KR101812951B1

KR101812951B1 - 근육 질환 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101812951B1
Application number: KR1020160052357A
Authority: KR
Inventors: 최인호; 이은주
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2017-12-28
Also published as: KR20170123114A

Abstract

본 발명은 마이오스타틴(Myostatin)의 특정한 아미노산에 파이브로모듈린(Fibromoduin)이 결합하여, 마이오스타틴과 2B형 액티빈 수용체(Activin receptor type IIB, ACVRⅡB)와의 결합을 방해함으로써 근육세포의 분화를 촉진하는 것을 확인한 것으로, 이를 기반으로, 근육 질환 치료제 스크리닝 방법, 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법, 근육 형성 보조제 스크리닝 방법 또는 근육 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

Description

근육 질환 치료제 스크리닝 방법{Screening method of agent for treating muscle disease}

본 발명은 마이오스타틴(Myostatin)의 특정한 아미노산과의 결합을 통해, 마이오스타틴과 2B형 액티빈 수용체(Activin receptor type IIB, ACVRⅡB)와의 결합을 방해하여, 근육세포 분화를 촉진시킬 수 있는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

근육 감소에 의한 질병인 근육감소증은 노화와 연관된 근육량의 손실로 정의되며, 이는 고령자에 있어서 중요한 결과를 초래하는 것으로 점점 더 인식되고 있는데, 그 이유는 근육감소증이 쇠약, 장애 및 이환과 연관될 수 있기 때문이다. 근육감소증의 유병률은 70세 미만의 사람들 사이에서의 13-24%로부터 80세 초과의 이들 사이에서의 50% 초과까지 증가한다. 근육감소증과 연관된 근육 쇠약은 피로, 독립적인 생활에 필요한 직무를 수행하는 능력의 감소 및 대퇴경부 골절과 같은 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 골절의 위험의 증가와 연관될 수 있는 것으로 알려져 있다.

더불어 근육 감소에 의한 또 다른 질병인 근위축증은 골격근 섬유의 진행성 퇴행에 의해 야기된다. 혈장막 또는 내부 막 내에 위치하는 여러 단백질 중 하나가 결핍되면, 수축 도중 손상의 가능성을 증가시키고, 결국 면역-적격 세포의 침윤을 동반한 심각한 국소 염증을 동반한 섬유 퇴행을 유발한다.

근위축증은 골격근 약화의 선택적 분포에 의해 임상적으로 구분되는, 유전성, 진행성 근육 장애의 그룹을 포함한다. 근위축증의 두 가지 가장 흔한 형태는 뒤센형(Duchenne) 및 베커(Becker) 위축증이고, 각각 Xp21 위치에 존재하는, 디스트로핀(dystrophin) 유전자 내의 돌연변이의 유전으로부터 야기된다. 다른 근위축증은 비제한적으로, 근위지대형(limb-girdle) 근위축증, 안면견갑상완형(fascioscapulohumeral)(Landouzy-Dejerine) 근위축증, 선천성(congenital) 근위축증, 근강직성 위축증 (myotonic dystrophy), 및 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss) 근위축증을 포함한다.

가장 심각한 형태는 뒤센형 근위축증으로, 재생은 소진되고, 골격근은 지방 및 섬유 조직에 의해 진행적으로 대체된다. 이 증상은 환자가 진행성 약화를 보이다가, 결국 호흡이나 심장 마비에 의한 죽음이 야기된다.

뒤센형 근위축증의 증상은 거의 남성에서만 한정적으로 발생하고, 약 3 내지 7세에 시작하여, 대부분은 환자들은 10세 내지 12세에는 휠체어로 이동을 하여야 하며, 약 20세에는 호흡 합병증으로 인해 많이 사망한다.

한편, 근위축증에 대한 가능성 있는 치료로서 시도된 여러 의약품 중, 프레드니손, 프레드니솔론 및 데플라자코르트(deflazacort)와 같은 코르티코스테로이드만이 일시적으로 개선하는 가능성을 보였다. 그러나 이는 진행 속도를 늦추거나 또는 근력 및 근육 기능을 안정화시키는 것에 주로 기인하므로 근본적인 치료제가 아니며, 코르티코스테로이드 요법도 부작용을 유발한다.

따라서, 근육감소증 및 근위축증의 원인인 근육 손실을 치료할 수 있는 치료법의 개발이 필요하다.

1. 한국등록특허 10-1122843호.

따라서 본 발명은 근육 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 근육 형성 보조제 스크리닝 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 근육 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 형성 보조제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 아미노산은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 Ala70, His57, Met101, Val22 및 Pro99로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 마이오스타틴(Myostatin)의 특정한 아미노산에 파이브로모듈린(Fibromoduin)이 결합하여, 마이오스타틴과 2B형 액티빈 수용체(Activin receptor type IIB, ACVRⅡB)와의 결합을 방해함으로써 근육세포의 분화를 촉진하는 것을 확인한 것으로, 이를 기반으로 근육 질환 치료제 스크리닝 방법, 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법, 근육 형성 보조제 스크리닝 방법 또는 근육 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

도 1은 분화에 따른 파이브로모듈린(fibromodulin, FMOD) 발현을 관찰한 결과이며, A는 FMOD mRNA 발현을 관찰한 것이고, B는 FMOD 단백질 발현을 관찰한 것이고, C는 FMOD 단백질 발현 및 발현 위치를 관찰한 것이다.
도 2는 FMOD 유전자의 넉-다운(Knock-down)에 따른 근관세포(myotube) 형성을 관찰한 결과이며, A는 FMOD 넉-다운에 따른 세포 모습을 관찰한 것이고, B는 정상세포와 FMOD 유전자를 넉-다운한 세포 간 융해지수(fusion index) 결과이고, C는 FMOD mRNA 발현을 관찰한 것이고, D 및 E는 FMOD 단백질 발현 및 위치를 관찰한 것이다.
도 3은 FMOD 유전자의 넉-다운에 따른 근육세포 분화관련 마커유전자의 발현을 관찰한 결과이며, A는 MYOD, MYOG(Myogenin), MYL2(Myosin light chain 2)의 mRNA 발현을 관찰한 것이고, B는 MYOD, MYOG, MYL2 단백질 발현을 관찰한 것이고, C는 MYOD, MYOG, MYL2 단백질의 발현 및 위치를 관찰한 것이다.
도 4는 FMOD 유전자의 넉-다운에 따른 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 발현을 관찰한 결과이며, A는 MSTN mRNA 발현을 관찰한 것이고, B는 MSTN 단백질 발현을 관찰한 것이고, C는 MSTN 단백질의 발현 및 발현 위치를 관찰한 것이다.
도 5는 인실리코(In silico) 분석을 통해 FMOD, MSTN, 2B형 액티빈 수용체(Activin receptor type IIB, ACVRⅡB) 단백질의 상호결합을 분석한 결과이며, A는 FMOD와 MSTN 결합을 확인한 것이고, B는 FMOD와 MSTN 결합에 따른 MSTN와 ACVRⅡB 결합을 관찰한 것이다.
도 6은 FMOD 유전자 넉-다운에 따른 FMOD와 MSTN 결합을 확인한 결과이며, A는 분화 2일 후 FMOD와 MSTN 단백질 결합을 관찰한 것이고, B는 FMOD 유전자를 넉-다운한 세포에서 FMOD와 MSTN 단백질의 결합을 확인한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 아미노산은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ala70, His57, Met101, Val22 및 Pro99로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함할 수 있다.

상기 MSTN은 TGF-β(Transforming growth factor-β) 패밀리에 속하는 단백질로서 근육분화과정에서 근육의 분화 및 성장을 억제하는 조절인자이며, 성장분화인자 8(growth differentiation factor 8, GDF-8)로도 알려져 있다. 마이오스타틴은 주로 골근 세포에서 생산되어 혈액을 통해 순환하여 근육 조직에 작용을 한다. 따라서 동물에서 마이오스타틴 유전자가 없거나 마이오스타틴의 활성을 억제하는 경우 근육이 증가할 것을 기대할 수 있다.

본 발명의 "MSTN"는 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 MSTN를 가지는 모든 진핵 생물 유래의 단백질일 수 있으며, 마우스 유래 NP_034964.1 중 서열번호 1의 하기 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다: DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS.

상기 물질은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 근육세포 분화를 촉진시킬 수 있으며, 상기 물질은 단백질, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 물질은 파이브로모듈린(fibromodulin, FMOD)일 수 있다.

상기 FMOD는 루이신이 풍부한 작은 프로테오글리칸 (SLRP) 족(family)의 일원이다. FMOD은 세포질 분비 단백질로서 주로 연골, 뼈, 결합조직 콜라겐이 풍부한 조직으로 발현되는 패턴을 가지며 원섬유형성(fibrillogenesis), 세포접착(cell adhesion) 및 사이토카인 활성 조절에 관여한다. 더불어 FMOD는 전환성장인자 (TGF)-β 아형(isoforms) 및 콜라겐들과 결합하여 세포외기질을 조절하는 것으로 보고된 바 있다.

본 발명의 "FMOD"는 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 FMOD를 가지는 모든 진핵 생물 유래의 단백질일 수 있으며, 마우스 유래 AAH52673.1 인 것이 바람직하다.

상기 근육 질환은 근육 감소증(sarcopenia), 근이영양증(muscular dystrophy), 경직성 척추 증후군(rigid spinesyndrome), 근육-눈-뇌병(muscle-eye-brain disease), 근위축증, 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 만성 염증성 신경증(chronic inflammatory neuropathy) 및 말단근병증(distal myopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 물질은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 가축의 근육세포 분화를 촉진시킬 수 있으며, 사료 첨가제의 용도로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 가축은 소, 염소, 양, 돼지, 말 및 토끼로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 보다 바람직하게는 소다.

또한, 본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 형성 보조제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 물질은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 근육세포 분화를 촉진시킬 수 있다.

또한 본 발명은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 물질은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 근육세포 분화를 촉진시킬 수 있으며, 상기 물질은 단백질, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 근육 분화 촉진용 조성물은 지방을 근육으로 바꿈으로써 지방을 감소시켜 비만의 개선 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.

상기 근육 분화 촉진용 조성물을 비만 치료를 위한 약학조성물로 사용할 경우 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제(연고), 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 근육, 경구, 직장 또는 정맥, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

더불어 상기 근육 분화 촉진용 조성물을 비만의 개선을 위한 건강기능식품으로 사용할 경우, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 근육 분화 촉진용 조성물 외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 실험방법

1. C2C12 세포배양

쥐의 근아세포주인 C2C12 세포는 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS, HyClone Laboratories)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin, P/S, Invitrogen)을 추가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, HyClone Laboratories)에서 배양하였다. 분화처리 유도를 위해 세포가 약 70% 이상 성장하였을 때 2% FBS와 1% P/S를 추가한 DMEM(분화배지)으로 교체하여 2일, 4일, 6일 동안 배양하였다. 배지는 2일에 한번 씩 교체하였으며 세포는 37℃에서 배양하였다.

2. FMOD 유전자 넉다운 (Knock-down)

C2C12 세포가 약 30% 정도 성장하였을 때 FMOD 유전자의 shRNA 구성물(construct) (1ng)을 형질주입(transfection) 시약(Santa Cruz Biotechnology)과 형질주입 배지(media)(Santa Cruz Biotechnology)에 같이 주입하였다. shRNA 구성물의 주입 후 2 μg/mL의 퓨로마이신(puromycin, Santa Cruz Biotechnology)을 처리한 후 주입된 세포만을 선별하였다. 선별된 세포를 약 70%까지 성장시킨 후 분화 배지로 교체하여 세포의 변화를 관찰하였다.

상기 FOMD 유전자의 shRNA 시퀀스는 하기 표 1과 같으며, 산타크루즈(Santacruz) 회사에서 구입하였고, 하기 3개의 시퀀스 조합을 통해 FMOD 유전자의 mRNA를 블럭킹(Blocking)하였다.

shRNA	Sequence			서열번호
FMOD	FMOD shRNA Plasmid (m) is a pool of 3 different shRNA plasmids			서열번호
	sc-44823-SHA	Hairpin sequence	GATCCCTACATGGCAACCAGATTATTCAAGAGATAATCTGGTTGCCATGTAGTTTTT	2
		Sense	CUACAUGGCAACCAGAUUAtt	3
		AntiSense	UAAUCUGGUUGCCAUGUAGtt	4
	sc-44823-SHB	Hairpin sequence	GATCCCTACTAGACCTGAGTTATATTCAAGAGATATAACTCAGGTCTAGTAGTTTTT	5
		Sense	CUACUAGACCUGAGUUAUAtt	6
		AntiSense	UAUAACUCAGGUCUAGUAGtt	7
	sc-44823-SHC	Hairpin sequence	GATCCGCAACAGGATCAATGAGTTTTCAAGAGAAACTCATTGATCCTGTTGCTTTTT	8
		Sense	GCAACAGGAUCAAUGAGUUtt	9
		AntiSense	AACUCAUUGAUCCUGUUGCtt	10

3. 김자 ( Giemsa ) 염색

세포의 배지를 제거하고 인산완충생리식염수(phosphate bufffered saline, PBS)로 세포를 세척하였다. 세척 후 1:1 부피비율의 메탄올(Methanol) : PBS 시약을 처리한 후 2분 동안 고정하였다. 추가적으로 2:1 부피비율의 메탄올 : PBS 시약을 첨가한 후 2분 동안 추가로 고정하였다. 2분 후 0.04% 김자 시약을 첨가한 후 30분 동안 방치하고 30분 후 PBS로 세척을 하고 세포의 모습을 현미경으로 관찰하였다.

4. 융해 지수(Fusion index)

세포의 근관세포(myotube) 형성을 관찰하기 위해 김자 염색을 진행한 후 세포사진을 3장씩 찍었다(300x). 찍은 사진에서 근관세포 내에서 융해(fusion)된 핵의 수를 세고, 총 세포의 핵 수를 센 후 융해된 핵 수를 총 세포의 핵 수로 나누어 % 값을 산출하였다.

5. RNA 추출 및 cDNA 합성

TRIzol™ 시약 1 ml을 첨가한 후 초고주파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄한 샘플을 원심분리한 후(12,000 rpm, 10분, 4℃) 상층액을 새 튜브에 옮기고 클로로포름 200 ul를 넣고 실온에 10분 동안 방치하였다. 그런 후 원심분리하여(12,000 rpm, 10분, 4℃) 투명색의 상층액을 수득하였다. 다음으로 이소프로판올(isopropanol) 500 ul를 넣고 10분 동안 방치하고 원심분리 하여 RNA 펠렛을 얻었다. RNA 펠렛에 70% 에탄올(에탄올 + 디에틸피로카르본산 (diethylpyrocarbonate, DEPC)가 처리된 증류수)을 첨가하여 세척한 후, 완벽하게 제거하고 건조시켰다. 건조된 투명색의 RNA에 DEPC가 처리된 증류수를 넣고 -80℃에 보관하였다. 전체 RNA 양은 나노드롭(Nanodrop)으로 측정하였으며, 1.2% 아가로즈 젤(Agarose gel)에서 18s, 28s 밴드를 확인하였다. cDNA는 1μg의 전체 RNA(total RNA)와 oligo-dT 프라이머, SuperScript™ Ⅱ RNase H 역전사효소(Reverse Transcriptase)와 함께 합성하였다(42℃: 50분, 72℃: 15분).

6. 유전자 발현 확인

유전자 발현 확인을 위해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 실시간 유전자 발현 관찰을 위해 SYBR 그린(green)의 형광물질을 포함한 Power SYBR^®Green PCR Master Mix를 이용하여 유전자 발현을 분석하였다(7500 real-time PCR system). PCR 프라이머는 NCBI GenBank에서 확보된 염기서열(nucleotide sequence)에 따라 Primer 3 software (http://frodo.wi.mit.edu)로 디자인하였다. PCR은 95℃에서 10분, 다시 95℃에서 33초, 유전자 프라이머 온도(tm)에 따라 33초, 72℃에서 33초 동안 40회 반응을 진행하였다. PCR 결과물은 전기영동(1.2 % 아가로즈 젤, 100 v 60분)을 통해 확인하였으며, 실시간 PCR 분석을 통해 나온 c(t) 값의 분석을 통해 유전자 발현 값을 분석하였다(fold change 2-^△△Ct formula). 처리하지 않은 세포의 유전자의 발현 값을 1로 두고 처리한 세포의 유전자 발현 값을 계산하였다. 유전자 c(t) 값 분석 시 평준화 (normalization)는 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 이용하였다.

상기 PCR 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다(MYOG (Myogenin), MYL2(Myosin light chain2), COL1α1(Collagen Type I Alpha 1)).

Species	Gene	Product size(bp)	Tm (℃)	Sequence	방향	서열번호
Mouse	GAPDH	155	55	5'-tgctggtgctgagtatgtcg-3'	정방향	11
				5'-caagcagttggtggtacagg-3'	역방향	12
	FMOD	155	59	5'-tgcagaagatccctcctgtc-3'	정방향	13
				5'-cttgatctcgttcccatcca-3'	역방향	14
	MSTN	163	59	5'-acgctaccacggaaacaatc-3'	정방향	15
				5'-ggagtcttgacgggtctgag-3'	역방향	16
	MYOG	185	59	5'-tccagtacattgagcgccta-3'	정방향	17
				5'-caaatgatctcctgggttgg-3'	역방향	18
	MYOD	213	59	5'-aggagcacgcacacttctct-3'	정방향	19
				5'-tctcgaaggcctcattcact-3'	역방향	20
	MYL2	177	59	5'-aaagaggctccaggtccaat-3'	정방향	21
				5'-cctctctgcttgtgtggtca-3'	역방향	22

7. 면역염색( immunocytochemistry )

배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 1번 세척하였다. 세척한 세포에 4% 포름알데히드(formaldehyde, Sigma)를 처리하여 15분간 세포를 고정한 후, PBS를 이용하여 세포를 세척하고 0.2% 트립톤(tipton) X-100 (Sigma)를 넣은 후 5분간 방치하였다. 다시 PBS를 이용하여 세척하고 인헨서 용액(enhancer sol.)을 넣고 30분간 방치한 후 1차 항체(FMOD, MSTN: 1:50, Santa Cruz Biotechnology)를 넣고 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 3번 세척한 후, 2차 항체(Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit SFX kit)와 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 세척한 후 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindol)로 핵을 염색하고 형광현미경을 이용하여 단백질의 발현을 관찰하였다.

8. 상호 면역침전(Co- immunoprecipitation )

상호 면역침전은 FMOD와 MSTN 항체를 이용하여 진행하였다. FMOD 유전자의 발현이 억제된 세포와 정상인 세포를 분화배지에서 2일 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 세포를 PBS로 세척하고 비변성 완충액(non-denaturing buffer, 20 mM Tris HCl(pH 8), 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA 포함)과 단백질분해효소 억제제(Thermo)를 넣어 세포를 용해시킨 후 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 200 μg을 3μg의 FMOD 또는 MSTN 항체와 4℃에서 16시간 이상 반응시켰다. 16시간 후 단백질 A 아가로즈(protein A agarose, Santa Cruz Biotechnology)를 넣고 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후 비변성 버퍼로 2번 세척한 후 FMOD 또는 MSTN 항체와 같이 웨스턴 블롯(Western blot)을 진행하였다.

9. 웨스턴 블롯

배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 세척한 세포에 RIPA 버퍼(Radioimmunoprecipitation assay buffer, Thermo)와 단백질분해효소 억제제(Thermo)를 넣은 후 세포를 용해하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 중 40 μg을 8 내지 10%의 아크릴아마이드 겔(Acrylamide gel)에서 전기영동한 후 PVDF 멤브레인(Polyvinylidene fluoride membrane, Milipore)에 옮겼다. 이를 3% 탈지유(skim milk)나 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블럭킹(blocking)하였다. 그런 후, 1% 탈지유 또는 BSA에 희석한 1차 항체(FMOD: 1:400, MSTN: 1:400, ß-actin: 1:1000, MYOD: 1:400. MYOG: 1:1000, MYL2: 1:1000)를 첨가하고 16시간 이상 4℃에서 반응시켰다. 16시간 후 TBST(Tween 20이 포함된 Tris-Buffered Saline)로 3번 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 TBST로 3번 세척하고 Thermo(Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate)를 넣어준 후 현상하였다.

10. 단백질 구조 예측

MSTN의 결정구조는 단백질 정보은행(protein data bank, PDB)에서 검색하였다(pdb id: 3HH2). PDB에서는 FMOD 및 2B형 액티빈 수용체(Activin receptor type IIB, ACVRⅡB)의 구조가 검색되지 않았으나, UniProt 데이터베이스에서 해당 아미노산 서열을 확인할 수 있었다(Q7TPZ1, P27040). 사람의 2형 액티빈 수용체 인산화 도메인 결정구조(pdb id: 2QLU)는 모델러(Modeller) 9v14를 이용한 ACVRⅡB의 모델을 만들기 위한 주형으로써 활용하였다. 5가지 다른 모델이 생성되면 도프 스코어(dope score, Discrete optimized protein energy)를 기준으로 가장 좋은 모델을 선정하였다. 활용할 수 있는 알맞은 주형이 없기 때문에, FMOD의 구조는 앱 이니시오 폴딩(ab initio folding)과 Ⅰ-TASSER (다중 쓰레딩 정렬(threading alignment)과 반복적인 구조조합 시뮬레이션을 이용하여 3D 원자 모델을 생성하는 프로그램)를 이용한 쓰레딩(Threading) 방법을 조합하여 생성하였다. 동족체(homologue)는 PDB 구조에서 서열 동일성(sequence identity)의 낮은 비율을 보이므로 FMOD에 대한 강력한 모델로 볼 수 없다.

따라서, 구조 예측의 “중요도 평가(최신의 구조 예측 모델들에 대한 객관적 평가를 제공하기 위해 설계된 전 세계적인 실험인 CASP7, CASP8)에 의해 인정된 최고의 단백질 모델을 제공하는 Ⅰ-TASSER 서버(http://www.zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)를 이용하였다.

11. 단백질-단백질 결합 상호작용분석

단백질-단백질 상호작용 연구는 MSTN과 MSTN의 수용체인 ACVRⅡB 사이의 결합을 조사하고 FMOD가 이 결합을 억제하는지 아닌지를 확인하기 위하여 수행하였다. MSTN과 ACVRⅡB의 단백질-단백질 상호작용은 PatchDock 서버 (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock)의 디폴트 세팅(default setting)을 사용하여 이루어졌다. 이 서버는 단백질-단백질간의 상호작용 연구에 있어 널리 이용되는 것으로 이것의 알고리즘은 엄격한 도킹에 의한 것이며 표면의 유연성은 분자간의 침투성을 사용하여 다루어진다. PatchDock 계산은 Fire Dock 알고리즘을 이용한 단백질-단백질 상호작용 에너지에 근거하여 점수화하여 더욱 더 개선된 단백질의 데카르트 좌표(Cartesian coordinates)의 3차원적 변형을 결과로 나타냈다. 가장 낮은 결합 에너지를 가진 복합체의 구조를 나중의 분석을 위한 최종 모델로 선택하였다.

< 실시예 2> 결과

1. 근육줄기세포 분화 동안 FMOD 유전자의 발현 증가 확인

근아세포주인 C2C12 세포에서 0일, 2일, 4일, 6일 동안 분화처리를 진행한 후 RNA와 단백질을 추출하여 분화에 따른 FMOD 유전자와 단백질 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과 분화 전 세포 (0일)에 비해 분화 2일째 세포에서 FMOD 유전자의 발현이 약 15배 정도 증가된 것을 관찰할 수 있었으며, 단백질 역시 비슷한 결과를 나타내었다(도 1).

2. FMOD 유전자 넉-다운 시 근관세포 형성 및 근육분화 마커 유전자 발현 확인

FMOD을 넉-다운하였을 때 근관세포의 형성 및 근육분화 마커유전자의 발현이 감소되었다.

근육분화에 따른 FMOD 유전자의 기능을 관찰하기 위해, FMOD 유전자의 넉-다운을 진행한 후 근관세포 형성과 근육분화 마커유전자의 발현을 관찰하였다. 정상세포와 FMOD 넉-다운한 세포에 분화처리를 진행한 후 근관세포 형성 정도를 관찰하였다. 그 결과, 정상세포에 비해 FMOD 유전자가 넉-다운된 세포에서 근관세포의 형성이 감소된 것을 관찰할 수 있었다(도 2). 더불어 FMOD 유전자가 넉-다운된 세포에서 근육분화 마커 유전자인 MYOD, MYOG (Myogenin), MYL2(Myosin light chain2) 유전자들의 발현도 정상 세포에 비해 감소하였다(도 3).

3. FMOD 유전자 넉-다운 시 MSTN 유전자 발현 확인

FMOD 유전자가 넉-다운된 세포에서 MSTN 유전자 및 단백질의 발현을 살펴본 결과, 정상세포에 비해 MSTN의 유전자 및 단백질의 발현이 증가하였다(도 4). 이를 통해 근육세포의 분화 동안 FMOD 유전자가 MSTN의 발현을 억제시킴으로써 근육분화를 조절한다는 것을 확인할 수 있었다.

4. FMOD에 의한 MSTN 발현 억제를 통한 근육분화 촉진 확인

FMOD 유전자가 어떻게 MSTN의 발현을 조절하는지 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

인실리코(In silico) 분석을 통해 근육세포의 분화 동안 FMOD 단백질과 MSTN 단백질과의 결합이 일어나게 되며, 이로 인해 MSTN과 ACVRⅡB와의 결합력이 감소하는 것이 관찰되었다. MSTN은 ACVRIIB 수용체와 결합을 하여 세포 내로 신호를 보내게 된다. MSTN의 결합에 따른 에너지 (global energy) 는 -56.99이며, 두 단백질이 결합을 하게 되면 아미노산 간 수소결합 (Hydrogen bonding)이 ACVRIIB 수용체 부위에는 6부위, MSTN 부위에는 6부위가 형성이 된다. 또한 소수성 작용의 경우 (Hydrophobic interaction) ACVRIIB 수용체 부위에는 20개 부위가, MSTN 부위에는 17개 부위가 형성된다(표 3). 하지만 MSTN 과 ACVRIIB 수용체 결합에 있어 FMOD가 MSTN와 결합할 경우 에너지가 -29.79로 변화하게 되어 결합효율(binding efficacy)이 감소하게 된다. 특히 FMOD 단백질이 MSTN 단백질과 결합한 경우 ACVRIIB 수용체의 아마노산 간 수소결합부위가 2개 부위로, MSTN의 수소결합부위가 2개 부위로 감소하게 된다. 또한, ACVRIIB 수용체의 소수성 작용에서도 2개 부위로, MSTN의 소수성 작용에서도 2개 부위로 감소하게 된다(표 4). 이는 FMOD의 단백질이 MSTN과 결합할 경우, MSTN이 ACVRIIB 수용체와 잘 결합하지 못하게 된다는 것을 의미한다.

복합체(complex)	관련된 잔기
	수소결합 (hydrogen bonding)		소수성 상호작용 (hydrophobic interaction)
	ACVR2B	MSTN	ACVR2B	MSTN
ACVRⅡB-MSTN	G57, E122, D261, E285, S289, R296	W31, S44, R67, G68, C76, T75	K59, H60, Y119, E122, K253, M255, R256, T258, I259, D261, L264, V274, E277, E278, D281, D283, E285, A286, S289, C292	L20, A26, F27, G28, W29, W31, Y42, R67, G68, S69, C73, T75, P76, M79, Y86, I98, A100

복합체		관련된 잔기
ACVRⅡB-MSTN-FMOD	ACVRⅡB-MSTN	수소결합		소수성 상호작용
		ACVRⅡB	MSTN	ACVRⅡB	MSTN
		K43, Q44	D30, E91	K71, S74	K90, E91
	ACVRⅡB-FMOD	수소결합		소수성 상호작용
		ACVRⅡB	FMOD	ACVRⅡB	FMOD
		D173, E190	S321, S359	R19, F20, Q41, H175, Q177, A192, N194	R293, G294, F318, V364, V365

이를 생체외 상에서 증명하기 위해 FMOD 유전자가 넉-다운된 세포와 정상세포에서 단백질을 추출한 후 상호 면역침전을 진행하여 FMOD 단백질과 MSTN 단백질과의 결합 여부를 확인하였다. 그 결과 FMOD 단백질과 MSTN 단백질이 결합되었으며, FMOD 유전자가 넉-다운 된 세포에서 정상세포에 비해 MSTN 결합이 감소함을 확인하였다(도 6). 인실리코 분석과 생체외 분석을 통해 FMOD가 MSTN를 조절함으로써 ACVRⅡB 과의 결합을 방해하여 근육세포의 분화를 촉진한다는 것을 확인하였다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Screening method of agent for treating muscle disease <130> ADP-2016-0134 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myostatin <400> 1 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 2 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHA(Hairpin) <400> 2 gatccctaca tggcaaccag attattcaag agataatctg gttgccatgt agttttt 57 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHA(Sense) <400> 3 cuacauggca accagauuat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHA(Antisense) <400> 4 uaaucugguu gccauguagt t 21 <210> 5 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHB(Hairpin) <400> 5 gatccctact agacctgagt tatattcaag agatataact caggtctagt agttttt 57 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHB(Sense) <400> 6 cuacuagacc ugaguuauat t 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHB(Antisense) <400> 7 uauaacucag gucuaguagt t 21 <210> 8 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHC(Hairpin) <400> 8 gatccgcaac aggatcaatg agttttcaag agaaactcat tgatcctgtt gcttttt 57 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHC(Sense) <400> 9 gcaacaggau caaugaguut t 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD_sc-44823-SHC(Antisense) <400> 10 aacucauuga uccuguugct t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_sense <400> 11 tgctggtgct gagtatgtcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_antisense <400> 12 caagcagttg gtggtacagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD primer_sense <400> 13 tgcagaagat ccctcctgtc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMOD primer_Antisense <400> 14 cttgatctcg ttcccatcca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN primer_sense <400> 15 acgctaccac ggaaacaatc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSTN primer_Antisense <400> 16 ggagtcttga cgggtctgag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOG primer_sense <400> 17 tccagtacat tgagcgccta 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOG primer_Antisense <400> 18 caaatgatct cctgggttgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOD primer_sense <400> 19 aggagcacgc acacttctct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYOD primer_Antisense <400> 20 tctcgaaggc ctcattcact 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYL2 primer_sense <400> 21 aaagaggctc caggtccaat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYL2 primer_Antisense <400> 22 cctctctgct tgtgtggtca 20

Claims

마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하여 근육세포 분화를 촉진시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 아미노산은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ala70, His57, Met101, Val22 및 Pro99로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 물질은 단백질, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 물질은 파이브로모듈린(fibromodulin, FMOD)인 것을 특징으로 하는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 근육 질환은 근육 감소증(sarcopenia), 근이영양증(muscular dystrophy), 경직성 척추 증후군(rigid spinesyndrome), 근육-눈-뇌병(muscle-eye-brain disease), 근위축증, 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 만성 염증성 신경증(chronic inflammatory neuropathy) 및 말단근병증(distal myopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근육 질환 치료제 스크리닝 방법.
마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 아미노산은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ala70, His57, Met101, Val22 및 Pro99로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 물질은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 가축의 근육세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 가축의 육량 증진제 스크리닝 방법.
마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 스크리닝하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 형성 보조제 스크리닝 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 아미노산은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ala70, His57, Met101, Val22 및 Pro99로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 형성 보조제 스크리닝 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 물질은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 근육세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 근육 형성 보조제 스크리닝 방법.
마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ile98, Gly68, Trp31, Trp29, Phe27, Tyr42 및 Leu20로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산과 결합하는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 분화 촉진용 조성물.
청구항 13에 있어서, 상기 아미노산은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 Ala70, His57, Met101, Val22 및 Pro99로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근육 분화 촉진용 조성물.
청구항 13에 있어서, 상기 물질은 마이오스타틴(myostatin, MSTN)의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 근육세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 근육 분화 촉진용 조성물.
청구항 13에 있어서, 상기 물질은 단백질, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근육 분화 촉진용 조성물.