CN115461077A - 表达针对牛中的bRSV的人类呼吸道合胞病毒蛋白的BCG免疫原性制剂的新用途 - Google Patents

表达针对牛中的bRSV的人类呼吸道合胞病毒蛋白的BCG免疫原性制剂的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫原性制剂的新用途，该免疫原性制剂包含稳定在药学上可接受的盐水缓冲溶液中的浓度为104‑109个细菌之间的卡介菌(BCG)，其重组地表达人类呼吸道合胞病毒(hRSV，人正肺病毒)的至少一种蛋白质或免疫原性片段，以预防、治疗或减弱牛中的bRSV感染。

Description

表达针对牛中的bRSV的人类呼吸道合胞病毒蛋白的BCG免疫 原性制剂的新用途
技术领域
提出了用于制备针对牛呼吸道合胞病毒(bRSV，牛正肺病毒(bovineorthopneumovirus))的疫苗的免疫原性制剂，其中该制剂包括至少一种减毒的分枝杆菌(Mycobacterium)菌株，优选卡介菌(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株，其重组地表达hRSV的一种或多种蛋白质或免疫原性片段。
背景技术
人类呼吸道合胞病毒(hRSV)感染是导致全球婴儿和5岁以下儿童中的下呼吸道急性感染的主要原因之一。尚不清楚哪种类型免疫应答对消除和防止hRSV感染最为有效。天然hRSV感染诱导Th1和Th2之间的混合应答，导致有害的肺部炎症，并且没有诱导持久的记忆应答。假定认为，针对hRSV诱导的更平衡的Th1型免疫应答将产生更好的疾病转归和持久的免疫记忆。
牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介菌(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是世界范围内施用的用于预防肺结核的M.bovis疫苗株。M.bovis BCG诱导有效和持续的Th1型免疫应答。它具有出色的安全性并且常规性地向婴儿和5岁以下儿童施用。本发明人开发了表达hRSV核衣壳的核蛋白(N)的BCG的重组株(rBCG-N-hRSV)，该重组株在WO2009/039178专利家族中受到保护。
用rBCG-N-hRSV的疫苗接种诱导针对hRSV的特异性细胞和体液免疫，保护小鼠免受与hRSV相关的肺损伤，并减少在攻击之后肺组织中的病毒载量。这是该种类开发的首款用于新生儿的疫苗，并且有可能保护婴儿免受hRSV感染和结核病两者。这种疫苗正处于批准用于人类尤其是新生儿的最后阶段。
另一方面，尽管在基因上与hRSV相关，并代表了幼牛(牛)发病的重要原因，但是牛RSV(bRSV)是一种不同于hRSV的病毒。犊牛的bRSV感染与人类新生儿的hRSV感染有许多相似之处，包括相似的年龄相关的易感性、季节周期性、宏观和微观病理以及先天和适应性免疫应答。新生犊牛由于它们的免疫系统不成熟，严重的bRSV感染的风险特别高，类似于在人类婴儿中的发生。
令人惊讶的是，本发明人发现针对hRSV开发的疫苗(rBCG-N-hRSV)保护新生犊牛对抗bRSV感染。
由于在两种病毒之间的差异，基于感染人类的病毒开发的疫苗能否为牛提供对抗bRSV的保护尚不明显或不可预测。正如我们稍后将详细说明的，本发明的疫苗是包含表达hRSV的至少一种蛋白质或免疫原性片段的浓度在每剂1x104至1x109菌落形成单位之间的卡介菌(BCG)菌株的制剂。
在现有技术中，已经开发了一些针对bRSV的疫苗，其与本发明中使用的疫苗不同，因为本发明的疫苗最初是为人类以及针对hRSV开发的。
例如，Zhang,Baoshan等人(Protection of calves by a prefusion-stabilizedbovine RSV F vaccine.npj Vaccines,2017,vol.2,no 7,p.1-11)，公开了使用bRSV F蛋白作为抗病毒成分的针对bRSV的疫苗。根据本发明人，他们依赖于为人类配制的带有hRSVF蛋白的疫苗，并组合使用基于结构的设计、抗原a表征和X射线晶体学来转化hRSV F在牛环境中的稳定。该公布公开了具有共价融合亚基的牛呼吸道合胞病毒的F蛋白的DS2稳定版本，消除了融合肽以及模拟通过突变实现的预融合构象。该蛋白在实验室中被针对融合前的bRSV F蛋白而获得的特异性抗体识别。结果表明，用DS2稳定的bRSV F免疫原可以在原生宿主中诱导针对RSV的高度保护性免疫，对犊牛的bRSV的预防有意义。
可以看出，对这项工作的作者来说，为人类开发的疫苗必须适应于对牛使用，并且这是他们所遵循的策略，这与本发明所做的相反。
附图说明
图1接种rBCG-N-hRSV的犊牛的bRSV疾病的症状减少。显示的结果来自以下组：未接种疫苗、未感染的对照组；接种rBCG-N-hRSV、未感染；未接种疫苗、感染bRSV；接种rBCG-N-hRSV并且感染bRSV。通过气溶胶接种使犊牛感染bRSV375菌株。每天由一名盲观察者对所有四组中的犊牛进行监测，并使用实施例中描述的标准进行临床评分。对照组一头未接种疫苗的感染bRSV的犊牛；因严重疾病的体征在第6天被安乐死。数据表示±SEM。*p<0.05由重复测量的2因素ANOVA，然后是Sidak多重比较检验而确定。
图2消除鼻拭子、BAL和肺中的病毒和肺病毒载量。(A)于感染bRSV后第0、2、4和7天采集鼻拭子。对样品进行分样和分析，用于病毒分离。(表1)和通过qPCR对bRSV基因NS2进行病毒定量。还通过qPCR针对NS2基因分析支气管肺泡灌洗液(BAL)(B)和肺组织样品(C)。使用标准曲线计算病毒NS2拷贝数。肺组织和BAL样品由S9基因归一化，以纠正输入材料中的差异。每组数据点代表±SEM。在未感染的对照犊牛样品中未检出病毒NS2。未接种疫苗与接种rBCG-N-hVRS的动物之间无显著性差异。
具体实施方式
本发明包括可以用于制备疫苗的免疫原性制剂，该疫苗在牛中，特别是在犊牛中诱导针对由牛呼吸道合胞病毒(bRSV)引起的感染的保护，或减弱由这种病毒引起的病理学状态。本发明的疫苗包含活的重组且减毒的分枝杆菌菌株，优选卡介菌(BCG)，例如以重组或异源方式表达一种或多种hRSV的蛋白质或免疫原性片段的Danish或Pasteur BCG菌株。本发明的疫苗包括1x104-1x109个菌落形成单位(CFU)的以剂量描述的菌株，并且在施用前可以以冻干形式或在冷稳定盐水溶液中保存。
在用于本发明免疫学制剂的适当溶液中的稳定疫苗的实例是：
-在4℃的Sauton稀释溶液SSI(125μg MgSO4、125μg K2HPO4、1mg L-天冬酰胺、12.5μg柠檬酸铁铵、18.4mg 85％甘油、0.5mg柠檬酸，在1ml H2O中)，
-在-80℃补充有0.02％吐温80和20％甘油的PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mMNa2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)，或者
-溶液体积：25％体积乳糖以及补充有葡萄糖和吐温80的Proskauer和Beck培养基(Proskauer and Beck Medium)(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml吐温80和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)，冻干并在4℃至25℃的温度范围下储存。
本发明的免疫原性制剂的减毒的重组的分枝杆菌细菌包含编码hRSV A或hRSV B亚型或者两者的hRSV的至少一种蛋白质或免疫原性片段的基因。呼吸道合胞病毒的基因组先前已经在GeneBank数据库中描述，登录号为NC_001803和NC_001781。
本发明的编码hRSV A或hRSV B亚型或者两者的hRSV的至少一种蛋白质或免疫原性片段的基因与所述基因库公开的序列中描述的基因(登录号为NC-001803和NC-001781)具有至少80％的同一性。
hRSV的蛋白质或免疫原性片段对应于RSV的NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白。在优选的制剂中，蛋白质或免疫原性片段对应于hRSV的N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G。
为了获得本发明的重组菌株，将编码这些蛋白质或它们的免疫原性片段的基因插入到质粒中，将质粒通过任何可用的技术掺入细菌中。在一种制剂中，使用质粒，将质粒通过电转化掺入到细菌中，并且通过分枝杆菌噬菌体整合酶的作用而整合到细菌基因组中。这些基因也可以插入到染色体外质粒中，其通过电转化掺入分枝杆菌中并在细菌中保持在染色体外。这些基因可以是一个或多个拷贝，并且它们的表达是组成型或诱导型的，受BCG内源性启动子的控制，例如分别为hsp60基因的启动子和acr基因的启动子。这些hRSV的蛋白质或免疫原性片段可以由BCG或其他减毒的分枝杆菌菌株表达为胞质可溶的形式、分泌至细胞外的或作为与细胞膜结合的蛋白质，这是由于呼吸道合胞病毒基因或具有编码充当朝向不同细菌区室的蛋白质的目的地信号的肽的DNA序列的免疫原性片段的使用，例如，α-抗原的基因的N-末端序列，其用于细胞外分泌，以及19kD蛋白的基因的N-末端序列，其用于膜结合蛋白。
本发明中公开的免疫原性制剂可以连同包含一种或多种减毒的分枝杆菌或BCG菌株并且在下列方面不同的免疫原性制剂一起使用：它们表达的hRSV的免疫原性蛋白质，以及基因定位(插入到基因组中或者处于染色体外)，蛋白质基因的拷贝数，诱导蛋白质表达的启动子，或者hRSV的蛋白质或免疫原性片段的目的地(胞质可溶的、分泌至细胞外的或附着在细胞膜的蛋白质)。
本发明人已经示出，本发明的疫苗诱导Th1型免疫应答，其包括产生抗体的IgG2a同种型的B淋巴细胞的两者，作为产生IFN-γ的T淋巴细胞的有效应答。这保证了针对这些病毒的体液保护以及增强本发明的免疫原性制剂的有效性和适用性两者的有效细胞应答。
可以将本发明的疫苗与缓冲或生理盐水溶液一起真皮下施用给个体。
本发明的免疫原性制剂可以用于向牛，尤其是之前未接触过bRSV的那些牛进行疫苗接种，以在未来赋予针对这一病毒的保护或减弱由所述病毒引起的病理学状态。
以下实施例扩展至包含表达hRSV的NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白的减毒的分枝杆菌的重组菌株的免疫学制剂以及这些制剂的所有组合。同样，这些实施例扩展至包含一种或多种减毒的BCG的重组菌株的免疫学制剂；其中，这些重组细菌包含编码以一个或多个拷贝插入细菌基因组或染色体外质粒中的hRSV的蛋白质或免疫原性片段的基因，并且它们的表达受内源性或外源性启动子控制，是组成型或诱导型表达的、胞质可溶的、分泌到细胞外的或作为与细胞膜结合的蛋白质。
从这些实施例中可以看出，本发明人对之后接受bRSV攻击的犊牛测试了疫苗。总之，临床疾病、肺病理学和BAL细胞学(支气管灌洗)的结果表明，接种rBCG-N-hRSV的犊牛没有出现任何疫苗增强型疾病的症状，提示rBCG-N-hRSV在新生牛中使用是安全的。此外，我们观察到接种和未接种疫苗的动物之间的临床疾病显著减少，以及中性粒细胞浸润到肺中的减少，证明rBCG-N-hRSV可以针对新生犊牛bRSV感染提供保护。
以下实施例对本发明的应用是示例性的而不是限制性的。
实施例
实施例I：由对于hRSV亚型A的N基因而言重组的BCG Danish菌株的108个细菌组成 的免疫原性制剂。
将该基因以单个拷贝插入到细菌基因组中，受BCG的组成型内源性启动子hsp60的调控，并且以胞质方式表达出蛋白质。该免疫原性制剂可以于-80℃存在于Sauton稀释溶液SSI(在1ml的H2O中的125μg MgSO4、125μg K2HPO4、1mg L-天冬酰胺、12.5μg柠檬酸铁铵、18.4mg 85％甘油、0.5mg柠檬酸)中。该制剂还可以以108个细菌/100μl的终浓度存在于补充有20％甘油和0.02％吐温80的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mMKH2PO4，pH 7.4)中，并于-80℃储存。类似地，可以将菌株重悬浮于溶液体积中：25％体积乳糖以及补充有葡萄糖和吐温80的Proskauer和Beck培养基(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml吐温80和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)，然后冻干并于25℃储存。
通过电转化用衍生自pMV361质粒的pMV361/N质粒转化BCG Danish菌株，所述质粒仅插入到细菌基因组中一次。该质粒包含编码hRSV亚型A的N蛋白的基因，该基因在内源性启动子下表达并且由BCG hsp60基因组成。使所得到的重组的菌落于37℃在补充的Middlebrock 7H9培养基中成长到OD600nm＝1，在4,000rpm/20min下离心(eppendorf转子5702/R A-4-38型)，并且以108个细菌/100μl的终浓度重悬浮在补充有20％甘油和0.02％吐温80的PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.47mM KH2PO4，pH 7.4)中，并于-80℃储存。类似地，可以将菌株重悬浮于溶液体积中：25％体积乳糖以及补充有葡萄糖和吐温80的Proskauer和Beck培养基(PBGT：0.5g天冬酰胺；5.0g磷酸二氢钾；1.5g柠檬酸镁；0.5g硫酸钾；0.5ml吐温80和10.0g葡萄糖/升蒸馏水)，然后冻干并于25℃储存。通过蛋白质印迹，使用RSV的N蛋白的抗体，本发明人观察到该BCG菌株在细胞质中重组地表达RSV亚型A的N蛋白。
实施例II：由hRSV的BCG-N赋予的针对牛bRSV感染的保护。
为了确定由rBCG-N-hVRS疫苗提供的针对牛bRSV的保护作用，对19头初乳饲喂的新生荷斯坦牛进行了评价。将犊牛分为4组：
1)未接种疫苗、未感染的对照(2个动物)
2)接种rBCG-N-hRSV、未感染(5个动物)
3)未接种疫苗、用bRSV感染(6个动物)
4)接种rBCG-N-hRSV、用bRSV感染(6个动物)
第2组和第4组犊牛在5日龄时在右侧颈部皮下接种悬浮于500μL的无菌生理盐水中的106CFU的rBCG-N-hRSV。对照组犊牛未接种疫苗。第2组和第4组的犊牛初次接种疫苗之后两周，在右侧颈部接受疫苗加强剂(booster)，悬浮于500μL的无菌生理盐水中的106CFU的rBCG-N-hRSV。
对于攻击，动物以具有bRSV 375菌株的5ml/鼻内气溶胶接种，浓度为104TCID50/mL的bRSV 375(TCID：组织培养感染剂量)。稀释病毒至它感染50％的培育中细胞。
感染后，每日监测所有动物的体温以及临床体征，包括食欲、呼吸速率、咳嗽、流鼻涕和眼睛分泌物以及肺听诊。
一名充当盲人的训练有素的观察者每天对犊牛进行一次临床疾病进行评定。记分卡根据发热和临床体征的严重程度分配数字(0-3)。在我们的记分卡中，我们包括了两个额外的类别，呼气用力(0＝毫不费力到3＝明显用力)和听诊肺音(0＝清晰、1＝喘息和噼啪声)。每个类别的评分加在一起，以确定总临床评分，最大可能得分为18分。特别地，>72小时在超过3个类别中得到3分的动物将被安乐死，以最大限度地减少不必要的悲痛和痛苦。
接种疫苗后每隔一周收集一次鼻液样品，并在用bRSV攻击后的第0、2、4和6天用1ml的无菌生理盐水湿润的无菌聚氨酯海绵片收集鼻液样品。这些被插入犊牛的鼻孔中5-10分钟。然后取出海绵，放入管内，并且再另外加入1ml无菌生理盐水。通过挤压到5ml注射器的管腔中从每个海绵中回收液体。得到的鼻液被分成等份，并在-80℃下冷冻备用。
在疫苗接种后以及暴露于bRSV后第3天和第7天以规律间隔采集外周血单核细胞(PBMC)和血清。
第3组(未接种疫苗、用bRSV感染)的犊牛在感染后第4-5天开始出现显著的临床体征(图1)，包括发烧、嗜睡、流鼻涕和呼吸困难。由于发展的疾病的严重程度，一只动物在感染后的第6天被宰杀。接受rBCG-N-hRSV疫苗的犊牛(第4组)也出现了bRSV感染的迹象；然而，与第3组的犊牛相比，bRSV相关疾病的症状明显较低(图1)。重要的是，我们在作为对照的接种疫苗的犊牛中的任何一个都没有观察到疫苗增强疾病的迹象，在疫苗和那些用bRSV攻击的犊牛中也没有观察到疫苗增强疾病的迹象(图1)。
如所指示的，于感染后第0、2、4和7天从每个动物采集鼻拭子。于攻击后第7天对动物实施安乐死，并且获取肺组织样品和支气管肺泡灌洗液。对样品进行处理用于病毒分离，并且使用qPCR对NS2 bRSV基因进行分析。如表1中所示，在对bRSV攻击之前，没有从任何犊牛的鼻拭子中检测到病毒。bRSV感染之后，无论疫苗接种状态如何，在整个感染过程中，从第3组和第4组大多数动物的鼻拭子中分离到病毒。在感染后的第7天，在第3组(未接种疫苗)中分别从5/6和6/6头犊牛、在第4组(接种rBCG-N-hRSV)中从4/6头犊牛的肺组织样品和BAL中分离到bRSV。第1组或第2组的犊牛在任何时间均未检测到bRSV。
表1来自鼻、BAL液和肺组织样品的病毒分离结果。
Figure BDA0003914754710000081
此外，用qPCR对bRSV的NS2基因进行了定量分析，其揭示了在感染后的任何时间，在鼻拭子中存在的病毒数量方面在第3组和第4组之间没有显著差异(图2A)。同样，我们观察到在BAL或肺组织中的病毒载量方面在第3组和第4组之间没有显著差异(图2B和2C)。这表明，用疫苗治疗并不能消除感染，但它确实有助于免疫系统控制疾病的发展和严重程度。

Claims (12)

1.一种免疫原性制剂的用途，所述免疫原性制剂在药学上可接受的缓冲盐水溶液中以104-109个细菌之间的浓度包含卡介菌(BCG)菌株，所述菌株表达人类呼吸道合胞病毒(hRSV)的至少一种蛋白质或免疫原性片段，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述hRSV的蛋白质或免疫原性片段对应hRSV亚型A或hRSV亚型B或两种亚型，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述hRSV免疫原性蛋白质或片段属于由NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白组成的组，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
4.根据权利要求3所述的用途，其中编码所述hRSV的蛋白质或免疫原性片段的基因以一个或多个拷贝插入到分枝杆菌优选BCG的基因组中或染色体外质粒中，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
5.根据权利要求4所述的用途，其中蛋白质基因的表达由组成型或诱导型的分枝杆菌BCG的内源性或外源性启动子控制，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
6.根据权利要求1所述的用途，其中hRSV的免疫原性蛋白质或片段可以由BCG表达为胞质可溶的形式、分泌至细胞外的或作为与细胞膜结合的蛋白质，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述hRSV的蛋白或免疫原性片段对应hRSV亚型A的N蛋白，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述制剂可以连同其他免疫原性制剂一起使用，所述其他免疫原性制剂表达除VRSh的NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G之外的蛋白质或者免疫原性片段，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述制剂可以连同其他免疫原性制剂一起使用，所述其他免疫原性制剂在将免疫原性蛋白质或片段表达为可溶的、胞质可溶的、分泌至细胞外或与细胞膜结合的蛋白质的形式上不同，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
10.根据权利要求6所述的用途，其中，所述制剂还可以连同其他免疫原性制剂或者在hRSV蛋白质或免疫原性片段的基因的拷贝数方面不同，以及在hRSV蛋白质或免疫原性片段表达是受控的、组成型的或诱导型的方式上不同，并且进一步在hRSV蛋白质或免疫原性片段的目的地方面不同的制剂一起使用，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
11.根据权利要求6所述的用途，其中所述制剂可以通过冷冻、冷冻干燥或盐水缓冲液来稳定以在使用前用于储存，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述制剂可以在可接受的生理盐水中以真皮下施用，其特征在于，其用于制备用于预防、治疗或减弱牛中的牛呼吸道合胞病毒(bRSV)感染的疫苗。
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CL2007002710A1 (es) * 2007-09-20 2008-01-04 Univ Pontificia Catolica Chile Formulacion inmunogenica que confiere proteccion contra la infeccion o patologia causada por el virus respiratorio sincicial (vrs) que comprende una cepa recombinante atenuada de mycobacterium; y uso de la formulacion inmunogenica para preparar una vacuna para prevenir, tratar o atenuar infecciones del vrs.

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