CN105745323B - 包含表达偏肺病毒(hMPV)抗原的重组活BCG的免疫原性制剂，其以无需佐剂地从冻干物制备的悬浮液形式存在并且适合于其制药用途 - Google Patents

包含表达偏肺病毒(hMPV)抗原的重组活BCG的免疫原性制剂，其以无需佐剂地从冻干物制备的悬浮液形式存在并且适合于其制药用途 Download PDF

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Abstract

本发明描述了用于在哺乳动物中针对人偏肺病毒(hMPV)进行使用的免疫原性制剂，其由1×109cfu/ml的表达(基因群(genogroup)A1、A2、B1和B2的)hMPV的病毒蛋白P的重组BCG的冻干物组成。所述疫苗源自hMPV的基因P的完全或部分产物，其可以无需佐剂地以溶液形式进行使用、稳定化和施用。制备物还可以包含上面所描述的制剂的组合。所述制剂可以通过冻干(4℃至8℃的保存范围)来进行稳定化，以便以后在其使用前在无佐剂的盐水溶液中进行重构。

Description

包含表达偏肺病毒(hMPV)抗原的重组活BCG的免疫原性制剂， 其以无需佐剂地从冻干物制备的悬浮液形式存在并且适合于 其制药用途
发明领域
本发明涉及免疫学和生物技术领域，特别地涉及待用于制备针对人偏肺病毒(hMPV)的疫苗的基于重组减毒细菌的免疫原性制剂。所述制剂包含表达hMPV的蛋白P这种抗原性肽的重组卡-介杆菌(BCG)。
发明背景
人偏肺病毒(此后，hMPV)是与上和下呼吸道的急性呼吸系统疾病相关的高住院百分比和发病率的病因学因子，特别是在婴儿、老年人和无免疫应答的个体中。由该病毒引起的感染与宽范围的病理学状况相关，其中细支气管炎和肺炎属于具有较大社会经济影响的情形。另外，它与胃肠炎和角膜结膜炎相关。Calvo等人(2008)在3年的时间段中证明，由呼吸道病毒RSV、ADV和hMPV引起的急性呼吸道感染的累积发病率对于64.5％的小于2岁的儿童的住院负有责任，其中对于所述病毒中的每一种而言发病率分别为35.4％、19.3％和9.8％。hMPV与其他具有高发病率的呼吸道病毒所共有的一个令人感兴趣的特征为在整个幼年期间产生反复感染，这是一种可能与在生命的最初几个月期间在建立针对初次感染的保护性免疫应答方面的失败相关的现象。该最后的现象激发了在公共卫生系统中对于能够控制呼吸道感染每年爆发的新的疫苗原型的急迫需要，从而使得能够减少医疗中心的拥堵和最终减少与这些感染相关的社会经济影响。迄今为止，还没有关于hMPV感染引起的特别的经济影响的研究，然而，由hMPV造成的住院发生率据估计为由人呼吸道合胞病毒(hRSV)造成的住院发生率的1/3。在发达国家中进行的研究估计，hRSV感染的个体花费为大约3,000欧元($1,860,000智利比索)，其中具有直至8,400欧元($5,200,000智利比索)的上限。考虑到需要住院的病理学过程具有相似的特征，暗示了关于个体住院的花费是近似的。
病毒hMPV被归类为副粘病毒科(Paramyxoviridae)的肺病毒亚科(Pneumovirinae)，这是与hRSV被归类为的相同的分类，虽然它们各自分别被分组在偏肺病毒属(Metapneumovirus)和肺病毒属(Pneumovirus)中。hMPV的基因组由负义的不分节段的单链核糖核酸(ssRNA)组成，因此病毒蛋白质以3’至5’的方向(关于其序列)按下列形式进行安排：N、P、M、F、M2(ORF1和2)、SH、G和L。这些蛋白质中的五个负责遗传物质的包装和确定病毒颗粒的特有结构，它们分别相应于核衣壳蛋白N和基质蛋白M，以及跨膜糖蛋白F、G和SH。其他四个蛋白质M2-1、M2-2、P和L参与病毒的复制和转录。存在两种亚型的hMPV，它们基于主要在蛋白F和G中的序列差异而被划分为A和B(关于两个抗原组)。虽然这些蛋白质具有一定程度的差异，但是相对于由病毒基因组所编码的其他蛋白质而言，存在高度的同一性。
针对呼吸道病毒的疫苗的开发始于20世纪60年代，其中采用基于通过福尔马林灭活的病毒(hRSV-FI)的最初的针对hRSV的疫苗原型，其具有很大的副作用，这阻碍了在免疫接种计划中的使用。伴随有氢氧化铝佐剂的肌内制剂在经疫苗接种的儿童中产生了比在未进行疫苗接种的那些被感染个体中更严重的状况。该效应与针对感染的免疫应答的超反应性相关，所述超反应性以升高的多形核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的实质浸润以及升高的补体结合性抗体的滴度为特征。
针对人偏肺病毒(hMPV)仅开发了很少的疫苗，并且迄今这些疫苗中没有任何一个拥有令人满意的结果。采用相同的通过福尔马林灭活的病毒(hMPV-FI)的先前设计的原型，也显示出产生具有与在感染的粗毛棉田鼠(Sigmodon hispidus)模型中由针对hRSV的疫苗所产生的相似的特征的炎症超反应性情形(Yim等人,2007)。与对于hRSV所观察到的超反应性过程不同，显示出将病毒从呼吸系统中部分地去除。在暴露于hRSV-FI的小鼠和粗毛棉田鼠中所观察到的疾病与Th2型的基于抗体的病理性免疫应答和NF-κΒ的过分激活相关。NF-κΒ转录活性的增加还涉及促炎细胞因子例如IL-8的分泌。另一方面，在hMPV感染后肺组织的超反应性与这样的免疫应答相关，所述免疫应答以在支气管肺泡灌洗物中存在IFN-γ和IL-4以及在患病小鼠的血清中检测到IgG1和IgG2a同种型的中和抗体为特征，这强烈地暗示所观察到的慢性炎症归因于Th1和Th2型的病理性应答，或者归因于不足的Th1型的基于细胞的应答，其伴随有Th2病理性应答。关于该后一种假设，一些作者已提出，增加的Th1型应答还可以使疾病加重。
这些过去的情况强调了建立平衡的且有效的免疫应答的重要性，其能够限制炎症过程的进展，并且同时，引起从被感染的组织中适当地去除这些病毒。
由于由hMPV引起的呼吸系统疾病与先前用hRSV所见到的(已将其与细胞免疫诱导失败相关)相似，因此需要产生尽到作为细胞毒性CD8+T细胞和辅助性CD4+T细胞(两者都产生IFN-γ)的良好诱导物之责的疫苗原型。最近的实验探求将其努力集中于开发针对仅一个病毒物种的疫苗，这通过使用不同的分子遗传学和免疫学技术来进行。重要的是提及，这些研究对于每一种目的病毒使用了有限量的蛋白质或蛋白质亚基作为抗原。对于hRSV，它们中的一些基于在感染的鼠类和非人灵长类模型中使用独个病毒蛋白质，例如蛋白F或G的完整亚基或片段，或者其混合物。已经在I和II期临床试验中使用了一些针对hRSV的疫苗原型，但是结果未显示出长期的保护能力，并且所述疫苗远不适合于将其在感染预防中大规模使用(Denis等人,2005；Karron等人,2005)。
通过去除已被提示涉及病毒致病性的基因，开发出了减毒的hMPV株系。已提出将缺乏编码蛋白SH、G、M2-1和M2-2的基因的hMPV株系作为用于疫苗的候选物(Biacchesi等人,2005)。这些候选物已经在动物模型中呈现出了良好的结果，但是还没有在人类中进行研究。虽然该备选方案是可行的，但其结果是昂贵的，因为这需要在被批准用于在人类中使用的细胞培养物中生产病毒。疫苗的其他来源为通过异源系统来过表达病毒蛋白质，例如hMPV的蛋白F，其与佐剂相偶联，从而产生中和抗体，但该选项的缺点是在非常短的时间段内提供免疫性(Herfst等人,2008a)。
不存在关于针对hMPV的疫苗候选物的临床研究，因为还未能开发出能够产生保护性免疫的原型。迄今在动物模型中评价过的原型产生Th2型的基于抗体的免疫性，其不是长期的，也未有效地防止感染。用这些原型进行疫苗接种的动物，虽然在体外产生中和抗体，但是针对感染没有受到保护，也没有减轻在小鼠中(Cseke等人,2007)或在猕猴中(Herfst等人,2008b)由hMPV感染诱导的疾病的临床症状。基于抗体的免疫性也不能有效地在体内中和病毒。能够在体外中和hMPV的抗体既不能防止感染，也不能防止由hMPV引起的疾病，当将其作为通过被动免疫接种的疗法进行使用时(Hamelin等人,2008)。另一方面，已观察到，病毒状况的消退需要Th1型的基于细胞的免疫应答的参与。显示了，病毒状况的消退和病毒颗粒的清除取决于CD4+和CD8+淋巴细胞的激活，虽然它们的活性也对疾病的免疫病理学负责(Kolli等人,2008)。最近，已发现，在病毒状况的消退中的主要效应子为CD8+类型的细胞毒性细胞，虽然CD4+辅助性T淋巴细胞具有调节性的参与。因此，需要Th1细胞类型的平衡的免疫应答，以产生病毒状况的消退而不发生炎症超反应性。总之，目前不存在针对人偏肺病毒(hMPV)的疫苗，其给予有效的保护作用且不具有重大的副作用，事实上，不存在针对该病毒的可得的商业疫苗。
令人惊讶地，发明人发现，使用表达人偏肺病毒的蛋白P的重组分枝杆菌菌株使得能够产生针对由偏肺病毒这种呼吸道病毒引起的感染的保护性免疫，而不引发不可接受的副作用，例如在气道中的炎症超反应性。本发明最终解决了现有技术中一直未解决的技术问题，其为给予针对hMPV感染的保护作用并且不产生炎症超反应性的免疫原性制剂。
附图描述
图1：构建体pMV361-P-hMPV的产生。从偏肺病毒的RNA开始，进行采用通用引物的反转录，然后用基因P的开放阅读框的引物P-hMPV-Fw和P-hMPV-Rv来进行扩增。在两个末端处向扩增产物中掺入EcoRI位点，并且插入到分枝杆菌载体pMV361的EcoRI位点中，从而产生载体pMV361-P-hMPV的构建。图1A显示了hMPV的基因组，和编码蛋白P的基因；和图1B显示了掺入了所述编码蛋白P的基因的载体pMV361-P-hMPV。
图2：由分枝杆菌BCG的重组菌株来表达hMPV的蛋白P或蛋白M2.1。用质粒pMV361-P-hMPV电转化分枝杆菌BCG的Danish株，并且在包含20μg/ml卡那霉素的补充有油酸、白蛋白、右旋糖和过氧化氢酶的Middlebrook 7H10琼脂培养基中进行选择。进行SDS-PAGE电泳(CB)和Western印迹(WB)，其中使用抗hMPV的蛋白P的单克隆抗体(WB)。图2A：Western印迹，其中使用抗hMPV的蛋白P的单克隆抗体；和图2B：Western印迹，其中使用抗hMPV的蛋白M2.1的单克隆抗体。在SDS-PAGE中，加载25μg的从rBCG-P-hMPV的四个克隆(图2A)或rBCG-M2.1-hMPV的五个克隆(图2B)制备的总蛋白质。作为阳性对照，加载5ng的重组蛋白P-hMPV或25μg的经灭活的hMPV(在适当时)。作为阴性对照，加载BCG野生型菌株的总蛋白质，和在rBCG-P-MPV的情况下，还加载对于RSV(N-5株)的基因N而言重组的BCG。可以看到，所有所分析的克隆都表达所克隆的质粒的蛋白质，要么蛋白P(图2A)，要么蛋白M2.1(图2B)。
图3：用重组的rBCG-P-hMPV进行的免疫接种提供针对hMPV感染的保护作用。4-8周龄的BALB/c小鼠的组接受1×108个菌落形成单位(CFU)的rBCG-M2.1-hMPV、rBCG-P-hMPV或BCG-WT(野生型)的一个真皮下剂量，还用1×106个噬斑形成单位(PFU)的活病毒(活-hMPV)或经UV灭活的病毒(UV-hMPV)进行疫苗接种。然后，所有组用1×106PFU的hMPV通过鼻内途径进行感染。作为对照组，包括未疫苗接种的动物和其他未感染的动物组。在感染后六天期间记录动物的体重，并且在实验结束时处死动物并从每一只动物中获得支气管肺泡灌洗物(BAL)和肺。符号代表每只独个动物，和水平条为平均值。(图3A)在感染后每个动物组的体重减轻的图。(图3B)浸润气道的全部细胞。(图3C)在BAL中对于关于CD11b和Gr1的双染色呈现阳性反应的细胞的百分比。(图3D)通过定量PCR来测定在被感染的小鼠的肺中的hMPV的RNA。从每只被处死的动物的肺中获得总RNA，并将其用于通过反转录来产生cDNA。然后，将所产生的cDNA用于定量PCR反应，以测定相对于β-肌动蛋白的RNA拷贝数而言的在样品中存在的病毒RNA的拷贝数。在图3A中，可以看到，关于蛋白P(·)和蛋白M2(◆)的重组BCG疫苗在感染后动物体重减轻方面是有保护性的，其中获得了与未感染的动物(▼)相似的体重。另一方面，未免疫接种的动物(▲)或者用野生型BCG(BCG-WT)(■)、活-hMPV(■)或UV-hMPV(·)进行免疫接种的动物在感染后遭受动物体重减轻。在图3B和3C中，观察到关于蛋白P的重组BCG疫苗防止在感染后免疫细胞浸润到动物气道中，其中获得了与未感染的动物相似的浸润。另一方面，未免疫接种的动物或者用野生型BCG(BCG-WT)、活-hMPV或UV-hMPV进行免疫接种的动物在感染后遭受在其气道中的免疫细胞的浸润。用rBCG-M2进行的疫苗接种赋予不完全的保护。在图3D中看到，在未免疫接种的被感染的动物的肺中存在的以“基因N-hMPV的拷贝数/5000个拷贝的β-肌动蛋白”表示的hMPV的病毒数目与用BCG-WT、活-hMPV或UV-hMPV进行免疫接种的被感染的动物的病毒数目相似，即没有给予保护作用，而用rBCG-P-MPV进行免疫接种的被感染的动物，像在未感染的动物中一样，几乎不存在该病毒。用rBCG-M2进行的免疫接种给予不完全的保护作用。
图4：用rBCG-P-hMPV进行的免疫接种在用hMPV进行攻击后提供针对炎症的保护作用。将在用1×106PFU的hMPV攻击后6天取出的动物的肺在低聚甲醛中进行固定并将其包埋在石蜡中，并且将7μm的切片用苏木精和伊红进行染色。在未免疫接种的动物或者用rBCG-M2.1-hMPV或BCG-WT进行免疫接种的动物中观察到显著的多形核细胞的浸润。然而，在从用rBCG-P-hMPV进行免疫接种的动物中获得的肺之中未观察到炎症的征候。所述图像是六次独立实验的代表。HSP表示“炎症得分/动物组”(组织病理学得分)的量化。可以看到，在被感染的且用rBCG-P-MPV进行免疫接种的动物中的炎症是非常低的或不存在，这与在未感染的动物中所看到的相似。
图5：用rBCG-P-hMPV进行的免疫接种产生的Th1型细胞因子特性谱。为了测定对由rBCG-P-hMPV产生的免疫性负责的免疫应答的类型是什么，分析了用对于hMPV的蛋白P而言重组的BCG菌株(rBCG-P-hMPV，在图中：rBCG-P)进行免疫接种的BALB/cj的脾细胞的细胞因子特性谱。回收四只用rBCG-P-hMPV进行免疫接种的BALB/cj小鼠的脾脏，并且通过与10μg的蛋白P-hMPV或PBS(在图中，U/S)一起温育7天来刺激脾细胞。作为对照，将用BCG-WT进行免疫接种的BALB/cj的脾细胞在相同条件下进行培养。在培养的第4天和第7天，就(A)IFN-γ、(B)IL-2、(C)IL-5和(D)IL-4的水平通过ELISA来对经刺激的和未刺激的rBCG-P-hMPV和BCG-WT的脾细胞的上清液进行测定。用蛋白P-hMPV进行刺激的源自rBCG-P-hMPV的脾细胞(rBCG-P)相比于来自用BCG-WT进行免疫接种的动物的细胞或未刺激的细胞(rBCG-P U/S)而言分泌显著更多量的IFN-γ(***，p<0.001，Student t检验)，图5A。此外，IFN-γ的量在第4和第7天之间增加(*，p<0.05，Student t检验)，图5A。用rBCG-P-hMPV(rBCG-P)进行免疫接种的小鼠的经刺激的脾细胞在第4天产生相对于未刺激的细胞(rBCG-P U/S)而言显著更多量的IL-2，和在第7天降低至基础水平(**，p<0.001；ns＝不显著，Student t检验)，图5B。脾细胞分泌少量的IL-5和IL-4，而没有显示相对于来自BCG-WT的脾细胞或未刺激的脾细胞而言的增加(ns＝不显著，Student t检验)，图5C。
图6：用rBCG-P-hMPV进行免疫接种的小鼠的T淋巴细胞的转移在未接触过抗原的小鼠中赋予对于hMPV感染的抵抗力。从用重组病毒蛋白进行刺激和未刺激的脾细胞中纯化出CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。通过未接触过抗原的小鼠的尾静脉，独立地转移两百万个来自用rBCG-P-MPV或BCG-WT进行免疫接种的动物的、经刺激或未刺激的CD4+或CD8+T淋巴细胞。在转移后24小时，将小鼠用1×106PFU的hMPV通过鼻内途径进行感染。在图6A中，被转移了用rBCG-P-hMPV进行免疫接种的小鼠的CD4+和/或CD8+T淋巴细胞的小鼠相比于未感染的小鼠而言未显示出任何体重差异。相反地，观察到被转移了用BCG-WT进行免疫接种的小鼠的CD4+和/或CD8+T淋巴细胞的小鼠相比于未感染的动物而言在感染后减轻了显著更多的体重(p<0.0001)(图6B)。图6C显示，在事先被转移了用rBCG-P-hMPV进行免疫接种的小鼠的CD4+和/或CD8+T淋巴细胞(P-CD8、P-CD4、P-CD8/4)的未接触过抗原的小鼠的支气管肺泡灌洗物BAL中，具有相比于被转移了BCG-WT的T淋巴细胞(Wt-CD8、Wt-CD4、Wt-CD8/4)的小鼠显著更低的粒细胞浸润(***，p<0.0001，Student t检验)。在被转移了BCG-WT的T淋巴细胞的小鼠或未免疫接种的小鼠的BAL中的粒细胞浸润与未接受T淋巴细胞的小鼠的浸润未显示出显著差异(ns＝不显著，Student t检验)。图7D显示，在被转移了来自用rBCG-P-hMPV进行免疫接种的小鼠的T淋巴细胞(P-CD8、P-CD4、P-CD8/4)的小鼠的肺中的病毒负荷，相比于被转移了用BCG-WT菌株进行免疫接种的动物和未免疫接种的动物的T淋巴细胞(Wt-CD8、Wt-CD4、Wt-CD8/4)的小鼠的病毒负荷而言是低的(***，p<0.0001，Student t检验)。在被转移了BCG-WT的T淋巴细胞(Wt-CD8、Wt-CD4、Wt-CD8/4)的小鼠的肺中的病毒负荷与未免疫接种的小鼠的病毒负荷未显示出显著差异(ns＝不显著，Student t检验)。病毒负荷通过RT-qPCR以N-hMPV的基因拷贝数的形式来进行定量，如前面所描述的那样。
发明详述
本发明在于针对hMPV的免疫原性制剂，其包含表达人偏肺病毒的蛋白P的重组BCG菌株。该制剂给予针对hMPV感染的有效保护作用并且不产生炎症超反应性应答。
本发明的制剂可以单独地或与其他疫苗相混合地(例如，与针对RSV的免疫原性制剂相混合地，以给出针对与hMPV和RSV相关的感染和/或并发症的保护作用的混合剂量)进行供给。
在本发明中所详细描述的免疫原性制剂可以用于制备以1×104cfu/剂至1×1010cfu/剂的剂量(特别地，1×108cfu/剂的剂量是优选的)包含来自纯性培养物的减毒活重组细菌的疫苗。所述制剂以冻干物形式存在，其有着不需要佐剂的重构溶液，因为所述重组细菌的胞外被膜的组成成分就是佐剂。本发明的经冻干的免疫原性制剂应当保存于4至8℃，避免遭受直接或间接的阳光，呈现为两个分开的小瓶，其中一个具有经冻干的重组细菌，和另一个具有重构盐水溶液，它们待在其施用前相混合。
自从其在1921年被引入起，基于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡-介杆菌(BCG)的疫苗已在超过10亿人中使用并且目前在全世界使用以对抗结核病。
发明人已发现，使免疫应答的平衡从促炎的Th2型应答(其保护作用不是在时间上持久的)移动至基于细胞(特别是细胞毒性CD8+T细胞和辅助性CD4+T细胞)的Th1型应答的一种方法是使用佐剂，例如分枝杆菌的细胞壁的组分。特别地，在牛分枝杆菌卡-介杆菌(BCG)中表达hMPV的免疫原性蛋白质。
hMPV的蛋白F和G存在于病毒颗粒的表面上，并因此对于循环抗体来说是可接近的。因此，所述蛋白质将会是对于实现用于防止hMPV感染的基于抗体产生的疫苗来说最显而易见的选择。
尽管有前述内容，但是在本发明中选择使用非暴露的衣壳蛋白(特别地，蛋白P)作为免疫原，其伴随有促进Th1型的基于细胞的应答的佐剂，例如牛分枝杆菌BCG的减毒细菌。已发现，hMPV的衣壳蛋白例如M2.1促进细胞毒性淋巴细胞(CTL)的激活。令人惊讶地，在本发明中描述了，由分枝杆菌所表达的蛋白P(hMPV这种病毒的一种非暴露的蛋白质)的使用，在当作为免疫原性蛋白质进行使用时，使得能够配制这样的免疫原性组合物，其在当作为疫苗或免疫原性组合物进行使用时，给予有效的保护作用而没有不希望的副作用例如炎症超反应性。
由在本发明中所使用的载体细菌所表达的重组蛋白质通过在原核表达载体(所有都是商购可得的)中克隆来自A组hMPV的编码它们的基因来获得。偏肺病毒(hMPV)的基因组先前已经进行了描述并且在GeneBank数据库中是可得的，登录号：AB503857.1、DQ843659.1、DQ843658.1、EF535506.1、GQ153651.1、AY297749.1、AY297748.1、AF371337.2、FJ168779.1、FJ168778.1、NC_004148.2和AY525843.1。在本发明中所描述的重组细菌菌株的获得考虑了在宿主中在细菌复制期间异源表达病毒蛋白质。借助于表达载体pMV361将异源DNA序列整合到细菌染色体DNA中。hMPV的这些蛋白质可以经基因改造，例如，通过掺入糖基化肽序列或结构域和/或后来被派送至抗原呈递细胞的胞吞或吞噬受体，这通过借助于使用生物素-链霉抗生物素蛋白系统将其与天然配体相偶联来进行(为此使用病毒蛋白质的生物素化和基因改造的商业试剂盒，这通过偶联至链霉抗生物素蛋白该细菌蛋白质或者通过在重组蛋白质或蛋白质片段中引入编码被描述为生物素化信号的氨基酸序列的基因序列来进行，其中使用先前被描述用于原核和/或真核异源表达系统的技术)。
本发明的免疫原性制剂包含在分枝杆菌减毒株中hMPV的蛋白P(其要么是完整的，要么为其免疫原性片段)的表达。特别地，优选的是，所述重组分枝杆菌减毒株源自卡-介杆菌(BCG)这一菌株。hMPV的蛋白P可以相应于A或B亚型的偏肺病毒的蛋白P。
本发明的重组分枝杆菌减毒株可以包含编码hMPV的蛋白P或其免疫原性片段的核酸序列，其以一个或多个拷贝插入到细菌基因组中或染色体外质粒中。该蛋白质的表达可以在分枝杆菌BCG的内源或外源的组成型或诱导型启动子的控制之下。
hMPV的蛋白P或其免疫原性片段可以以可溶的形式、以可溶的胞质蛋白质形式、作为经分泌的细胞外蛋白质或者作为与膜相结合的蛋白质进行表达。
本发明的免疫原性制剂可以包含两种或更多种重组分枝杆菌减毒株，并且其中hMPV的蛋白P的蛋白质或免疫原性片段由所述菌株进行表达以产生不同数目的拷贝，组成性或诱导性地进行表达，和/或定位于不同的细胞位置。
在本发明中所公开的免疫原性制剂可以与包含针对不同于hRSV和hMPV的病毒的其他抗原制剂的免疫原性制剂相联合地，与BCG减毒株和针对流感A和B的季节性疫苗相联合地进行使用。
上面所描述的免疫原性制剂可以与缓冲盐水溶液(PBS，磷酸钠缓冲液)或生理盐水溶液相联合地以皮下/真皮下形式应用于个体。
为了开发表达hMPV的蛋白P的重组分枝杆菌细菌，首先应当产生表达所述蛋白质的载体。可以使用任何已知的分枝杆菌表达载体，并且应当以具有其启动子区的状态插入编码hMPV该病毒的蛋白P的基因。在一个优选的实施方案中，用通用引物从分离的人偏肺病毒RNA进行反转录。然后，用特异性引物扩增蛋白P的基因(图1A)。将扩增产物插入到表达载体中。在本发明中，使用分枝杆菌表达载体pMV361，从而产生载体pMV361-P-hMPV(图1B)。
一旦获得，就将该载体用于转化分枝杆菌菌株，例如分枝杆菌BCG。为了本发明的目的，可以使用任何已知的BCG菌株，例如BCG Danish或BCG Pasteur。转化方法可以是任何可用的方法，特别地，优选电转化。然后，应当选择出表达hMPV的蛋白P的转化细胞。
这些重组细胞构成了本发明的免疫原性制剂，其以104至109CFU/剂的量提供在药理学上可接受的盐水缓冲液之中。
另外，本发明的制剂可以与表达合胞病毒(RSV)的免疫原性蛋白质的重组BCG菌株相组合地进行配制。在一个优选的实施方案中，将表达hMPV的蛋白P的重组BCG细菌与表达RSV的蛋白N、P、M、F、M2(ORF1和2)、SH、G或L的重组BCG细菌相联合地进行提供。在一个更优选的实施方案中，将本发明的免疫原性制剂与对于RSV的基因N而言重组的BCG菌株相组合地进行使用。特别地，对于A亚型hMPV的基因P而言重组的BCG与对于A亚型RSV的基因N而言重组的BCG的组合是优选的。
在本发明的另一个实施方案中，用表达hMPV的蛋白P的载体转化BCG菌株，然后将经转化的细胞再次用表达合胞病毒(RSV)的蛋白质的载体进行转化。所述RSV的蛋白质选自N、P、M、F、M2(ORF1和2)、SH、G或L。特别地，优选的是，首先用表达A亚型hMPV的蛋白P的载体进行转化，并且随后使这些转化株经历用表达A亚型RSV的基因N的载体来进行的第二次转化，从而获得同时表达A亚型hMPV的蛋白P和A亚型RSV的蛋白N的BCG菌株。
本发明的免疫原性制剂可以以冻干物形式提供，呈现出为在1ml随附的盐水溶液中进行重构作好准备的多剂量形式，以便获得1×109cfu/ml重构出的溶液这样的溶液。每0.1ml的重悬浮溶液包含对于施用来说合适的1×108cfu的剂量。
为了制备经冻干的溶液，可以将本发明的转化株悬浮在任何合适的冻干溶液中(例如可以采用包含4％(w/v)甘露醇、0.05％(w/v)泰洛沙泊、0.25％蔗糖和5mM组氨酸的LYO C缓冲液)，以便然后进行冻干，并且保存于25℃。
重构溶液可以是任何在本领域中可得的溶液，在一个实施方案中，优选的是在-80℃下的经稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4、125μg K2HPO4、1mg L-天冬酰胺、12.5μg柠檬酸铁铵、18.4mg 85％甘油、0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)。在本发明的制剂的另一个实施方案中，可以以108个细菌/100μl的终浓度悬浮在补充有20％甘油和0.02％Tween 80的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中，并保存于-80℃。这两者都在非离子型去污剂例如0.1％
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-80或0.05％泰洛沙泊存在的情况下。
在重构之前和之后，本发明的制剂应当保持在4至8℃，始终远离直接和间接的阳光，并且一旦重构出来，应当在当天结束时丢弃。
下面的关于产生和使用基于表达病毒蛋白质的重组分枝杆菌细菌的针对hMPV的免疫原性制剂的实施例仅是举例说明性的，并且并不试图限制本发明的生产或应用范围。虽然在下面的描述中使用了特定的术语，但是其使用仅是描述性的而非限制性的。
实施例
实施例I：重组载体的产生使得能够在分枝杆菌BCG这种细菌中表达hMPV的蛋白P
从偏肺病毒的RNA开始，扩增基因P的编码区，其中使用下列引物：P-hMPV_Fw：GAATTCATGTCATTCCCTGAAGGAAA(SEQ ID No:1)和P-hMPV_Rv：GAATTCCTACATAATTAACTGGTAAA(SEQ ID No:2)，其中加下划线的序列在扩增产物的两个末端处掺入EcoRI位点，图1A。将分枝杆菌载体pMV361在EcoRI位点处进行线性化，这使得能够插入下述的相应于hMPV的基因P的序列：
GAATTCATGTGATTCCCTGAAGGAAAAGATATTCTTTTCATGGGTAATGAAGCGGCAAAATTGGCAGAAGCTTTCCAAAAATCATTAAGAAAACCTAGTCATAAAAGATCTCAATCTATTATAGGAGAAAAAGTGAACACTGTATCTGAAACATTGGAATTACCTACTATCAGTAGACCTACCAAACCGACCATATTGTCAGAGCCGAAGTTAGCATGGACAGACAAAGGTGGGGCAATCAAAACTGAAGCAAAGCAAACAATCAAAGTTATGGATCCTATTGAAGAAGAAGAGTTTACTGAGAAAAGGGTGCTGCCCTCCAGTGATGGGAAAACTCCTGCAGAAAAGAAGTTGAAACCATCAACCAATACTAAAAAGAAGGTCTCATTTACACCAAATGAACCAGGAAAATACACAAAGTTGGAGAAAGATGCTCTAGACTTGCTTTCAGACAATGAAGAAGAAGATGCAGAATCCTCAATCTTAACCTTCGAAGAAAGAGATACTTCATCATTAAGCATTGAAGCCAGACTAGAATCGATTGAGGAGAAATTAAGCATGATATTAGGGCTATTAAGAACACTCAACATTGCTACAGCAGGACCCACAGCAGCAAGAGATGGGATCAGAGATGCAATGATTGGCATAAGGGAGGAACTAATAGCAGACATAATAAAAGAAGCCAAGGGAAAAGCAGCAGAAATGATGGAAGAAGAAATGAACCAGCGGACAAAAATAGGAAACGGTAGTGTAAAATTAACTGAAAAGGCAAAGGAGCTCAACAAAATTGTTGAAGACGAGAGCACAAGTGGTGAATCCGAAGAAGAAGAAGAACTAAAAGACACACAGGAAAATAATCAAGAAGATGACATTTACCAGTTAATTATGTAGGAATTC(SEQ IDNo 3)
hMPV的基因P的开放阅读框向载体pMV361的EcoRI位点处的插入将其放置于hsp60启动子的控制之下，并且导致产生构建体pMV361-P-hMPV(图1B)。
实施例II：免疫原性制剂，其包含10个剂量的1×108CFU/剂的对于A亚型hMPV的基因P而言重组的BCG Danish菌株
将A亚型hMPV的基因P以一个拷贝插入到细菌的基因组中，处于分枝杆菌BCG的内源性组成型hsp60启动子的调控之下，以用于蛋白质的表达。
借助于电转化用源自质粒pMV361(Stover等人,1991)的质粒pMV361-P-hMPV转化分枝杆菌BCG Danish菌株(ATCC 35733)，所述质粒插入到细菌基因组中仅一次。该质粒包含编码A亚型hMPV的蛋白P的基因，其在BCG的基因hsp60的内源性组成型启动子之下进行表达。使所得到的重组菌落生长(在37℃下在经补充的Middlebrock 7H9培养基(4.9g/L)中)直至OD600nm＝1，以4,000rpm离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且以108个细菌/100μl的终浓度重悬浮在补充有20％甘油和0.02％Tween 80的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中并保存于-80℃。
以相同的方式，可以将菌株重悬浮在25％(v/v)乳糖溶液和补充有葡萄糖和Tween80的Proskauer&Beck培养基(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml Tween80；和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)中以便随后进行冻干，并保存于25℃。
通过使用针对hMPV的蛋白P的抗体的Western印迹，可以观察到，该BCG菌株在细胞质中组成性地表达A亚型hMPV的蛋白P(图2A)。
用一个真皮下剂量的1×108个菌落形成单位(CFU)的rBCG-P-hMPV作为疫苗对BALB/c小鼠进行的免疫接种赋予这些动物针对用106个噬斑形成单位的A亚型hMPV进行的鼻内感染的保护作用(图3)。将本发明的疫苗rBCG-P-hMPV的效应与表达hMPV的其他蛋白质(蛋白M2)的疫苗rBCG以及与未转化的BCG进行比较，作为对照使用未免疫接种的组，所有这些组用hMPV通过鼻内途径进行感染，还包括未免疫接种且未感染的对照。分析在感染后动物体重的变化，结果显示在图3A中。关于hMPV的蛋白P(·)和蛋白M2(◆)的重组BCG疫苗在感染后动物体重减轻方面都是有保护性的，其中获得了与未感染的动物(▼)相似的体重。另一方面，未免疫接种的动物(▲)或者用野生型BCG(BCG-WT)(■)、活-hMPV(■)或UV-hMPV(·)进行免疫接种的动物在感染后遭受动物体重减轻。
还分析了在感染后在动物气道中免疫细胞的浸润，这是疾病发展的指示性参数。这通过在气道中浸润细胞的数目(图3B)和通过相应于粒细胞的关于CD11b和Gr1而言阳性的浸润细胞(图3C)来进行分析。在图3B中看到，仅本发明的疫苗rBCG-P-hMPV防止淋巴细胞浸润到气道中，其中获得了与未感染的动物相似的浸润。另一方面，未免疫接种的动物或者用其他疫苗即野生型BCG(BCG-WT)或rBCG-M2-hMPV进行免疫接种的动物在感染后遭受在其气道中的免疫细胞的浸润。用rBCG-M2进行的疫苗接种赋予针对在动物气道中免疫细胞浸润的不完全的保护作用。
另外，还分析了在所研究的不同组的肺细胞中基因N-hMPV的RNA拷贝数。较大的病毒hMPV的RNA拷贝数指示了较大的感染，结果用β-肌动蛋白的拷贝数来进行标准化。结果显示在图3D中。看到，在未免疫接种的被感染的动物的肺中存在的hMPV的病毒数目与用BCG-WT、活-hMPV或UV-hMPV进行免疫接种的被感染的动物的病毒数目相似，即这些免疫接种没有给予保护作用。观察到，用rBCG-M2进行的免疫接种给予不完全的保护作用。另一方面，在用本发明的疫苗rBCG-P进行免疫接种的被感染的动物中几乎不存在该病毒，具有与未感染的动物组相似的结果。这证明，本发明的制剂针对hMPV感染有效地发挥了保护作用。
实施例III：免疫原性制剂，其包含5×107个对于A亚型hMPV的基因P而言重组的分枝杆菌BCG Danish菌株的细菌和5×107个对于A亚型RSV的基因N而言重组的分枝杆菌BCGDanish菌株的细菌
在组成该免疫原性制剂的每一个细菌中，hMPV和RSV的基因以一个拷贝插入到细菌基因组中，处于BCG的内源性组成型hsp60启动子的调控之下，并且蛋白质的表达是胞质性的。将该免疫原性制剂以108个细菌/100μl的终浓度保存在补充有20％甘油和0.02％Tween80的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中，并且保存于-20℃。
借助于电转化用hMPV的质粒pMV361-P转化BCG Danish菌株(ATCC 35733)以给出本发明的菌株rBCG-P-MPV，和另外将第二组用RSV的pMV361-N进行转化以获得转化株rBCG-N RSV，这些质粒源自质粒pMV361(Stover等人,1991)，所述质粒插入到细菌基因组中仅一次。使所得到的重组菌落在37℃下在经补充的Middlebrock 7H9培养基中进行生长直至OD600nm＝1，以4,000rpm离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且以107个细菌/100μl的终浓度重悬浮在补充有20％甘油和0.02％Tween 80的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mMKCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中并保存于-20℃。将菌株重悬浮在包含4％(w/v)甘露醇、0.05％(w/v)泰洛沙泊、0.25％蔗糖和5mM组氨酸的LYO C缓冲液中，然后冻干并保存于4℃。通过使用特异于hMPV的蛋白P或RSV的蛋白N的抗体的Western印迹，观察到这些BCG Danish菌株分别重组地表达A亚型的hMPV的蛋白P或RSV的蛋白N(图2)。包含这两种转化株的免疫原性制剂赋予同时针对病毒hMPV和RSV的免疫性。
实施例IV：免疫原性制剂，其具有104个对于A亚型hMPV的基因P而言重组的BCGDanish菌株的细菌
用A亚型hMPV的基因P转化BCG Danish菌株，从而将该基因以一个拷贝插入到细菌基因组中，处于BCG的内源性诱导型acr启动子的调控之下，所述启动子响应于一氧化氮、低的氧浓度和生长稳定期而成为有活性的。蛋白质的表达是胞质性的。将该免疫原性制剂在包含4％(w/v)甘露醇、0.05％(w/v)泰洛沙泊、0.25％蔗糖和5mM组氨酸的LYO C缓冲液中进行冻干，并且保存于25℃，在经稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4、125μg K2HPO4、1mg L-天冬酰胺、12.5μg柠檬酸铁铵、18.4mg 85％甘油、0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)中进行重构。备选地，可以将转化株以104个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中。
借助于电转化用源自质粒pMV361(Stover等人,1991)的质粒pMV361Pacr/P-hMPV转化BCG Danish菌株(美国典型培养物保藏中心，www.atcc.org，ATCC编号35733)，所述质粒插入到细菌基因组中仅一次。该质粒包含编码A亚型hMPV的蛋白P的基因，其在BCG的基因acr的内源性诱导型启动子之下进行表达。使所得到的重组菌落生长(在37℃下在经补充的Middlebrock 7H9培养基中)直至OD600nm＝1，以4,000rpm离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且重悬浮在包含4％(w/v)甘露醇、0.05％(w/v)泰洛沙泊、0.25％蔗糖和5mM组氨酸的LYO C缓冲溶液中。最后，将具有104个细菌的1ml的等分试样冻干并保存于25℃。以相同的方式，可以将菌株以104个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％Tween80和20％甘油的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中。该免疫原性制剂赋予针对病毒hMPV的免疫性。
实施例V：免疫原性制剂，其包含109个对于A亚型hMPV的基因P而言重组的BCGDanish菌株的细菌
将该基因以一个拷贝插入到细菌基因组中，处于在共表达T7噬菌体聚合酶的BCG菌株中的组成型表达的外源性T7噬菌体启动子的调控之下。蛋白质的表达是胞质性的。将该免疫原性制剂置于在经稀释的Sauton SSI溶液(125μg MgSO4、125μg K2HPO4、1mg L-天冬酰胺、12.5μg柠檬酸铁铵、18.4mg 85％甘油、0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)中并保存于-20℃，或者可以进行冻干并保存于4℃。以相同的方式，可以将菌株以109个细菌/100μl的终浓度保存在补充有0.02％Tween 80和20％甘油的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mMNa2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中。
借助于电转化用源自质粒pMV361(Stover等人,1991)的质粒pMV361PT7/P-hMPV转化BCG Danish菌株ATCC 35733，所述质粒插入到细菌基因组中仅一次。该质粒包含编码A亚型hMPV的蛋白P的基因，其在通过T7噬菌体聚合酶的表达而激活的T7启动子之下进行表达。
借助于电转化用源自质粒pMV261(Stover等人,1991)的质粒pMV261Amp/PolT7转化所得到的BCG菌株，所述质粒以多个拷贝以染色体外的方式存在于细菌中。在该质粒中，对于抗生素卡那霉素的抗性已被对于抗生素潮霉素(Higr)的抗性所代替。T7噬菌体的T7聚合酶处于BCG的基因hsp60的组成型启动子的控制之下。使所得到的重组菌落在37℃下在经补充的Middlebrock 7H9培养基中进行生长直至OD600nm＝1，以4,000rpm离心20分钟(Eppendorf 5702/R A-4-38型转子)，并且重悬浮在经稀释的Sauton SSI溶液(125μgMgSO4、125μg K2HPO4、1mg L-天冬酰胺、12.5μg柠檬酸铁铵、18.4mg 85％甘油、0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)中并保存于-80℃。该免疫原性制剂赋予针对病毒hMPV的免疫性。
实施例VI：用在任何其免疫原性制剂中的108个对于基因P-hMPV而言重组的BCGDanish菌株的细菌进行的接种发挥保护作用而免于免疫病理学损害
以任何其呈现形式用表达偏肺病毒的蛋白P的重组BCG菌株进行的接种发挥保护作用而免于出现由hMPV的A和B株系进行的感染的临床征候和症状。减轻了由发热和全身不适所引发的食欲缺乏(图3A)，以及气道的浸润(图3B、3C)。还减少了hMPV的A和B株系的复制和散布(图3D)。
以任何其呈现形式用所述制剂进行的接种还显著地减轻了由hMPV的A和B株系进行的感染的组织病理学表现。用所述制剂进行疫苗接种的动物的肺显示出相对于未免疫接种的或用野生型菌株进行免疫接种的动物而言低得多的肺组织的免疫细胞浸润、结构丧失和炎症(图4)。
以任何其呈现形式用具有表达hMPV的蛋白P的重组BCG的制剂进行的接种产生基于细胞的免疫性，其可以通过从经免疫接种的供者个体中回收和纯化T淋巴细胞而转移给未接触过抗原的个体(图6)。
上面的实施例可扩展至包含表达hMPV的蛋白P或其实质性部分的重组分枝杆菌减毒株的免疫原性制剂，以及所有与包含表达RSV的蛋白NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G中任一个的重组分枝杆菌减毒株的免疫原性制剂的组合。同样，所述实施例可扩展至包含一种或多种重组分枝杆菌减毒株的免疫原性制剂；其中所述重组细菌包含hMPV的蛋白P的蛋白质或免疫原性片段的基因，其要么插入到细菌基因组中要么插入到染色体外质粒中(以一个或多个拷贝)，并且其表达由内源性或外源性的、组成型或诱导型的启动子来指挥，并且其以可溶的胞质蛋白质形式、以分泌至细胞外的形式或者作为与细胞膜相结合的蛋白质进行表达。
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Figure IDA0000981795940000011

Claims (15)

1.赋予针对人偏肺病毒(hMPV)亚型A感染的保护作用和/或减弱由hMPV亚型A引起的致病性的免疫原性制剂，其特征在于，所述制剂在药理学上可接受的盐水缓冲液中以104至109个细菌/剂的量包含重组分枝杆菌减毒卡-介杆菌(BCG)的Danish株，其中所述Danish株表达由SEQ ID NO:3编码的来自hMPV的蛋白P。
2.根据权利要求1的免疫原性制剂，其特征在于，将编码hMPV的蛋白P的核酸序列以一个或多个拷贝插入到分枝杆菌减毒BCG的Danish株的基因组中或插入到染色体外质粒中，从而使得由所述核酸序列表达出所述病毒蛋白。
3.根据权利要求1的免疫原性制剂，其特征在于，所述制剂包含重组分枝杆菌减毒BCG的Danish株，并且其中所述Danish株在不同的位置处表达hMPV的蛋白P，以可溶的形式、作为经分泌的细胞外蛋白质或者作为与膜相结合的蛋白质。
4.根据权利要求1的免疫原性制剂，其特征在于，所述蛋白P来源于在分枝杆菌BCG的Danish株的内源性或外源性的、组成型或诱导型的启动子的控制之下的核酸表达。
5.根据权利要求1的免疫原性制剂，其特征在于，所述制剂包含重组分枝杆菌减毒BCG的Danish株，并且其中hMPV的蛋白P由所述菌株进行表达以产生不同数目的拷贝，组成性或诱导性地进行表达，和/或定位于不同的细胞位置。
6.根据权利要求1的免疫原性制剂，其特征在于，通过冷冻、冷冻干燥或使用缓冲盐水溶液来使所述制剂稳定化，以便在其使用前进行保存。
7.根据权利要求1的免疫原性制剂，其特征在于，所述蛋白质表达为可溶性胞质蛋白质，分泌至细胞外，或者与细胞膜相结合。
8.根据权利要求1的免疫原性制剂在制备疫苗中的用途，所述疫苗用于针对hMPV感染或由hMPV引发的病理学状况进行保护。
9.根据权利要求8的用途，其特征在于，所述疫苗通过皮下途径进行施用。
10.根据权利要求8的用途，其特征在于，所述疫苗通过经皮途径进行施用。
11.根据权利要求8的用途，其特征在于，所述疫苗通过真皮下途径进行施用。
12.针对hMPV的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含根据权利要求1的免疫原性制剂。
13.根据权利要求12的疫苗，其特征在于，将所述疫苗配制成用于皮下施用。
14.根据权利要求12的疫苗，其特征在于，将所述疫苗配制成用于经皮施用。
15.根据权利要求12的疫苗，其特征在于，将所述疫苗配制成用于真皮下施用。
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