WO2015049633A1 - FORMULACION INMUNOGENICA QUE CONTIENE BCG VIVAS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN ANTIGENOS DE METAPNEUMOVIRUS (hMPV), EN UNA SUSPENSION QUE SE PREPARA A PARTIR DE UN LIOFILIZADO SIN LA NECESIDAD DE ADJUVANTE, APTA PARA SU USO FARMACEUTICO. - Google Patents

FORMULACION INMUNOGENICA QUE CONTIENE BCG VIVAS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN ANTIGENOS DE METAPNEUMOVIRUS (hMPV), EN UNA SUSPENSION QUE SE PREPARA A PARTIR DE UN LIOFILIZADO SIN LA NECESIDAD DE ADJUVANTE, APTA PARA SU USO FARMACEUTICO. Download PDF

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immunogenic
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Susan Marcela Bueno Ramirez
Alexis Mikes Kalergis Parra
Christian PALAVECINO BEAUMONT
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    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to the areas of immunology and biotechnology, specifically addressing an immunogenic formulation based on a recombinant attenuated bacterium to be used in the preparation of a vaccine against human Metapneumo virus (hMPV).
  • This formulation contains the recombinant Calmette and Guérin Bacillus (BCG), which expresses the antigenic peptide protein P of the hMPV virus.
  • BCG Calmette and Guérin Bacillus
  • the human Metapneumo virus (hereinafter hMPV), is the etiologic agent of a high percentage of hospitalizations and morbidity associated with acute respiratory diseases of the upper and lower respiratory tracts, especially in infants, the elderly and individuals immunocompromised. Infection with this virus is associated with a wide range of pathologies, within which bronchiolitis and pneumonia correspond to the cases with the greatest socio-economic impact. Additionally, they have been associated with gastroenteritis, and keratoconjunctivitis. Calvo et al.
  • the hMPV virus is classified in the family Paramyxoviridae subfamily Pneumovirinae, the same in which hRSV is classified, although each is grouped into the genera Metapneumo virus and Pneumovirus, respectively.
  • the hMPV genome is composed of single stranded non-segmented ribonucleic acid (ssRNA), so viral proteins are organized in a 3 'to 5' direction (with respect to their sequence) as follows: N, P, M, F, M2 (ORF1 and 2), SH, G and L.
  • the other proteins are responsible for packing the genetic material and defining the structure of the viral particle, corresponding to the nucleocapsid protein N and the M matrix protein, together with transmembrane glycoproteins F, G and SH, respectively.
  • the other four proteins, M2-1, M2-2, P and L, are involved in viral replication and transcription.
  • hRSV-FI formalin inactivated virus
  • hMPV-FI formalin inactivated virus
  • the increase in NF- ⁇ transcriptional activity is further related to the secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-8.
  • pro-inflammatory cytokines such as IL-8.
  • the hyper-reactivity of the lung tissue after hMPV infection has been associated with immune responses characterized by the presence of IFN- ⁇ and IL-4 in broncho-alveolar lavage and the detection of neutralizing antibodies of the IgGl isotypes. and serum IgG2a from diseased mice, strongly suggesting that the chronic inflammation observed is due to pathological responses of the Thl and Th2 types, or to an insufficient response based on Thl type cells that is accompanied by a Th2 pathological response.
  • some authors have proposed that an increased response of the Thl type could also exacerbate the disease.
  • hVRS For hVRS, some of them have been based on the use of individual viral proteins, such as complete subunits or fragments, of F or G proteins, or a mixture of them in models of murine infection and nonhuman primates. Some prototypes of hVRS vaccine have been used in phase I and II clinical trials, but the results have not demonstrated a long-term protective capacity, and the vaccines are far from being suitable for mass use in infection prophylaxis (Denis et al., 2005; Karron et al., 2005).
  • Antibodies capable of neutralizing hMPV in vitro are not able to prevent infection or disease caused by hMPV, when used as therapies by passive immunization (Hamelin et al., 2008).
  • the resolution of the viral condition requires the participation of a cell-based immune response, of the Thl type. It was shown that the resolution of the viral picture and the removal of viral particles is dependent on the activation of CD4 + and CD8 + lymphocytes, although their activity is also responsible for the immunopathology of the disease (Kolli et al., 2008).
  • the inventors have found that the use of a recombinant strain of Mycobacterium that expresses the P protein of the human Metapneumo virus allows generating a protective immunity against infection by the respiratory virus Metapneumovirus, without causing unacceptable side effects, such as hyper-inflammatory reactivity The airways.
  • This invention solves a technical problem that remained unresolved in the prior art, which consists of an immunogenic formulation that provides protection against hMPV infections and does not generate hyper inflammatory reactivity.
  • Figure 1 Generation of construction pMV361-P-hMPV. From the metapneumovirus RNA, reverse transcription was performed with universal splitters and subsequently amplified with the P-hMPV-Fw and P-hMPV-Rv splitters of the open reading frame of the P gene. Sites were incorporated into the amplification product. EcoRI at both ends and inserted into the EcoRI site of the mycobacterial vector pMV361 to generate the construction of the vector pMV361-P-hMPV.
  • Figure 1A shows the hMPV genome, and the gene encoding the P protein
  • Figure IB shows the vector pMV361-P-hMPV incorporating said gene encoding the P protein.
  • FIG. 1 Expression of the P protein or M2.1 protein of hMPV by recombinant strains of Mycobacterium BCG.
  • the Danish strain of Mycobacterium BCG was electrotransformed with plasmid pMV361-P-hMPV and Middlebrook 7H10 agar medium supplemented with oleic acid, albumin, dextrose and catalase containing 20 ⁇ g / ml kanamycin was selected. It has been made an SDS-PAGE (CB) electrophoresis and a Western Blot (WB), using hMPV anti-protein P monoclonal antibodies (WB).
  • CB SDS-PAGE
  • WB Western Blot
  • Figure 2A western blot, using hMPV protein P monoclonal antibodies
  • Figure 2B western blot, using hMPV M2.1 protein monoclonal antibodies.
  • SDS-PAGE 25 ⁇ g of total protein prepared from four clones of rBCG-P-hMPV ( Figure 2A) or five clones of rBCG-M2.1-hMPV ( Figure 2B) was loaded.
  • As a positive control 5 ng of recombinant P-hMPV protein or 25 ⁇ g of inactivated hMPV were loaded as appropriate.
  • FIG. 3 Immunization with recombinant rBCG-P-hMPV protects against infection with hMPV.
  • CFU colony forming units
  • rBCG-P-hMPV or BCG-WT (wild) 6 plaque-forming units (UFP) of live virus (Live-hMPV) or UV-inactivated virus (UV-hMPV) were also vaccinated with lxlO
  • Control groups included unvaccinated animals and another group of uninfected animals. During the six days after infection, the weight of the animals was recorded and they were sacrificed at the end of the experiment and from each one the alveolar bronchial lavage (BAL) and lung was obtained. The symbols represent each individual animal and the horizontal bar is the average.
  • Figure 3 A Graph of weight loss by group of animals after infection.
  • Figure 3 B Total cells that infiltrate the airways.
  • Figure 3 C Percentage of cells that give a positive reaction to double staining for CDl lb and Grl in the BAL.
  • Figure 3 D Determination of hMPV RNA in the lung of infected mice, by quantitative PCR.
  • Figure 3D shows that the number of hMPV viruses expressed in copies of the N-hMPV gene per 5000 copies of ⁇ -actin, present in the lungs of non-immunized infected animals is similar to that of infected animals immunized with BCG-WT, Live-hMPV or UV-hMPV, that is, would not grant protection, while infected animals immunized with rBCG-P-MPV virtually no virus is found, as in uninfected animals. Immunization with rBCG-M2 granted non-complete protection.
  • FIG. 4 Immunization with rBCG-P-hMPV protects against inflammation after challenge with hMPV.
  • Significant infiltration of nuclear polymorphic cells is observed in animals not immunized or immunized with rBCG-M2.1-hMPV or BCG-WT.
  • the images are representative of six independent experiments.
  • HSP represents the quantification of an inflammation score by group of animals (Histopathology Score). It can be seen that the inflammation in animals immunized with rBCG-P-MPV and infected was very low or non-existent, similar to that seen in non-infected animals.
  • rBCG-P-hMPV-P- cytokine profile of BALB / cj spleen cells immunized with the recombinant BCG strain for hMPV P protein
  • rBCG-P- hMPV P protein
  • the spleen was recovered from four BALB / cj mice immunized with rBCG-P-hMPV and the spleen cells were stimulated for 7 days by incubation with 10 ⁇ g of P-hMPV protein or PBS (in the I / O graphics).
  • BALB / cj spleen cells immunized with BCG-WT were cultured under the same conditions.
  • the supernatant of the stimulated and unstimulated rBCG-P-hMPV and BCG-WT spleen cells were determined by ELISA levels of (A) IFN- ⁇ , (B) IL-2, (C) IL-5 and (D) IL-4 on days 4 and 7 of culture.
  • Spleen cells derived from rBCG-P-hMPV stimulated with P-hMPV protein secrete significantly larger amounts of IFN- ⁇ compared to cells from animals immunized with BCG-WT or unstimulated cells (rBCG-P U / S) (*** p ⁇ 0.001, Student's t-test), Figure 5 A.
  • the amounts of IFN- ⁇ increased between day 4 to 7 (* p ⁇ 0.05, Student's t-test) , Figure 5 A.
  • FIG. 6 Transfer of T lymphocytes of mice immunized with rBCG-P-hMPV confer resistance to hMPV infection in mice na 'ive.
  • CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes were purified from splenocytes stimulated and not stimulated with recombinant viral proteins.
  • mice transferred with CD4 + and / or CD8 + T cells from mice immunized with rBCG-P-hMPV show no difference in body weight compared to uninfected mice.
  • mice transferred with CD4 + and / or CD8 + T lymphocytes from mice immunized with BCG-WT lost significantly more weight after infection, compared to non-infected animals (p ⁇ 0.0001) ( Figure 6B).
  • Figure 6C shows that in the alveolar bronchus wash, BAL, of nai ' ve mice previously transferred with CD4 + and / or CD8 + T cells from mice immunized with rBCG-P-hMPV (P-CD8, P-CD4, P- CD8 / 4), show significantly less granulocyte infiltration compared to mice transferred with BCG-WT T lymphocytes (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8 / 4) (*** p «3,0001, test Student's t).
  • the viral load was quantified as gene copies of N-hMPV by RT-qPCR, as described above.
  • the present invention consists of an immunogenic formulation against hMPV comprising a recombinant BCG strain that expresses the P protein of the human Metapneumo virus. This formulation provides effective protection against hMPV infections and does not generate a response of inflammatory hyper reactivity.
  • the formulation of the invention can be supplied alone or mixed with other vaccines, such as with an immunogenic formulation against RSV, in a mixed dose that would provide protection against infection and / or complications associated with hMPV and RSV.
  • Detailed immunogenic formulation in this invention can be used to prepare vaccines containing attenuated live axenic cultures from recombinant bacteria in doses between lxlO 4 cfu to 10 cfu per dose lxlO, especially dose of 1x10 s cfu per dose are preferred.
  • the formulation will be lyophilized with a restorative solution that does not need adjuvant, since the composition of the cell envelope of the recombinant bacterium is the adjuvant.
  • the lyophilized immunogenic formulation of the invention should be stored between 4 and 8 o C, protected from direct and indirect sunlight, in the presence of two separate bottles, one with the lyophilized recombinant bacteria, and another with the reconstituting saline solution, to be mixed previously to his administration. Since its introduction in 1921, the Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) -based vaccine has been used in more than one billion people and is currently used around the world against tuberculosis.
  • BCG Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin
  • the inventors have found that a way to shift the balance of the immune response from a pro-inflammatory Th2 type response whose protection is not lasting over time towards a cell-based Thl response, specifically cytotoxic CD8 + T cells and T cells CD4 + helper is to use adjuvants as the components of the cell wall of Mycobacterium. Specifically, express hMPV immunogenic protein in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG).
  • BCG Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin
  • the F and G proteins of hPMV are found on the surface of the viral particle and are therefore accessible to circulating antibodies. For this reason, these proteins would be the most obvious choice to make a vaccine based on the production of antibodies to prevent hMPV infection.
  • capsid proteins specifically P protein
  • an adjuvant that promotes a response based on Thl type cells, such as the attenuated bacteria Mycobacterium bovis BCG .
  • capsid proteins like M2.1 of hMPV promote the activation of cytotoxic lymphocytes (LTC).
  • LTC cytotoxic lymphocytes
  • the recombinant proteins expressed by the vector bacterium used in this invention are obtained by cloning the genes encoding them from hMPV group A virus into prokaryotic expression vectors, all commercially available.
  • the genome of Metapneumo virus (hMPV) has been described previously and is available in the GeneBank databases, access number: AB503857.1, DQ843659.1, DQ843658.1, EF535506.1, GQ153651.1, AY297749 .1, AY297748.1, AF371337.2, FJ168779.1, FJ168778.1, NC_004148.2 and AY525843.1.
  • hMPV proteins can be genetically modified, such as by incorporating peptide sequences or glycosylation domains and / or subsequent destination to endocytic or phagocytic receptors of antigen presenting cells, by coupling to natural ligands through the use of the system.
  • biotin-streptavidin using commercial biotinylation kits and genetic modification of viral proteins by coupling to the bacterial streptavidin protein, or by introducing the genetic sequence coding for amino acid sequences described as biotinylation signals in proteins or fragments recombinant proteins, using techniques previously described for heterologous prokaryotic and / or eukaryotic expression systems).
  • the immunogenic formulation of the invention comprises the expression of the hMPV P protein either complete or an immunogenic fragment thereof, in an attenuated strain of Mycobacterium.
  • the attenuated recombinant Mycobacterium strain is derived from the Bacillus Calmette-Guerin (BCG) strain.
  • BCG Bacillus Calmette-Guerin
  • the hMPV P protein may correspond to the P protein of Metapneumo virus of subtypes A or B.
  • the recombinant Mycobacterium attenuated strain of the invention may contain the nucleic acid sequences encoding the hMPV P protein or its immunogenic fragment inserted in the bacterial genome or in an extrachromosomal plasmid, in one or more copies. Protein expression may be under the control of constitutive or inducible, endogenous or exogenous promoters of Mycobacterium BCG.
  • the hMPV P protein or its immunogenic fragment can be expressed in soluble, soluble-cytoplasmic form, as secreted extracellular protein, or membrane bound.
  • the immunogenic formulation of the invention may comprise two or more recombinant attenuated Mycobacterium strains, and wherein the hMPV P protein immunogenic proteins or fragments of the strains are expressed to generate a different number of copies, constitutively or induciblely expressed, and / or are located in different cell locations.
  • the immunogenic formulation disclosed in the present invention can be used in conjunction with immunogenic formulations containing other antigenic formulations against viruses other than hVRS and hMPV, with attenuated strains of BCG and seasonal vaccines against influenza A and B.
  • the immunogenic formulation described above can be applied to the individual subcutaneously / subdermally in conjunction with a saline buffer (PBS, sodium phosphate buffer) or physiological solution.
  • a saline buffer PBS, sodium phosphate buffer
  • a vector that expresses said protein must first be generated. Any known mycobacterial expression vector can be used, and the gene encoding the hMPV virus P protein in phase with its promoter region must be inserted. In a preferred embodiment, reverse transcription is performed with universal cleaners from the isolated human virus metapneumo RNA. Subsequently, the P protein gene is amplified with specific splitters ( Figure 1A). The amplification product is inserted into the expression vector. In the present invention, the mycobacterial expression vector pMV361 has been used, generating the vector pMV361 -P-hMPV ( Figure IB).
  • the vector is used to transform the Mycobacterium strain, such as Mycobacterium BCG.
  • Mycobacterium BCG Any known BCG strain, such as BCG Danish or BCG Pasteur, can be used for the purposes of the invention.
  • the transformation method can be any available method, especially electrotransformation is preferred. Subsequently, the transformed cells expressing hMPV P protein must be selected.
  • These recombinant cells constitute the immunogenic formulation of the invention, which is provided in amounts of between 10 4 to 10 9 CFU / dose in a pharmacologically acceptable saline buffer.
  • the formulation of the invention can be formulated in combination with recombinant BCG strains that express immunogenic syncytial virus (RSV) proteins.
  • RSV immunogenic syncytial virus
  • the BCG recombinant bacterium that expresses the hMPV P protein is provided in conjunction with BCG recombinant bacteria that express N, P, M, F, M2 (ORF1 and 2), SH, G or L RSV proteins.
  • the formulation Immunogenic of the invention is used in combination with a recombinant BCG strain for the RSV N gene.
  • a strain of BCG is transformed with a vector that expresses the hMPV P protein and subsequently the transformed cell is transformed again with a vector that expresses a syncytial virus protein (RSV).
  • the RSV protein is chosen from N, P, M, F, M2 (ORF1 and 2), SH, G or L. It is especially preferred to first transform with a vector that expresses the P protein of hMPV subtype A, and in Secondly, subject these transformed strains to a second transformation with a vector that expresses the N gene of RSV subtype A, obtaining a BCG strain that simultaneously expresses the P proteins of hMPV subtype A and N of RSV subtype A.
  • the immunogenic formulation of the invention can be provided lyophilized in a multidose presentation ready to be reconstituted in 1 ml of an attached saline solution, to obtain a solution of 9 ug / ml of reconstituted solution.
  • Each 0.1 ml of resuspended solution will contain the appropriate dose of 1x10 s for the administration.
  • the transformed strains of the invention can be suspended in any appropriate lyophilization solution, for example, the LYO C buffer, composed of 4% mannitol (w / v), 0.05% Tyloxapol (w / v), 0.25% sucrose and 5 mM histidine. to then be lyophilized and preserved at 25 ° C.
  • the LYO C buffer composed of 4% mannitol (w / v), 0.05% Tyloxapol (w / v), 0.25% sucrose and 5 mM histidine.
  • the reconstituting solution can be any solution available in the art, in one embodiment a dilute solution Sauton SSI (125 mg MgS0 4, K 2 HP0 125 mg 4 1 mg L-asparagine, 12.5 g ferric ammonium citrate is preferred, 18.4 mg 85% glycerol, 0.5 mg citric acid in 1 ml of H20) at -80 ° C.
  • Sauton SSI 125 mg MgS0 4, K 2 HP0 125 mg 4 1 mg L-asparagine, 12.5 g ferric ammonium citrate is preferred, 18.4 mg 85% glycerol, 0.5 mg citric acid in 1 ml of H20) at -80 ° C.
  • the formulation of the invention can be suspended in a solution of PBS (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na2HP04; 1.47 mM KH2P04, pH 7.4), supplemented with 20% Glycerol and Tween 80 0.02% at a final concentration of 10 8 bacteria per 100 ⁇ and stored at -80 ° C. Both in the presence of a non-ionic detergent such as 0.1% Tween®-80 or 0.05% Tyloxapol.
  • the formulation of the invention should be kept between 4 to 8 ° C, before and after reconstitution, at all times away from direct and indirect sunlight and once reconstituted should be removed at the end of the day.
  • the following examples of the generation and use of the immunogenic formulation against hMPV based on the recombinant bacterium Mycobacterium expressing viral proteins are only illustrative and are not intended to limit the range of production or application of the invention. Although specific terms are used in the following descriptions, their use is only descriptive and not limiting.
  • Example I Generation of a recombinant vector allows the expression of the P protein of hMPV in the Mycobacterium BCG bacteria.
  • the coding region of the P gene was amplified using the following splitters: P-hMPV_Fw: GAATTCATGTCATTCCCTGAAGGAAA (SEQ ID No 1) and P-hMPV_Rv: GAATTCCTACATAATTAACTGGTAAA (SEQ ID No 2), where the underlined sequences incorporate EcoRI site at both ends of the amplification product, Figure 1A.
  • the mycobacterial vector pMV361 was linearized at the EcoRI site, which allowed the insertion of the following sequence corresponding to the P gene of hMPV:
  • Example II Immunogenic formulation consisting of 10 doses of lxlO 8 CFU each of the recombinant BCG Danish strain for the P gene of hMPV subtype A.
  • the P gene of hMPV subtype A is inserted into a copy in the genome of the bacterium under the regulation of the constitutive endogenous promoter hsp60 of Mycobacterium BCG for protein expression.
  • the Mycobacterium BCG Danish strain (ATCC 35733) was transformed by electrotransformation with plasmid pMV361-P-hMPV, derived from plasmid pMV361 (Stover et al., 1991), which is inserted only once into the genome of the bacterium.
  • This plasmid contains the gene that codes for hMPV protein P subtype A, which is expressed under the endogenous promoter and constitutive of the hsp60 BCG gene.
  • PBS solution 137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH 7.4
  • strains can be resuspended in a solution volume: 25% lactose volume and Proskauer and Beck medium supplemented with glucose and Tween 80 (PBGT: 0.5 g asparagine; 5.0 g monopotassium phosphate; 1.5 g citrate magnesium; 0.5 g potassium sulfate; 0.5 ml Tween 80 and 10.0 g glucose per liter of distilled water) and then freeze-dried and stored at 25 ° C.
  • PBGT glucose and Tween 80
  • RNA copies of the N-hMPV gene in the lung cells of the different groups studied was analyzed. A larger number of RNA copies of the hMPV virus is indicative of a higher infection, the results are normalized by copies of ⁇ -actin. The results are shown in Figure 3D. It is appreciated that the number of hMPV viruses present in the lungs of non-immunized infected animals is similar to that of infected animals immunized with BCG-WT, Live-hMPV or UV-hMPV, that is, these immunizations would not grant protection. It is noted that immunization with rBCG-M2 granted a non-complete protection.
  • Example III Immunogenic formulation consisting of 5xl0 7 bacteria of the recombinant Mycobacterium BCG Danish strain for the P gene of hMPV subtype A and 5xl0 7 bacteria of the recombinant Mycobacterium BCG Danish strain for the N gene of RSV subtype A.
  • the hMPV and RSV genes are inserted in a copy in the genome of the bacteria under the regulation of the constitutive endogenous promoter hsp60 of BCG and the expression of the protein is cytoplasmic.
  • the immunogenic formulation is preserved in PBS (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH 7.4), supplemented with 20% Glycerol and Tween 80 0.02% at a final concentration of 10 8 bacteria per 100 ⁇ and stored at -20 ° C.
  • BCG Danish strains (ATCC 35733) were transformed by electrotransformation with the plasmid pMV361-P from hMPV to give the strain of the invention rBCG-P-MPV, and additionally a second group was transformed with pMV361-N from VRS to obtain the transformed strain rBCG-N VRS, these plasmids are derived from plasmid pMV361 (Stover et al., 1991), which are inserted only once into the genome of the bacterium.
  • a strain of BCG Danish was transformed with the P gene of hMPV subtype A, so that the gene was inserted into a copy in the genome of the bacterium under the regulation of the BCG inducible endogenous promoter, which is active in response to nitric oxide, low oxygen concentrations, and stationary phases of growth. Protein expression is cytoplasmic.
  • the immunogenic formulation was lyophilized in LYO C buffer, composed of 4% mannitol (w / v), 0.05% tyloxapol (w / v), 0.25% sucrose and 5 mM histidine and conserved 25 ° reconstituted C in diluted solution Sauton SSI (125 ⁇ g MgS0 4 , 125 ⁇ g K 2 HP0 4 , 1 mg L-asparagine, 12.5 ⁇ g ferric ammonium citrate, 18.4 mg 85% glycerol, 0.5 mg citric acid in 1 mi from H 2 0).
  • LYO C buffer composed of 4% mannitol (w / v), 0.05% tyloxapol (w / v), 0.25% sucrose and 5 mM histidine and conserved 25 ° reconstituted C in diluted solution Sauton SSI (125 ⁇ g MgS0 4 , 125 ⁇ g K 2 HP0 4 , 1 mg L-
  • the transformed strains can be preserved in a PBS solution (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH 7.4) supplemented with Tween 80 0, 02% and 20% glycerol at a final concentration of 10 4 bacteria per 100 ⁇ .
  • PBS solution 137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH 7.4
  • the BCG Danish strain (American Type Culture Collection, www.atcc.org, ATCC number 35733) was transformed by electrotransformation with plasmid pMV361p ac / P-hMPV, derived from plasmid pMV361 (Stover et al., 1991), which is inserted only once in the genome of the bacteria.
  • This plasmid contains the gene encoding the hMPV protein P subtype A, which is expressed under the endogenous and inducible promoter of the BCG acr gene.
  • ODóoo nm 1, centrifuged at 4,000 rpm for 20 min (eppendorf rotor model 5702 / R A-4-38) and resuspended in a LYO C buffer solution, composed of 4% mannitol (w / v), 0.05% Tyloxapol (w / v), 0.25% sucrose and 5 mM histidine. Finally, 1 ml aliquots were lyophilized with 10 4 bacteria and stored at 25 ° C.
  • the strains can be preserved in a PBS solution (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH 7.4) supplemented with Tween 80 0.02% and Glycerol 20% at a final concentration of 10 4 bacteria per 100 ⁇ .
  • This immunogenic formulation confers immunity against the hMPV virus.
  • Example V Immunogenic formulation consisting of 10 9 bacteria of recombinant BCG Danish strain for the P gene of hMPV subtype A.
  • the gene is inserted in a copy in the genome of the bacteria under the regulation of the exogenous promoter of phage T7 constitutive expression in BCG strains that co-express polymerase of phage T7. Protein expression is cytoplasmic.
  • the immunogenic formulation is in a diluted Sauton SSI solution (125 ⁇ g MgS0 4 , 125 ⁇ g K 2 HP0 4 , 1 mg L-asparagine, 12.5 ⁇ g ferric ammonium citrate, 18.4 mg 85% glycerol, 0.5 mg citric acid in 1 ml of H 2 0) and was stored at -20 ° C, or it may be freeze-dried and stored at 4 ° C.
  • the strains can be preserved in a PBS solution (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH 7.4) supplemented with Tween 80 0.02% and Glycerol 20% at a final concentration of 10 9 bacteria per 100 ⁇ .
  • PBS solution 137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HP0 4 ; 1.47 mM KH 2 P0 4 , pH 7.4
  • the BCG Danish ATCC 35733 strain was transformed by electrotransformation with plasmid pMV361pT7 / P-hMPV, derived from plasmid pMV361 (Stover et al., 1991), which is inserted only once into the genome of the bacterium.
  • This plasmid contains the gene that codes for hMPV protein P subtype A, which is expressed under the T7 promoter activated by expression of phage T7 polymerase.
  • the resulting BCG strain was transformed by electrotransformation with plasmid pMV26lAm P / PolT7, derived from plasmid pMV261 (Stover et al., 1991), which resides extrachromosomally in the bacterium in multiple copies.
  • plasmid pMV26lAm P / PolT7 derived from plasmid pMV261 (Stover et al., 1991), which resides extrachromosomally in the bacterium in multiple copies.
  • the resistance to the antibiotic kanamycin has been replaced by the resistance to the antibiotic hygromycin (Higr).
  • the T7 polymerase of phage T7 is under the control of the constitutive promoter of the hsp60 gene of BCG.
  • the inoculation of the formulation in any of its presentations also significantly decreases the histopathological manifestations of infection by strains A and B of hMPV.
  • the lungs of animals vaccinated with the formulation demonstrate much less infiltration of immune cells, loss of structure and inflammation of the lung tissues compared to animals not immunized or immunized with the wild type strain ( Figure 4).
  • Inoculation of the formulation with recombinant BCG expressing the P protein of hMPV in any presentation generates based immunity cells can be transferred to nai individuals' seen by the recovery and purification of T cells from donors immunized individuals ( Figure 6 ).
  • the examples are extended to immunological formulations containing one or more attenuated recombinant Mycobacterium strains; where said recombinant bacteria contain protein genes, or immunogenic fragments of the hMPV P protein that are inserted either in the bacterial genome or in extrachromosomal plasmids, in one or several copies, and their expression is commanded by endogenous or exogenous promoters, constitutive or inducible, expressed, soluble-cytoplasmic, secreted extracellularly or as proteins bound to the cell membrane.
  • T lymphocytes contribute to antiviral immunity and pathogenesis in experimental human metapneumovirus infection. J Virol 82, 8560-8569.
  • Human metapneumovirus enhanced pulmonary disease in cotton rats immunized with formalin-inactivated virus vaccine and challenged. Vaccine 25, 5034-5040.

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Abstract

La presente invención describe una formulación inmunogénica para ser utilizada en mamíferos contra Metapneumovirus humano (hMPV) consistente en un liofilizado de 1x109 ufc/ml de BCG recombinantes que expresa la proteína viral P de hMPV (de los genogrupos A1, A2, B1 y B2). La vacuna esta derivada del producto completo o parcial del gen P de hMPV pudiendo ser utilizadas, estabilizadas y administradas en solución sin la necesidad de adyuvantes. La preparación puede contener además combinaciones de formulaciones descritas anteriormente. La formulación está estabilizada por liofilización (rango de conservación entre 4°C y 8°C), para ser posteriormente reconstituida en una solución salina sin adyuvante previo a su uso.

Description

FORMULACION INMUNOGENICA QUE CONTIENE BCG VIVAS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN ANTIGENOS DE METAPNEUMOVIRUS
(hMPV), EN UNA SUSPENSION QUE SE PREPARA A PARTIR DE UN LIOFILIZADO SIN LA NECESIDAD DE ADJUVANTE, APTA PARA SU USO FARMACEUTICO.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con las áreas de inmunología y biotecnología, abordando específicamente una formulación inmunogénica basada en una bacteria atenuada recombinante a ser utilizada en la preparación de una vacuna contra Metapneumo virus humano (hMPV). Dicha formulación contiene el Bacilo de Calmette y Guérin (BCG) recombinante, que expresa el péptido antigénico proteína P del virus hMPV.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El Metapneumo virus humano (de ahora en adelante hMPV), es el agente etiológico de un alto porcentaje de las hospitalizaciones y la morbilidad asociadas a enfermedades respiratorias agudas de los tractos respiratorio superior e inferior, especialmente en infantes, personas de la tercera edad e individuos inmunocomprometidos. La infección por este virus se asocia a una amplia gama de patologías, dentro de las cuales la bronquiolitis y neumonía corresponden a los cuadros con mayor impacto socio-económico. Adicionalmente, han sido asociadas con gastroenteritis, y queratoconjuntivitis. Calvo y colaboradores (2008) demostraron en un período de 3 años que la incidencia acumulada de infecciones respiratorias agudas los virus respiratorios VRS, ADV y hMPV, son responsables del 64,5% de las hospitalizaciones de niños menores de 2 años, siendo la incidencia para cada uno de los virus de 35,4%, 19,3% y 9,8% respectivamente. Una característica interesante que hMPV comparte con los otros virus respiratorios de alta incidencia es la producción de infecciones repetidas a lo largo de la infancia, fenómeno posiblemente asociado a una falla en el establecimiento de una respuesta inmune protectora frente a la primera infección durante los primeros meses de vida. Este último fenómeno motiva la urgente necesidad en los sistemas públicos de salud por nuevos prototipos de vacunas capaces de controlar brotes anuales de infecciones respiratorias, de tal modo que permita disminuir la congestión de los centros asistenciales y en último término, el impacto socio-económico asociado a estas infecciones. No hay estudios hasta el momento del impacto económico específico que ocasiona la infección por hMPV, sin embargo, la incidencia de hospitalización por hMPV se ha estimado en 1/3 respecto de la incidencia de hospitalización por virus respiratorio sincicial humano (hRSV). Estudios realizados en países desarrollados, estiman que el costo individual de la infección por hRSV es de sobre 3.000 euros ($1.860.000 pesos chilenos) con un límite superior de hasta 8.400 euros ($5.200.000 pesos chilenos). Los costos por concepto de hospitalización individual se sugieren aproximados, considerando que el proceso patológico que amerita la hospitalización es de similares características.
El virus hMPV se clasifica en la familia Paramyxoviridae subfamilia Pneumovirinae, la misma en que se clasifica hRSV, si bien cada uno está agrupado dentro de los géneros Metapneumo virus y Pneumovirus, respectivamente. El genoma de hMPV está compuesto por ácido ribonucleico de hebra simple (ssRNA) no segmentada de sentido negativo, por lo que las proteínas virales se organizan en sentido 3 'a 5' (con respecto a su secuencia) de la siguiente forma: N, P, M, F, M2 (ORF1 y 2), SH, G y L. Cinco de estas proteínas son responsables del empaquetamiento del material genético y de definir la estructura propia de la partícula viral, correspondiendo a la proteína de nucleocápside N y la proteína de matriz M, junto a las glicoproteínas de transmembrana F, G y SH, respectivamente. Las otras cuatro proteínas, M2-1, M2-2, P y L, están involucradas en la replicación y transcripción viral. Existen 2 subtipos de hMPV, clasificados como A y B respecto de dos grupos antigénicos basados en diferencias de secuencia principalmente en las proteínas F y G. Si bien estas proteínas presentan cierto grado de diferencia, existe una alta identidad respecto de las otras proteínas codificadas por el genoma viral.
El desarrollo de vacunas contra virus respiratorios se inició en la década de 1960 con el primer prototipo de vacuna contra hRSV, basado en virus inactivado por formalina (hRSV- FI), que presentó importantes efectos adversos que impidieron utilización en programas de inmunización. La formulación intramuscular acompañada del adyuvante hidróxido de aluminio produjo en los infantes vacunados un cuadro más severo que en aquellos individuos que se infectaron que no fueron vacunados. Este efecto fue asociado con una híper-reactividad de la respuesta inmune frente a la infección, caracterizándose por una elevada infiltración parenquimatosa de polimorfonucleares, eosinófilos y neutrófilos además de un elevado título de anticuerpos fijadores de complemento.
Contra Metapneumo virus humano (hMPV) se han desarrollado pocas vacunas y hasta el momento ninguna ha tenido un resultado satisfactorio. Un prototipo que utilizó el mismo diseño anterior de virus inactivado por formalina (hMPV-FI), también demostró producir cuadros de híper-reactividad inflamatoria de similares características al producido por la vacuna contra hRSV en el modelo Sigmodon hispidus de infección (Yim et al., 2007). A diferencia de los procesos de híper-reactividad observados para hVRS, se demostró eliminación parcial del virus desde el sistema respiratorio. La enfermedad observada en ratones y Sigmodon hispidus expuestos a hVRS-FI se asoció a una respuesta inmune patológica basada en anticuerpos de tipo Th2 y una activación exagerada de NF-κΒ. El incremento en la actividad transcripcional NF-κΒ se relaciona adicionalmente con la secreción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-8. Por otro lado, la híper-reactividad del tejido pulmonar luego de la infección por hMPV ha sido asociada a respuestas inmunes caracterizadas por la presencia de IFN-γ e IL-4 en lavado bronco-alveolar y la detección de anticuerpos neutralizantes de los isotipos IgGl e IgG2a en suero de ratones enfermos, sugiriendo fuertemente que la inflamación crónica observada se debe a respuestas patológicas de los tipos Thl y Th2, o bien, a una insuficiente respuesta basada en células de tipo Thl que se ve acompañada de una respuesta patológica Th2. En cuanto a este último postulado, algunos autores han propuesto que una respuesta incrementada del tipo Thl, también podría exacerbar la enfermedad.
Estos antecedentes destacan la importancia de establecer una respuesta inmune equilibrada y eficaz, capaz de limitar el progreso del proceso inflamatorio y a la vez, inducir una adecuada eliminación de estos virus desde los tejidos infectados.
Debido a que la enfermedad respiratoria causada por hMPV es similar a lo visto anteriormente con hVRS, que se ha asociado con una falla en la inducción de inmunidad celular, es necesario generar un prototipo de vacuna cumpla con ser un buen inductor de células T CD8+ citotóxicas y células T CD4+ helper, ambos productores de IFN-γ. Las aproximaciones experimentales recientes han enfocado sus esfuerzos en el desarrollo de vacunas contra sólo una especie viral, mediante el uso de distintas técnicas de genética molecular e inmunología. Es importante mencionar que estos estudios han utilizado una cantidad limitada de proteínas o subunidades proteicas como antígenos para cada virus de interés. Para hVRS, algunas de ellas se han basado en el uso de proteínas virales individuales, como subunidades completas o fragmentos, de las proteínas F o G, o una mezcla de ellas en modelos de infección murino y primates no humanos. Se han utilizado en ensayos clínicos de fase I y II algunos prototipos de vacuna contra hVRS, pero los resultados no han demostrado una capacidad protectora a largo plazo, y las vacunas distan de ser adecuadas para su uso masivo en la profilaxis de la infección (Denis et al., 2005; Karron et al., 2005).
Mediante la eliminación de genes que se ha sugerido se relacionan con la patogenicidad viral se han desarrollado cepas de hMPV atenuadas. Cepas de hMPV carentes de los genes que codifican para las proteínas SH, G, M2-1 y M2-2 se han planteado como candidatos para vacunas (Biacchesi et al., 2005). Estos candidatos han presentado buenos resultados en modelos animales pero aún no se han realizado estudios en seres humanos. Si bien, esta alternativa es viable, resulta ser costosa ya que requiere de la producción de virus en cultivos celulares que estén aprobados para uso en seres humanos. Otra fuente de vacuna es la sobreexpresión de proteínas virales por sistemas heterólgos, como la proteína F de hMPV, acoplada a adyuvantes genera anticuerpos neutralizantes, pero la desventaja de esta opción es que proporcionan inmunidad por un periodo muy corto de tiempo (Herfst et al., 2008a).
No existen estudios clínicos para candidatos de vacunas contra hMPV, pues no se ha podido desarrollar prototipos capaces de generar inmunidad protectora. Los prototipos hasta ahora evaluados en modelos animales generan una inmunidad basada en anticuerpos de tipo Th2, que no son de largo plazo ni eficientes previniendo la infección. Animales vacunados con estos prototipos, si bien generan anticuerpos neutralizantes in vitro, no son protegidos contra la infección ni tampoco disminuyen los síntomas clínicos de la enfermedad inducida por la infección de hMPV en ratones (Cseke et al., 2007) o en macacos (Herfst et al., 2008b). La inmunidad basada en anticuerpos tampoco es eficiente neutralizando el virus in vivo. Anticuerpos capaces de neutralizar el hMPV in vitro, no son capaces de prevenir la infección ni la enfermedad ocasionada por hMPV, cuando se utilizan como terapias mediante inmunización pasiva (Hamelin et al., 2008). Por otra parte, se ha observado que la resolución del cuadro viral requiere de la participación de una repuesta inmune basada en células, de tipo Thl. Se demostró que la resolución del cuadro viral y la remoción de partículas virales es dependiente de la activación de linfocitos CD4+ y CD8+, si bien la actividad de estos es responsable también de la inmunopatologia de la enfermedad (Kolli et al., 2008). Más recientemente se ha visto que los principales efectores en la resolución del cuadro viral son células citotóxicas de tipo CD8+, si bien los linfocitos T helper CD4+ tienen una participación regulatoria. Por esto, es necesaria una respuesta inmune equilibrada de tipo celular Thl para producir la resolución del cuadro viral sin generar hiper-reactividad inflamatoria. En resumen, no existe en la actualidad una vacuna contra el Metapneumo virus humano (hMPV) que otorgue una protección efectiva y que no tenga efectos secundarios importantes, de hecho no existen vacunas comerciales disponibles contra este virus.
Sorprendentemente los inventores han encontrado que el uso de una cepa de Mycobacterium recombinante que expresa la proteína P del Metapneumo virus humano permite generar una inmunidad protectora contra la infección por el virus respiratorio Metapneumovirus, sin provocar efectos secundarios no aceptables, tales como hiper reactividad inflamatoria en las vías aéreas. Esta invención viene a solucionar un problema técnico que permanecía sin solución en el arte previo, que consiste en una formulación inmunogénica que otorgue protección contra infecciones por hMPV y no genere hiper reactividad inflamatoria.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Generación de la construcción pMV361-P-hMPV. A partir de RNA de metapneumovirus se realizó la transcripción reversa con partidores universales y posteriormente se amplificó con los partidores P-hMPV-Fw y P-hMPV-Rv del marco abierto de lectura del gen P. Al producto de amplificación se le incorporó lo sitios EcoRI en ambos extremos y se insertó en el sitio EcoRI del vector micobacteriano pMV361 para generar la construcción del vector pMV361-P-hMPV. La Figura 1A muestra el genoma de hMPV, y el gen que codifica para la proteína P, y la Figura IB muestra el vector pMV361-P-hMPV que incorpora dicho gen que codifica para la proteína P.
Figura 2. Expresión de la proteína P o proteína M2.1 de hMPV por cepas recombiantes de Mycobacterium BCG. Se electrotransformo la cepa Danish de Mycobacterium BCG con el plásmido pMV361-P-hMPV y se seleccionó en medio agar Middlebrook 7H10 suplementado con ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa que contiene kanamicina 20 μg/ml. Se realizó una electroforesis SDS-PAGE (CB) y un Western Blot (WB), utilizando anticuerpos monoclonales anti proteína P de hMPV (WB). Figura 2A: western blot, utilizando anticuerpos monoclonales anti la proteína P de hMPV y Figura 2B: western blot, utilizando anticuerpos monoclonales anti la proteína M2.1 de hMPV. En el SDS-PAGE se cargó 25 μg de proteína total preparada de cuatro clones de rBCG-P-hMPV (Figura 2A) o cinco clones de rBCG- M2.1-hMPV (Figura 2B). Como control positivo se cargaron 5 ng de proteína recombinante P-hMPV o 25 μg de hMPV inactivado según corresponda. Como control negativo se cargó proteína total de la cepa tipo silvestre de BCG y en el caso de rBCG-P-MPV además una BCG recombinante para el gen N de VRS (cepa N-5). Se puede apreciar que todos los clones analizados expresan la proteína del plásmido clonado, ya sea la proteína P, Figura 2A, o la pro teína M2.1, Figura 2B.
Figura 3. Inmunización con rBCG-P-hMPV recombinante protege contra la infección con hMPV. Grupos de ratones BALB/c de 4-8 semanas de vida recibieron una dosis subdérmica de 1 x 108 unidades formadoras de colonia (UFC) de rBCG-M2.1-hMPV, rBCG- P-hMPV o BCG-WT (silvestre) también se vacunaron con lxlO6 unidades formadoras de placas (UFP) de virus vivo (Live-hMPV) o virus inactivado por UV (UV-hMPV). Posteriormente todos los grupos fueron infectados vía intranasal con 1 x 106 ufp de hMPV. Como grupos control se incluyó animales sin vacunar y otro grupo de animales sin infectar. Durante los seis días posteriores a la infección se registró el peso de los animales y se sacrificaron al término del experimento y de cada uno se obtuvo el lavado bronco alveolar (BAL) y pulmón. Los símbolos representan a cada animal individual y la barra horizontal es la media. (Figura 3 A) Gráfico de la pérdida peso por grupo de animales posterior a la infección. (Figura 3 B) Total de células que infiltran las vías aéreas. (Figura 3 C) Porcentaje de células que dan reacción positiva a la doble tinción para CDl lb y Grl en el BAL. (Figura 3 D) Determinación de RNA de hMPV en el pulmón de ratones infectados, mediante PCR cuantitativa. Se obtuvo RNA total del pulmón de cada animal sacrificado y se utilizó para producir cDNA mediante transcripción reversa. Posteriormente el cDNA generado se utilizó en una reacción de PCR cuantitativa para determinar el número de copias de RNA viral presente en la muestra respecto del número de copias del RNA de β-actina. En la Figura 3A se puede apreciar que las vacunas recombinantes BCG para proteínas P (*) y M2 (♦) fueron protectoras en la pérdida de peso del animal posterior a la infección, obteniéndose un peso similar al animal sin infectar ( '? ). Por otra parte los animales sin inmunizar ( s ) o inmunizados con BCG silvestre (BCG-WT) (■ ), Live-hMPV ( ) o UV-hMPV ( ) sufrieron pérdida de peso corporal del animal posterior a la infección. En la Figura 3B y 3C se observa que la vacuna recombinante BCG para la proteína P previno la infiltración de células inmunes en las vías aéreas del animal posterior a la infección, obteniéndose una infiltración similar al animal sin infectar. Por otra parte los animales sin inmunizar o inmunizados con BCG silvestre, BCG-WT, Live-hMPV o UV-hMPV sufrieron la infiltración de células inmunes en sus vías aéreas posterior a la infección. La vacunación con rBCG-M2 confirió una protección incompleta. En la Figura 3D se aprecia que el número de virus de hMPV expresados en copias del gen N-hMPV por 5000 copias de β-actina, presentes en los pulmones de animales infectados no inmunizados es similar al de animales infectados inmunizados con BCG-WT, Live-hMPV o UV-hMPV, es decir, no otorgarían protección, mientras que los animales infectados inmunizados con rBCG-P-MPV prácticamente no se encuentra el virus, al igual que en animales no infectados. La inmunización con rBCG-M2 otorgó una protección no completa.
Figura 4 La inmunización con rBCG-P-hMPV protege contra la inflamación después del desafío con hMPV. Los pulmones de animales removidos 6 días después del desafío con 1 x 106 UFP de hMPV, fueron fijados en paraformaldehido y e incluidos en parafina y cortes de 7 μιη fueron teñidos con hematoxilina y eosina. Se observa una significativa infiltración de células polimorfas nucleares en animales no inmunizados o inmunizados con rBCG-M2.1- hMPV o BCG-WT. Sin embargo, no se observan signos de inflamación en pulmones obtenidos de animales inmunizados con rBCG-P-hMPV. Las imágenes son representativas de seis experimentos independientes. HSP representa la cuantificación de una puntuación de inflamación por grupo de animales (Histopathology Score). Se puede apreciar que la inflamación en animales inmunizados con rBCG-P-MPV e infectados fue muy baja o inexistentes, similar a lo apreciado en animales no infectados.
Figura 5. La inmunización con rBCG-P-hMPV produce un perfil de citoquinas tipo Thl.
Para determinar cuál es el tipo de respuesta inmune responsable de la inmunidad por rBCG-P- hMPV, se analizó el perfil de citoquinas de células de bazo de BALB / cj inmunizados con la cepa BCG recombinante para proteína P de hMPV (rBCG-P-hMPV, en los gráficos: rBCG- P). Se recuperó el bazo de cuatro ratones BALB / cj inmunizados con rBCG-P-hMPV y las células de bazo se estimularon durante 7 días por incubación con 10 μg de proteína P-hMPV o PBS (en los gráficos U/S). Como control, las células de bazo de BALB / cj inmunizados con BCG- WT se cultivaron en las mismas condiciones. El sobrenadante de las células de bazo de rBCG-P-hMPV y BCG-WT estimuladas y no estimuladas se les determinó por ELISA los niveles de (A) IFN-γ, (B) IL-2, (C) IL-5 y (D) IL-4 a los días 4 y 7 de cultivo. Las células de bazo derivadas de rBCG-P-hMPV estimuladas con proteína P-hMPV (rBCG-P) secretan cantidades significativamente mayores de IFN-γ en comparación con células provenientes de animales inmunizados con BCG-WT o células no estimuladas (rBCG-P U/S) (*** p <0,001, prueba t de Student), Figura 5 A. Además, las cantidades de IFN-γ aumentaron entre el día 4 a 7 (* p <0,05, prueba t de Student), Figura 5 A. Las células de bazo estimuladas, de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV (rBCG-P) producen cantidades significativamente mayores de IL-2 al 4 día respecto de células no estimuladas (rBCG-P U/S) y disminuyó al nivel basal en el día 7 (**, p <0,001; ns = no significativo prueba t de Student), Figura 5 B. Las células de bazo secretaron cantidades bajas de IL-5 e IL-4 sin mostrar incremento respecto de células de bazo provenientes de BCG-WT o no estimuladas (ns = prueba no significativa t de Student), Figura 5 C.
Figura 6. Transferencia de Linfocitos T de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV confieren resistencia a la infección por hMPV en ratones na'ive. Se purificaron linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ desde esplenocitos estimulados y no estimulados con proteínas recombinantes virales. Se transfirió independientemente a través de la vena caudal de ratones nai've, dos millones de linfocitos T CD4+ o CD8+, estimulados o sin estimular provenientes de animales inmunizados con rBCG-P-MPV o BCG-WT. Veinticuatro horas después de la transferencia, los ratones fueron infectados vía intranasal con lxlO6 ufp de hMPV. En la Figura 6A los ratones transferidos con linfocitos T CD4+ y/o CD8+ de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV no muestran ninguna diferencia en el peso corporal en comparación con los ratones no infectados. Por el contrario se observa que los ratones transferidos con linfocitos T CD4+ y/o CD8+ de ratones inmunizados con BCG-WT, perdieron significativamente más peso tras la infección, en comparación con los animales no infectados (p <0,0001) (Figura 6B). La figura 6C muestra que en el lavado bronco alveolar, BAL, de ratones nai've previamente transferidos con linfocitos T CD4+ y/o CD8+ de ratones inmunizado con rBCG-P-hMPV (P-CD8, P-CD4, P-CD8/4), presentan una infiltración significativamente menor de granulocitos en comparación a ratones transferidos con linfocitos T de BCG-WT (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4) (*** p «3,0001, prueba t de Student). La infiltración de granulocitos en BAL de ratones transferidos con linfocitos T de BCG-WT o no inmunizados no muestran diferencias significativas con infiltración de ratones que no recibieron linfocitos T (NS = no significativo, prueba t de Student). La Figura 7D muestra que la carga viral en los pulmones de ratones transferidos con linfocitos T (P-CD8, P-CD4, P- CD8/4) provenientes de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV, fue baja en comparación con la carga viral de ratones transferidos con linfocitos T (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4) de animales inmunizados con la cepa BCG-WT y sin inmunizar (***, p <0,0001, prueba t de Student). En los pulmones de ratones transferidos con linfocitos T de BCG-WT (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4), la carga viral no muestra diferencias significativas con los ratones sin inmunizar (ns = no significativo, prueba t de Student). La carga viral se cuantificó como copias génicas de N-hMPV por RT-qPCR, como se describió anteriormente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención consiste en una formulación inmunogénica contra hMPV que comprende una cepa BCG recombinante que expresa la proteína P del Metapneumo virus humano. Esta formulación otorga protección efectiva contra infecciones por hMPV y no genera una respuesta de hiper reactividad inflamatoria.
La formulación de la invención se puede suministrar sola o mezclada con otras vacunas, como por ejemplo con una formulación inmunogénica contra VRS, en una dosis mixta que entregaría protección contra la infección y/o las complicaciones asociadas a hMPV y VRS.
La formulación inmunogénica detallada en esta invención puede ser utilizada para preparar vacunas que contengan bacterias recombinantes vivas atenuadas, provenientes de cultivos axénicos en dosis de entre lxlO4 ufe a lxlO10 ufe por dosis, especialmente se prefieren dosis de 1x10s ufe por dosis. La formulación se presentará liofilizada con una solución reconstituyente que no necesita adyuvante, pues la composición de la envoltura celular de la bacteria recombinante es el adyuvante. La formulación inmunogénica liofilizada de la invención se debe conservar entre 4 y 8o C, protegida de luz solar directa e indirecta, en presentación de dos frascos separados, uno con la bacteria recombinante liofilizada, y otro con la solución salina reconstituyente, a mezclar previa a su administración. Desde su introducción en 1921, la vacuna basada en Mycobacterium bovis bacillus Calmette- Guerin (BCG) se ha utilizado en más de mil millones de personas y se utiliza actualmente alrededor del mundo contra la tuberculosis.
Los inventores han encontrado que una manera de desplazar el equilibrio de la respuesta inmune desde una respuesta de tipo Th2 pro inflamatoria cuya protección no es duradera en el tiempo hacia una respuesta de tipo Thl basada en células, específicamente células T CD8+ citotóxicas y células T CD4+ helper es utilizar adyuvantes como los componentes de la pared celular de Mycobacterium. Específicamente, expresar la proteína inmunogénica de hMPV en Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG).
Las proteínas F y G de hPMV se encuentran en la superficie de la partícula viral y por lo tanto son accesibles a anticuerpos circulantes. Por esta razón dichas proteínas serían la elección más obvia para realizar una vacuna basada en la producción de anticuerpos para prevenir una infección por hMPV.
No obstante lo anterior, en la presente invención se ha escogido utilizar como inmunógeno proteínas de la cápside no expuestas, específicamente la proteína P, acompañada de un adyuvante que promueve una respuesta basada en células de tipo Thl, como es la bacteria atenuada Mycobacterium bovis BCG. Se ha visto que proteínas de la cápside como M2.1 de hMPV promueven la activación de linfocitos citotóxicos (LTC). Sorprendentemente, en la presente invención se describe que el uso de la proteína P, una proteína no expuesta del virus hMPV al ser utilizada como proteína inmunógena, expresada por Mycobacterium permite formular una composición inmunogénica que, al ser utilizada como vacuna o composición inmunogénica, otorga una protección efectiva sin efectos secundarios indeseados tales como hiper-reactividad inflamatoria
Las proteínas recombinantes expresadas por la bacteria vector utilizada en esta invención se obtiene mediante la clonación de los genes que las codifican provenientes del virus hMPV del grupo A en vectores de expresión procariontes, todos disponibles comercialmente. El genoma de Metapneumo virus (hMPV) ha sido descrito con anterioridad y se encuentra disponible en las bases de datos de GeneBank, número de acceso: AB503857.1, DQ843659.1, DQ843658.1, EF535506.1, GQ153651.1, AY297749.1, AY297748.1, AF371337.2, FJ168779.1, FJ168778.1, NC_004148.2 y AY525843.1. La obtención de la cepa bacteriana recombinante descrita en esta invención, considera la expresión heterologa de las proteínas virales durante la replicación bacteriana en el hospedero. Las secuencias de DNA heterólogo se integran al DNA cromosómico bacteriano mediante el vector de expresión pMV361. Estas proteínas de hMPV pueden ser modificadas genéticamente, como por ejemplo, mediante la incorporación de secuencias peptídicas o dominios de glicosilación y/o posterior destinación a receptores endocíticos o fagocíticos de células presentadoras de antígeno, mediante su acoplamiento a ligandos naturales mediante el uso del sistema biotina-estreptavidina (utilizando para ello kits comerciales de biotinilación y modificación genética de las proteínas virales mediante acoplamiento a la proteína bacteriana estreptavidina, o bien, mediante la introducción de la secuencia genética codificante de secuencias aminoácidicas descritas como señales de biotinilación en las proteínas o fragmentos proteicos recombinantes, utilizando técnicas previamente descritas para sistemas de expresión heterologa procarionte y/o eucarionte) .
La formulación inmunogénica de la invención comprende la expresión de la proteína P de hMPV ya sea completa o un fragmento inmunogénico de la misma, en una cepa atenuada de Mycobacterium. Especialmente se prefiere que la cepa de Mycobacterium recombinante atenuado se derive de la cepa Bacillus Calmette-Guerin (BCG). La proteína P de hMPV puede corresponder a la proteína P de Metapneumo virus de los subtipos A o B.
La cepa atenuada de Mycobacterium recombinante de la invención puede contener las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la proteína P de hMPV o su fragmento inmunogénico insertado en el genoma de la bacteria o en un plásmido extracromosomal, en una o más copias. La expresión de la proteína puede estar bajo el control de promotores constitutivos o inducibles, endógenos o exógenos de Mycobacterium BCG.
La proteína P de hMPV o su fragmento inmunogénico puede expresarse en forma soluble, soluble-citoplasmática, como proteína extracelular secretada, o unida a membrana.
La formulación inmunogénica de la invención puede comprender dos o más cepas atenuadas recombinantes de Mycobacterium, y en el que las proteínas o fragmentos inmunogénicos de proteína P de hMPV de las cepas se expresan para generar un número diferente de copias, se expresan constitutivamente o inducibles, y / o están ubicados en diferentes localizaciones celulares. La formulación inmunogénica que se divulga en la presente invención puede ser utilizada en conjunto con formulaciones inmunogénicas que contienen otras formulaciones antigénicas contra virus diferentes de hVRS y hMPV, con cepas atenuadas de BCG y vacunas estacionales contra influenza A y B.
La formulación inmunogénica anteriormente descrita puede ser aplicada al individuo de forma subcutánea/subdérmica en conjunto con una solución salina tampón (PBS, tampón fosfato de sodio) o fisiológica.
Para desarrollar la bacteria recombinante Mycobacterium que expresa la proteína P de hMPV, en primer lugar debe generarse un vector que exprese dicha proteína. Puede utilizarse cualquier vector de expresión micobacteriano conocido, y debe insertarse el gen que codifica para la proteína P del virus hMPV en fase con su región promotora. En una realización preferida se realiza una transcripción reversa con partidores universales desde el RNA de metapneumo virus humano aislado. Posteriormente el gen de la proteína P se amplifica con partidores específicos (Figura 1A). El producto de amplificación se inserta en el vector de expresión. En la presente invención se ha utilizado el vector de expresión micobacteriano pMV361, generando el vector pMV361 -P-hMPV (Figura IB).
Una vez obtenido el vector se utiliza para transformar la cepa Mycobacterium, tal como Mycobacterium BCG. Para efectos de la invención puede utilizarse cualquier cepa BCG conocida, como por ejemplo BCG Danish o BCG Pasteur. El método de transformación puede ser cualquier método disponible, especialmente se prefiere electrotransformación. Posteriormente se deben seleccionar las células transformadas que expresan proteína P de hMPV.
Estas células recombinantes constituyen la formulación inmunogénica de la invención, la que se provee en cantidades de entre 104 a 109 UFC/dosis en un tampón salino farmacológicamente aceptable.
Adicionalmente la formulación de la invención puede formularse en combinación con cepas BCG recombinantes que expresen proteínas inmunogénicas de virus sincicial (VRS). En una realización preferida la bacteria recombinante BCG que expresa la proteína P de hMPV se provee en conjunto con bacterias recombinantes BCG que expresan proteínas N, P, M, F, M2 (ORF1 y 2), SH, G o L de VRS. En una realización más preferida la formulación inmunogénica de la invención se utiliza en combinación con una cepa BCG recombinante para el gen N de VRS. Especialmente se prefiere la combinación de BCG recombinante para el gen P de hMPV subtipo A y BCG recombinante para el gen N de VRS subtipo A.
En otra realización de la invención se transforma una cepa de BCG con un vector que expresa la proteína P de hMPV y posteriormente la célula transformada se vuelve a transformar con un vector que exprese una proteína de virus sincicial (VRS). La proteína de VRS se escoge entre N, P, M, F, M2 (ORF1 y 2), SH, G o L. Especialmente se prefiere transformar en primer lugar con un vector que expresa la proteína P de hMPV subtipo A, y en segundo lugar someter estas cepas transformadas a una segunda transformación con un vector que exprese el gen N de VRS subtipo A, obteniendo una cepa BCG que expresa simultáneamente las proteínas P de hMPV subtipo A y N de VRS subtipo A.
La formulación inmunogénica de la invención se puede proveer liofilizada en una presentación multidosis lista para reconstituirse en 1 mi de una solución salina adjunta, para obtener una solución lxlO9 ufe / mi de solución reconstituida. Cada 0,1 mi de solución resuspendida contendrá la dosis apropiada de 1x10s ufe para la administración.
Para preparar la solución liofilizada las cepas transformadas de la invención pueden suspenderse en cualquier solución de liofilización apropiada, por ejemplo se puede emplear el tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (w/v), Tyloxapol al 0,05% (w/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM. para luego ser liofilizada y conservada a 25°C.
La solución reconstituyente puede ser cualquier solución disponible en la técnica, en una realización se prefiere una solución diluida Sauton SSI (125 μg MgS04, 125 μg K2HP04, 1 mg L-asparragina, 12,5 μg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 mi de H20) a -80°C. En otra realización la formulación de la invención puede suspenderse en una solución de PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HP04; 1,47 mM KH2P04, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 80 0,02% a una concentración final de 108 bacterias por 100 μΐ y conservadas a -80°C. Ambos en presencia de un detergente no iónico como Tween®-80 al 0,1% o Tyloxapol al 0,05%.
La formulación de la invención debe mantenerse entre 4 a 8°C, antes y después de reconstituir, en todo momento alejada de la luz solar directa e indirecta y una vez reconstituida deberá eliminarse al final del día. Los siguientes ejemplos de la generación y uso de la formulación inmunogénica contra hMPV a base de la bacteria recombinante Mycobacterium que expresa proteínas virales son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el rango de producción o aplicación de la invención. Aunque en las siguientes descripciones se utilicen términos específicos, su uso es sólo descriptivo y no limitante.
EJEMPLOS
Ejemplo I: Generación de un vector recombinante permite la expresión de la pro teína P del hMPV en la bacteria Mycobacterium BCG.
A partir de RNA de metapneumo virus se amplificó la región codificante del gen P utilizando los siguientes partidores: P-hMPV_Fw: GAATTCATGTCATTCCCTGAAGGAAA (SEQ ID No 1) y P-hMPV_Rv: GAATTCCTACATAATTAACTGGTAAA (SEQ ID No 2), donde las secuencias subrayadas incorporan el sitio EcoRI en ambos extremos del producto de amplificación, Figura 1A. El vector micobacteriano pMV361 se linearizó en el sitio EcoRI, lo que permitió insertar la siguiente secuencia correspondiente al gen P de hMPV:
GAATTCATGTCATTCCCTGAAGGAAAAGATATTCTTTTCATGGGTAATGAAGCGGCAAAATTGGCAGAAGCTTTC CAAAAAT CATTAAGAAAACCTAGT CATAAAAGAT CT CAAT CTATTATAGGAGAAAAAGT GAACACT GTAT CT GAA AC AT T G GAAT T AC C T AC T AT C AGT AGAC C T AC C AAAC C GAC C AT AT T GT C AGAG C C GAAGT T AG C AT G GAC AGAC AAAG GT G G G G CAAT C AAAAC T GAAG C AAAG C AAAC AAT C AAAGT T AT G GAT C C T AT T GAAGAAGAAGAGT T T AC T GAGAAAAG GGTGCTGCCCTC C AGT GAT G G GAAAAC T C C T G C AGAAAAGAAGT T GAAAC C AT C AAC C AAT AC T AAA AAGAAG GT C T C AT T T AC AC C AAAT GAAC C AG GAAAATACAC AAAGT T G GAGAAAGAT G C T C T AGAC T T G C T T T C A GAC AAT GAAGAAGAAGAT G C AGAAT C C T CAAT C T T AAC C T T C GAAGAAAGAGAT AC T T C AT C AT T AAG C AT T GAA G C C AGAC T AGAAT C GAT T GAG GAGAAAT T AAG C AT GAT AT T AG G G C T AT T AAGAAC AC T C AAC AT T G C T ACAG C A G GAC C C AC AG C AG C AAGAGAT G G GAT C AGAGAT G CAAT GAT T G G C AT AAG G GAG GAAC T AAT AG C AGAC AT AAT A AAAGAAG C C AAG G GAAAAG C AG C AGAAAT GAT G GAAGAAGAAAT GAAC C AG C G GAC AAAAAT AG GAAAC G GT AGT GT AAAAT T AAC T GAAAAG G C AAAG GAG C T C AAC AAAAT T GT T GAAGAC GAGAG C AC AAGT G GT GAAT C C GAAGAA GAAGAAGAAC T AAAAGAC AC AC AG GAAAAT AAT C AAGAAGAT GAC AT T TAC C AGT T AAT T AT GT AG GAAT T C
(SEQ ID No 3)
La inserción del marco de lectura abierto del gen P de hMPV en el sitio EcoRI del vector pMV361 lo posiciona bajo el control del promotor hsp60 y dio origen a la construcción pMV361-P-hMPV (Figura IB). Ejemplo II: Formulación inmunogénica compuesta por 10 dosis de lxlO8 UFC cada una de la cepa BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A.
El gen P de hMPV subtipo A se encuentra inserto en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor endógeno constitutivo hsp60 de Mycobacterium BCG para la expresión de la proteína.
La cepa Mycobacterium BCG Danish (ATCC 35733) fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV361-P-hMPV, derivado del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), que se inserta una sola vez en el genoma de la bacteria. Este plásmido contiene el gen que codifica para la proteína P de hMPV subtipo A, el cual se expresa bajo el promotor endógeno y constitutivo del gen hsp60 de BCG. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron (a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 (4,9 g/L), suplementado) hasta OD6oonm=l, fueron centrifugadas a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HP04; 1,47 mM KH2P04, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 80 0,02% a una concentración final de 108 bacterias por 100 μΐ y se conservaron a - 80°C.
Del mismo modo, las cepas pueden resuspenderse en una solución volumen: volumen de lactosa 25% y Medio Proskauer y Beck suplementado con glucosa y Tween 80 (PBGT: 0,5 g asparragina; 5,0 g fosfato monopotasio; 1,5 g citrato de magnesio; 0,5 g sulfato de potasio; 0,5 mi Tween 80 y 10,0 g glucosa por litro de agua destilada) para luego ser liofilizada y conservada a 25°C.
Por Western blot, con el uso de anticuerpos para la proteína P de hMPV, puede observarse que esta cepa de BCG expresa de manera constitutiva la proteína P de hMPV subtipo A en el citoplasma (Figura 2A).
La inmunización de ratones BALB/c con una dosis subdérmica de 1 x 108 unidades formadoras de colonia (UFC) de rBCG-P-hMPV, a modo de vacuna, confiere protección de estos animales contra una infección intranasal con 106 unidades formadoras de placa de hMPV subtipo A (Figura 3). Se comparó el efecto de la vacuna de la invención, rBCG-P- hMPV, con una vacuna rBCG que expresa otra proteína de hMPV, la proteína M2, y con BCG sin transformar, como control se utilizó un grupo sin inmunizar, todos estos grupos se infectaron con hMPV por vía intranasal, también se incluyó un control sin inmunizar y sin infectar. Se analizó la variación de peso de los animales después de lainfección, los resultados se muestran en la Figura 3A. Ambas vacunas recombinantes BCG para proteínas P (*) y M2 (♦) de hMPV fueron protectoras en la pérdida de peso del animal posterior a la infección, obteniéndose un peso similar al animal sin infectar ( T ). Por otra parte los animales sin inmunizar ( >;¾,) o inmunizados con BCG silvestre (BCG-WT) (■), Live-hMPV ( is ) o UV- hMPV ( ) sufrieron pérdida de peso corporal del animal posterior a la infección.
Se analizó además la infiltración de células inmunes en las vías aéreas del animal posterior a la infección, parámetro indicativo del desarrollo de la enfermedad. Esto se analizó por el número de células infiltradas en la vía aérea (Figura 3B) y por las células infiltradas que al ser positivas para CDl lb y Grl corresponden a granulocitos (Figura 3C). En la Figura 3 B, se aprecia que sólo la vacuna de la invención rBCG-P-hMPV previno la infiltración de linfocitos en la vía aérea, obteniéndose una infiltración similar al animal sin infectar. Por otra parte los animales sin inmunizar o inmunizados con otras vacunas BCG silvestre (BCG-WT) o rBCG- M2-hMPV, sufrieron la infiltración de células inmunes en sus vías aéreas posterior a la infección. La vacunación con rBCG-M2 confirió una protección incompleta para la infiltración de células inmunes en las vías aéreas del animal.
Adicionalmente se analizó el número de copias de RNA del gen N-hMPV en las células de pulmón de los distintos grupos estudiados. Un mayor número de copias de RNA del virus hMPV es indicativo de una mayor infección, los resultados se normalizan por copias de β- actina. Los resultados se muestran en la Figura 3D. Se aprecia que el número de virus de hMPV, presentes en los pulmones de animales infectados no inmunizados es similar al de animales infectados inmunizados con BCG-WT, Live-hMPV o UV-hMPV, es decir, estas inmunizaciones no otorgarían protección. Se observa que la inmunización con rBCG-M2 otorgó una protección no completa. Por otra parte, en los animales infectados inmunizados con la vacuna de la invención rBCG-P prácticamente no se encuentra el virus, tienen resultados similares al grupo de animales no infectados. Esto comprueba que la formulación de la invención protege efectivamente contra la infección de hMPV. Ejemplo III: Formulación inmunogénica que consiste en 5xl07 bacterias de la cepa Mycobacterium BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A y 5xl07 bacterias de la cepa Mycobacterium BCG Danish recombinante para el gen N de VRS subtipo A.
En cada una de las bacterias que componen la formulación inmunogénica, los genes de hMPV y de VRS se encuentran insertos en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor endógeno constitutivo hsp60 de BCG y la expresión de la proteína es citoplasmática. La formulación inmunogénica se encuentra preservada en PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HP04; 1,47 mM KH2P04, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 80 0,02% a una concentración final de 108 bacterias por 100 μΐ y se conservaron a -20°C.
Cepas BCG Danish (ATCC 35733) fueron transformadas mediante electrotransformación con el plásmido pMV361-P de hMPV para dar la cepa de la invención rBCG-P-MPV, y adicionalmente un segundo grupo fue transformado con pMV361-N de VRS para obtener la cepa transformada rBCG-N VRS, estos plásmidos son derivados del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), los cuales se insertan una sola vez en el genoma de la bacteria. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado hasta ODÓOO nm =1, fueron centrifugadas a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en una solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HP04; 1,47 mM KH2P04, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 80 0,02% a una concentración final de 107 bacterias por 100 μΐ y se conservaron a - 20°C. Las cepas se resuspendieron en tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (w/v), Tyloxapol al 0,05% (w/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM, luego fueron liofilizadas y conservadas a 4°C. Por Western blot, con el uso de anticuerpos específicos para la proteína P de hMPV o la proteína y N de VRS, se observó que estas cepas de BCG Danish expresan de manera recombinate, la proteínas P de hMPV o N de VRS, subtipo A respectivamente (Figura 2). Una formulación inmunogénica comprendiendo ambas cepas transformadas conferirá inmunidad simultánea contra los virus hMPV y VRS. Ejemplo IV: Formulación inmunogénica de 104 bacterias de la cepa BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A.
Se transformó una cepa de BCG Danish con el gen P de hMPV subtipo A, de modo que el gen se insertó en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor endógeno inducible acr de BCG, el cual es activo en respuesta a óxido nítrico, baja concentraciones de oxígeno, y fases estacionarias de crecimiento. La expresión de la proteína es citoplasmática. La formulación inmunogénica se liofilizó en tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (w/v), Tyloxapol al 0,05% (w/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM y fue conservarse reconstutuida 25°C en solución diluida Sauton SSI (125 μg MgS04, 125 μg K2HP04, 1 mg L-asparragina, 12,5 μg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 mi de H20). Alternativamente las cepas transformadas pueden preservarse en una solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HP04; 1,47 mM KH2P04, pH 7,4) suplementado con Tween 80 0,02% y Glicerol 20% a una concentración final de 104 bacterias por 100 μΐ.
La cepa BCG Danish (American Type Culture Collection, www.atcc.org, ATCC number 35733) fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV361pac/P- hMPV, derivado del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), que se inserta una sola vez en el genoma de la bacteria. Este plásmido contiene el gen que codifica para la proteína P de hMPV subtipo A, el cual se expresa bajo el promotor endógeno e inducible del gen acr de BCG. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron (a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado) hasta ODóoo nm =1, fueron centrifugadas a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en una solución tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (w/v), Tyloxapol al 0,05% (w/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM. Finalmente se liofilizaron alícuotas de 1 mi con 104 bacterias y se conservaron a 25°C. Del mismo modo, las cepas pueden preservarse en una solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HP04; 1,47 mM KH2P04, pH 7,4) suplementado con Tween 80 0,02% y Glicerol 20% a una concentración final de 104 bacterias por 100 μΐ. Esta formulación inmunogénica confiere inmunidad contra el virus hMPV. Ejemplo V: Formulación inmunogénica que consiste en 109 bacterias de la cepa BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A.
El gen se encuentra inserto en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor exógeno del fago T7 de expresión constitutiva en cepas de BCG que co-expresen la polimerasa del fago T7. La expresión de la proteína es citoplasmática. La formulación inmunogénica se encuentra en una solución diluida Sauton SSI (125 μg MgS04, 125 μg K2HP04, 1 mg L-asparragina, 12,5 μg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 mi de H20) y fue conservada a-20°C, o puede encontrarse liofilizada y conservada a 4°C. Del mismo modo, las cepas pueden preservarse en una solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HP04; 1,47 mM KH2P04, pH 7,4) suplementado con Tween 80 0,02% y Glicerol 20% a una concentración final de 109 bacterias por 100 μΐ.
La cepa BCG Danish ATCC 35733 fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV361pT7/P-hMPV, derivado del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), que se inserta una sola vez en el genoma de la bacteria. Este plásmido contiene el gen que codifica para la proteína P de hMPV subtipo A, el cual se expresa bajo el promotor T7 activado por la expresión de la polimerasa del fago T7.
La cepa BCG resultante fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV26lAmP/PolT7, derivado del plásmido pMV261 (Stover et al., 1991), el cual reside extracromosomalmente en la bacteria en múltiples copias. En este plásmido la resistencia al antibiótico kanamicina ha sido reemplazada por la resistencia al antibiótico higromicina (Higr). La polimerasa T7 del fago T7 se encuentra bajo control del promotor constitutivo del gen hsp60 de BCG. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado hasta ODóoo nm =1, se centrifugaron a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en una solución diluida Sauton SSI (125 μg MgS04, 125 μg K2HP04, 1 mg L-asparragina, 12,5 μg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 mi de H20) y fue conservada a -80°C. Esta formulación inmunogénica confiere inmunidad contra el virus hMPV. Ejemplo VI: La inoculación de 108 bacterias de la cepa BCG Danish recombinante para gen P-hMPV en cualquiera de sus formulaciones inmunogénicas, protege del daño inmunopatológico.
La inoculación de la cepa recombinante BCG que expresa la proteína P de metapneumo virus en cualquiera de sus presentaciones protege de los signos y síntomas clínicos de la infección con la cepa A y B de hMPV. Disminuye la anorexia provocada por la fiebre y el malestar general (Figura 3A), además de la infiltración de las vías aéreas (Figura 3B 3C). También disminuye la replicación y diseminación de las cepas A y B hMPV (Figura 3D).
La inoculación de la formulación en cualquiera de sus presentaciones también disminuye significativamente las manifestaciones histopatológicas de la infección por las cepas A y B del hMPV. Los pulmones de los animales vacunados con la formulación demuestran una mucha menor infiltración de células inmunes, perdida de estructura e inflamación de los tejidos pulmonares respecto de animales no inmunizados o inmunizados con la cepa de tipo silvestre (Figura 4).
La inoculación de la formulación con la BCG recombinante que expresa la proteína P de hMPV en cualquiera de sus presentaciones genera una inmunidad basada en células que puede transferirse a individuos nai've mediante la recuperación y purificación de linfocitos T desde individuos donantes inmunizados (Figura 6).
Los ejemplos anteriores se hacen extensivos a formulaciones inmunológicas que contenga una cepa recombinante de Mycobacterium atenuada que exprese la proteína P de hMPV o parte sustancial de la misma, así como todas las combinaciones con formulaciones inmunológicas que contenga una cepa recombinante de Mycobacterium atenuada que exprese cualquiera de las proteínas NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1), M2 (ORF2), L, F o G de VRS. Así mismo los ejemplos se hacen extensivos a formulaciones inmunológicas que contienen una o varias cepas recombinantes de Mycobacterium atenuadas; donde dichas bacterias recombinantes contienen genes de proteínas, o fragmentos inmunogénicos de la proteína P de hMPV que se encuentre insertos ya sea en el genoma bacteriano o en plásmidos extracromosomales, en una o varias copias, y su expresión este comandada por promotores endógenos o exógenos, constitutivos o inducibles, expresadas, de forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a la membrana celular. Referencias
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Una formulación inmunogénica que confiere protección contra la infección por el metapneumo virus (hMPV) y/o atenúa la patogenicidad causada por hMPV, CARACTERIZADA porque la formulación comprende una o más cepas atenuadas de Mycobacteriumrecombinante en una cantidad que va de 104 a 109 bacterias (CFU/dosis) por cepa, donde cada cepa expresa la proteína P o un fragmento inmunogénico de la proteína P de hMPV, en un tampón salino farmacológicamente aceptable.
2. La formulación inmunogénica según la cláusula 1, CARACTERIZADA porque la cepa de Mycobacterium recombinante atenuado se deriva de la cepa Bacillus Calmette-Guerin (BCG).
3. La formulación inmunogénica según la cláusula 1, CARACTERIZADA porque el metapneumo virus comprende es del subtipo A, B o ambos subtipos.
4. La formulación inmunogénica según la cláusula 1, CARACTERIZADA porque las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la proteína P o fragmento inmunogénico de la proteína P de hMPV, se inserta en el genoma de una cepa atenuada de Mycobacterium o se inserta en un plásmido extracromosomal, en una o más copias, de tal manera que la proteína viral o fragmento inmunogénico se expresa a partir de las secuencias de ácidos nucleicos.
5. La formulación inmunogénica según la cláusula 1, CARACTERIZADA porque la formulación comprende dos o más cepas atenuadas recombinantes de Mycobacterium, y en donde cada una comprende dos o más cepas de Mycobacterium atenuada recombinante, y en donde cada una de las cepas expresa una proteína o fragmento inmunogénico de proteína P de hMPV en una ubicación diferente, ya sea como una forma soluble, soluble- citoplasmática, como proteína extracelular secretada, o unida a membrana.
6. La formulación inmunogénica según la cláusula 1, CARACTERIZADA porque las proteínas o fragmentos inmunogénicos derivan de la expresión de ácidos nucleicos que están bajo el control de promotores constitutivos o inducibles, endógenos o exógenos de Mycobacterium BCG.
7. La formulación inmunogénica de la cláusula 1, CARACTERIZADA porque dicha formulación comprende dos o más cepas atenuadas recombinantes de Mycobacterium, y en el que las proteínas o fragmentos inmunogénicos de la proteína P de hMPV de las cepas se expresan para generar un número diferente de copias, se expresan constitutivamente o inducibles, y / o están ubicados en diferentes localizaciones celulares.
8. La formulación inmunogénica de la cláusula 1, CARACTERIZADA porque la formulación se estabiliza por congelación, secado por congelación o el uso de una solución salina tamponada para la conservación antes de su uso.
9. La formulación inmunogénica según la cláusula 1, CARACTERIZADA porque la proteína o fragmentos inmunogénicos se expresan como proteínas citoplasmáticas solubles, se secretan extracelularmente, o están unidos a la membrana celular.
10. Método para la protección contra la infección por hMPV o patología provocada por hMPV, CARACTERIZADA porque comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica de la cláusula 1.
11. El método de la cláusula 10, CARACTERIZADA porque dicha formulación se administra por vía subcutánea, percutánea o subdérmica.
12. Una vacuna contra hMPV, CARACTERIZADA porque comprende una formulación inmunogénica de la cláusula 1.
13. La vacuna de la cláusula 12, CARACTERIZADA porque se formula para administración subcutánea, percutánea, o administración subdérmica.
14. La vacuna de la reivindicación 13, CARACTERIZADA porque las proteínas o fragmentos inmunogénicos de la proteína expresada es P de hMPV.
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