KR101803224B1 - 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 미오스타틴 활성 저해용 조성물 - Google Patents

매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 미오스타틴 활성 저해용 조성물 Download PDF

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영남대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 미오스타틴 활성 저해용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육분화와 관련된 유전자들의 발현을 증가시켜 근육위성세포의 분화를 촉진하고 근육감소를 유도하는 미오스타틴와 ACVRIIB의 결합을 저해시켜 미오스타틴의 활성을 억제시키는 것으로 확인됨에 따라, 상기 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 미오스타틴 활성 조절제 및 미오스타틴에 의해 유도되는 근육감소와 같은 근육질환 치료제로 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 미오스타틴 활성 저해용 조성물{Composition for inhibiting myostatin activity comprising matrix gla protein}
본 발명은 근육감소를 유도하는 미오스타틴의 활성 저해용 조성물에 관한 것이다.
근력의 약화를 유발하는 질환은 노화와 함께 진행되는 근감소증과 심위축증, 단백질 대사의 불균형이나 근육사용 감소에서 유발되는 근위축증, 기아 및 소모성질환 등이 있다.
근감소증은 노화가 진행되는 동안 근육량 감소에 따른 근력의 저하를 일컬으며, 가장 큰 특징인 근육량의 감소뿐만 아니라, 근섬유의 종류 변화도 관찰된다. 이러한 근감소증은 성장호르몬의 감소 또는 신경학적 변화, 생리활성의 변화, 대사의 변화, 성호르몬의 양 또는 지방이나 카타볼릭 싸이토카인의 증가, 단백질의 합성과 분화의 균형 변화에 의해 유도된다.
근감소증의 가장 큰 특징인 근육량의 감소는 위성세포의 활성 감소가 가장 중요한 원인으로 알려져있다. 위성세포는 기저막과 근섬유의 근 사이에 위치하고 있는 작은 단핵 세포로, 이들은 부상 또는 운동과 같은 자극에 의해 활성화되어 근원세포로 증식하며, 분화가 진행되면 다른 세포와 융합되어 다핵의 근섬유를 형성한다.
이에 따라, 위성세포의 활성 감소는 손상된 근육을 재생하는 능력이나 분화신호에 대한 반응이 떨어지게 되고 그 결과 근육 형성이 저하된다.
근위축증은 영양결핍이나 장기간 근육을 사용하지 않을 경우에 유발되며 정상적인 단백질의 합성과 분해의 균형이 붕괴되어 단백질이 분해되면서 나타난다.
이러한 근감소증의 치료방법으로 적절한 운동 및 약물치료 방법이 진행되고 있다. 운동은 단기적으로 골격근의 단백질 합성 능력을 증가시킬 수 있지만 장기적 치료방법에는 부적절하며, 약물치료에는 테스토스테론 또는 아나볼릭 스테로이드의 사용이 가능하나 이는 여성에게는 남성화를 유도하며, 남성의 경우 전립선 증상등의 부작용이 나타난다.
최근에는 위성 세포를 분리하여 체외에서 분화시킨 후 체내에 도입시키는 줄기세포치료법과 직접 체내의 위성 세포를 활성화하여 근육분화를 촉진시켜 근육을 유지하거나 강화시키는 방법이 근감소증과 같은 근력약화 치료 방법으로 대두되고 있으나, 근력약화 관련 질환을 치료하기 위해서는 보다 근본적이며 부작용이 없는 치료방법과 근원세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 물질의 개발이 필요한 실정이다.
한국공개특허 제2015-0131558호(2015.11.25 공개)
본 발명은 근육감소를 유도하는 미오스타틴의 활성을 저해하기 위해 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여 미오스타틴과 관련된 근육질환 치료제로 사용하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 매트릭스 Gla 단백질(matrix gla protein; MGP)을 유효성분으로 함유하는 미오스타틴 활성 저해용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 후보물질의 결합 수준을 확인하는 단계를 포함하는 미오스타틴 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 서열번호 1로 표시되는 매트릭스 gla 단백질 아미노산 서열 내 Arg49, Pro46, Gln48, Leu4, Ser45, Glu24, Met26, Ser25, Arg38, Thr42, Arg37, Met1 및 Phe43로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산의 결합 수준 증가를 확인하는 단계를 포함하는 매트릭스 gla 단백질과 미오스타틴 결합촉진제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육분화와 관련된 유전자들의 발현을 증가시켜 근육위성세포의 분화를 촉진하고 근육감소를 유도하는 미오스타틴와 ACVRIIB의 결합을 저해시켜 미오스타틴의 활성을 억제시키는 것으로 확인됨에 따라, 상기 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 미오스타틴 활성 조절제 및 미오스타틴에 의해 유도되는 근육감소와 같은 근육질환 치료제로 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 시간 경과에 따라 분화 배지에서 성장한 C2C12 세포에서 MGP 발현을 확인한 결과로, 도 1(A)는 MGP mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 결과이며, 도 1(B)는 MGP 단백질 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이며, MGP shRNA를 주입한 C2C12 세포에 분화처리 후 2일간 배양한 후 MGP 발현 감소 효과를 확인한 결과로, 도 1(C)는 MGP mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 결과이며, 도 1(D)는 웨스턴 블롯 결과이며, 도 1(E)는 MGP 발현이 감소된 C2C12 세포에서 근관세포 형성을 확인한 결과이며, 도 1(F)는 MGP 발현이 감소된 C2C12 세포에서 융해지수를 확인한 결과이며, 도 1(G)는 MGP 단백질 발현을 확인한 면역세포화학 결과이다.
도 2는 근관세포의 세포질에서 MGP 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 근관세포 형성에 있어 MGP 발현 감소 영향을 확인하기 위해, MGP 발현이 감소된 C2C12 세포(MGPkd)에서 세포외기질(ECM) 및 근원성 마커 유전자 발현을 확인한 결과로, 도 3(A)는 근원성 마커 유전자 MYOG의 RNA 및 단백질 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 3(B)는 근원성 마커 유전자 MYOD의 RNA 및 단백질 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 3(C) 및 3(D)는 분화기간 동안(day 2) MGP 발현이 감소된 세포에서 세포외기질(ECM) 유전자 COL1α1 및 FMOD의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 FMOD, COL1α1, 또는 MSTN 유전자가 발현 억제된 세포에서 MGP 발현 수준을 확인한 결과로, 도 4(A)는 FMOD가 발현 감소된 세포(FMODkd)에서 MGP 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 4(B)는 COL1α1가 발현 감소된 세포(COL1α1kd)에서 MGP 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 4(C)는 MSTN가 발현 감소된 세포(MSTNkd)에서 MGP 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 4(D) 및 (E)는 MGP 발현이 감소된 세포와 정상세포에서 근육발달 음성 조절자인 MSTN의 발현 수준을 확인한 면역화학 분석결과이다.
도 5는 in vitro 조건에서 MGP와 MSTN 및 MGP와 FMOD 사이의 상호관계를 복합 면역침강 및 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과로, 도 5(A)는 정상세포에서 확인한 결과이며, 도 5(B)는 MGP 발현이 감소된 세포(MGPkd)에서 확인한 결과이며, 도 5(C)는 제작된 MGP의 구조이며, 도 5(D)는 In silico 실험을 수행하여 MGP와 MSTN 사이의 상호관계를 확인한 결과이며, 도 5(E)는 MSTN와 결합하는 수용체 ACVRIIB에 대한 영향을 확인한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 매트릭스 gla 단백질(matrix gla protein; MGP)을 유효성분으로 함유하는 미오스타틴 활성 저해용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 매트릭스 gla 단백질은 미오스타틴과 이의 수용체인 액티빈 수용체 타입 2B(activin receptor type ⅡB)의 결합을 억제하여 미오스타틴 활성을 저해시킬 수 있다.
보다 상세하게는 상기 매트릭스 gla 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 내 Arg49, Pro46, Gln48, Leu4, Ser45, Glu24, Met26, Ser25, Arg38, Thr42, Arg37, Met1 및 Phe43으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴의 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 미오스타틴과 이의 수용체인 ACVRⅡB의 결합을 저해함으로써 미오스타틴 활성을 조절할 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg49는 미오스타틴의 아미노산 Leu20와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg38은 미오스타틴의 아미노산 Tyr55, Pro76, Thr77, Lys78 또는 Met79 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg37은 미오스타틴의 아미노산 Met79 또는 Ala100 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Gln48은 미오스타틴의 아미노산 Phe27과 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Gln24는 미오스타틴의 아미노산 Arg67 또는 Gly68 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Leu4는 미오스타틴의 아미노산 Trp29 또는 Trp31 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Met26은 미오스타틴의 아미노산 Gly68, Ser69, Ala70, Gly71 또는 Cys73 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Met1은 미오스타틴의 아미노산 Tyr86, Asn88 또는 Gly89 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Phe43은 미오스타틴의 아미노산 Ala100 또는 Met101 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Pro46은 미오스타틴의 아미노산 Val22 또는 Phe27 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Ser45는 미오스타틴의 아미노산 Ala40, Asn41 또는 Tyr42 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Ser25는 미오스타틴의 아미노산 Ala70과 결합하고, 상기 매드릭스 gla 단백질 아미노산 Thr42는 미오스타틴의 아미노산 Pro76 또는 Met79 중 어느 하나와 결합함으로써 미오스타틴 활성을 조절할 수 있다.
상기 조성물은 약학조성물 및 건강식품으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 미오스타틴(Myostatin; MSTN)은 형질전환 생장인자-β(TGF-β, transforming growth factor-β) 슈퍼패밀리 중의 하나로 근육 성장에 매우 중요한 오토크린/파라크린(autocrine/paracrine)의 저해제로 작용하고 있다. 보고된 바에 따르면 마우스에서 미오스타틴의 발현이 없어질 경우 골격근의 질량이 비약적으로 증가되어, 근육이상발달증과 근육과형성이 나타나는 것으로 확인되었다.
최근 보고에서는 미오스타틴의 작용이 액티빈 수용체 타입 2B(activin receptor type ⅡB; ACVRⅡB)에 직접적으로 결합하여 근육감소를 유도하는 것으로 확인되었다.
상기 액티빈 수용체 타입 2B는 ACVR2B 유전자에 의해 암호화되어 있는 단백질로서, 액티빈 신호전달 기전에 관계된다. 액티빈에 의한 신호 전달은 난포 자극 호르몬(folliclestimulating hormone, FSH)의 생성이나 분비, 월경 주기의 조절에 관여하는 것으로 알려져있으며, 세포의 증식(proliferation), 분화(differentiation), 세포 사멸(apoptosis)에 작용한다.
본 발명의 매트릭스 gla 단백질(MGP)은 세포외기질(extracellular matrix; ECM)의 다른 성분으로 비타민 K2 의존적이며 gla(γ-carboxyglutamate) 도메인이 포함된 단백질 중 하나로, 다른 gla 함유 단백질과 마찬가지로 칼슘 이온에 높은 친화성 결합을 하고, 혈관의 무기화작용(mineralization)의 억제제 역할을 하며 뼈 조직에서 중요한 역할을 한다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 매트릭스 gla 단백질은 MSTN과 ACVRIIB 결합을 억제하는 것으로 확인되었는데, 단백질-단백질 상호관계 연구를 통하여 MSTN과 ACVRIIB 결합의 전체적 에너지 점수가 -56.99인 것으로 확인된 반면, 도 5d와 같이 MGP 존재하에서는 상기 결합 효율이 -25.08으로 감소 되는 것을 확인할 수 있었으며, 도 5e 및 표 2와 같이 MGP의 존재하에서 MSTN와 ACVRIIB 결합에 포함되는 아미노산 잔기가 매우 감소하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 MGP가 MSTN에 결합함으로써 MSTN와 ACVRIIB 결합을 저해시켜 MSTN 활성을 조절하는 것이 확인되었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면 MGP에 의한 MSTN 발현 조절 효과를 확인하기 위해, MGP가 감소된 세포(MGPkd)에서 MSTN의 mRNA 및 단백질 수준을 확인한 결과, 도 4d와 같이 MGP가 감소된 세포에서 MSTN 발현 감소가 확인되었으며, MSTN 항체를 이용한 면역염색을 수행한 결과에서도 도 4e와 같이 MGP가 감소된 세포에서 MSTN 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
이에 따라, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 근육질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 매트릭스 gla 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 내 Arg49, Pro46, Gln48, Leu4, Ser45, Glu24, Met26, Ser25, Arg38, Thr42, Arg37, Met1 및 Phe43로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴의 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 미오스타틴과 이의 수용체인 ACVRⅡB의 결합을 저해함으로써 미오스타틴이 유도하는 근육감소를 억제할 수 있다.
보다 바람직하게는 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg49는 미오스타틴의 아미노산 Leu20와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg38은 미오스타틴의 아미노산 Tyr55, Pro76, Thr77, Lys78 또는 Met79 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg37은 미오스타틴의 아미노산 Met79 또는 Ala100 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Gln48은 미오스타틴의 아미노산 Phe27과 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Gln24는 미오스타틴의 아미노산 Arg67 또는 Gly68 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Leu4는 미오스타틴의 아미노산 Trp29 또는 Trp31 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Met26은 미오스타틴의 아미노산 Gly68, Ser69, Ala70, Gly71 또는 Cys73 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Met1은 미오스타틴의 아미노산 Tyr86, Asn88 또는 Gly89 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Phe43은 미오스타틴의 아미노산 Ala100 또는 Met101 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Pro46은 미오스타틴의 아미노산 Val22 또는 Phe27 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Ser45는 미오스타틴의 아미노산 Ala40, Asn41 또는 Tyr42 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Ser25는 미오스타틴의 아미노산 Ala70과 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Thr42는 미오스타틴의 아미노산 Pro76 또는 Met79 중 어느 하나와 결합하는 것일 수 있다.
또한, 상기 매트릭스 gla 단백질은 근육분화 유전자인 MYOD, MYOG, Col1α1 및 FMOD의 발현을 증가시켜 근육위성세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.
상기 근육질환은 근이영양증(muscular dystrophy), 경직성 척추 증후군(rigid spine syndrome), 근육-눈-뇌병(muscle-eye-brain disease), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 만성 염증성 신경증(chronic inflammatory neuropathy) 및 말단근병증(distal myopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 후보물질의 결합 수준을 확인하는 단계를 포함하는 미오스타틴 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 후보물질이 미오스타틴과 결합하여 미오스타틴과 이의 수용체인 액티빈 수용체 타입 2B(activin receptor type ⅡB)의 결합 감소 수준을 확인하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 매트릭스 gla 단백질과 미오스타틴 수용체 간의 결합 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전법(Immunoprecipitation), 면역세포화학(Immunocytochemistry), 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포분석법(FACS)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 확인할 수 있다.
상기 미오스타틴 활성 억제제는 근육질환 치료제, 가축의 육량증진제 및 근육형성보조제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 스크리닝 방법으로 선별된 미오스타틴 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포에서 서열번호 1로 표시되는 매트릭스 gla 단백질 아미노산 서열 내 Arg49, Pro46, Gln48, Leu4, Ser45, Glu24, Met26, Ser25, Arg38, Thr42, Arg37, Met1 및 Phe43로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산의 결합 수준 증가를 확인하는 단계를 포함하는 매트릭스 gla 단백질과 미오스타틴 결합촉진제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 매트릭스 gla 단백질의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 건강식품은 상기 매트릭스 gla 단백질(MGP) 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 1> 세포배양
생쥐 근원세포 주인 C2C12 세포를 한국 세포주은행(KCLB; Korean Cell Line Bank)에서 구입하여, 10% 태아소혈청(FBS; HyClone Laboratories) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 포함된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium; HyClone Laboratories, Logan, UT) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
분화 유도를 위해, C2C12 세포를 70% 합류되도록 성장시키고 2% 태아소혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 분화 배지로 교체하고 1 내지 5일간 성장시켰으며, 분화배지는 격일로 교체되었다.
< 실험예 2> RNA 추출 및 실시간 RT- PCR 분석
Trizol™ 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라, C2C12 세포의 전체 RNA를 추출한 후 사용 전까지 -80℃ 조건에서 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate)가 처리된 H2O에 저장하였다.
전체 RNA (1μg)가 포함된 반응혼합물 20 μl으로 oligo (dT) 20 프라이머 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 제작한 후 42℃로 50분 및 72℃로 15분간 역전사 시켰다. 이렇게 얻어진 cDNA(2 μl)와 각각의 유전자 특이적 프라이머(10 pmoles)를 이용하여 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 PCR을 수행하였다.
형광원으로 Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Bio systems)을 사용하였으며, Primer 3 software (http://frodo.wi.mit.edu) 및 미국 국립생물공학정보센터의 염기서열 정보 리스트를 이용하여 프라이머를 제작하였다.
유전자 발현 분석을 수행하고 대조군으로 GAPDH를 이용하여 fold differences를 확인하였으며, 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
Species Gene Product size(bp) Tm (℃) Sequence 방향
Mouse GAPDH 155 55 5'-tgctggtgctgagtatgtcg-3' 정방향
5'-caagcagttggtggtacagg-3' 역방향
FMOD 155 59 5'-tgcagaagatccctcctgtc-3' 정방향
5'-cttgatctcgttcccatcca-3' 역방향
MSTN 163 59 5'-acgctaccacggaaacaatc-3' 정방향
5'-ggagtcttgacgggtctgag-3' 역방향
MYOG 185 59 5'-tccagtacattgagcgccta-3' 정방향
5'-caaatgatctcctgggttgg-3' 역방향
MYOD 213 59 5'-aggagcacgcacacttctct-3' 정방향
5'-tctcgaaggcctcattcact-3' 역방향
MYL2 177 59 5'-aaagaggctccaggtccaat-3' 정방향
5'-cctctctgcttgtgtggtca-3' 역방향
COL1α1 244 59 5'-ctttgcttcccagatgtcct-3' 정방향
5'-ccccatcatctccattcttg-3' 역방향
MGP 174 59 5'-acaggagaaatgccaaca-3' 정방향
5'-ggttgtaggcagcgttgt-3' 역방향
< 실험예 3> 면역세포화학( Immunocytochemistry )
C2C12 세포를 cover glass-bottom dishes에서 분화 배지로 2 또는 4일간 배양하고 MGP 단백질을 염색하였다.
먼저, 세포를 PBS로 세척하고 4% 포름알데하이드로 고정시킨 후 0.2% Triton X-100 (Sigma Aldrich)를 투과시키고 Image-iTTM FX 신호 증폭제로 인큐베이트하였다.
그 후, 1시간 동안 5% 염소 혈청이 포함된 PBS로 차단한 후 4℃ 습윤조건에서 하룻밤 동안 MGP 항체(래빗 다클론성 IgG MGP, 1:50; Proteintech)로 인큐베이트하였다.
그 다음 PBS로 세 번 세척하고 실온에서 1시간 동안 이차 항체(1:100; Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit, Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 적용시켰다.
시료들을 PBS로 세척한 후 4'6'-디아미노-2-페닐인돌(DAPI; Sigma-Aldrich)로 핵을 대비염색하고 디지털 카메라를 갖춘 형광 현미경(Nikon)으로 촬영하여 이미지를 얻었다.
< 실험예 4> 웨스턴 블롯 분석
다른 시간으로 분화된 세포의 단백질 시료로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
세포를 어름같이 차가운 PBS로 세척하고 단백질 분해효소 억제제 칵테일(Thermo Scientific, NH, USA)이 포함된 RIPA 버퍼로 용해시킨 후, 4℃, 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 전체 단백질을 분리시키고 상층액을 수집하여 Bradford 방법으로 단백질을 분석하였다.
β-멀캅토에탄올(Sigma-Aldrich)이 포함된 dye와 단백질 40 μg을 혼합하여 95℃에서 5분간 가열한 후 15% SDS-PAGE에 전기 이동시키고 PVDF 막(Immobilon®-p, Millipore, Billerica MA, USA)에 옮겼다.
3% BSA로 1시간 동안 블롯을 차단하고 1차 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이트하였다. 그 후 막을 TBST로 세척하고 페록시다아제가 표지된 2차 항체(Santa Cruz)를 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 다시 TBST로 세척한 후 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)를 처리하고 luminescent image analyzer (LAS-4000 mini; Fujifilm, Tokyo)에 노출시켜 면역 반응 단백질을 검출하였다.
< 실험예 5> 유전자 발현 감소 및 융해 지수 확인
각 제조사의 설명서에 따라, 특이적 유전자(shMGP, shFMOD, shMSTN)에 대한 혼합 벡터 또는 shRNA를 C2C12 세포에 형질주입하였다.
30% 합류되도록 성장된 C2C12 세포에 형질주입 시약(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)을 이용하여 유전자 특이적인 shRNA 및 혼합 벡터(대조군) 1ng를 각각 처리하여 하룻밤 동안 형질주입하고, 세포가 80% 합류될 때 퓨로마이신(Sigma Life Sciences) 2 μg/ml를 처리하여 형질주입된 세포를 선택하였다.
siRNA를 이용한 발현 감소 유도를 위해, 100 mM의 대조군 또는 Col1α1 siRNA를 5시간 동안 C2C12 세포에 형질주입한 후, 분화 배지에서 2일간 배양하였다.
발현 감소를 효율을 확인하기 위해, RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 수행하여 mRNA 및 단백질 발현 수준을 확인하였다.
야생형과 발현 감소된 세포 사이에 Col1α1 유전자 발현 백분율 차이는 shRNA/siRNA 넉 다운 구조의 형질주입 효율성 확인에 사용되었다.
또한, 보고되어진 방법(Brigitle et al., 1998 및 Velic et al., 2012)으로 MGPkd 및 MGPwt 세포에서 융해지수를 확인하였다.
먼저, Giemsa G250 (Sigma Aldrich)로 세포핵을 염색하고 무작위로 서로 다른 세 부위의 이미지를 얻은 후 각 이미지에서 근관세포 내 핵 수와 전체 세포의 핵 수를 세고, 각 이미지에 존재하는 전체 세포 수의 백분율로 근관세포에 포함된 핵의 수를 나타내어 융해 지수를 계산하였다.
< 실험예 6> 복합 면역침전(Co- Immunoprecipitation )
MGP, FMOD 및 MSTN 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위해, 복합 면역침전(Co-Immunoprecipitation)을 수행하였다.
먼저, 2% 태아소혈청(FBS)로 2일간 분화된 정상 C2C12 세포, MGP shRNA가 형질주입 된 C2C12 세포 및 복합 벡터로 형질주입 된 C2C12 세포에서 시료를 얻었다.
간략하게 PBS로 세척된 세포에 변성되지 않은 버퍼(20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA)와 HaltTM 단백질분해효소 억제제(Thermo Scientific)를 100:1 비율로 첨가하였다.
세포 스크랩퍼로 세포를 수집한 후 얼음에서 10분 마다 약하게 흔들어주면서 30분간 인큐베이트한 후, 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다.
전체 단백질 300 μg와 단백질 A 아가로스(Santa Cruz Biotechnology) 20μl를 인큐베이트한 후, 4℃에서 900 rcf으로 3 내지 4 시간 동안 인큐베이트하였다.
상등액을 제거한 후 펠렛에 FMOD 또는 MSTN 항체(Santa Cruz)를 혼합하여 하룻밤 동안 인큐베이트하고 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다.
상기 과정으로 얻은 시료에 변성되지 않은 버퍼 200 μl를 첨가하고 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 두 번 세척한 후 상등액을 제거하고 MGP 단백질에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다.
< 실험예 7> 단백질 구조 예측 및 상호작용 연구
단백질 정보은행(Protein Data Bank; PDB)에서 MSTN(pdb id: 3HH2)의 결정 구조를 검색하였으며, 사람 액티빈 수용체 타입 II 키나제 도메인(pdb id: 2QLU)의 결정 구조를 주형으로 사용하여 Modeller 9v14로 5개의 ACVRIIB 모델을 제작한 후 도프 점수(dope score)를 기반으로 가장 좋은 모델을 선택하였다.
한편, 단백질 데이터 뱅크의 MGP 구조는 사용할 수 없었으므로 UniProt database (P19788)에서 검색한 아미노산 서열을 이용하여 ab initio 접힘 및 깍기 방법의 조합을 이용하는 I-TASSER로 MGP의 구조를 제작하였다.
그 후 상기 방법으로 제작된 MSTN과 이의 수용체인 ACVRIIB 사이의 결합을 조사하였으며, in silico 상에서 MGP가 MSTN과 ACVRIIB의 상호작용을 차단할 수 있는지 확인하였다.
ACVRIIB 및 MSTN 사이의 단백질-단백질 상호작용은 MGP의 존재 또는 비존재 조건에서 PatchDock server (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/)를 이용하여 확인하였다.
PatchDock에서 얻은 결과를 추가 정제하고 Fire Dock algorithm을 이용하여 단백질-단백질 상호작용 에너지들을 기준으로 기록하였다.
낮은 상호작용 에너지를 갖는 복합체 구조를 분석용 최종 모델로 선정하였다.
< 실시예 1> 근육분화 동안 MGP 발현 증가 확인
0 내지 5일간 근육분화 유도에 따른 MGP의 발현 패턴을 확인하였다.
그 결과, 도 1a와 같이 근육분화 유도 2일째에 8배 이상으로 높은 수준의 MGP mRNA 발현이 확인되었으며, 웨스턴 블롯 결과인 도 1b에서도 MGP 단백질 발현 수준이 유사한 패턴으로 나타났다. 추가적으로 도 2를 참고하면 근관세포의 세포질에서도 MGP 단백질 발현이 확인되었다.
근육분화에 있어 MGP 역할을 확인하기 위해, C2C12 세포에 MGP shRNA를 형질주입하고, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1c 및 1d와 같이 형질주입 된 세포에서 MGP의 발현이 60% 감소 되었으며, MGP 발현 감소에 따라 도 1e 및 1f와 같이 근관세포 형성이 감소되는 것이 확인되었으며, 면역염색을 수행하여 근관세포 형성 감소 효과를 확인한 결과에서도 도 1g와 같이 MGP가 감소된 세포(MGPkd)보다 정상세포(MGPwt)에서 많은 근관세포가 확인되었다.
상기 결과로부터 MGP는 분화기간 동안 근관세포 형성을 조절하는 역할을 하는 것이 확인되었다.
< 실시예 2> 세포외기질 및 근원성 마커 유전자 발현에 미치는 MGP 영향 확인
근육조직 발생 과정에서 MGP의 역할을 확인하기 위해, MGP 발현 감소에 따른 근원성 마커(MYOD 및 MYOG) 및 Col1α1 유전자 발현 영향을 확인하였다.
근육조직 발생 과정에서 MYOD 및 MYOG는 근육줄기세포 분화 진행을 조절하는 것으로 알려져 있으며, MGP와 관계를 확인한 결과 도 3a 및 3b와 같이 MGP가 발현 감소된 세포(MGPkd)에서 MYOD 및 MYOG의 mRNA 및 단백질 수준이 모두 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 3c와 같이 중요한 세포외기질 유전자인 Col1α1의 mRNA 및 단백질 발현 수준 역시 감소된 것을 확인할 수 있었으며, MSTN 조절자로 알려진 FMOD의 발현 분석에서도 도 3d와 같이 상기 mRNA 감소 결과들과 동일하게 감소 경향을 나타내었다. 반면, 웨스턴 블롯 분석결과에서는 MGP가 발현 감소된 세포에서 FMOD 단백질의 발현이 높게 나타났다.
상기 결과로부터 MGP는 근육분화를 유도하는 유전자의 발현을 조절하는 것으로 확인되었다.
한편, 근육조직 발생 과정에서 FMOD가 MSTN의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐에 따라, Col1α1 및 FMOD 발현을 억제시킨 C2C12 세포에서 MGP 발현 패턴을 확인하였다.
< 실시예 3> MGP 발현에서 ECM 유전자 넉 다운 효과 확인
근육조직 발생과정에서 MGP와 ECM 유전자 사이에 교차 매커니즘은 상기 유전자 발현의 영향을 나타낼 가능성이 있을 것으로 고려되어 짐에 따라, ECM 유전자 발현 조절에 대한 MGP의 역할을 확인하였다.
상호작용 가능성을 확인하기 위해, C2C12 세포에 shRNA/siRNA (shFMOD, siCol1α1, 또는 shMSTN)를 형질주입하였다.
그 결과, 도 4a 내지 4c와 같이 야생형보다 FMODkd, Col1α1kd 및 MSTNkd 세포에서 MGP 발현이 증가되었다.
상기 결과로부터 FMOD, Col1α1 및 MSTN은 동일한 방법으로 상호작용하는 것이 확인되었으며, 근육조직 발생과정을 조절하는 매커니즘을 이해하기 위해, MGP가 감소된 세포에서 MSTN 발현을 확인하였다.
< 실시예 4> 근육분화기간 동안 MSTN 발현에 미치는 MGP의 영향 확인
MGP에 의한 MSTN 발현 조절 및 FMOD와의 상호관계를 이해하기 위해, MGP가 감소된 세포에서 MSTN 발현을 확인하였다.
MGP 야생형 세포와의 비교를 위해, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 MGP가 감소된 세포(MGPkd)에서 MSTN의 mRNA 및 단백질 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 3d와 같이 MGP가 감소된 세포에서 MSTN 발현 감소가 확인되었다.
상기 결과로부터 MGP는 MSTN 발현을 조절하는 유전자인 것이 확인되었으며, 상기 결과에 대한 추가 확인을 위해 MSTN 항체를 이용한 면역염색을 수행한 결과, 도 4e와 같이 MGP가 감소된 세포에서 MSTN 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> MGP의 상호작용 확인
본 발명자들은 최근 연구에서 FMOD가 MSTN와 상호작용 함으로써 MSTN와 수용체인 ACVRIIB의 결합을 막아 MSTN 발현이 조절되는 것을 확인하였다. 이에 따라 MGP와 FMOD 및 MSTN의 상호관계를 확인하기 위해, 복합 면역침전을 수행한 후 FMOD 또는 MSTN 침전된 시료에 MGP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 5a와 같이 MGP와 FMOD 및 MGP와 MSTN 단백질 간의 강한 상호작용이 확인되었다. 상기 결과와 같이 정상세포 내에서 MGP와 FMOD 및 MSTN 단백질 간의 상호작용을 확인한 후, 정상세포(MGPwt)와 MGP가 감소된 세포(MGPkd)에서도 복합 면역침전을 수행하였다.
그 결과, 도 5b와 같이 MGP가 감소된 세포에서는 약한 상호작용이 확인되었다.
또한, In silico 분석을 수행하여 MGP, FMOD 및 MSTN 사이의 상호작용을 확인하였다. 단백질 정보은행(PDB)의 MGP 구조는 이용 가능성이 없어, 도 5c와 같이 MGP 구조를 제작하였다.
단백질-단백질 상호관계 연구를 통하여 MSTN과 ACVRIIB 결합의 전체적 에너지 점수가 -56.99인 것으로 확인되었으나, 도 5d와 같이 MGP 존재하에서는 상기 결합 효율이 -25.08으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 MGP가 MSTN와 ACVRIIB의 결합을 억제하는 것으로 확인되었다.
또한, 도 5e 및 표 2와 같이 MGP 존재하에서 MSTN와 ACVRIIB 결합에 포함되는 아미노산 잔기가 매우 감소하는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터 MGP는 MSTN와 ACVRIIB 결합을 교란시킬 수 있음이 확인되었다.
Complex Residues involved





MGP - MSTN









MGP - MSTN

Hydrogen bonding Hydrophobic interaction
MGP MSTN MGP MSTN
NIL R49, P46, Q48, L4, S45, E24, M26, S25, R38, T42, R37, M1
F43		 L20, V22, P27, W29, W31, A40, N41, Y42, Y55, R67, G68, S69, A70, G71, C73, P76, T77, K78, M79, Y86, N88, G89, P100, A100, M101
Complex Residues involved






ACVRIIB - MSTN -MGP






ACVRIIB - MSTN
Hydrogen bonding Hydrophobic interaction
ACVRIIB MSTN ACVRIIB MSTN
NIL P167, G168, P170 Y55, H57



ACVRIIB - MGP

Hydrogen bonding Hydrophobic interaction
ACVRIIB MGP ACVRIIB MGP
G191, N194, D283, E285 Y29, V85, R81, Y86 P167, G168, E190, G191, A192, I193, N194, F195, Q196, R202,
D283, E285		 P6, L7, L10, Y29, I31, P33, F34, R81, Y82, Y86, R94
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Composition for inhibiting myostatin activity comprising matrix gla protein <130> ADP-2016-0524 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 104 <212> PRT <213> Matrix gla protein <400> 1 Met Lys Ser Leu Leu Pro Leu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Thr Leu Cys Tyr Glu Ser His Glu Ser Met Glu Ser Tyr Glu Ile Ser 20 25 30 Pro Phe Ile Asn Arg Arg Asn Ala Asn Thr Phe Met Ser Pro Gln Gln 35 40 45 Arg Trp Arg Ala Lys Ala Gln Lys Arg Val Gln Glu Arg Asn Lys Pro 50 55 60 Ala Tyr Glu Ile Asn Arg Glu Ala Cys Asp Asp Tyr Lys Leu Cys Glu 65 70 75 80 Arg Tyr Ala Met Val Tyr Gly Tyr Asn Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe 85 90 95 Arg Gln Arg Arg Gly Ala Lys Tyr 100 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Myostatin <400> 2 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 3 <211> 536 <212> PRT <213> Activin receptor <400> 3 Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160 Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Val Arg 165 170 175 Gln Cys Gln Arg Trp Ala Gly Arg Arg Asp Gly Cys Ala Asp Ser Phe 180 185 190 Lys Pro Leu Pro Phe Gln Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg 210 215 220 Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val 225 230 235 240 Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu 245 250 255 Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile 260 265 270 Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile 275 280 285 Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn 290 295 300 Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg 305 310 315 320 Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly 325 330 335 His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu 340 345 350 Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val 355 360 365 Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly 370 375 380 Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe 385 390 395 400 Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val 405 410 415 Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp 420 425 430 Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu 435 440 445 Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile 450 455 460 Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr 465 470 475 480 Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly 485 490 495 Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr 500 505 510 Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp 515 520 525 Leu Leu Pro Lys Glu Ser Ser Ile 530 535

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 매트릭스 gla 단백질(matrix gla protein; MGP)을 유효성분으로 함유하며, 상기 매트릭스 gla 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 내 Arg49, Pro46, Gln48, Leu4, Ser45, Glu24, Met26, Ser25, Arg38, Thr42, Arg37, Met1 및 Phe43로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴의 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 결합하여 미오스타틴 활성을 억제시키는 미오스타틴 활성 저해용 시약조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 매트릭스 gla 단백질은 미오스타틴과 이의 수용체인 액티빈 수용체 타입 2B(activin receptor type ⅡB)의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 미오스타틴 활성 저해용 시약조성물.
  3. 삭제
  4. 청구항 1항에 있어서, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg49는 미오스타틴의 아미노산 Leu20와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg38은 미오스타틴의 아미노산 Tyr55, Pro76, Thr77, Lys78 또는 Met79 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Arg37은 미오스타틴의 아미노산 Met79 또는 Ala100 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Gln48은 미오스타틴의 아미노산 Phe27과 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Gln24는 미오스타틴의 아미노산 Arg67 또는 Gly68 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Leu4는 미오스타틴의 아미노산 Trp29 또는 Trp31 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Met26은 미오스타틴의 아미노산 Gly68, Ser69, Ala70, Gly71 또는 Cys73 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Met1은 미오스타틴의 아미노산 Tyr86, Asn88 또는 Gly89 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Phe43은 미오스타틴의 아미노산 Ala100 또는 Met101 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Pro46은 미오스타틴의 아미노산 Val22 또는 Phe27 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Ser45는 미오스타틴의 아미노산 Ala40, Asn41 또는 Tyr42 중 어느 하나와 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Ser25는 미오스타틴의 아미노산 Ala70과 결합하고, 상기 매트릭스 gla 단백질 아미노산 Thr42는 미오스타틴의 아미노산 Pro76 또는 Met79 중 어느 하나와 결합하는 것을 특징으로 하는 미오스타틴 활성 저해용 시약조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
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  8. 삭제
  9. 삭제
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  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 포유류에서 분리된 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보물질이 처리된 세포에서 서열번호 1로 표시되는 매트릭스 gla 단백질 아미노산 서열 내 Arg49, Pro46, Gln48, Leu4, Ser45, Glu24, Met26, Ser25, Arg38, Thr42, Arg37, Met1 및 Phe43로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산과 서열번호 2로 표시되는 미오스타틴 아미노산 서열 내 Leu20, Val22, Phe27, Trp29, Trp31, Ala40, Asn41, Tyr42, Tyr55, Arg67, Gly68, Ser69, Ala70, Gly71, Cys73, Pro76, Thr77, Lys78, Met79, Tyr86, Asn88, Gly89, Pro100, Ala100 및 Met101로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산의 결합 수준 증가를 확인하는 단계를 포함하는 매트릭스 gla 단백질과 미오스타틴 결합촉진제 스크리닝 방법.
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