 동결건조되었고 희석 Sauton SSI 용액 (1ml의 물 내에 125μg MgSO₄, 125μg K₂HPO₄, 1mg L-아스파라긴, 12.5μg 2가 철 암모늄 시트레이트, 18.4mg 85% 글리세롤, 0.5mg 시트르산) 내에서 25℃에서 재구성되어 보관되었다. 대안적으로, 형질전환된 균주는 100μl 당 10⁴ 박테리아의 최종 농도까지 0.02% Tween 80 및 20% 글리세롤이 첨가된 PBS (137mM NaCl; 2.7mM KCl; 4.3mM Na₂HPO₄; 1.47mM KH₂PO₄, pH 7,4) 내에서 보존될 수 있다.

BCG Danish 균주 (American Type Culture Collection, www.atcc.org, ATCC number 35733)는 박테리아 게놈에 한번 삽입된 플라스미드 pMV361 (Stover et al., 1991)로부터 유래한 플라스미드 pMV361_Pacr/P-hMPV로 전기형질전환에 의해 형질전환되었다. 이 플라스미드는 BCG로부터 내인성 유도성 acr 프로모터의 조절하에 발현되는, hMPV 아형 A로부터 P-단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다. 결과적인 재조합 콜로니는 최대 OD_{600 nm} =1까지 키워졌고 (37℃에서 첨가된 Middlebrock 7H9 배양 배지), 20분 동안 4000rpm에서 원심분리되었고 (Eppendorf rotor model 5702/R A-4-38) 4% (w/v) 만니톨, 0.05% (w/v) 티록사폴, 0.25% 수크로오스 및 5mM 히스티딘으로 구성된 LYO C 완충제에서 재현탁되었다. 결국, 10⁴박테리아의 1ml 분획은 동결건조되었고 25℃에서 보관되었다. 유사하게도, 균주는 100μl 당 10⁴ 박테리아의 최종 농도에서 0.02% Tween 80 및 20% 글리세롤이 첨가된 PBS (137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 4.3 mM Na₂HPO₄; 1.47 mM KH₂PO₄, pH 7,4) 내에서 보존될 수 있다. 이 면역원성 제제는 hMPV 바이러스에 대한 면역성을 제공한다.

실시예 V: hMPV 아형 A로부터 유전자 P가 재조합된 BCG Danish 균주로부터 10 ⁹ 박테리아로 구성된 면역원성 제제

T7-파지 폴리머라제를 공동-발현하는 BCG 균주 내에서 구성적인 발현을 위한 외인성 T7-파지 프로모터의 조절 하에, 유전자가 박테리아 게놈에 한 카피로 삽입되었다. 단백질 발현은 세포질성이었다. 면역원성 제제는 희석 Sauton SSI 용액 (1ml 물 내에 125μg MgSO₄, 125μg K₂HPO₄, 1mg L-아스파라긴, 12.5μg 2가 철 암모늄 시트레이트, 18.4mg 85% 글리세롤, 0.5mg 시트르산)에 현탁되었고, 20℃에서 보관되었거나, 4℃에서 동결 건조될 수 있고 보관될 수 있다. 유사하게도, 균주들은 100μl당 10⁹ 박테리아의 최종 농도까지 0.02% Tween 80 및 20% 글리세롤이 첨가된 PBS (137mM NaCl; 2.7mM KCl; 4.3mM Na₂HPO₄; 1.47mM KH₂PO₄, pH 7.4) 내에서 보존될 수 있다.

BCG Danish 균주 ATCC 35733은 박테리아 게놈에 한 번 삽입된 플라스미드 pMV361 (Stover et al., 1991)로부터 유래한 플라스미드 pMV361_PT7/P-hMPV로 전기형질전환에 의해 형질전환되었다. 이 플라스미드는 T7-파지 폴리머라제의 발현에 의해 활성화되는 T7 프로모터 하에 발현되는 hMPV 아형 A로부터 P-단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다.

결과적인 BCG 균주는 박테리아 내부에 다수의 카피로 염색체외로 존재하는 플라스미드 pMV261 (Stover et al., 1991)로부터 유래한 플라스미드 pMV261_Amp/PolT7로 전기형질전환에 의해 형질전환되었다. 이 플라스미드 내에서, 항생제 카나마이신 (kanamycin)에 대한 내성은 항생제 하이그로마이신 (hygromycin (Hygr))에 대한 내성으로 대체되었다. T7 파지로부터 T7 폴리머라제는 BCG로부터 hsp60 유전자의 구성적인 프로모터의 조절하에 있다. 결과적인 재조합 콜로니는 OD_{600 nm} =1까지 첨가된 Middlebrock 7H9 배양 배지에서 37℃에서 키워졌고, 20분 동안 4000rpm에서 원심분리되었고 (Eppendorf rotor model 5702/R A-4-38) 희석 Sauton SSI 용액 (1ml의 물 내에 125μg MgSO₄, 125μg K₂HPO₄, 1mg L-아스파라긴, 12.5μg 2가 철 암모늄 시트레이트, 18.4mg 85% 글리세롤, 0.5mg 시트르산))에서 재현탁되고 -80℃에서 보관되었다. 이 면역원성 제제는 hMPV 바이러스에 대한 면역을 제공한다.

실시예 VI: 면역병리학적 손상으로부터 보호하는 임의의 전술한 면역원성 제제 내의 hMPV-P유전자가 재조합된 BCG Danish 균주로부터 10 ⁸ 박테리아의 접종

임의의 제제 내의 메타뉴모바이러스로부터 P-단백질을 발현하는 재조합 BCG 균주의 접종은 hMPV의 균주 A 및 B 감염의 임상적 신호 및 증상에 대하여 보호한다. 기도의 침윤 (도 3B 3C)뿐만 아니라 열 및 권태에 의해 유발된 식욕부진도 감소되었다 (도 3A). 또한, hMPV의 균주 A 및 B의 복제 및 전파가 감소되었다 (도 3D).

또한, 임의의 제형인 제제의 접종은 hMPV의 균주 A 및 B에 의한 감염의 조직병리학적 징후를 상당히 감소시켰다. 제제로 면역된 동물의 폐는 비면역 동물 또는 야생형 균주로 면역된 동물과 관련하여 상당히 낮은 면역세포의 침윤, 구조의 손실 및 폐 조직의 염증을 보였다 (도 4).

hMPV P-단백질을 발현하는 재조합 BCG를 포함하는 임의의 제형인 제제의 접종은 면역된 기증자로부터 T 림프구의 회복 및 정제에 의하여 나이브 개인에게 전달될 수 있는 세포-기반 면역을 생성하였다 (도 6).

상기 실시예는 RSV로부터 임의의 NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1), M2 (ORF2), L, F 또는 G 단백질을 발현하는 재조합 약독화 마이코박테리움 균주를 함유하는 면역원성 제제와의 모든 조합과 마찬가지로 hMPV P-단백질 또는 동일한 것의 상당한 부분을 발현하는 재조합 약독화 마이코박테리움 균주를 함유하는 면역원성 제제로 확장될 수 있다. 또한, 실시예는 하나 또는 몇 재조합 약독화 마이코박테리움 균주를 함유하는 면역원성 제제로 확장될 수 있다. 상기 재조합 박테리아는 단백질 유전자 또는 하나 이상의 카피로 박테리아 게놈 또는 염색체외 플라스미드에 임베딩된 hMPV P-단백질의 면역원성 분절을 함유하고, 이들의 발현은 내인성 또는 외인성, 구성적 또는 유도적 프로모터에 의해 지휘되고, 세포외로 분비되는 단백질 또는 세포막-결합 단백질의 세포질-가용성 형태로 발현된다.

참고문헌

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SEQUENCE LISTING <110> PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE <120> IMMUNOGENIC FORMULATION CONTAINING RECOMBINANT LIVE BCG THAT EXPRESS ANTIGENS OF METAPNEUMOVIRUS (HMPV), IN A SUSPENSION PREPARED FROM A LYOPHILISATE, WITHOUT REQUIRING AN ADJUVANT, SUITABLE FOR PHARMACEUTICAL USE <130> PXWO625-2014 <140> CL 2013-02829 <141> 2013-10-01 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Human Metapneumovirus <400> 1 gaattcatgt cattccctga aggaaa 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Human Metapneumovirus <400> 2 gaattcctac ataattaact ggtaaa 26 <210> 3 <211> 897 <212> DNA <213> Human Metapneumovirus <400> 3 gaattcatgt cattccctga aggaaaagat attcttttca tgggtaatga agcggcaaaa 60 ttggcagaag ctttccaaaa atcattaaga aaacctagtc ataaaagatc tcaatctatt 120 ataggagaaa aagtgaacac tgtatctgaa acattggaat tacctactat cagtagacct 180 accaaaccga ccatattgtc agagccgaag ttagcatgga cagacaaagg tggggcaatc 240 aaaactgaag caaagcaaac aatcaaagtt atggatccta ttgaagaaga agagtttact 300 gagaaaaggg tgctgccctc cagtgatggg aaaactcctg cagaaaagaa gttgaaacca 360 tcaaccaata ctaaaaagaa ggtctcattt acaccaaatg aaccaggaaa atacacaaag 420 ttggagaaag atgctctaga cttgctttca gacaatgaag aagaagatgc agaatcctca 480 atcttaacct tcgaagaaag agatacttca tcattaagca ttgaagccag actagaatcg 540 attgaggaga aattaagcat gatattaggg ctattaagaa cactcaacat tgctacagca 600 ggacccacag cagcaagaga tgggatcaga gatgcaatga ttggcataag ggaggaacta 660 atagcagaca taataaaaga agccaaggga aaagcagcag aaatgatgga agaagaaatg 720 aaccagcgga caaaaatagg aaacggtagt gtaaaattaa ctgaaaaggc aaaggagctc 780 aacaaaattg ttgaagacga gagcacaagt ggtgaatccg aagaagaaga agaactaaaa 840 gacacacagg aaaataatca agaagatgac atttaccagt taattatgta ggaattc 897 <210> 4 <211> 49 <212> PRT <213> human respiratory syncytial virus <400> 4 His Met Lys Lys Arg Gly Leu Thr Val Ala Val Ala Gly Ala Ala Ile 1 5 10 15 Leu Val Ala Gly Leu Ser Gly Cys Ser Ser Asn Lys Ser Thr Thr Gly 20 25 30 Ser Gly Glu Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Thr Ala Ser Pro Gly 35 40 45 Gly

Claims

사람 메타뉴모바이러스 (hMPV)에 의한 감염에 대한 보호를 사람에게 제공하고/하거나 hMPV의 병원성을 약독화하는 면역원성 제제로, 제제는 균주 당 10⁴ 내지 10⁹ 박테리아 (CFU/용량) 범위의 양으로 재조합 약독화 마이코박테리움 (Mycobacterium) 균주를 하나 이상 포함하고, 각 균주는 약제학적으로 적합한 식염수 완충제 중에 hMPV의 P-단백질을 발현하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서, 재조합 약독화 마이코박테리움 균주는 바실러스 칼메트-게렝 (Bacillus Calmette-Guerin, BCG) 균주에서 유래한 면역원성 제제.
제1항에 있어서, 사람 메타뉴모바이러스는 아형 A 및/또는 B인 면역원성 제제.
제1항에 있어서, hMPV의 P-단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 하나 이상의 카피 (copies)로서, 마이코박테리움의 약독화된 균주의 게놈에 삽입되거나 염색체외 플라스미드에 삽입되어, 바이러스성 단백질이 핵산 서열로부터 발현되는 면역원성 제제.
제1항에 있어서, 제제는 둘 이상의 재조합 약독화 마이코박테리움 균주를 포함하고, 각각은 둘 이상의 재조합 약독화 마이코박테리움 균주를 포함하고, 각 균주는 hMPV의 P-단백질을 다른 장소에서, 각각 가용성, 세포질-가용성, 세포외로 분비되는 또는 막-결합 단백질로서 발현하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서, hMPV의 P-단백질은 마이코박테리움 BCG로부터 구성적 또는 유도적, 내인성 또는 외인성 프로모터의 조절 하에 핵산의 발현으로 유래하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 둘 이상의 재조합 약독화 마이코박테리움 균주를 포함하고, hMPV의 P-단백질은 다른 수의 카피를 생성하기 위해 균주로부터 발현되며, 구성적 또는 유도적으로 발현되고/되거나, 다른 세포 내 장소에 위치하는 면역원성 제제.
제1항에 있어서, 제제는 사용 전 보존을 위해 동결, 동결-건조 또는 완충 식염수 용액의 사용에 의해 안정화되는 면역원성 제제.
제1항에 있어서, hMPV의 P-단백질은 가용성 세포질 단백질로서 발현되거나, 세포외로 분비되거나, 세포막-결합되는 면역원성 제제.
제1항에 있어서, 상기 면역원성 제제는 hMPV 감염 또는 hMPV에 의해 유발되는 질병에 대한 보호를 제공하는 것인 면역원성 제제.
제10항에 있어서, 상기 제제는 피하로, 경피로, 또는 진피하로 (subdermally) 투여되는 것인 면역원성 제제.
제1항의 면역원성 제제를 포함하는, hMPV에 대한 백신.
제12항에 있어서, 피하, 경피 또는 진피하 투여를 위해 제제화된 백신.
제13항에 있어서, 발현된 단백질은 hMPV의 P-단백질인 백신.