CN117750967A - 衍生自扭链瘤胃球菌的肽 - Google Patents

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CN117750967A CN202280050894.8A CN202280050894A CN117750967A CN 117750967 A CN117750967 A CN 117750967A CN 202280050894 A CN202280050894 A CN 202280050894A CN 117750967 A CN117750967 A CN 117750967A
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O·彼泽森
范勇
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Kobenhavns Universitet
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Abstract

本发明涉及衍生自扭链瘤胃球菌的多肽，以及多肽片段及其变体，其可用于治疗和/或预防代谢病症、肌肉病症和损伤、以及骨病症；以及包含所述多肽、多肽片段或其变体的宿主细胞，其用作益生菌或活体生物药(LBP)。

Description

衍生自扭链瘤胃球菌的肽
技术领域
本发明涉及衍生自扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的多肽，以及多肽片段及其变体，其可用于治疗和/或预防代谢病症、肌肉病症和损伤、以及骨病症；以及包含所述多肽、多肽片段或其变体的宿主细胞，其用作益生菌或活体生物药(LiveBiopharmaceutical Product)。
背景技术
根据过去10年基于流行病学、生理学、生态学和组学的人类研究结果，再辅以动物中的细胞研究和机制实验，看起来相当一部分环境对人类健康的影响是由微生物群落介导的1,2。这些非致病性(即，共生和互生)微生物统称为微生物群，包括共存于人体表面上和所有体腔中的大量相互作用的细菌、古细菌、细菌噬菌体、真核病毒和真菌。个体内和个体上的所有微生物基因(即，微生物组)的集合代表了遗传库，其基因组比人类基因组高一个数量级以上3。
栖息在人体的大多数微生物位于远端肠道内，在那里它们在训练宿主免疫力、消化食物、调控肠道内分泌功能和神经信号传导，调节药物作用和代谢，消除毒素以及释放影响宿主的几种微生物化合物方面具有重要作用1,2。存在人肠道细菌菌株的许多实例。其中之一是扭链瘤胃球菌。在人类宏基因组中，扭链瘤胃球菌的某些菌株的贡献可以达到总相对丰度的高达10％8。该细菌已与粘膜相关，并且可以降解粘液。
已知调控宿主代谢的少数细菌化合物之一的最初实例是Amuc_1100，一种位于共生肠道细菌嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的外膜中的蛋白质4。在临床前实验中,当以活体或巴氏灭菌的形式施用时，该细菌与改善的代谢相关4。在最近的一项人试点干预中，嗜粘蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)的处方被证实是可耐受的，没有副作用，并且减轻超重和肥胖患者的代谢障碍，具有一定的临床相关性5。
根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)，自1975年以来，肥胖人数已增加了两倍；在2016年，超过19亿成人是超重的，并且在其中，超过6.5亿人是肥胖的。肥胖与其它病症密切相关，这些其它病症例如代谢综合征，其适应症包括高血压、脂肪肝病(FLD)和2型糖尿病(T2D)。WHO估计自1980年以来，患有糖尿病的人的数量已翻了两番。如今，全世界4.22亿人患有糖尿病，其中大多数患有由超重、肥胖和缺乏体力活动引起的T2D。
影响大量人的其它疾病包括肌肉和骨骼疾病、病症和损伤。骨质流失或骨骼脆弱尤其是人口老龄化的国家中的常见病症。在一些国家，骨质疏松症影响高达70％的80岁以上的人。随着时间的推移，几种肌肉病症(下文称为神经肌肉病症)，例如肌营养不良会引起骨骼肌的无力和崩塌。肌营养不良和其它神经肌肉病症的预后范围取决于具体原因从轻度到重度不等。
因此，本领域显然需要上文列出的疾病和病症的改善治疗和预防。此类治疗的方法可能是鉴定衍生自肠道微生物组的生物体和化合物，其经由对宿主代谢的积极影响来促进健康。
发明内容
本发明涉及多肽及其用于治疗和/或预防代谢、肌肉和骨病症的用途，以及用作益生菌或活体生物药(LBP)的包含所述多肽、多肽片段及其变体的宿主细胞。
本发明人已表明，衍生自扭链瘤胃球菌的细菌肽以及所述肽的片段和变体在治疗和预防代谢病症、肌肉病症和损伤、以及骨病症中可能是有效的。
因此，本文提供了长度小于200个氨基酸的分离的多肽(isolated polypeptide)，其包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：
a)根据SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性，但与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有小于99％的序列同一性；
c)SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的变体，其中所述变体相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至40个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有5、10、15、20、25、30或35个氨基酸取代；
d)长度为至少10个氨基酸的SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的片段，或者分别相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的所述片段的变体，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
e)通过在N末端处截短至少一个氨基酸，例如1至67个氨基酸，例如1至60个氨基酸，例如1至50个氨基酸，例如1至40个氨基酸，例如1至30个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至10个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代的变体；
f)通过在C末端处截短至少一个氨基酸，例如1至21个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至15个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至30个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、5、10、15、20或25个氨基酸取代的变体；
g)通过在N末端处截短至少一个氨基酸，1至67个氨基酸，例如1至60个氨基酸，例如1至50个氨基酸，例如1至40个氨基酸，例如1至30个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸，以及在C末端处截短至少一个氨基酸，例如1至21个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至15个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，其中所述多肽具有至少10个氨基酸的长度，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的变体；
h)根据SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
i)SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性，但与SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有小于99％的序列同一性；
j)SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的变体，其中所述变体相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1至10个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
k)包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的至少10个连续氨基酸的SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的片段，或者其相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
1)SEQ ID NO:19的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:27、33、34、35、36、37和95，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
m)SEQ ID NO:4的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:107、108、109、110、111、165和168，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
n)SEQ ID NO:19的变体的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:173、176、181和188，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
o)SEQ ID NO:4的变体的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:193、196、201和208，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
p)SEQ ID NO:19的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:210、211、212、213、229、232、233、234和235，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；和
q)SEQ ID NO:4的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:243、244、245、246、262、265、266、267和268，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ IDNO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度。
本文进一步提供了编码本发明多肽的分离的多核苷酸。
本文还提供了包含根据本发明多核苷酸的载体。
本文进一步提供了包含根据本发明的多核苷酸和/或载体的宿主细胞。
本文还提供了包含根据本发明多肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的药物组合物。
本文还提供了包含根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的膳食组合物，其中所述膳食组合物包含益生元、益生菌、活体生物药(LBP)、合生元、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、纤维和/或营养素，例如膳食矿物质中的一种或多种。
本文进一步提供了根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物，其用作药物。
本文进一步提供了根据本发明的宿主细胞，其用作益生菌或活体生物药(LBP)。
本文还提供了根据本发明的多肽、缀合物、载体和/或宿主细胞作为食品成分或者作为食品或饮品添加剂的用途。
本文进一步提供了根据本发明的宿主细胞作为益生菌或作为活体生物药(LBP)的用途。
本文还提供了根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物，其用于治疗和/或预防代谢病症、肌肉病症和损伤、和/或骨病症。
本文进一步提供了根据本发明的多肽、缀合物、载体、宿主细胞和/或药物组合物在制备用于治疗以下的药物中的用途：代谢病症、肌肉病症和损伤、和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和/或骨硬化症。
本文还提供了用于治疗以下的方法：代谢病症、肌肉病症和损伤、和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和/或骨硬化症，其中所述方法包括将根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物施用于有此需要的个体。
附图说明
图1.人FNDC5、细菌FNDC5-样蛋白、人鸢尾素和RUCILP2相应的氨基酸序列比对。RUCILP2和人鸢尾素之间相同的氨基酸残基用星号表示；低相似度和高相似度分别用句点和冒号表示。使用开放获取工具Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分别对人FNDC5、细菌FNDC5-样蛋白、人鸢尾素和RUCILP2中的氨基酸进行多重序列比对，以确定相同和保守残基的数目。因此，该图相应地示出了人FNDC5、细菌FNDC5-样蛋白、人鸢尾素和RUCILP2之间的氨基酸序列相似性水平。
图2.培养基中二聚化的RUCILP1和RUCILP2的检测。左图，聚偏二氟乙烯印迹膜上的蛋白质的考马斯亮蓝染色指示了每个孔中相等上样量的蛋白质。右图，在以每ml培养基～1010细菌细胞密度厌氧培养3天后，来自扭链瘤胃球菌(RT)-ATCC 27756(n＝3)和对照菌株RT-ATCC 35915(n＝3)的相应培养基中针对FNDC5的蛋白质印迹。因此，该图结果表明，扭链瘤胃球菌(RT)-ATCC 27756菌株将RUCILP2以二聚体形式释放到生长培养基中。
图3.RUCILP2的预测结构以及与鸢尾素的比对。开源软件I-TASSER通过迭代线程组装模拟来用于蛋白质结构建模。开放获取PyMOL(v2.1.1)工具作为所预测的3D结构的可视化工具应用。该图表明RUCILP2是鸢尾素的结构类似物。
图4.整联蛋白αV/β5受体与RUCILP2(左图)和鸢尾素(右图)之间的相互作用的相应对接模型。氨基酸60-76和101-118处的推定的整联蛋白结合区域分别以黑色显示。RUCILP2的结合残基似乎比鸢尾素的结合残基更接近于整联蛋白αV/β5受体。通过Autodock(v4.2.6)计算分析来评估RUCILP2和鸢尾素与整联蛋白αV/β5受体的结合能力。通过PyMOL(v2.1.1)证实了对接模型的最终复合物结构。该图表明RUCILP2与整联蛋白αV/β5受体之间的结合。
图5.RUCILP2中与整联蛋白αV/β5受体的预测结合位点的可视化。应用ZDOCK网络服务器ZDOCK(https://zdock.umassmed.edu/)来预测RUCILP2和整联蛋白αV/β5受体复合物的最高位列模型。该模型在PyMOL(v2.1.1)程序中可视化，并且显示在RUCILP2的V7、E9和E58处的氨基酸残基分别与整联蛋白αV/β5受体结合。
图6.在镍离子柱上的免疫共沉淀，以验证重组RUCILP2与αV/β5整联蛋白受体复合物的结合。将100nM Fc-融合的RUCILP2与5nM His-标签αV/β5整联蛋白受体一起孵育，随后使用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行免疫沉淀。通过免疫印迹分析来分析沉淀的整联蛋白和共沉淀的鸢尾素。洗脱指示了来自整联蛋白-RUCILP2复合物的解离的整联蛋白和RUCILP2的混合物。在上样之前，样品是RUCILP2和整联蛋白受体的共孵育的混合物。因此，该实验显示了RUCILP2和整联蛋白αV/β5之间的直接相互作用。
图7.应用基于双链体RNAscope的mRNA原位杂交阵列鉴定正常人结肠的粘膜下层中的整联蛋白αV/β5受体(ITGAV和ITGB5 mRNA)的信号点。两种靶mRNA分别被染色为红色(ITGAV)和绿色(ITGB5)信号点。实验设置包括Polr2a(RNA聚合酶II亚基A，红色)和作为阳性对照的PPIB(肽基脯氨酰异构酶B，绿色)，以及作为阴性对照探针组的DapB(二氢吡啶二羧酸还原酶)。使用Zeiss AxioScan以20×物镜获取图像。可视化信号证实了人结肠组织中存在整联蛋白αV/β5受体。
图8.基于双链体RNAscope的mRNA原位杂交阵列鉴定正常人结肠中的整联蛋白αV/β5受体(ITGAV和ITGB5 mRNA)以及可卡因和安非他明-调控的转录蛋白(CART)的信号点(粘膜下层)。两种靶mRNA被染色为红色(ITGAV和ITGB5)和绿色(CART)信号点。实验设置包括作为阴性对照探针组的DapB(二氢吡啶二羧酸还原酶)。使用20×物镜与Zeiss AxioScan获取图像。
图9.重组RUCILP2暴露于人内脏白色前脂肪细胞或小鼠腹股沟白色脂肪细胞引起参与产热/褐变的基因的表达上调。上图：脂肪细胞分化标记基因(包括Ucp1、Pparγ1、Dio2和Cox2)以及棕色脂肪细胞选择性基因(包括Cpt1b和Ebf2)在人白色前脂肪细胞(HWP)上的mRNA表达水平。培养人白色前脂肪细胞直至80％汇合，并且转入分化培养基(具有0.3ml/ml胎牛血清、8ug/ml d-生物素、0.5ug/ml胰岛素、400ng/ml地塞米松)。在12至14天后完成向成熟脂肪细胞的分化过程。从分化的第三天起，处理RUCILP2。在分化14天后收获细胞，并且通过q-PCR定量基因表达。所有基因表达水平都标准化为TATA结合蛋白(TBP)的基因表达水平。下图：来自小鼠腹股沟白色脂肪组织的基质血管部分细胞分化成脂肪细胞，并且分别用指示剂量的重组RUCILP2处理4天。该图显示了指示基因表达的qPCR。对于整联蛋白抑制剂处理，用10uM cRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，并用PBS洗涤，然后用RUCILP2处理。
数据呈现为以技术一式三份完成的代表性实验的平均值+/-SEM。统计显著性通过非配对的双尾斯氏t检验来确定。*，相对于0nM RUCILP2，p<0.05。
图10.油红O染色显示，重组RUCILP2降低了脂肪细胞中的脂质含量。根据制造商的方案，对10％福尔马林固定的脂肪细胞进行染色。
图11.重组RUCILP2刺激了MLO-Y4(鼠长骨骨细胞-Y4)细胞系中硬化蛋白的表达。使细胞与FreeStyle293培养基一起孵育4小时，并且用指示浓度的RUCILP2或鸢尾素处理16小时(上图)，其中在预处理时添加载剂(磷酸盐缓冲盐水)或10μM整联蛋白抑制剂cRGDyK共10分钟(下图)。数据表示为平均值±SEM，n＝3孔/组。使用双尾、非配对的斯氏t检验评估两组之间的显著性差异。上图，与空白组相比时，*，p<0.05，**，p<0.01，#，p<0.05，##，p<0.01。下图，与载剂组相比时，*，p<0.05。
图12.重组RUCILP2诱导小鼠C2C12成肌细胞中肌管形成。用指示剂量的RUCILP2处理C2C12肌管过夜，并且在×10放大率下获取肌管图像。
图13.重组RUCILP2处理降低参与HepG2肝细胞糖异生的基因的表达，增加参与Caco-2细胞中肠整合的基因的表达，并且刺激H9C2心肌细胞中的基因表达。用各种剂量的RUCILP2处理细胞，并且收集细胞用于对指示基因的q-PCR定量。对于整联蛋白抑制剂处理，用10uM cRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，用PBS洗涤，然后用RUCILP2处理。数据以技术一式三份完成的代表性实验的平均值+/-SEM呈现。统计显著性通过非配对的双尾斯氏t检验来确定。*，相对于0nM RUCILP2，p<0.05。
图14.当通过腔内途径灌注RUCILP2时，重组RUCILP2刺激灌注大鼠结肠中的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌。左图，在RUCILP2的存在下，来自分离的灌注大鼠结肠的GLP-1分泌，平均值±SEM，每组n＝6。右图，基线减去在10分钟(12-21分钟)腔内输注期间的总GLP-1输出。**，使用斯氏t检验p<0.01。
图15.当通过腔内途径灌注RUCILP2时，重组RUCILP2刺激灌注大鼠结肠中的肽-YY(PYY)分泌。左图，在RUCILP2的存在下，来自分离的灌注大鼠结肠的PYY分泌，平均值±SEM，每组n＝6。右图，基线减去在10分钟(12-21分钟)腔内输注期间的总PYY输出。**，使用斯氏t检验，p<0.01。
图16.当通过腔内途径灌注RUCILP2时，重组RUCILP2刺激灌注大鼠结肠中的生长抑素分泌。左图，在RUCILP2的存在下，来自分离的灌注大鼠结肠的生长抑素分泌，平均值±SEM，每组n＝6。右图，基线减去在10分钟(12-21分钟)腔内输注期间的总生长抑素输出。*，使用斯氏t检验，p<0.05。
图17.对饲喂正常食物的小鼠每天腹膜内注射重组RUCILP2共7天，诱导产热相关基因的表达并且降低脂肪生成相关基因的表达。对关于脂解的标记物基因的表达没有影响。重组RUCILP2以1mg/kg的浓度每天腹膜内注射到9周龄的野生型C57BL/6N小鼠内，持续一周。通过qRT-PCR分析所指示基因的mRNA水平。数据表示为平均值±SEM，与磷酸盐缓冲盐水(PBS)组相比时，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，n＝9只动物/组。
图18.小鼠经口管饲扭链瘤胃球菌种的各种菌株处理的体重变化。R3-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R3-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R2-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC27756；HK-R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC27756。数据以平均值+/-SEM呈现。因此，该图表明经口(管饲)活体或巴氏灭菌的扭链瘤胃球菌菌株对用饲料(Altromin 1328饮食)喂养的小鼠中在8周内的体重发展没有显著影响。
图19.小鼠经口管饲合成RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌ATCC 27756菌株降低了小鼠体脂量并增加了瘦体重(lean body mass)。给小鼠饲喂正常食物，并且干预持续8周。根据制造商的教程，对所指示的小鼠组中的身体组成进行磁共振成像扫描。R3-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R3-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R2-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；HK-R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现。通过非配对的双尾斯氏t检验确定，与PBS组相比时，*，p<0.05，*，p<0.01。
图20.经口管饲扭链瘤胃球菌物种的各种菌株处理的高脂饮食喂养的小鼠的体重发展。RT3，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915，其缺乏编码RUMTOR_00181的基因；热灭活的RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756，其存在编码RUMTOR_00181的基因；RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756，其存在编码RUMTOR_00181的基因的存在。数据以平均值+/-SEM呈现，每组10只小鼠。RT2相对于RT3，*，p<0.05；RT2相对于无菌磷酸盐缓冲盐水，#，p<0.05；RT2相对于热灭活的RT2，&，p<0.05。通过非配对的双尾t检验确定统计显著性。因此，该图显示了在用高脂饮食(研究饮食，D12451i)喂养的小鼠中，在8周的时期内，经口(管饲)补充扭链瘤胃球菌活菌株显著降低了体重发展。
图21.产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌(RT ATCC 27756)菌株改善葡萄糖耐量。给小鼠饲喂正常食物。在第6周进行葡萄糖耐量实验。左图，经口管饲产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌菌株6周后，腹膜内葡萄糖耐量测试曲线。右图，葡萄糖耐量测试(GTT)的曲线下面积。R3-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R3-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R2-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；HK-R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现。*，指示使用斯氏t检验p<0.05。i.p.表示腹膜内注射。GTT表示葡萄糖耐量测试。AUC表示曲线下面积(此处为血糖波动曲线)。
图22.产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌(RT ATCC 27756)菌株改善葡萄糖耐量。用高脂饮食饲喂小鼠。经口管饲扭链瘤胃球菌菌株6周后，进行腹膜内葡萄糖耐量测试。RT3，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915，其缺乏编码RUMTOR_00181的基因；热灭活的RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756，其存在编码RUMTOR_00181的基因；RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756，其存在编码RUMTOR_00181的基因。数据以平均值+/-SEM存在，每组10只小鼠。RT2相对于RT3，*，p<0.05，***，p<0.001；RT2相对于无菌磷酸盐缓冲盐水，#，p<0.05；RT2相对于热灭活的RT2，&，p<0.05。通过非配对的双尾t检验确定统计显著性。Ip表示腹膜内注射。GTT表示葡萄糖耐量测试。
图23.对饲喂正常食物的小鼠经口管饲产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌菌株(RT ATCC 27756)八周，激活产热相关基因的表达并且降低腹股沟脂肪细胞中的脂肪生成基因的表达。对从小鼠腹股沟脂肪组织中提取的RNA进行q-PCR定量。R3-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R3-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R2-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；HK-R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现。n＝3-4只小鼠/组。*，相对于以5×108菌落形成单位/100μl组的扭链瘤胃球菌ATCC 35915，p<0.05。
图24.对饲喂正常食物的小鼠经口管饲产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌菌株(RT ATCC 27756)八周，引起胫骨皮质厚度的增加。左图，各组中胫骨中段的横截面的3D图像。右图，从各组的3D图像中获取的皮质厚度。*，伪发现率校正的p<0.05。R3-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R3-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R2-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；HK-R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现。n＝3-4只小鼠/组。*，通过斯氏t检验确定的p<0.05。
图25.显示了空腹人血浆中存在RUCILP2的代表性色谱图。在人血浆样品中发现的独特胰蛋白酶RUCILP2肽(EAAGYNVYVDGVK)的y-离子平行反应监测(PRM)洗脱曲线。上图是在人血浆样品中发现的轻肽的碎片离子(方框a)的PRM迹线，下图是掺入分级的人血浆样品中的10.0飞摩尔重同位素标记的(Lys 13C6，15N4)合成肽(内标，IS)的碎片离子(方框b)的PRM迹线。各肽的保留时间标记在x轴上，并且y轴代表每个碎片离子峰的相对强度。在去糖基化之后，耗尽一毫升人血浆样品中的白蛋白和免疫球蛋白G。通过SDS-PAGE分辨去糖基化的血浆，并且切除与完全去糖基化的RUCILP2(10–15kDa)相对应的分子量区域，并且随后在凝胶中消化过夜，然后进行LC-MS/MS检测。基于对处理后的人血浆中发现的碎片离子和掺有重同位素标记的内标的血浆中发现的碎片离子的相对强度的比较分析，我们估计人血浆中RUCILP2的个体间浓度在10至100pg/ml之间变化。
图26.RUCILP2和21-AABP2之间的氨基酸序列比对。通过Clustal Omega进行多重序列比对。21-AABP2的序列以灰色突出显示。
图27.21-AABP2和整联蛋白αV/β5受体的分子对接模型。虚线指示由两个配体形成的氢键，21-AABP2的结合位点以氨基酸残基编码显示。在PyMOL(v2.1.1)程序中可视化ZDOCK网络服务器(ZDOCK(https://zdock.umassmed.edu/)预测的RUCILP2和整联蛋白αV/β5受体复合物的最佳模型，以显示在21-AABP2的Y5、F6、E8和N17处分别与整联蛋白αV/β5受体的结合氨基酸残基。该对接模型预测了21-AABP2和整联蛋白αV/β5受体之间的潜在结合以及结合位点。
图28.21-AABP2促进人内脏白色前脂肪细胞(HWP)中的产热/褐变相关基因的表达，诱导小鼠腹股沟前脂肪细胞中调控产热的关键基因的表达，并且刺激小鼠C2C12成肌细胞中肌生成相关基因的表达。培养来自人内脏脂肪的白色前脂肪细胞(C-12732，PromoCell)直至80％汇合，并且转入至存在15nM 21-AABP2的分化培养基(具有0.3ml/ml胎牛血清(FCS)、8ug/ml d-生物素、0.5ug/ml胰岛素、400ng/ml地塞米松)。在14天后完成向成熟脂肪细胞的分化过程。分化14天后收获细胞，并且通过q-PCR定量所指示的基因。解剖来自6周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠的腹股沟脂肪组织，并且用PBS洗涤，切碎并在37℃下于含有10mM CaCl2、2.4U/ml分散酶II(Roche)和10mg/ml胶原酶D(Roche)的PBS中消化1小时。在添加具有10％FCS的温热DMEM/F12(1:1)后，通过70mm细胞滤网来过滤经消化的组织，并且以600×g离心10分钟。将沉淀物通过具有10％FCS的40ml DMEM/F12(1:1)进行重悬浮，并且通过40mm细胞滤网来过滤，随后以600×g离心10分钟。使形成沉淀的腹股沟基质血管细胞生长至汇合并且分到12孔板上。通过用1mM罗格列酮、5mM地塞米松、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤处理2天来诱导细胞分化。这之后，细胞在1mM罗格列酮中保持4天，伴随每隔一天更换培养基。在6天的分化过程中，每隔一天用15nM 21-AABP2处理细胞。在分化6天后收获细胞，并且通过q-PCR定量产热基因。培养C2C12成肌细胞(CRL-1772，ATCC)直至80％汇合，并且转入分化培养基(含2％马血清)。从分化的第二天起，用21-AABP2处理。分化4天后收获细胞，并通过q-PCR定量肌生成基因的表达。数据以生物一式三份完成的代表性实验的平均值+/-SEM呈现。统计显著性通过非配对的双尾斯氏t检验来确定，*，p<0.05
图29.21-AABP2增加C2C12小鼠成肌细胞中的肌管发育。在磷酸盐缓冲盐水(PBS，空白)或21-AABP2(15nM)的存在下，分化24小时时成肌细胞(CRL-1772，ATCC)的代表性图像。所呈现的图像来自以生物一式三份完成的代表性实验。
图30.来自永生化的大鼠胰岛素瘤INS-1细胞的胰岛素释放在21-AABP2刺激之后增加。INS-1细胞(832/13，ThermoFisher)在RPM 1640培养基中生长直至达到70％的汇合，并且转入提供有15nM 21-AABP2的RPM 1640培养基并孵育12小时。通过MSD大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒，来测量细胞培养基上清液中的胰岛素浓度。数据以生物一式三份完成的代表性实验的平均值+/-SEM来呈现。统计显著性通过非配对的双尾斯氏t检验来确定，*，p<0.05。
图31.RUMTOR_00181蛋白质的高质量3D结构。SP，信号肽，TD，跨膜结构域，FNIII，含纤连蛋白III型结构域。蓝带展示未注释的区域。使用多重序列比对23，使用经由ColabFold23和MMseqs224用于预测蛋白质结构的人工智能算法AlphaFold222，对蛋白质结构进行建模。
图32.鸢尾素与RUCILP1和RUCILP2的比对。(A)来自RUCILP 1(88aa)的总共27个氨基酸与鸢尾素相同。(B)证实了来自RUCILP2(87aa)的30个氨基酸残基与鸢尾素相同。两个序列之间相同的残基用星号表示；低相似度和高相似度分别用句点和冒号表示。
图33.RUCILP1和RUCILP2序列之间的比对。来自RUCILP 1(88aa)的总共65个氨基酸与RUCILP2(87aa)相同。两个序列之间相同的残基用星号表示；低相似度和高相似度分别用句点和冒号表示。
图34.RUMTOR_00181蛋白和胰蛋白酶/LysC依赖性切割的提议拓扑结构，用于将RUCILP1和RUCILP2释放到细菌细胞外空间。aa，氨基酸残基，K，赖氨酸，LysC，在赖氨酸残基的C末端侧上切割蛋白质的内切蛋白酶。
图35.经口管饲合成RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌ATCC 27756菌株的小鼠，降低饲料饲喂八周的小鼠的体脂量并增加瘦体重。给小鼠饲喂正常食物，并且干预持续八周。根据制造商的教程，对所指示的小鼠组中的身体组成进行磁共振成像(MRI)扫描。PBS，磷酸盐缓冲盐水；R3-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R3-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；R2-LD，剂量为5×107菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；HK-R2-HD，剂量为5×108菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现。*，p<0.05和**，p<0.01，通过非配对的双尾斯氏t检验确定。
图36.用合成RUMTOR_00181的ATCC 27756扭链瘤胃球菌菌株经口管饲经高脂饮食饲喂的小鼠降低了腹股沟和附睾脂肪的组织重量。PBS，磷酸盐缓冲盐水；RT3，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；热灭活的RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现，每组10只小鼠；iWAT，腹股沟白色脂肪组织；eWAT，附睾白色脂肪组织。数据以平均值+/-SEM呈现。*，p<0.05，通过单因素ANOVA且随后通过Turkey事后校正确定。
图37.通过经口管饲产生RUMTOR_00181的ATCC 27756扭链瘤胃球菌菌株，激活了用高脂饮食饲喂的小鼠的脂肪组织中的产热，降低了脂肪生成，增强了脂解并下调了炎症。PBS，磷酸盐缓冲盐水；RT3，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC35915；热灭活的RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC27756；RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现，每组10只小鼠。ns，无显著性，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，利用单因素ANOVA且随后通经Turkey事后校正确定。
图38.通过苏木精和伊红染色可视化，经口管饲产生RUMTOR_00181的ATCC 27756扭链瘤胃球菌菌株降低用高脂饮食饲养的小鼠的腹股沟脂肪中的脂肪细胞尺寸。PBS，磷酸盐缓冲盐水；RT3，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；热灭活的RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。
图39.经口管饲产生RUMTOR_00181的ATCC 27756扭链瘤胃球菌菌株增强用高脂饮食饲养的小鼠的腹股沟白色脂肪组织中，在蛋白质水平下的褐变标记物UCP1表达。PBS，磷酸盐缓冲盐水；RT3，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；热灭活的RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现，每组6只小鼠。使用单因素ANOVA随后为Turkey事后校正确定，**，p<0.01；***，p<0.001。
图40.经口管饲产生RUMTOR_00181的ATCC 27756扭链瘤胃球菌菌株激活用高脂饮食喂养的小鼠的股骨远端中的骨形成。上图证实了股骨的代表性3D横截面图像，下图总结了从3D(左)和2D(右)图像中收集的皮质厚度的比较。PBS，磷酸盐缓冲盐水；RT3，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 35915；热灭活的RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的热灭活的扭链瘤胃球菌ATCC 27756；RT2，剂量为5×109菌落形成单位/100μl的扭链瘤胃球菌ATCC 27756。数据以平均值+/-SEM呈现，每组6只小鼠。使用单因素ANOVA随后为Turkey事后校正确定，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图41.RUCILP1和RUCILP2与整联蛋白αV/β5受体结合的SPOT肽微阵列(μSPOT)测定的图像。(A)在6x-His抗体的直接孵育后，不含合成的15-mer肽的纤维素膜图像。(B)在与整联蛋白αV/β5受体相互作用，随后与6x-His抗体一起孵育后，分别附接RUCILP1(左)和RUCILP2(右)的15-mer肽的合成文库的纤维素膜的代表性图像。
图42.鉴定RUCILP与整联蛋白αV/β5受体的结合表位的系统筛选结果。(A)RUCILP1的15-mer肽(SEQ ID NO:22-95)的相对整联蛋白αV/β5(2.5nM)结合。(B)RUCILP2的15-mer肽(SEQ ID NO:96-168)的整联蛋白αV/β5(2.5nM)结合。数据以一式三份定量的平均值±SD表示。
图43.RUCILP的AlphaFold 3D结构。(A)通过AlphaFold预测的RUCILP1结构。(B)通过AlphaFold预测的RUCILP2结构。(C)鸢尾素的晶体结构。(D)RUCILP1(上)和RUCILP2(下)的静电表面示意图。在A至C中，负责与整联蛋白αV/β5受体结合的环以红色标记。在D中，红色区域指示两种蛋白质的柔性C末端。
图44.RUCILP1(A图)和RUCILP2(B图)在各种细胞类型的基因表达研究中的体外作用。在RUCILP1(A)和RUCILP2(B)处理后，在小鼠3T3-L1成纤维细胞上的棕色脂肪细胞选择性基因和白色脂肪细胞标记物基因、在小鼠成骨细胞上的骨重塑标记物基因以及在小鼠成肌细胞上的肌管形成基因的mRNA表达水平。*指示使用单因素ANOVA随后为Dunnett事后校正的p<0.05。数据以平均值±SEM表示，n＝3孔/组。
图45.21-AABP1对小鼠3T3-L1成纤维细胞的作用。数据以平均值±SEM表示，n＝3孔/组。
图46.RUCILP1和RUCILP2对体内基因表达的作用。重组RUCILP以1mg/kg的浓度每天一次腹膜注射至8周龄的野生型C57BL/6N小鼠，持续一周。通过qRT-PCR分析皮下白色脂肪组织(SWAT)和肝脏中的指示基因的mRNA水平。n＝6只动物/组。*指示使用单因素ANOVA随后为Dunnett事后校正的p<0.05。数据以平均值±SEM表示。
图47.RUCILP1和RUCILP2中针对整联蛋白αV/β5受体的19-mer表位的丙氨酸扫描。(A)与RUCILP1的19-mer表位(SEQ ID NO:169-188)的丙氨酸扫描文库结合的相对整联蛋白αV/β5(2.5nM)。(B)与RUCILP2的19-mer表位(SEQ ID NO:189-208)的丙氨酸扫描文库结合的相对整联蛋白αV/β5(2.5nM)。数据以一式三份定量的平均值±SEM表示。
图48.RUCILP1和RUCILP2中针对整联蛋白αV/β5受体的19-mer表位的截短扫描。(A)与RUCILP1的19-mer表位(SEQ ID NO:209-241)的截短扫描文库结合的相对整联蛋白αV/β5(2.5nM)。(B)与RUCILP2的19-mer表位(SEQ ID NO:242-274)的截短扫描文库结合的相对整联蛋白αV/β5(2.5nM)。深色条突出显示了在减去背景信号后增强的结合命中。数据以一式三份定量的平均值±SD表示。
具体实施方式
定义
氨基酸取代–如本文使用的，术语“氨基酸取代”指肽、多肽或蛋白质中从一种氨基酸到不同氨基酸的改变。取代可以是保守取代，其中氨基酸被交换成具有相似性质的另一种氨基酸。取代也可以是非保守取代，其中氨基酸被交换成具有不同性质的另一种氨基酸。氨基酸的性质包括例如氨基酸的电荷、极性、酸度、大小和疏水性。
骨病症-如本文使用的，术语“骨病症”指影响人骨骼的肌骨骼病症、疾病、损伤和状况的亚组。特别地，它指骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。骨质疏松症可分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。原发性骨质疏松症是该疾病的最常见形式，并且包括绝经后骨质疏松症(I型)和老年性骨质疏松症(II型)。继发性骨质流失(骨质疏松症)存在众多原因，包括各种药物治疗的副作用、内分泌紊乱、进食障碍、制动(immobilization)、骨髓相关病症、胃肠道或胆道病症、肾脏疾病和癌症。
同一性-就多核苷酸或多肽而言，术语同一性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口，以实现最大百分比同一性后，候选序列中与相应天然核酸或氨基酸残基相同的核酸或氨基酸的百分比。5'或3'延伸或插入(对于核酸)或者N'或C'延伸或插入(对于多肽)都不引起同一性的降低。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。
活体生物药(LBP)–如本文使用的，术语“活体生物药”或“LBP”指具有以下特征的生物产品：
i)含有活的微生物，例如细菌或酵母；
ii)适用于人类的疾病或病症的预防、治疗或治愈；和
iii)不是疫苗、粪便微生物群移植或基因治疗试剂。
代谢病症–如本文使用的，术语“代谢病症”指负面地改变身体对宏量营养素(例如蛋白质、脂肪和碳水化合物)加工和分配的病症。特别地，如本文使用的，术语‘代谢病症’指与代谢综合征有关的疾病、病症和状况。
代谢综合征–如本文使用的，术语“代谢综合征”指一系列病理状况的并发症，包括肥胖、高血压、高血糖、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白，以及心血管疾病、FLD、前驱糖尿病和T2D。相关概念例如X综合征、胰岛素抵抗综合征、内脏脂肪综合征和多危险因素综合征也涵盖如本发明中使用的“代谢综合征”内。在本发明中，预防或治疗代谢综合征意指预防或治疗选自如上文提到的病理状况组的至少一种病理状况中的症状的发生。
肌肉病症–如本文使用的，术语“肌肉病症”指影响人关节和肌肉的肌肉骨骼病症、疾病、损伤和状况以及神经肌肉病症的亚组。特别是指肌营养不良，例如杜兴氏肌营养不良、肌萎缩侧索硬化(ALS)、兰伯特-伊顿综合征(兰伯特-伊顿肌无力综合征)、重症肌无力、多发性肌炎和周围神经病变。
前驱糖尿病–如本文使用的，术语“前驱糖尿病”指以血糖水平升高为特征的状况。许多(但并非全部)患有前驱糖尿病的患者将发展T2D。可通过测量血红蛋白A1C、空腹血糖或葡萄糖耐量测试来诊断前驱糖尿病，其中指示前驱糖尿病的结果是A1C为5.7％至6.4％、空腹血糖为100mg/dl至125mg/dl，以及口服葡萄糖耐量测试(OGTT)2小时血糖为140mg/dl至199mg/dl。
治疗–如本文使用的，术语“治疗”可以指任何类型的治疗。治疗可以是治愈性治疗；它也可以是改进治疗和/或降低所治疗的疾病、损伤和/或病症的影响的治疗。治疗还可以是延迟所治疗的疾病、损伤和/或病症的进展和/或发展的治疗。治疗还可以是预防的/预防性的，即消除或降低发展本文公开的疾病、损伤和/或病症的风险的治疗。
多肽
本发明涉及衍生自肠道细菌菌株扭链瘤胃球菌的含纤连蛋白III型结构域的蛋白5(FNDC5)或RUMTOR_00181(UniProt ID：A5KIY5)的多肽。特别地，本发明涉及包含FNDC5多肽或RUMTOR_00181(RUCILP1；RUCILP2；扭链瘤胃球菌鸢尾素样肽1或2)的片段的多肽，以及其变体和片段，例如RUCILP1(21-AABP1；21-氨基酸细菌肽1)或RUCILP2(21-AABP2；21-氨基酸细菌肽2)的21氨基酸片段，以及21-AABP2或21AABP1的片段和变体。
因此，本文提供了长度小于200个氨基酸的分离的多肽，其包含选自以下项组成的组中的氨基酸序列或由选自以下项组成的组中的氨基酸序列组成：
a.根据SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
b.SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性，但与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有小于99％的序列同一性；
c.SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的变体，其中所述变体相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至40个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有5、10、15、20、25、30或35个氨基酸取代；
d.长度为至少10个氨基酸的SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的片段，或者相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19分别具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的所述片段的变体，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
e.通过在N末端处截短至少一个氨基酸，例如1至67个氨基酸，例如1至60个氨基酸，例如1至50个氨基酸，例如1至40个氨基酸，例如1至30个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至10个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代的变体；
f.通过在C末端处截短至少一个氨基酸，例如1至21个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至15个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至30个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、5、10、15、20或25个氨基酸取代的变体；
g.通过在N末端处截短至少一个氨基酸，1至67个氨基酸，例如1至60个氨基酸、例如1至50个氨基酸、例如1至40个氨基酸、例如1至30个氨基酸、例如1至20个氨基酸、例如1至10个氨基酸、例如1至5个氨基酸，以及在C末端处截短至少一个氨基酸、例如1至21个氨基酸、例如1至20个氨基酸、例如1至15个氨基酸、例如1至10个氨基酸、例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，其中所述多肽具有至少10个氨基酸的长度，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的变体；
h.根据SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
i.SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％的序列同一性，但与SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有小于99％的序列同一性；
j.SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的变体，其中所述变体相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1至10个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
k.包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的至少10个连续氨基酸的SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的片段，或者其相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
1.SEQ ID NO:19的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:27、33、34、35、36、37和95，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体所组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
m.SEQ ID NO:4的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:107、108、109、110、111、165和168，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体所组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
n.SEQ ID NO:19的变体的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:173、176、181和188，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体所组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
o.SEQ ID NO:4的变体的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:193、196、201和208，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体所组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
p.SEQ ID NO:19的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:210、211、212、213、229、232、233、234和235，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体所组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；和
q.SEQ ID NO:4的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:243、244、245、246、262、265、266、267和268，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ IDNO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体所组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少10个氨基酸，例如至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少100个氨基酸的长度。
因此，在一个实施方案中，多肽具有至少15个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少20个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少25个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少30个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少35个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少40个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少45个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少50个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少55个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少60个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少65个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少70个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少75个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少80个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少85个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少90个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少95个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有至少100个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于150个氨基酸，例如小于140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30，或者小于25、20、15或10个氨基酸的长度。因此，在一个实施方案中，多肽具有小于150个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于140个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于130个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于120个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于110个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于100个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于95个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于90个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于85个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于80个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于75个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于70个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于65个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于60个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于55个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于50个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于45个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于40个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于35个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于30个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于25个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于20个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于15个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有小于10个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有10至200个氨基酸，例如10至150，例如10至100，例如10至80，例如10至50，例如10至30，例如10至15，例如25至75，例如25至60，例如30至80，例如40至70，例如15至30，例如15至25，例如18至23，例如20至22，例如50至150，例如50至100，例如70至100，例如80至90，例如85至90，例如86至88个氨基酸的长度。
因此，在一个实施方案中，多肽具有10至200个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有10至150个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有10至100个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有10至80个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有10至50个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有10至30个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有10至15个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有25至75个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有25至60个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有30至80个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有40至70个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有15至30个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有15至25个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有18至23个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有20至22个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有50至150个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有50至100个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有70至100个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有80至90个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有85至95个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽具有86至88个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少60％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少61％的同一性，例如至少62％的同一性，例如至少63％的同一性，例如至少64％的同一性，例如至少65％的同一性，例如至少66％的同一性，例如至少67％的同一性，例如至少68％的同一性，例如至少69％的同一性，例如至少70％的同一性，例如至少71％的同一性，例如至少72％，例如至少73％，例如至少74％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的同一性，例如100％的序列同一性。
因此，在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少60％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少61％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少62％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少63％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少64％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少65％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:19具有至少66％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQID NO:19具有至少67％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少68％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少69％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:19具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少71％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少72％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少73％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少74％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少75％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少76％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少77％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少78％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少79％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少80％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少81％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少82％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少83％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少84％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少85％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少86％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少87％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少88％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少89％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少91％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少92％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少93％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少94％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少95％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少96％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有至少97％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:19具有至少98％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQID NO:19具有至少99％的序列同一性。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19具有小于99％的序列同一性。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有1至25个氨基酸取代，例如与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4相比具有1至20个，例如1至15个，例如1至10个，例如1至5个，例如1至3个，例如10至20个，例如5至15个，例如5至10个氨基酸取代。
因此，在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有1至25个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有1至20个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有1至15个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有1至10个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有1至5个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有1至3个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有10至20个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有5至15个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:19相比具有5至10个氨基酸取代。
在一些实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:19的序列，或者如本文所述的其各自的变体或片段。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少90％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少61％的同一性，例如至少62％的同一性，例如至少63％的同一性，例如至少64％的同一性，例如至少65％的同一性，例如至少66％的同一性，例如至少67％的同一性，例如至少68％的同一性，例如至少69％的同一性，例如至少70％的同一性，例如至少71％的同一性，例如至少72％，例如至少73％，例如至少74％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的同一性，例如100％的序列同一性。
因此，在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少60％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少61％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少62％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少63％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少65％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少65％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:20具有至少66％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQID NO:20具有至少67％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少68％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少69％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:20具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少71％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少72％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少73％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少75％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少75％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少76％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少77％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少78％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少79％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少80％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少81％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少82％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少83％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少85％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少85％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少86％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少87％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少88％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少89％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少91％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少92％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少93％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少95％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少95％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少96％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有至少97％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:20具有至少98％的序列同一性。在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQID NO:20具有至少99％的序列同一性。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20具有小于99％的序列同一性。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有1至5个氨基酸取代，例如与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有1至4个，例如1至3个，例如2至4个，例如2至5个，例如3至5个氨基酸取代。
因此，在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有1至5个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有1至4个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有1至3个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有2至4个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有2至5个氨基酸取代。
在一个实施方案中，多肽的变体与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:20相比具有3至5个氨基酸取代。
在一些实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:20的序列，或者如本文所述的其各自的变体或片段。
在一个实施方案中，多肽的片段包含以下或由以下组成：对应于SEQ ID NO:6的根据SEQ ID NO:4的位置7至16的氨基酸序列，或者其与SEQ ID NO:4相比具有1至5个氨基酸取代、例如与SEQ ID NO:4相比具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的变体。
在一个实施方案中，多肽的片段包含以下或由以下组成：对应于SEQ ID NO:7的根据SEQ ID NO:4的位置27至39的氨基酸序列，或者其与SEQ ID NO:4相比具有1至6个氨基酸取代、例如与SEQ ID NO:4相比具有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代的变体。
在一个实施方案中，多肽的片段包含以下或由以下组成：对应于SEQ ID NO:8的根据SEQ ID NO:4的位置43至56的氨基酸序列，或者其与SEQ ID NO:4相比具有1至6个氨基酸取代、例如与SEQ ID NO:4相比具有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代的变体。
在一个实施方案中，氨基酸取代是保守取代。保守氨基酸取代是将多肽中的氨基酸替换为具有相似生物化学性质(例如相似的大小、电荷、疏水性和/或极性)的给定氨基酸。与非保守取代相比，此类取代通常对多肽功能具有较小的影响。保守氨基酸取代的实例可以在下表中看到。
保守氨基酸取代的实例。
氨基酸 保守取代
A G、S、T、V
C S、T、M
D S、K、Q、H、N、E
E P、D、S、R、K、Q、H、N
F M、V、I、L、W、Y
G A、S、N
H D、E、N、M、R、Q
I M、V、Y、F、L
K D、E、N、Q、R
L M、V、I、Y、F
M H、Q、Y、F、L、I、V
N G、D、E、T、S、R、K、Q、H
P E
Q D、E、N、H、M、S、R、K
R E、N、H、Q、K
S G、D、E、N、Q、A、T
T N、S、V、A
Y H、M、I、L、F、W
V T、A、M、F、L、I
W F、Y
在其它实施方案中，氨基酸取代是非保守取代。本文的数据表明，用碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基可能是有益的。因此，在某些实施方案中，取代包含用碱性氨基酸残基对酸性氨基酸残基的一个或多个取代。
多肽的片段可以是RUCILP1的15个氨基酸片段。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ IDNO:95的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本公开提供了根据SEQ ID NO:27、33、34、35、36、37或95中任何一个的多肽的变体，其中所述变体与衍生出其的序列，即SEQ ID NO:27、33、34、35、36、37或95相比，具有1、2或3个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开提供了长度小于50个氨基酸的分离的多肽，其包含SEQID NO:19(RUCILP1)的片段或由SEQ ID NO:19(RUCILP1)的片段组成，其中所述片段选自由SEQ ID NO:27、33、34、35、36、37和95，以及相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的其各自的变体组成的组。
多肽的片段可以是RUCILP2的15个氨基酸片段。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:108的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:109的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:110的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:111的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:165的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:168的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本公开提供了根据SEQ ID NO:107、108、109、110、111、165或168中任何一个的多肽的变体，其中所述变体与衍生出其的序列，即SEQ ID NO:107、108、109、110、111、165或168相比，具有1、2或3个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开提供了长度小于50个氨基酸的分离的多肽，其包含SEQID NO:4(RUCILP2)的片段或由SEQ ID NO:4(RUCILP2)的片段组成，其中所述片段选自由SEQ ID NO:107、108、109、110、111、165和168，以及相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的其各自的变体组成的组。
在一些实施方案中，多肽的片段是RUCILP1的19个氨基酸片段，其中一个氨基酸被丙氨酸替换。与其中没有氨基酸改变的相同片段相比，所述片段可具有对整联蛋白αV/β5受体增加的结合亲和力。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:173的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:176的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:188的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本公开提供了根据SEQ ID NO:173、176、181或188中任何一个的多肽的变体，其中所述变体与衍生出其的序列相比，具有1、2或3个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开提供了长度小于50个氨基酸的分离的多肽，其包含SEQID NO:19(RUCILP1)的变体的片段或由SEQ ID NO:19(RUCILP1)的变体的片段组成，其中所述片段选自由SEQ ID NO:173、176、181和188，以及相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的其各自的变体组成的组。
在一些实施方案中，多肽的片段是RUCILP2的19个氨基酸片段，其中一个氨基酸被丙氨酸替换。与其中没有氨基酸改变的相同片段相比，所述片段可具有对整联蛋白αV/β5受体增加的结合亲和力。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:193的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:196的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:201的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:208的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本公开提供了根据SEQ ID NO:193、196、201或208中任何一个的肽的变体，其中所述变体与衍生出其的序列相比，具有1、2或3个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开提供了长度小于50个氨基酸的分离的多肽，其包含SEQID NO:4(RUCILP2)的变体的片段或由SEQ ID NO:4(RUCILP2)的变体的片段组成，其中所述片段选自由SEQ ID NO:193、196、201和208，以及相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的其各自的变体组成的组。
在一些实施方案中，多肽的片段是RUCILP1的片段。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:210的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ IDNO:211的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:212的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:213的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:229的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:232的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:233的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:234的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:235的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本公开提供了根据SEQ ID NO:210、211、212、213、229、232、233、234或235中任何一个的肽的变体，其中所述变体与衍生出其的序列相比，具有1、2或3个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开提供了长度小于50个氨基酸的分离的多肽，其包含SEQID NO:19(RUCILP1)的片段或由SEQ ID NO:19(RUCILP1)的片段组成，其中所述片段选自由SEQ ID NO:210、211、212、213、229、232、233、234和235，以及相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的其各自的变体组成的组。
在一些实施方案中，多肽的片段是RUCILP2的片段。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:243的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ IDNO:244的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:245的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:246的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:262的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:265的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:266的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:267的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽的片段由根据SEQ ID NO:268的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本公开提供了根据SEQ ID NO:243、244、245、246、262、265、266、267或268中任何一个的肽的变体，其中所述变体与衍生出其的序列相比，具有1、2或3个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开提供了长度小于50个氨基酸的分离的多肽，其包含SEQID NO:4(RUCILP2)的片段或由SEQ ID NO:4(RUCILP2)的片段组成，其中所述片段选自由SEQ ID NO:243、244、245、246、262、265、266、267和268，以及相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的其各自的变体组成的组。
本发明人已鉴定了可能参与RUCILP2(SEQ ID NO:4)/21-AABP2(SEQ ID NO:5)与整联蛋白αV/α5受体相互作用的某些氨基酸。特别地，在SEQ ID NO:4的位置7、9和58以及SEQ ID NO:5的位置5、6和8的残基似乎分别在RUCILP2-整联蛋白αV/β5受体与21-AABP2-整联蛋白αV/β5受体相互作用中发挥作用。
因此，在一个实施方案中，多肽包含在SEQ ID NO:4的氨基酸位置7的V，或者其保守取代例如M、I、Y、F或L；和/或在SEQ ID NO:4的氨基酸位置9的E，或者其保守取代例如Q、D、K、N、H或R；和/或在SEQ ID NO:4的氨基酸位置58的E，或者其保守取代例如Q、D、K、N、H或R。在一个实施方案中，多肽包含在SEQ ID NO:4的氨基酸位置7的V，或者其保守取代例如M、I、Y、F或L；在SEQ ID NO:4的氨基酸位置9的E，或者其保守取代例如Q、D、K、N、H或R；以及在SEQ ID NO:4的氨基酸位置58的E，或者其保守取代例如Q、D、K、N、H或R。
在另一个实施方案中，多肽包含在SEQ ID NO:5的氨基酸位置5的Y，或者其保守取代例如F、W、M、I、V或L；和/或在SEQ ID NO:5的氨基酸位置6的F，或者其保守取代例如M、Y、I、L、W或V；和/或在SEQ ID NO:5的氨基酸位置8的E，或者其保守取代例如Q、D、K、N、H或R；和/或在氨基酸位置17的N，或者其保守取代例如D、S或Q。在一个实施方案中，多肽包含在SEQ ID NO:5的氨基酸位置5的Y，或者其保守取代例如F、W、M、I、V或L；在SEQ ID NO:5的氨基酸位置6的F，或者其保守取代例如M、Y、I、L、W或V；以及在SEQ ID NO:5的氨基酸位置8的E，或者其保守取代例如Q、D、K、N、H或R；和/或在氨基酸位置17的N，或者其保守取代例如D、S或Q。
本文公开的多肽可例如通过附接一个或多个部分而被进一步修饰，从而提供本发明的缀合物。此类修饰可以改善多肽的性质，下文中的多肽的体内稳定性、膜渗透性和/或半衰期。因此，在一个实施方案中，多肽包含与所述多肽缀合的一个或多个部分，任选地其中所述多肽和该一个或多个部分通过接头彼此缀合。
一个或多个部分可以是任何类型的部分。在一个实施方案中，一个或多个部分选自由烯烃、烷基、芳基、杂芳基、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)、糖类和多糖组成的组。在一个实施方案中，烷基包含1至12个碳原子，例如1至6个碳原子。在一个实施方案中，烯烃包含1至12个碳原子，例如1至6个碳原子。在一个实施方案中，脂肪酸包含1至12个碳原子，例如1至6个碳原子。
多肽可以形成任何类型的复合物，例如二聚体和/或多聚体。多肽二聚体由通过非共价键连接的两个多肽单体形成。多肽多聚体由多于两个的多肽单体形成。因此，在一个实施方案中，多肽是二聚体。在另一个实施方案中，多肽是多聚体。
发明人已表明，本文呈现的多肽以及其片段和变体在生物和细胞水平上显著影响各种过程，包括例如细胞信号传导、肽分泌和基因表达。例如，发明人已表明，本文公开的多肽与至少一种类型的整联蛋白受体；αV/β5整联蛋白受体结合。因此，在一个实施方案中，多肽能够与αV/β5整联蛋白受体结合。
整联蛋白受体或整联蛋白是促进细胞间以及细胞-细胞外基质粘附的跨膜受体。在配体结合后，整联蛋白激活介导细胞信号的信号转导途径，例如细胞周期的调控、细胞内细胞骨架的组构以及新受体向细胞膜的移动。整联蛋白是由α和β亚基构成的专性异二聚体。
aV类整联蛋白是可能存在于骨细胞和脂肪组织中的受体。本发明人已使用靶向整联蛋白αV/β5受体的信号点(ITGAV和ITGB5 mRNA)的基于双链体RNAscope的mRNA原位杂交阵列，进一步表明整联蛋白αV/β5受体存在于人结肠组织的粘膜下层中。
脂肪组织或体脂主要由脂肪细胞构成。两种主要类型的脂肪组织是白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)。WAT负责能量贮存，例如贮存甘油三酯，而BAT是对于人和其它哺乳动物中的适应性产热重要的特殊形式的脂肪组织。WAT的褐色化，也被称为“米色化(beiging)”，发生在WAT储库内的脂肪细胞发展出BAT的特征时。米色脂肪细胞呈现多腔外观(含有几个脂滴)，并且增加包括解偶联蛋白1(UCP1)在内的几种蛋白质的表达。在这种情况下，这些通常贮存能量的脂肪细胞变成释放能量的脂肪细胞。
发明人已表明，本文公开的多肽以及所述多肽的片段和变体诱导白色脂肪细胞中的产热。换言之，多肽诱导WAT的褐色化。特别地，多肽诱导参与产热的基因的表达，并且例如通过降低脂肪细胞中参与脂肪生成的基因的表达来降低脂肪生成。因此，在一个实施方案中，多肽例如通过诱导参与产热的基因的表达来诱导白色脂肪细胞中的产热。在一个实施方案中，多肽诱导人白色前脂肪细胞中选自由Ucp1、Pparγ1、Dio2、Cox2、Cpt1b和Ebf2组成的组中的一种或多种基因的mRNA表达，其中所述mRNA表达水平通过q-PCR定量。在一个实施方案中，多肽诱导参与产热的一种或多种基因的体内mRNA表达，其中所述基因选自由UCP1、Dio1、Elovl3、Cidea、Cox2和Prdm16组成的组，其中mRNA表达的水平通过q-PCR来定量。
在一个实施方案中，多肽例如通过降低参与脂肪生成的基因的表达来降低脂肪细胞的脂质含量。在一个实施方案中，多肽降低脂肪细胞中的脂质含量，其中所述降低使用油红O染色来测量。在一个实施方案中，多肽降低参与脂肪生成的一种或多种基因(例如Acaca、Scd1和/或Fasn)的体内mRNA表达，其中所述mRNA表达的水平通过q-PCR来定量。
WAT的大量沉积与肥胖和代谢综合征密切相关。除了肥胖之外，代谢综合征患者通常还患有高血压、高血糖、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白(HDL)。代谢综合征还与胰岛素抵抗、T2D、FLD、肠道屏障连接受损和心血管疾病密切相关。
发明人已表明，本文公开的多肽以及其片段和变体作用于与代谢综合征有关的几种因素，例如基因和激素。例如，发明人已表明，多肽刺激胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰岛素、肽-YY(PYY)和生长抑素的分泌，并且它诱导重量减轻并改善体内葡萄糖耐量。
因此，在一个实施方案中，多肽刺激GLP-1和胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的分泌。在一个实施方案中，多肽刺激肠腔释放GLP-1和GLP-2。GLP-1是能够以葡萄糖依赖的方式促进胰岛素分泌的肽激素。GLP-1通过促进胰岛素基因转录、mRNA稳定性和生物合成，进一步确保了β细胞胰岛素贮存得到补充，以防止分泌过程中的耗竭。在胃中，GLP-1抑制胃排空、酸分泌和蠕动，从而共同降低食欲。GLP-1与胰高血糖素样肽2(GLP-2)以等摩尔量分泌。
在一个实施方案中，多肽刺激胰岛素的分泌。在一个实施方案中，多肽刺激INS-1细胞释放胰岛素。胰岛素是由胰岛的β细胞产生并且响应食物摄入而释放到血液内的肽激素。它被视为人体的主要合成代谢激素。胰岛素通过促进葡萄糖从血液吸收到肝脏、脂肪和骨骼肌细胞内，来调控碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢。血液中高浓度的胰岛素强烈抑制或消除肝脏产生和分泌葡萄糖。胰岛素活性的减少或缺失导致糖尿病(在下文称为T2D)。
在一个实施方案中，多肽刺激PYY的分泌。在一个实施方案中，多肽刺激PYY的肠腔释放。PYY是响应进食由回肠和结肠中的细胞释放的短肽。在血液、肠道和外周的其它元件中，PYY起到降低食欲的作用。
在一个实施方案中，多肽刺激生长抑素的分泌。在一个实施方案中，多肽刺激生长抑素的肠腔释放。生长抑素是通过消化系统中的δ细胞分泌的肽激素。它降低胃排空率，并且抑制胰腺激素的释放，例如胰岛素和胰高血糖素的分泌。
在一个实施方案中，多肽改善葡萄糖耐量。葡萄糖耐量被定义为处置葡萄糖负荷的能力。在患有代谢综合征的大多数患者中可能可见的葡萄糖耐受性不良被定义为对葡萄糖处置的能力受损。用于测试葡萄糖耐量的方法是本领域众所周知的，并且包括例如用口服葡萄糖负荷挑战受试者并测量在挑战之前和之后的循环葡萄糖。
在一个实施方案中，多肽降低参与糖异生的基因的表达。在一个实施方案中，多肽降低HepG2细胞中G6pase和/或Pepck的mRNA表达，其中所述mRNA表达水平使用q-PCR定量。
在一个实施方案中，多肽增强肠屏障连接。在一个实施方案中，多肽增加Caco-2细胞中参与肠整合的基因(例如Ocln和/或ZO-1)的mRNA表达，其中所述mRNA表达水平使用q-PCR定量。肠屏障确保肠内的腔内容物的充分容纳，同时保存吸收营养的能力。肠屏障连接的功能障碍与众多健康状况有关，包括代谢综合征、FLD和糖尿病(例如T2D)。
在一个实施方案中，多肽诱导重量减轻。在一个实施方案中，多肽降低受试者(例如小鼠、大鼠或人)的脂肪量并增加瘦体质量。在一个实施方案中，多肽诱导患有肥胖的受试者中的重量减轻。肥胖是其中过量体脂已累积到可能对健康具有负面影响程度的医学状况。当体重指数(BMI)高于30kg/m2时，人通常被认为肥胖。BMI在25至30kg/m2之间的人被定义为超重。如上文陈述的，肥胖以及某种程度上的超重与各种疾病和病理状况(在下文中的心血管疾病、肌肉骨骼病症、T2D和FLD)相关联。
骨细胞是成熟骨组织中最常见的细胞。骨细胞合成硬化蛋白，其可以通过拮抗骨形成、降低成骨细胞生成和成骨细胞活性来增加骨吸收。已发现，骨骼中缺乏硬化蛋白表达是硬化性骨化病中的高骨量的原因。已进一步表明，鸢尾素可以通过改善硬化蛋白的分泌来调节骨形成。在各种骨骼病症(下文中称为骨质疏松症)中，形成成熟骨组织的能力受损，导致骨脆性和骨折风险增加。发明人已表明，本文公开的多肽刺激骨形成，并且增加胫骨的皮质厚度。因此，在一个实施方案中，多肽例如通过刺激骨细胞中的硬化蛋白表达来刺激骨形成。在一个实施方案中，多肽诱导MLO-Y4(小鼠长骨骨细胞-Y4)细胞中编码硬化蛋白的基因的mRNA表达，其中所述mRNA表达水平使用q-PCR定量。在另一个实施方案中，多肽增加胫骨的皮质厚度。
在一个实施方案中，多肽诱导心肌生成。心肌生成涉及骨髓干细胞的增殖，所述骨髓干细胞随后分化成心肌细胞。在一个实施方案中，多肽增加H9C2心肌细胞中FST(卵泡抑素)的mRNA表达，其中所述mRNA表达水平使用q-PCR定量。
在一个实施方案中，多肽诱导肌管形成和肌生成。在一个实施方案中，多肽增加所形成的肌管的数目。在一个实施方案中，多肽增加C2C12成肌细胞中的肌管形成。在一个实施方案中，多肽增加参与肌生成的基因(例如Mymk和/或Caveolin-3)的mRNA表达，其中所述mRNA表达水平通过q-PCR定量。肌生成是骨骼肌组织的形成，即肌肉形成。肌肉一般通过成肌细胞融合成肌管而形成。在患有肌肉骨骼病症和肌营养不良的患者中，例如在患有杜兴氏肌营养不良的患者中，肌生成经常是受损的。据报道，肌生成受损或肌无力存在于ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力和多发性肌炎中。
核酸/载体/宿主细胞
本文还提供了分离的多核苷酸，其编码在本文“多肽”一节中呈现的多肽。
在一个实施方案中，分离的多核苷酸选自由SEQ ID NO:9至18组成的组，例如SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。在优选的实施方案中，多肽选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的组。
还提供了包含本文呈现的多核苷酸的载体。载体可以是任何类型的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如选自由细菌表达载体、哺乳动物表达载体和昆虫表达载体组成的组中的表达载体。在一个实施方案中，表达载体是大肠杆菌(E.coli)表达载体(例如pGEX-4T-1表达载体)，或昆虫表达载体(例如SF9-昆虫表达载体)。
进一步提供了包含本文呈现的多核苷酸的宿主细胞。宿主细胞可以是能够表达且分泌由本文公开的多核苷酸编码的多肽的任何类型的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人肠道微生物群中天然存在的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞选自由乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和扭链瘤胃球菌组成的组。在优选实施方案中，宿主细胞选自由大肠杆菌和扭链瘤胃球菌组成的组。
如本文所述的多核苷酸和/或载体可以不是天然地包含在所述宿主细胞中。因此，在一些实施方案中，所述宿主细胞中包含的多核苷酸对于所述宿主细胞是异源的。在一些实施方案中，所述宿主细胞中包含的载体对于所述宿主细胞是异源的。在一些实施方案中，所述宿主细胞中包含的多核苷酸和/或载体对于所述宿主细胞是异源的。
在一些实施方案中，宿主细胞是扭链瘤胃球菌ATCC 27756。在一些实施方案中，宿主细胞是扭链瘤胃球菌AM22-16。在一些实施方案中，宿主细胞是扭链瘤胃球菌aa_0143。在一些实施方案中，宿主细胞是扭链瘤胃球菌2789STDY5834841。
药物组合物
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的多肽、缀合物、多核苷酸、载体和/或宿主细胞。所述药物组合物还可以包括：包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述蛋白质的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞。
药物组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或其它添加剂。
药物组合物可以进一步包含一种或多种适合于治疗本文公开的适应症的另外的活性成分。
医学用途
本文呈现的数据表明，本文所述的多肽或包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，以及其片段和变体，有效治疗和预防代谢病症、肌肉病症和损伤以及骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。
因此，本文提供了根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物，其用作药物。在一些实施方案中，本文提供了包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述蛋白质的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞，其用作药物。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物用于治疗代谢病症。在一个实施方案中，代谢病症选自由代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D和FLD组成的组。在一些实施方案中，提供了包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述蛋白质的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞，其用于治疗代谢病症，例如选自由代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D和FLD组成的组的代谢病症。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物用于治疗肌肉病症和/或肌肉损伤。在一些实施方案中，提供了包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述多肽的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞，其用于治疗代谢病症。在一个实施方案中，肌肉病症选自由肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎和周围神经病变组成的组。
在一个实施方案中，根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物用于治疗骨病症。在一些实施方案中，提供了包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述多肽的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞，其用于治疗骨病症。在优选实施方案中，骨病症选自由骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症组成的组。
因此，本文提供了多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物，其用于治疗和/或预防代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症。在一些实施方案中，提供了包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述多肽的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞，其用于治疗和/或预防代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症。
本文进一步提供了根据本发明的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物，其用于治疗和/或预防选自由以下组成的组的疾病、病症和状况：代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。在一些实施方案中，提供了包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述多肽的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞，其用于治疗和/或预防选自以下的疾病、病症和状况：代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。
本文还提供了多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主和/或药物组合物在制备用于治疗以下的药物中的用途：代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。在一些实施方案中，提供了包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述多肽的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞在制备用于治疗以下的药物中的用途：代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。
本文进一步提供了用于治疗以下的方法：代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症，其中所述方法包括：将本文所述的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主和/或药物组合物施用于有此需要的个体。在一些实施方案中，提供了用于治疗以下的方法：代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症，其中所述方法包括：将包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述多肽的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞施用于有此需要的个体。
施用治疗有效量的多肽、缀合物、多核苷酸、载体、宿主和/或药物组合物。类似地，施用治疗有效量的包含所述多肽的天然存在的蛋白质，例如SEQ ID NO:21所示的扭链瘤胃球菌蛋白RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5)，或者编码所述多肽的载体或多核苷酸，或者包含所述载体或多核苷酸的宿主细胞。
在一个实施方案中，个体或受试者是哺乳动物，优选人类。
在一个实施方案中，本公开提供了扭链瘤胃球菌，其用于治疗代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。
益生菌或活体生物药用途
本文呈现的数据表明，当包含在益生菌或活体生物药(LBP)中时或当作为膳食组合物施用时，本文所述的多肽，包含所述多肽(例如扭链瘤胃球菌RUMTOR_00181(Uniprot:A5KIY5))的天然存在的蛋白质，以及其片段和变体是有用的。
在一些方面，因此提供了膳食组合物，其包含：
a)如本文别处所述的多肽或缀合物；
b)包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽：
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与SEQ ID NO:21具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的其变体；
c)如本文别处所述的多核苷酸；
d)编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
e)如本文别处所述的载体；
f)包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；和/或
g)根据项目24至26中任一项的宿主细胞；和/或
h)包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；和/或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
其中所述膳食组合物任选进一步包含益生元、益生菌、合生元、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、纤维和/或营养素(例如膳食矿物质)中的一种或多种。
在一些方面，还提供了包含以下的宿主细胞，其用作益生菌或活体生物药(LBP)：
a)如本文别处所述的多肽或缀合物，和/或包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与SEQ ID NO:21具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的其变体；
b)如本文其它地方所述的多核苷酸和/或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；和/或
c)如本文其它地方所述的载体和/或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体。
在另一个方面，提供了包含以下的宿主细胞作为益生菌或活体生物药(LBP)的用途：
a)如本文其它地方所述的多肽或缀合物，和/或包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与SEQ ID NO:21具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的其变体；
b)如本文其它地方所述的多核苷酸和/或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；和/或
c)如本文其它地方所述的载体和/或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体。
另一个方面提供了以下项在用作食品成分或者作为食品或饮品添加剂中的用途：
如本文其它地方所述的多肽或缀合物，或者包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽：
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与其SEQ ID NO:21具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的其变体；
如本文其它地方所述的多核苷酸，或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
如本文其它地方所述的载体，或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
如本文其它地方所述的宿主细胞，或包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:21的变体与SEQ ID NO:21具有至少70％，例如至少71％，例如至少72％，例如至少73％，例如至少74％，例如至少75％，例如至少76％，例如至少77％，例如至少78％，例如至少79％，例如至少80％，例如至少81％，例如至少82％，例如至少83％，例如至少84％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列同一性。
向受试者施用所述益生菌、活体生物药(LBP)或膳食组合物具有一系列健康益处。在一些实施方案中，施用所述益生菌、LBP或膳食组合物引起本文其它地方关于施用分离的多肽所描述的效果。
在一些实施方案中，所述益生菌、LBP或膳食组合物的施用例如通过减少白色脂肪组织的脂肪细胞大小而引起体脂量的降低。在一些实施方案中，所述益生菌、LBP或膳食组合物的施用引起瘦体重的增加。
在一些实施方案中，所述益生菌、LBP或膳食组合物的施用引起脂肪组织中的产热的增加，例如通过编码产热标记物(例如Ucp1、Cidea或Dio2)的mRNA或相应mRNA的表达增加来测量的产热增加。在一些实施方案中，所述益生菌、LBP或膳食组合物的施用引起脂肪生成减少，例如通过编码参与脂肪生成的基因(例如Fasn、Scd1和Acaca)的mRNA或相应基因的表达降低测量的脂肪生成减少。在一些实施方案中，所述益生菌、LBP或膳食组合物的施用引起脂肪组织中UCP1的蛋白质水平增加。
在一些实施方案中，所述益生菌、LBP或膳食组合物的施用引起葡萄糖耐量的改善。在一些实施方案中，所述益生菌、LBP或膳食组合物的施用引起骨量的增加。
实施例
实施例1–由人肠道微生物群中的常见共生细菌菌株释放的新型多肽激素的探索和表征
主要结果
应用计算机芯片上(in silico)的(比对)方法，我们在约5600个原核生物全基因组中搜索与118种哺乳动物多肽激素、代谢相关细胞因子和神经肽的部分序列同源性。我们在2019年的第4周通过搜索公开可获得的科学文献，鉴定了118种肽和细胞因子。一个比对命中预测了细菌前多肽的存在，所述细菌前多肽与已知的人前体蛋白(含纤连蛋白III型结构域蛋白5(FNDC5))具有相对较高的同源性6(图1)。包括信号肽的212个氨基酸的人FNDC5主要在骨骼肌中表达，在骨骼肌中，其在急性运动之后被切割为由112个氨基酸组成的肌细胞因子(myokine)鸢尾素7。
细菌FNDC5样蛋白包含142个氨基酸，其中66％的氨基酸显示与人FNDC5的相似性(通过用与人FNDC5具有相同和相似的化学结构的细菌FNDC5样蛋白中的氨基酸数目除以细菌FNDC5样蛋白的长度并乘以100％来计算)。细菌FNDC5样蛋白由共生扭链瘤胃球菌(RT)种的4种菌株表达，该共生扭链瘤胃球菌(RT)种中20种已知菌株在人肠道微生物群中既普遍存在又高度丰富(高达10％)8。据预测，具有编码FNDC5样蛋白的基因的四种RT菌株合成87氨基酸的多肽，其与人鸢尾素具有总体64％的氨基酸序列相似性和32％的氨基酸同一性(通过用与人鸢尾素具有相同和相似的化学结构的细菌FNDC5样蛋白中的氨基酸数目除以细菌FNDC5样蛋白的长度并乘以100％来计算，图1)。切割人FNDC5和细菌FNDC5样蛋白的酶尚不清楚7。我们对于扭链瘤胃球菌鸢尾素样肽2(RUCILP2)创建了酶促切割的细菌片段FNDC5样蛋白。
在带有感兴趣的FNDC5样序列的四种RT菌株之一(RT-ATCC 27756)和不含特定序列的对照菌株RT-ATCC 35915的细菌培养实验中，我们证明了带有用于合成RUCILP2的序列的RT菌株将多肽释放到培养基中(图2)。
应用鸢尾素和αV/β5(ITGAV/ITGB5)整联蛋白受体之间的相互作用的对接模型9，我们评估了RUCILP2的推定3D结构(图3)。RUCILP2受体结合的估计自由能为-1.43kcal/mol，表面RUCILP2和普遍表达的αV/β5整联蛋白受体之间的高结合亲和力(图4)。
应用ZDOCK预测工具和PyMOL程序，我们预测了RUCILP2的氨基酸V7、E9和E58作为αV/β5整联蛋白受体的结合位点(图5)。使用重组RUCILP2，我们在实验地表明配体与αV/β5整联蛋白受体的结合(图6)。除在计算机芯片上的分析之外，还通过基于RNAscope的mRNA原位杂交和免疫染色来可视化人结肠中αV/β5整联蛋白受体的存在(图7和图8)。
材料与方法
生物信息学分析：
从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db)下载参考原核生物基因组数据库，并且使用tBLASTn(阈值e值≤0.1)从补充表中报告的Uniprot(https://www.uniprot.org/)中搜索118种肽和细胞因子氨基酸序列。在比对分析中，表明RUCILP2被预测为由FNDC5样前体合成的87个氨基酸的蛋白质，其与鸢尾素具有整体64％的氨基酸序列同源性和32％的氨基酸序列同一性。使用开放获取工具Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对人FNDC5、FNDC5样细菌蛋白、人鸢尾素和RUCILP2中氨基酸进行多重序列比对，以确定相同和保守残基的数目。使用开放获取网站工具I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)预测RUCILP2的3D结构。通过ZDOCK(https://zdock.umassmed.edu/)计算分析来评估RUCILP22和鸢尾素与整联蛋白αV/β5受体的结合能力。通过PyMOL(v2.1.1)证实了对接模型的最终复合物结构。通过PyMOL(v2.1.1)可视化复合物内的直接结合相互作用。
实验验证：
(1)培养的RT菌株中RUCILP2的释放
在RT菌株之一，即带有感兴趣的FNDC5样蛋白序列的RT-ATCC 27756和不含特定序列的对照菌株RT-ATCC 35915的培养实验中，我们证实了带有用于合成RUCILP2的序列的RT菌株将肽释放到培养基中。详细实验方案如下：
(1)对于每1ml重悬浮的细胞培养物，加入100μl细菌蛋白提取试剂(ThermoScientific，90080，含有溶菌酶和DNase I(Fisher Scientific，181610)，并且补充有1mM二硫苏糖醇(Sigma，10197777001)、0.5mM苯甲基磺酰氟(Sigma，10837091001)以及磷酸酶抑制剂混合物(Fisher Scientific，78440))，并且通过上下吸液进行混合。
(2)在室温下孵育细胞15分钟。
(3)以13000转/分钟(rpm)离心10分钟，并且得到上清液。
(4)对每个标准或细菌蛋白裂解物样品进行Pierce Rapid Gold BCA ProteinAssay，将20μL一式两份地分配到96孔微板内。将50份试剂A和1份试剂B混合来制备PierceRapid Gold BCA Protein Assay(Fisher Scientific，A53225)工作试剂，并且用多通道移液器将200μl工作试剂加入每个孔中，并且在板式振荡器上充分混合30秒。使板在室温下孵育5分钟，然后在Thermo ScientificTMMultiskanTMGO微孔量分光光度计上检测480nm处的吸光度。使用标准曲线来确定未知蛋白质浓度。
(5)将蛋白质提取物(30μg)在98℃下孵育10分钟，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶分辨，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5％脱脂乳封闭，并且与兔抗FNDC5抗体(abcam，ab131390)一起孵育过夜。
(6)使膜与抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(Fisher Scientific，G21234)一起孵育，并且通过增强化学发光进行可视化。使用PVDF膜(PVDF，Millipore，IPFL85R)的考马斯亮蓝染色来确认相等的负荷。
(2)在镍离子柱上进行免疫共沉淀，以验证RUCILP2与αV/β5整联蛋白受体复合物的结合
步骤1：使整联蛋白和RUCILP2结合。将100nM FC-标签化的RUCILP2与5nM指示的his-标签整联蛋白avb5一起在1.5ml Protein LoBind Tubes(Eppendorf，022431081)中以500μl的最终体积于室温、旋转下孵育5/30/90分钟。
步骤2：在旋转后，应用Ni旋转柱(ThermoFisher Scientific，R901-01)来免疫沉淀整联蛋白。具体来说，将500μl FC-RUCILP2-整联蛋白-His蛋白复合物加入柱中。在4℃下翻转混合15分钟。将柱洗涤两次，随后洗脱两次，并且保存洗脱的样品。
步骤3：额外洗脱：将200μl SDS-PAGE上样缓冲液加入柱中，上下吸液，并且从旋转柱中取出树脂的等分试样。在70℃下孵育5分钟，以释放在洗脱之后残留在树脂上的所有蛋白质。上样并通过SDS-PAGE分析蛋白质。大多数蛋白质，无论它们是与镍结合还是与琼脂糖珠本身结合，都可通过此过程来回收。
步骤4：在每个过程中，在70℃下孵育样品10分钟，以使RUCILP2和整联蛋白解离。
步骤5：通过SDS-PAGE进行分析。上样并通过SDS-PAGE分析蛋白质混合物(FC-RUCILP2-整联蛋白-His蛋白质复合物(在上样到柱之前)、流过柱、洗涤和洗脱)。通过针对his标签的免疫印迹分析来检测沉淀的整联蛋白。通过针对FC-标签的免疫印迹分析来检测共沉淀的RUCILP2。将每个样品上样到两个凝胶上，分别通过抗his-标签整联蛋白和抗FC整联蛋白αV/β5的一抗进行测试。
(3)使用基于RNAscope的mRNA原位杂交(ISH)和免疫染色，来可视化人结肠组织样品中的整联蛋白αV/β5(ITGAV/ITGB5)受体
样品：对从BioIVT获得的具有正常人结肠组织的三个石蜡样品进行ITGAV/ITGB5mRNA ISH分析。用苏木精和伊红对切片进行染色，以确认该组织包含结肠粘膜和结肠壁，并且存在神经节/神经细胞。
双重测定的性能：实验设置包括阳性和阴性对照探针组。两种靶mRNA被染色为红色和绿色信号点，当以过量出现时，所述信号点变成更分散的沉淀物。ISH信号点分别以红色染色(ITGAV)和绿色染色(ITGB5)可视化。
指示检测通道和相关色原体的RNAscope探针。
使用Zeiss AxioScan以20x物镜获取图像。选择代表性区域用于呈现。
实施例2–RUCILP2的作用：在细胞(体外)和啮齿类动物(体内)中的研究
主要结果
在细胞和小鼠实验中，我们提供了重组RUCILP2的代谢作用的证据。因此，我们发现，以等摩尔浓度(细胞研究)或剂量(体内研究)的RUCILP2和鸢尾素以剂量依赖性方式对人和小鼠前脂肪细胞中的产热和褐色化的关键基因表达具有相似的作用(图9)。RUCILP2抑制脂肪细胞中调控脂肪生成的基因的表达(图10和图17)。RUCILP2对骨形成(图11)和肌生成(图12)产生显著的刺激作用。在肝细胞中，该激素抑制调控糖异生的基因的表达(图13)。另外，RUCILP2增加了参与肠上皮细胞的肠屏障功能以及心肌生成的标记物的基因的表达(图13)。RUCILP2的细胞作用通过用CycloRGDyK(整联蛋白受体的非特异性抑制剂)的预处理进行阻断。在活大鼠结肠灌注实验中，RUCILP2对通过腔输注对胰高血糖素样肽-1(GLP-1，图14)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、肽YY(PYY，图15)和生长抑素(图16)的肠腔释放表现出刺激作用。
材料与方法
(1)6-his标签的RUCILP2在大肠杆菌中的重组合成
针对大肠杆菌对87个氨基酸的RUCILP2多肽的靶DNA序列进行密码子优化和合成。将合成的序列克隆到具有6-His-标签的载体pET-30a(+)内，用于在用重组质粒转化的大肠杆菌菌株BL21 star(DE3)中表达蛋白质。将单菌落接种到含有相关抗生素的TerrificBroth(TB)培养基内；将培养物在37℃、200rpm下孵育，然后用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。使用SDS-PAGE监测表达。将贮存于甘油中的重组BL21 star(DE3)接种到含有相关抗生素的TB培养基内，并且在37℃下培养。当OD 600达到约1.2时，用IPTG在37℃下诱导细胞培养物4小时。通过离心收获细胞。用裂解缓冲液重悬浮细胞沉淀物，随后进行超声处理。保存离心后的上清液作将来纯化之用。通过使用Ni柱的一步纯化获得靶蛋白。将靶蛋白保存于50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10％甘油，pH 8.0中，随后通过0.22μm过滤器灭菌，然后以等分试样贮存。通过用牛血清白蛋白(BSA)作为标准的二辛可酸(BCA)TM蛋白质测定来确定浓度。通过标准SDS-PAGE连同蛋白质印迹确认来确定蛋白质纯度和分子量。将蛋白质稀释在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以用于细胞培养实验和体内注射。
(2)重组RUCILP2对人内脏白色前脂肪细胞的作用
将人白色前脂肪细胞培养直至80％汇合，并且转入至分化培养基(具有0.3ml/ml胎牛血清、8μg/ml d-生物素、0.5μg/ml胰岛素、400ng/ml地塞米松)。在12至14天后完成向成熟脂肪细胞的分化过程。从分化的第三天起始RUCILP2和鸢尾素的处理。对于整联蛋白复合物抑制，用10μM CycloRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，然后用PBS进行洗涤，随后分别用RUCILP2和鸢尾素处理。在分化14天后收获细胞，并且通过定量聚合酶链反应(q-PCR)定量产热基因。
(3)重组RUCILP2对小鼠腹股沟前脂肪细胞的作用
解剖来自10周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠的腹股沟脂肪组织，用含有1％青霉素-链霉素(P/S)溶液的杜氏改良Eagle培养基(D-MEM)洗涤，切碎并在含有2％BSA、0.2％1型胶原酶的D-MEM(1％P/S)中于37℃下消化1小时。然后将经消化的组织在室温下以400g离心5分钟。沉淀物用10ml含有10％FBS和1％P/S的D-MEM重悬浮，并且通过200μm细胞滤网过滤。将腹股沟基质血管细胞分配到I型胶原包被的包被12孔板上，并且使其生长至汇合，然后通过用1μM罗格列酮、86nM胰岛素、0.1μM地塞米松、1nM三碘-L-甲状腺氨酸(T3)和250μM甲基异丁基黄嘌呤处理来诱导分化。
诱导后两天，将细胞在15nM重组RUCILP2或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)或盐水的存在下转入诱导培养基中两天。这之后，在指示浓度的重组RUCILP2或商业重组鸢尾素或盐水的存在下，将细胞在86nM胰岛素和1nM T3中保持四天，每隔一天更换培养基。为了抑制整联蛋白复合物，在6天的分化期间，每隔一天在用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素或盐水处理之前，用10μM cRGDyK处理细胞10分钟。收获细胞用于qRT-PCR分析，如关于基因表达分析的方案中所进行的描述。
根据下文方案对脂肪细胞中的脂质进行油红O染色：
(1)固定-去除培养基，并且用PBS轻轻洗涤细胞两次。将福尔马林(10％)加入细胞中，并且孵育30分钟
(2)弃去福尔马林，并且使用无菌水洗涤细胞两次。将60％异丙醇加入细胞中，并且孵育5分钟
(3)弃去60％异丙醇，并且用油红O工作溶液均匀地覆盖细胞。旋转板或培养皿，并且孵育15分钟
(4)弃去油红O溶液，并且用水洗涤细胞四次，直至看不到过量的染色
(5)将苏木精加入细胞中，并且孵育1分钟。弃去苏木精，并且用水洗涤细胞四次
(6)用无菌水覆盖细胞并在显微镜下观察。脂滴呈红色，而核呈蓝色。
(4)重组RUCILP2对小鼠长骨骨细胞-Y4(MLO-Y4)细胞系的作用
MLO-Y4细胞由University of Southern Denmark的Prof Moustapha Kassem捐赠。在补充有2.5％胎牛血清(来自Fisher Scientific的FBS，#11550356)、2.5％小牛血清(Hyclone，SH30072.03)和1％青霉素-链霉素(Fisher Scientific，#11548876)的最低基本培养基(来自Fisher Scientific的α-MEM，#15430584)下，将细胞接种到I型胶原包被的6孔板。将细胞培养物保持在37℃、5％CO2的湿化室中，并且每2-3天更换培养基。
在60％汇合时，用温PBS洗涤，然后将培养基转换为FreeStyle293Expression培养基。孵育4小时后，用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenixpharmaceuticals，#067-29A)或盐水处理细胞24小时。对于整联蛋白抑制剂处理，用10μMCycloRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，用PBS洗涤，然后用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素或盐水处理。处理后，收获MLO-Y4细胞，用于硬化蛋白的mRNA水平的qRT-PCR分析，如基因表达分析中所进行的描述。
(5)重组RUCILP2对永生化的小鼠成肌细胞C2C12细胞系的作用
在补充有10％FBS(胎牛血清，Fisher Scientific，#11550356)和1％青霉素-链霉素(Fisher Scientific，#11548876)的DMEM/F-12培养基(杜氏改良Eagle培养基/营养混合物F-12，Fisher Scientific，#11524436)下，将C2C12细胞接种到12孔板上。将细胞培养物保持在37℃、5％CO2的湿化室中，并且每2-3天更换培养基。
在大约80％汇合时，用2％马血清替换10％胎牛血清，以诱导C2C12成肌细胞分化成肌管。二十四小时后(分化的第1天)，用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)或盐水处理细胞。对于整联蛋白抑制剂处理，用10μM CycloRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，用PBS洗涤，然后用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素或盐水处理。在第三天，用与第一天相同的培养基更新(refresh)细胞。在第3天时处理6小时后，收获C2C12细胞用于qRT-PCR分析。
(6)重组RUCILP2对永生化的肝癌细胞HepG2细胞系的作用
在补充有10％FBS(胎牛血清，Fisher Scientific，#11550356)和1％青霉素-链霉素(Fisher Scientific，#11548876)的DMEM/F-12培养基(杜氏改良Eagle培养基/营养素混合物F-12，Fisher Scientific，#11524436)下，将HepG2细胞接种到12孔板。将细胞培养物保持在37℃、5％CO2的湿化室中，并且每2-3天更换培养基。
在70％汇合时，为了诱导胰岛素抵抗，将HepG2细胞与18mM葡糖胺(GlcN)在无血清培养基中孵育18小时，随后用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)或盐水处理24小时。对于整联蛋白抑制剂处理，用10μM CycloRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，用PBS洗涤，然后用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素或盐水处理。处理后，收获HepG2细胞用于qRT-PCR分析。
(7)重组RUCILP2对永生化的人结肠直肠腺癌细胞Caco-2细胞系的作用
在补充有20％FBS(胎牛血清，Fisher Scientific，#11550356)和1％青霉素-链霉素(Fisher Scientific，#11548876)的EMEM培养基(Eagle最低基础培养基，ATCC，#302003)下，将商购可得的Caco-2细胞(ATCC，#HTB-37)接种到12孔板。将细胞培养物保持在37℃、5％CO2的湿化室中，并且每2-3天更换培养基。
在70％汇合时，为了诱导缺氧/复氧(H/R)细胞培养模型，Caco-2细胞在EMEM培养基(不含葡萄糖和FBS)中培养，并且在37℃下暴露于缺氧条件(94％N2、5％CO2和1％O2)共120分钟。接下来，在复氧开始时，立即用指示浓度的重组RUCILP2或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)或PBS处理细胞24小时。对于整联蛋白抑制剂处理，用10μM CycloRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，用PBS洗涤，然后用重组RUCILP2或商业重组鸢尾素或PBS处理。处理后，收获Caco-2细胞，用于肠上皮屏障相关基因的mRNA水平的qRT-PCR分析。
(8)重组RUCILP2对H9C2细胞系的作用
在补充有10％FBS(胎牛血清，Fisher Scientific，#11550356)和1％青霉素-链霉素(Fisher Scientific，#11548876)的DMEM/F-12培养基(杜氏改良Eagle培养基/营养素混合物F-12，Fisher Scientific，#11524436)下，将商购可得的H9C2细胞(ATCC，#CRL-1446)接种到12孔板上。将细胞培养物保持在37℃、5％CO2的湿化室中，并且每2-3天更换培养基。
在70％汇合时，用指示浓度的重组RUCILP2、商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)和PBS处理细胞24小时。对于整联蛋白抑制剂处理，用10μM CycloRGDyK(Selleckchem，#S7844)处理细胞10分钟，用PBS洗涤，然后用重组RUCILP2、商业重组鸢尾素和PBS处理。处理后，收获H9C2细胞，用于心肌细胞生长和分化相关基因的mRNA水平的qRT-PCR分析。
(9)重组RUCILP2对灌注的活大鼠结肠中激素释放的作用
动物：雄性Wistar大鼠(～250g)得自Janvier(Le Genest-Saint-Isle，法国)，并且每笼饲养2至4只大鼠。使大鼠适应环境一周，保持12:12小时的光照/黑暗周期，随意获取水和标准食物。
伦理考虑：按照欧盟指令(EU Directive)2010/63/EU以及丹麦动物实验立法(1987)和国家卫生研究院(National Institute of Health)指南，在丹麦动物实验监察局(Danish Animal Experiments Inspectorate)(2018-15-0201-01397)和当地伦理委员会(EMED，P20-058)的许可下进行研究。
大鼠近端结肠的分离和灌注：在实验当天，通过皮下注射芬太尼/咪达唑仑(0.0158mg柠檬酸芬太尼+0.5mg氟阿尼酮+0.25mg咪达唑仑/100g)来麻醉非禁食大鼠。当确认缺乏反射时，将大鼠置于加热板(37℃)上，并打开腹腔。通过结扎盲肠、小肠、脾、胃、肾以及腹腔动脉的血管供应来隔离结肠，允许结肠的最近端部分与紧邻肠系膜下动脉的入口的部分(～10cm)的分离。将塑料管置于结肠腔中，并且用等渗盐水(室温)轻轻冲洗结肠，以去除腔内容物。在整个实验方案中，经由注射泵(0.15ml/分钟)施加恒定腔流动的盐水。将导管插入腹主动脉内，从而对肠系膜上动脉进行近端结扎，并且使用单向灌注系统(UP100，Hugo Sachs Harvard Apparatus，德国)以3ml/分钟的恒定流速，用加热(37℃)、含氧(95％O2和5％CO2)灌注缓冲液，对肠进行血管灌注。将金属导管插入门静脉内，以收集静脉流出物。一旦适当的流动显而易见，就通过膈膜的穿孔对大鼠实施安乐死。为了使系统达到平衡，在实验方案开始之前，将肠灌注25分钟。
每个方案都从基线期起始，随后通过腔管或通过插入主动脉内的导管在动脉内加入施加的测试物质。使用级分收集器经由引流导管收集静脉流出物1分钟。将流出物样品立即置于冰上并贮存于-20℃下直至分析。作为结肠健康的指标，在实验自始至终监测灌注压。
灌注缓冲液：灌注缓冲液由改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液组成，所述缓冲液补充有3.5mmol/L葡萄糖，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(目录号1.12018.0500，Merck，丹麦)，5％(w/v)葡聚糖T-70(以平衡胶体渗透压；Pharmacosmos，丹麦)，各5mmol/L的富马酸盐、丙酮酸盐和谷氨酸盐(Sigma Aldrich，丹麦)，以及10μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，目录号5879，Sigma Aldrich)。
激素测量：使用内部放射性免疫测定来测量肽激素：使用靶向GLP-1的酰胺化形式的C末端特异性抗体(编码89390)，来测量总GLP-1(7-36NH2、9-36NH2和潜在中端切割片段的总和)。用猪抗血清(目录号T-4093；Bachem)测量总PYY(PYY1–36+PYY3–36)。使用检测生长抑素的所有生物活性形式的侧视抗体(side-viewing antibody)(编码1758-5)，来测量生长抑素。
(10)在腹膜内注射到用食物饲喂的小鼠后，重组RUCILP2的作用
将小鼠(20只雄性野生型C57BL/6N，8周龄，Janvier)单独饲养在23±1℃下，进行12小时光照/12小时黑暗周期，随意获取食物和水。对标准饲料(chow diet)(Altromin1328饮食含有11％的脂肪、24％的蛋白质和65％的碳水化合物)适应7天。这种饮食是基于谷物(大豆、小麦、玉米)的固定配方，其不含苜蓿和鱼/动物粉以及缺乏亚硝胺)以避免应激，小鼠每天分别接受1mg/kg重组RUCILP2和盐水的腹膜内注射，持续7天。然后处死所有动物，并且收集皮下脂肪垫和肝组织。通过如下所述的qRT-PCR分析腹股沟脂肪中的产热基因(包括Ucp1、Elovl3、Cidea和Prdm16)以及脂肪生成基因(包括Acaca和Fasn)的mRNA水平。
RNA提取和实时PCR分析：根据制造商的说明，使用Trizol试剂(Invitrogen)，从组织中提取总RNA，随后进行浓度测量。使用逆转录系统(Promega)，将1μg RNA转录为cDNA。使用LC480检测系统(Roche Diagnostics)和SYBR Green I Supermix(Takara)，进行实时PCR。样品在单个384孔反应板中一式两份运行。针对管家Rpl36、TBP或GAPDH基因进行标准化，并且根据ΔΔCT方法进行分析。
实施例3-产生RUMTOR_00181的RT菌株和不产生RUMTOR_00181的RT菌株分别对用饲料饲喂的小鼠的全身作用
主要结果
在用饲料饲喂的小鼠中，比较用产生RUMTOR_00181的RT菌株(VPI B2-51，ATCC)或不产生RUMTOR_00181的RT菌株(VPI 13831，ATCC)每周两次经口管饲共8周的作用。发现，经口管饲产生RUMTOR_00181的RT菌株降低脂肪量并增加瘦体质量(图19)，而对小鼠体重增加没有影响(图18)。同时，腹股沟脂肪组织中的产热程序被激活，随后脂肪生成减少(图23)。葡萄糖耐量得到改善(图21)，并且另外，皮质骨密度增加(图24)。在用高脂饮食饲喂的小鼠中，发现在8周的干预期间，产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌活菌株-ATCC 27756-(RT2)降低了体重增加(图20)。另外，腹膜内注射的葡萄糖耐量测试表明，产生RUMTOR_00181的菌株-ATCC 27756-(RT2)-改善了用高脂饮食喂养的小鼠中的体内葡萄糖耐量(图22)。
材料与方法
产生RUMTOR_00181的RT菌株和不产生RUMTOR_00181的RT菌株对小鼠的相应干预研究
对于用饲料饲喂的小鼠的干预研究，将八周龄的雄性C57BL/6N小鼠(无特定病原体级，Janvier)单独饲养在严格的12小时光照周期下，自由获取含有11％的脂肪、24％的蛋白质、65％的碳水化合物的饲料(Altromin1328饮食)和水。然后将它们分成分别用以下管饲的六组：无菌PBS、活的RT-ATCC 35915(5×107菌落形成单位(CFU)/100μl，在无菌PBS中)、活的RT-ATCC 35915(5×108CFU/100μl，在无菌PBS中)、活的RT-ATCC 27756(5×107CFU/100μl，在无菌PBS中)、活的RT-ATCC 27756(5×108CFU/100μl，在无菌PBS中)以及热灭活的RT-ATCC 27756(5×108CFU/100μl，在无菌PBS中，在70℃下30分钟)，每周两次，持续8周。在每一次管饲前测量体重。对于用高脂饮食喂养的小鼠的干预研究，八周龄的雄性C57BL/6N小鼠(无特定病原体级，Janvier)分组饲养，在严格的12小时光照周期下，自由获取含有45千卡％脂肪、20千卡％蛋白质和35千卡％碳水化合物的高脂饮食(研究饮食，D12451i)和水。然后将它们分成分别用以下管饲的四组：无菌PBS、活的RT-ATCC 35915(5×109菌落形成单位(CFU)/100μl，在无菌PBS中)、活的RT-ATCC 27756(5×109CFU/100μl，在无菌PBS中)、以及热灭活的RT-ATCC 27756(5×109CFU/100μl，在无菌PBS中，在70℃下30分钟)，每周两次，持续8周。每隔一周测量体重。在管饲前以及在实验结束时收集粪便样品，并且在进一步分析前立即贮存于-80℃下。通过全身组成分析仪(EchoMRI)评估体脂量和瘦体重。适应环境的小鼠基于其体重来分组，以确保相同的起点。在研究结束时，麻醉小鼠，并且将来自眼眶丛的血液收集到含有乙二胺四乙酸(EDTA)的管中。血液样品在6000rpm、4℃下离心6分钟。将血浆样品分离并且贮存于-80℃下，用于后续生物化学测试。解剖组织样品(肝脏、棕色脂肪组织、皮下脂肪组织、肠系膜脂肪组织、空肠、回肠和近端结肠)，称重并且贮存于–80℃下用于进一步分析。将一部分脂肪组织和胫骨之一固定在4％多聚甲醛的PBS溶液中，用于组织学分析或显微CT扫描。
对于细菌处理6周后的葡萄糖耐量测试，将所有小鼠恢复标准饮用水，禁食4小时，称重，然后通过腹膜内注射给予一剂葡萄糖(2g葡萄糖/kg体重)。在0、15、30、60和120分钟时，从尾静脉获取血液样品，用于使用葡萄糖计(LifeScan)测量血糖。
实施例4–用于测量人血浆中的RUCILP2的蛋白质组学测定
主要结果
开发的靶向蛋白质组学测定表明，根据6个个体测量的，RUCILP2以10-100pg/ml的个体间浓度区间在人血浆中循环(图25)。
材料与方法
用于蛋白质组学样品制备的方案
(1)使用ProteoExtract试剂盒(Millipore，122642)耗尽人血浆样品(1ml)的白蛋白和IgG。
1.1用10X结合缓冲液和水稀释所需量的样品
1.2安装柱或柱组件用于注射器式滤器(syringe tip filter)使用
1.3用6-10ml 1X结合缓冲液填充注射器用于柱平衡。在与柱连接之前，去除注射器中任何截留的空气
1.4通过施加轻微压力，使2ml 1X结合缓冲液/柱的体积通过树脂床。弃去流出物
1.5用稀释的样品填充新注射器。通过施加轻微压力，使经稀释的样品通过柱。收集柱流出物。注意：在两个连续液滴之间计数到五，以使样品和树脂之间有足够的接触时间
1.6将步骤3装满1X结合缓冲液的注射器连接到柱。通过施加轻微压力，使2ml缓冲液/柱的体积通过树脂床。收集柱流出物作为洗涤级分。将洗涤级分与先前收集的流出物合并作为经耗尽的样品
(2)随后使用3千道尔顿(kDa)截留分子量旋转过滤柱(Millipore，UFC900324)浓缩经耗尽的样品
(3)在变性反应条件下，使用Protein Deglycosylation Mix II试剂盒(NewEngland Biolabs)进行血浆的去糖基化
3.1将100μg糖蛋白溶解在40μl水内
3.2添加5μl去糖基化混合缓冲液2
3.3在75℃下孵育10分钟，冷却
3.4添加5μl蛋白质去糖基化混合物II，轻轻混合
3.5在25℃(室温)下孵育3反应0分钟
3.6将反应转移到37℃，孵育1小时
凝胶内消化步骤
(1)用10mM二硫苏糖醇(DTT，Sigma)还原去糖基化的血浆样品(300μg)，并且用50mM碘乙酰胺进行烷基化，然后使用4％–12％NuPAGE Bis-Tris预制凝胶(Biorad 4–12％CriterionTMXT Bis-Tris Protein Gel，18孔，30μl，#3450124)通过SDS-PAGE分辨
(2)对凝胶进行考马斯染色，并从10–15kDa区域中切下片段
(3)用100％乙腈对凝胶块进行脱色和脱水，真空干燥
(4)用200μl Tris-尿素缓冲液(0.1M Tris–HCl，pH 8.5中的8M尿素(sigma))重悬浮经干燥的残留物，并且将其添加到离心旋转过滤单元(0.5ml，以10kDa的截留分子量)上，并且以10000g离心，直至小于10μl的样品保留在过滤器中。这通常需要10-15分钟的离心时间。这适用于所有进一步的离心步骤
(5)将200μl UA加入过滤单元中，并重复离心
(6)弃去来自收集管的流出物
(7)将100μl DB(0.05M Tris–HCl，pH 8.5)加入过滤单元中，并且以10000g离心10分钟。将此步骤重复两次
(8)将100μl 50mM碳酸氢铵(Sigma-Aldrich)和500ng测序级胰蛋白酶(Promega)直接添加到滤膜上，于37℃下孵育过夜
(9)将20μl 1x内标混合物(＝2皮摩尔)直接添加到滤膜上
(10)12小时后，以10000g离心过滤单元，直至溶液完全通过滤膜(约5分钟)
(11)添加100μl消化缓冲液(0.05M Tris–HCl，pH 8.5)，并且将以10000g离心过滤单元，直至所有液体通过。样品体积现在应该为大约200μl
(12)使用Millipore C18 ZipTips(Sigma)对肽进行脱盐
(13)用5μl 70％乙腈和1％甲酸对肽进行洗脱，然后使用speedvac进行干燥。
液相色谱-质谱仪(LC-MS)检测步骤
使用与Famos Autosampler(LC Packings)和Accela 600液相色谱法(LC泵(Thermo Fisher Scientific))联接的Q Exactive或LTQ Orbitrap Elite质谱仪(ThermoFisher Scientific)收集质谱数据。在100-μm内径微毛细管柱上分离肽，该柱填充有～0.5cm的Magic C4树脂(5μm，Michrom Bioresources)，随后为～20cm的Accucore C18树脂(1.6μm，Thermo Fisher Scientific)。对于每次分析，将～4μl上样到柱上。以～250nl/min的流速，使用8％–30％乙腈的0.125％甲酸溶液的50分钟梯度分离肽。
靶向质谱的平行反应监测(PRM)步骤
使用下述参数用Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行PRM分析：在轨道阱分辨率为70000(以m/z 200)下从400到700Thomson(Th)的全MS扫描，自动增益控制(AGC)靶5×106，以及500ms(毫秒)最大注射时间。全MS扫描后，进行以35000分辨率(以m/z 200)的25–50PRM扫描(AGC靶5×106，500ms最大注射时间)，如通过预定的包含列表触发的。PRM方法采用通过2Th(Thomson)分离窗的靶离子分离，用25的标准化碰撞能量(NCE)进行片段化。MS/MS扫描以100m/z的起始质量范围采集，并且作为轮廓谱数据(profilespectrum data)类型采集。使用Skyline版本3.1来定量前体和片段离子。
数据依赖性采集步骤
对于使用Q Exactive的数据依赖性采集，扫描顺序从Orbitrap MS1谱开始，具有下述参数：分辨率70000，扫描范围400至1400Th，5×106的自动增益控制(AGC)靶，250ms的最大注射时间，和质心谱数据类型。我们选择了前20种前体用于MS2分析，其由高能碰撞解离(HCD)组成，具有下述参数：分辨率17500、AGC 1×105、最大进注射时间60ms、分离窗口2Th、NCE 25，以及作为质心谱数据类型获得。未充满系数(underfill ratio)设定为9％，其对应于1.5×105强度阈值。另外，从MS2分析中排除未分配的和单荷电的物质，并且动态排除设定为自动。
对于使用Linear Trap Quadropole(LTQ)Orbitrap Elite第一分析仪MS1的数据依赖性采集，在轨道阱中以3×104的分辨率在300至1500Th的范围内进行全谱扫描。随后为使用2Th的前体分离宽度窗口选择十种最强的离子(TOP10)，用于碰撞诱导解离(CID)-MS2碎片化。对于全谱和MS2扫描，AGC分别设置为3×106和2.5×105离子。当离子强度达到500个计数的阈值时，选择用于MS2的离子，并且分配了同位素分布包层(isotopic envelope)。对于全谱MS扫描，最大离子累积时间设定为1000ms；对于MS2扫描，设定为250ms。单荷电的离子种类以及对于其无法确定电荷状态的离子并不经受MS2。对于MS2选择的离子周围百万分之(ppm)10m/z窗口内的离子从碎片化120s的进一步选择中排除。
肽和蛋白质鉴定步骤
在获取质谱数据之后，将Thermo Fisher RAW文件转换成可扩展标记语言(eXtensible Markup Language)(mzXML)格式，并且使用内部开发的一套软件工具进行处理，以分析蛋白质组数据集。选择用于MS/MS碎片化的所有前体都使用算法进行确认，以检测且校正单同位素峰分配中的错误并完善前体离子质量测量。然后，将所有MS/MS谱作为各个DTA文件输出，并且使用Sequest算法进行搜索。这些谱针对在正向和反向上包括通过Uniprot报告的所有人蛋白质序列的数据库进行搜索。还包括常见的污染蛋白序列(例如人角蛋白、猪胰蛋白酶)。选择下述参数以鉴定未富集的肽样品中的肽：25ppm前体质量容差、0.02Da产物离子质量容差、无酶消化、最多两次胰蛋白酶遗漏切割。
可变的修饰：甲硫氨酸(+15.994915)的氧化和天冬酰胺(0.984016)的脱酰胺；固定的修饰：半胱氨酸(+57.021464)的脲甲基化。实施AScore算法，以定量每种脱酰胺修饰可以分配给每个肽中的特定残基的置信度。AScore高于13的肽被视为局限于特定残基(p<0.05)。
实施例5–21-AABP2的鉴定和体外功能表征
主要结果
RUCILP2的胰蛋白酶切割片段之一，21个氨基酸的细菌肽2(称为21-AABP2，图26)被预测为具有比RUCILP2更高的疏水性评分的唯一片段肽，这意味着21-AABP2可能显示出比其前体RUCILP2更高的蛋白质结构或功能稳定性。此外，21-AABP2预测为与RUCILP2受体(αV/β5整联蛋白受体，图27)结合。肽21-AABP2被证实为人内脏白色前脂肪细胞和小鼠腹股沟前脂肪细胞中调控产热的关键基因的诱导剂(图28)。在小鼠成肌细胞中，21-AABP2促进肌生成和肌管形成(图29)。另外，21-AABP2刺激来自大鼠胰岛素瘤细胞系的胰岛素释放(图30)。
材料与方法
RUCILP2及其胰蛋白酶切割的片段肽的疏水性评分的预测
在胰蛋白酶消化后RUCILP2的理论蛋白质切割通过PeptideMass(https://web.expasy.org/peptide_mass/)进行处理。通过使用默认设置的PEPTIDE 2.0(https://www.peptide2.com/N_peptide_hydrophobicity_hydrophilicity.php)预测肽疏水性。
预测21-AABP2和αV/β5整联蛋白受体之间的相互作用
通过PEP-FOLD预测21-AABP2的3D蛋白质结构。根据供应商的指南，使用ZDOCK服务器，将RUCILP2或21-AABP2与αV/β5受体对接。通过PyMOL可视化复合物3D结构。通过ZDOCK服务器执行21-AABP2和整联蛋白受体的对接模型，并且选择具有最高对接评分的复合物作为最佳结合模型。
重组21-AABP2在大肠杆菌中的合成
优化并合成21个氨基酸21-AABP2的靶DNA序列。将合成的序列克隆到具有6-His-标签的载体pET-30a(+)内，用于在用重组质粒转化的大肠杆菌菌株BL21 star(DE3)中表达蛋白质。将单菌落接种到含有相关抗生素的Terrific Broth(TB)培养基内；将培养物在37℃、200rpm下孵育，然后用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。使用SDS-PAGE来监测表达。将贮存于甘油中的重组BL21 star(DE3)接种到含有相关抗生素的TB培养基内，并且在37℃下培养。当OD 600达到约1.2时，用IPTG在37℃下诱导细胞培养物4小时。通过离心收获细胞。用裂解缓冲液重悬浮细胞沉淀物，随后为超声处理。保存经离心的上清液留作进一步纯化。使用Ni柱通过一步纯化获得靶蛋白。将靶蛋白保存于50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10％甘油，pH 8.0中，随后通过0.22μm过滤器灭菌，然后以等分试样贮存。通过用牛血清白蛋白(BSA)作为标准的二辛宁酸(BCA)TM蛋白质测定来确定浓度。通过标准SDS-PAGE连同蛋白质印迹确认来确定蛋白质纯度和分子量。将蛋白质稀释在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以用于细胞培养实验中。
21-AABP2的细胞代谢作用
(1)重组21-AABP2促进了人内脏白色前脂肪细胞中的产热和褐变的关键基因的表达
将来自人内脏脂肪的白色前脂肪细胞(C-12732，PromoCell)培养直至80％汇合，并且在15nM 21-AABP2的存在下，转入分化培养基(具有0.3ml/ml胎牛血清(FCS)、8ug/mld-生物素、0.5ug/ml胰岛素、400ng/ml地塞米松)。向成熟脂肪细胞的分化过程在14天后完成。分化14天后收获细胞，通过q-PCR定量产热相关基因(包括Ucp1和Lhx8)。
(2)重组21-AABP2诱导小鼠腹股沟前脂肪细胞中调控产热的关键基因的表达
解剖来自6周龄的野生型C57BL/6J雌性小鼠的腹股沟脂肪组织，用PBS洗涤，切碎并在含有10mM CaCl2、2.4U/ml分散酶II(Roche)和10mg/ml胶原酶D(Roche)的PBS中于37℃下消化1小时。在添加具有10％FCS的温热DMEM/F12(1:1)后，通过70mm细胞滤网进行过滤经消化的组织，并且以600×g离心10分钟。用具有10％FCS的40ml DMEM/F12(1:1)重悬浮沉淀物，并且通过40mm细胞滤网过滤，随后以600×g离心10分钟。使沉淀的腹股沟基质血管细胞生长至汇合并且分配到12孔板上。通过用1mM罗格列酮、5mM地塞米松、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤处理细胞2天来诱导分化。接下来，细胞在1mM罗格列酮中维持4天，每隔一天更换培养基。在6天的分化过程中，每隔一天用15nM 21-AABP2处理细胞。分化6天后收获细胞，并且通过q-PCR定量产热基因(包括Ucp1、Cidea、Elovl3、Dio2和Pgc1α)。
(3)重组21-AABP2刺激小鼠C2C12成肌细胞中的肌生成和肌管形成
培养C2C12成肌细胞直至80％汇合，并且转入至分化培养基(具有2％马血清)。从分化的第二天起，用21-AABP2处理。捕获在PBS(空白)或21-AABP2(15nM)的存在下，在分化24小时形成的肌管的代表性图像。分化4天后收获细胞，并且通过q-PCR定量肌生成基因(包括Mymk和Caveolin-3)的表达。
(4)重组21-AABP2刺激来自永生化的大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞的胰岛素释放
INS-1细胞在RPMI 1640培养基(11875093，ThermoFisher Scientific)中生长直至达到70％的汇合，并且转入至提供15nM 21-AABP2的RPMI 1640培养基并孵育12小时。通过MSD大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Merck Millipore)测量细胞培养基的上清液中的胰岛素浓度。
实施例6–经口管饲产生RUMTOR_00181的活RT2菌株对饲喂食物或高脂饮食的小鼠的生理作用
介绍
通过在可公开获得的原核生物基因组中全面生物信息学搜索人激素样序列的存在，我们鉴定了两个显著的同源性，这两者均来自扭链瘤胃球菌ATCC 27756的基因组中注释为RUMTOR_00181(Uniprot：A5KIY5)的编码序列(CDS)。扭链瘤胃球菌ATCC 27756的基因组信息已作为参考基因组保藏于NCBI，并且用作细菌物种扭链瘤胃球菌的模式株。
通过AlphaFold222预测的RUMTOR_00181蛋白的3D结构证实了N末端处的信号肽、两个纤连蛋白III型(FNIII)结构域和一个可能是膜插入的疏水结构域，随后为7-氨基酸的C末端结构域(图31)。
扭链瘤胃球菌物种具有26种报道的菌株。在来自扭链瘤胃球菌的另外三种菌株的基因组内，我们发现了与RUMTOR_00181蛋白具有高度同源性的预测蛋白的存在。在四种扭链瘤胃球菌菌株中编码RUMTOR_00181和RUMTOR_00181样蛋白的基因中，1271个氨基酸残基中的1260个是保守的。成对比较显示了扭链瘤胃球菌AM22-16、扭链瘤胃球菌aa_0143和扭链瘤胃球菌2789STDY5834841中的RUMTOR_00181样序列。这些与扭链瘤胃球菌ATCC 27756中的RUMTOR_00181分别具有99.5％(1271个中的1265个)、99.5％(1271个中的1265个)和99.4％(1271个中的1263个)的同一性。
有趣的是，我们发现RUMTOR_00181中的两个FNIII结构域与最近发现的肌细胞因子鸢尾素分别具有30.7％和34.5％的同源同一性(图32)。因此，将这两个含FNIII结构域命名为瘤胃球菌鸢尾素样肽1(简称RUCILP1)和RUCILP2，分别具有88和87个氨基酸残基。
通过应用EMBOSS Needle Pairwise Sequence Alignment Program(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)，RUCILP1与RUCILP2的成对比对证实了RUCILP1与RUCILP2具有73.9％(65/88)的同一性(图33)。
RUCILP1和RUCILP2被视为由产生RUMTOR_00181的菌株通过分别在K961、K1050、K1122和K1220处的细胞外胰蛋白酶/LysC依赖性蛋白酶解切割得到释放(图34)。
鉴于RUCILP2与鸢尾素具有相对较高的同一性，我们从大肠杆菌中重组合成了RUCILP2，并探讨了其生理作用。在细胞和动物实验中，我们已表明，等摩尔浓度(细胞研究)或剂量(体内研究)的重组RUCILP2和鸢尾素对小鼠和人内脏脂肪细胞中产热和褐变的关键基因的表达具有相似的作用。RUCILP2增强脂肪细胞中的瘦素表达，并且抑制脂肪细胞和肝细胞中调控脂肪生成的基因的表达。另外，在肝细胞中，该激素抑制调控糖异生的基因的表达。RUCILP2刺激胰岛素生物合成，并且在活大鼠结肠灌注实验中，RUCILP2显示出对GLP-1、GLP-2、PYY和生长抑素的腔释放的强刺激作用。
在下文中，我们概括了在研究起始时，在8周龄的具有C57BL/6N背景(无特定病原体级)的小鼠中，用产生RUMTOR_00181的活菌株的经口补充的两种干预的主要发现。一种干预是在食物饲喂的小鼠中。另一种是在高脂饲喂的小鼠中。每种干预持续八周。
主要结果
在饲喂饲料的C57BL/6N小鼠中，比较用产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌ATCC27756(RT2)活菌株或不产生RUMTOR_00181的扭链瘤胃球菌ATCC 35915(RT3)活菌株每周两次经口管饲共8周的影响。经口管饲RT2菌株降低体脂量并增加瘦体重(图19)，而它对在研究期内的小鼠体重增加没有影响(图18)。同时，基因表达分析表明，腹股沟脂肪组织中的产热程序被激活，伴随脂肪组织脂肪生成的同时降低(图23)。葡萄糖耐量得到改善(图21)，并且另外，胫骨近端的皮质厚度增加(图24)。
在饲喂高脂饮食(HFD)的小鼠中，我们发现，活的RT2菌株在八周的干预期间降低了体重增加(图19)。同时，身体组成的磁共振成像(MRI)扫描表明，RT2补充显著降低了小鼠的脂肪量并增加了瘦体质量(图35)。如通过补充RT2的小鼠中的腹股沟和附睾白色脂肪组织质量的较低重量所表明的，总结为RT2定殖降低了饲喂HFD的小鼠中随时间的脂肪增加(图36)。另外，腹膜内葡萄糖耐量测试显示了，RT2菌株改善了饲喂HFD的小鼠中的葡萄糖耐量(图22)。腹股沟脂肪中的基因分析证实，在RT2管饲的小鼠中，编码产热标记物(包括Ucp1、Cidea和Dio2)的mRNA表达增强，而参与脂肪生成的基因(包括Fasn、Scd1和Acaca)表达减弱。我们一致地发现，补充RT2的小鼠的皮下白色脂肪组织细胞中激活的脂解。另外，饲喂HFD的小鼠的白色脂肪组织炎症标记物(包括Tnf-α、Mcp-1和F4/80)，响应RT2干预受到抑制(图37)。腹股沟脂肪的组织学分析揭示了，与用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或热灭活的RT2或RT3活菌株管饲的HFD小鼠相比，在用活的RT2管饲的HFD小鼠的脂肪细胞尺寸显著更小(图38)。除了白色脂肪组织的脂肪细胞尺寸减少之外，在蛋白质水平下的UCP1表达在腹股沟脂肪组织中得到增强(图39)。值得注意的是，我们检测到在通过RT2的干预之后，在饲喂HFD的小鼠中显著更高的股骨远端骨量(图40)。
材料与方法
扭链瘤胃球菌菌株的培养
RUMTOR_00181阳性扭链瘤胃球菌ATCC 27756(RT2)和RUMTOR_00181阴性扭链瘤胃球菌ATCC 35915(RT3)菌株购自ATCC细菌保藏中心，并且在含有改良碎肉与1％葡萄糖的ATCC培养基#1589(Anaerobe Systems#AS-813)中于厌氧条件(95％N2，5％H2)下培养过夜。
对于小鼠中的经口管饲，将两种菌株的培养物以6000g离心10分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并在具有20％(vol/vol)甘油的厌氧PBS中厌氧浓缩至5×1010菌落形成单位/ml(CFU/ml)。
使用具有5％脱纤维绵羊血和1.5％琼脂的胰蛋白酶大豆培养基(ATCC培养基#260)来确定细菌计数。另外，将5×1010CFU/ml的经浓缩的RT2菌株在121℃下高压灭菌15分钟。确认通过培养来确认存活率，表明热灭活的RT2根本不生长，而活的RT2菌株生长良好。
在经口施用于小鼠之前，解冻细菌原液，并且稀释至5×107CFU/ml、5×108CFU/ml和5×109CFU/ml用于相应的实验。
小鼠中的干预方案
所有小鼠都购自Janvier Labs(Le Genest-Saint-Isle，法国)，具有C57BL/6N背景品系(无特定病原体级)。根据丹麦动物实验监察局(许可证号：2018-15-0201-01491)和哥本哈斯大学(项目号：P20-392)批准的协议进行动物实验。在下述条件下饲养小鼠：除非另有说明，否则所有小鼠都饲养在23±1℃的富集环境下，12小时光照/12小时黑暗循环，随意获取食物和自来水。使用雄性小鼠进行所有体内研究。在进行任何实验之前，使小鼠在标准饲料下适应上述环境1周。在恒定气候室(Memmert，HPP750)的开放笼中进行该适应。除非有关表型分型策略(间接量热法)要求单独饲养，否则将小鼠分组饲养。
对饲喂饲料的小鼠进行干预研究，将八周龄的雄性C57BL/6N小鼠(无特定病原体级，Janvier)单独饲养，在严格的12小时光照周期下自由获取饲料(参见下文描述)和水。将它们分成分别用以下管饲的六组：无菌PBS，低剂量的活的RT3(RT3-LD，5×107菌落形成单位(CFU)/100μl，在无菌PBS中)，高剂量的活的RT3(RT3-HD，5×108CFU/100μl，在无菌PBS中)，低剂量的活的RT2(RT2-LD，5×107CFU/100μl，在无菌PBS中)，高剂量的活的RT2(RT2-HD，5×108CFU/100μl，在无菌PBS中)，以及热灭活的RT2(HK-RT2，5×108CFU/100μl，在无菌PBS中，在121℃下，15分钟)，每周两次，持续8周。在每次管饲前测量体重。
对饲喂高脂饮食的小鼠进行干预研究，将八周龄的雄性C57BL/6N小鼠(无特定病原体级，Janvier)分组饲养，在严格的12小时光照周期下自由获取高脂饮食(参见下文)和水。将它们分成分别用以下管饲的四组：无菌PBS，活的RT3(5×109菌落形成单位(CFU)/100μl，在无菌PBS中)，活的RT2(5×109CFU/100μl，在无菌PBS中)以及热灭活的RT2(5×109CFU/100μl，在无菌PBS中，在121℃下，15分钟)，每周两次，持续8周。每隔一周测量体重。在管饲前以及在实验结束时收集粪便样品，并且在进一步分析前立即贮存于-80℃下。通过全身组成分析仪(EchoMRI)评估体脂量和瘦体重。适应环境的小鼠基于其体重分组，以确保相同的起点。在研究结束时，麻醉小鼠，并且将来自眼眶丛的血液收集到含有乙二胺四乙酸(EDTA)的管中。血液样品在6000rpm，4℃下离心6分钟。分离血浆样品并且贮存于-80℃下，用于后续生物化学分析。
饮食
标准饲料(Altromin 1328饮食)包含11％的脂肪、24％的蛋白质和65％的碳水化合物。这种饮食是基于谷物(大豆、小麦、玉米)的固定配方，其不含苜蓿和鱼/动物粉并且缺乏亚硝胺。
高脂饮食(研究饮食，D12451i)通过45kcal％脂肪(猪油和大豆油)、20kcal％蛋白质(酪蛋白)和35kcal％碳水化合物(蔗糖、lodex 10和淀粉)来配制。
组织取样
解剖组织样品(肝脏、肩胛间棕色脂肪组织、腹股沟白色脂肪组织、附睾白色脂肪组织、空肠、回肠和近端结肠)，称重并贮存于–80℃下用于后续分析。将一部分脂肪组织以及胫骨和股骨之一固定在4％多聚甲醛的PBS溶液中，用于组织学分析或显微CT扫描。
葡萄糖耐量测试
对于在细菌处理6周后的葡萄糖耐量测试，所有小鼠恢复标准饮用水，禁食4小时，称重，然后通过腹膜内注射给予一剂葡萄糖(2g葡萄糖/kg体重)。在0、15、30、60和120分钟时，从尾静脉中采集血液样品，用于使用葡萄糖计(LifeScan)测量血糖。
组织学分析
小鼠腹股沟白色脂肪组织(iWAT)储库在4％多聚甲醛/1×PBS中于4℃下固定过夜，随后在石蜡包埋之前浸入100％乙醇中24小时。为了确定脂肪细胞尺寸，脂肪组织石蜡切片用苏木精和伊红进行染色(H&E染色)。图像在明场显微镜下获得。我们的研究中示出了每组的代表性图像，并且使用开源ImageJ软件，从H&E染色的载玻片测量脂肪细胞直径。
RNA提取和定量
对于从小鼠中分离的组织样品的总RNA提取，在加入一颗无菌不锈钢珠(Qiagen，#69989)和500μl QIAzol裂解试剂后，对每片冷冻组织样品(重约50mg)进行匀浆。匀浆后，样品以12000g在4℃下离心15分钟，收集上清液。随后根据通过RNeasy微型试剂盒(Qiagen，#74106)的制造商提供的说明进行RNA提取，随后为通过NanoDropTM2000/2000c分光光度计(Thermo Fisher，#ND2000CLAPTOP)测量RNA纯度和浓度。按照方案和加热程序，使用高容量RNA-to-cDNATM试剂盒(Fisher Scientific，#10704217)，将总共1μg RNA用于逆转录为cDNA。在与PLUS Master Mix(引物设计，#PPLUS-机器类型)预混合后，使用480系统(Roche Diagnostics)对cDNA样品进行实时PCR。对于每种指示的基因，样品在白色384孔板中运行，并且使用ΔΔCt方法来定量RNA表达水平。
蛋白质印迹分析
使用与含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的混合物预混合的放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)，从iWAT提取总蛋白。在用4-20％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE之前，所提取的蛋白质用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo FisherScientific)进行测量，用上样染料进行稀释并在96℃下加热10分钟。然后用UCP1(ab10983，Abcam)对蛋白质进行免疫印迹测定，并且使用β-肌动蛋白抗体(ab115777，Abcam)作为内部对照。根据供应商的指南，使用LAS 4000(Life Science)系统来对膜进行可视化。
小鼠胫骨近端和股骨远端的显微CT分析
我们使用高分辨率台式微型计算机断层扫描成像(Skyscan 1172，Bruker)扫描来自饲喂饲料的小鼠的胫骨近端和来自喂养HFD的小鼠的股骨远端。如下进行对胫骨近端和股骨远端的皮质显微结构的形态学分析：50kV的X射线电压，200μA的X射线电流，0.5mm铝的过滤器，4-5μm的图像像素尺寸，1280像素域宽的相机分辨率，180°/360°的断层扫描旋转，0.3-0.5°的旋转步长，1-2的均帧，30-50分钟的扫描持续时间。
参考生长板选择干骺端-骨干皮质。如下选择横截面切片作为生长板参考切片：从干骺端/骨干朝向生长板逐个切片移动，到达其中低密度软骨的清晰“桥”(软骨细胞接缝)变得从横截面的一个拐角到另一个拐角建立的点。该桥通过中断软骨细胞接缝的最后一段细小的初级海绵骨的消失而建立。该特征点(landmark)能够为生长板定义参考水平。然后相对于该参考水平定义感兴趣的皮质体积。
皮质区域在干骺端的方向上从生长板水平开始约2.15mm(500个图像切片)，并且从该位置进一步延伸0.43mm(100个图像切片)。计算皮质选定感兴趣区域(ROI)的3D和2D形态测定参数。3D参数基于具有渲染表面的移动立方体(Marching Cubes)类型模型的分析。2D面积和周长的计算基于Pratt算法。使用局部厚度或“球面拟合”方法计算3D结构厚度，并且根据Hildebrand和Ruegsegger的方法推导出结构模型指数(板和杆的相对普遍性的指标)。通过平均截距方法计算各向异性程度。构建渲染的3D模型用于皮质分析区域的3D观察。模型构建是通过“双时间立方体(Double time cubes)”方法(一种改进的移动立方体方法)。通过显微CT测量的皮质形态测定参数包括3D皮质厚度(Ct.Th，mm)、2D皮质横截面厚度(Ct.Cs.Th mm)、皮质骨膜周长(Ct.Pe.Pm，mm)、皮质骨内膜周长(Ct.En.Pm，mm)、皮质横截面积(Ct.Ar，mm2)、极惯性矩(MMI(p)，mm4)、偏心率(Ecc)和皮质孔隙率(Ct.Po，％)。
所有测量都对于检查者不知情地完成。
实施例7-使用SPOT肽微阵列测定来鉴定RUCILP1和RUCILP2与整联蛋白αV/β5受体的结合表位
如所示的，RUCILP1和RUCILP2可通过与整联蛋白αV/β5受体的结合来发挥其多重代谢有益作用。本实施例旨在通过进行无偏且半定量的SPOT肽微阵列(μSPOT)测定，来鉴定两种蛋白质与受体的结合表位。
材料与方法
用于μSPOT测定的两种蛋白质的15-mer肽的合成
在含有9-芴甲氧羰基-β-丙氨酸(Fmoc-β-Ala)接头的酸不稳定的、氨基官能化的纤维素膜盘(Intavis AG)(最小负载1.0μmol/cm)上，使用RePepSL合成仪(Intavis AG)来合成μSPOT肽阵列25(CelluSpots，Intavis AG，Cologne，德国)。通过使用20％哌啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液(分别为1×2和1×4μL，3和5分钟)进行Fmoc脱保护来启动合成，随后用二甲基甲酰胺(DMF，7×100μL/盘)和乙醇(EtOH，3×300μL/盘)洗涤。通过使用Fmoc-Gly-OH和Boc-Gly-OH的混合物(0.25M：0.25M的NMP溶液)，将盘的负载降低到50％。所有偶联都使用1.2μL偶联溶液来实现，所述偶联溶液由预活化的氨基酸(AA，0.5M)与2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯oxyma(1.5M)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC，1.1M)的NMP溶液(2:1:1，AA:oxyma:DIC)组成。进行6次偶联(分别为5、10、20、30、30和30分钟)，随后用封端混合物(5％酸酐的NMP溶液)将膜封端两次，用DMF(7×100μL/盘)洗涤。链延长后，用20％哌啶的NMP溶液(3×4μL，每次5分钟)进行最终的Fmoc脱保护，随后用DMF的6×洗涤，用封端混合物(3×4μL，每次5分钟)进行后续N末端乙酰化，以及用DMF(7×100μL/盘)和EtOH(7×200μL/盘)进行最终洗涤。将经干燥的纤维素膜盘转移到96个深孔板中，并且用由80％TFA、12％DCM、5％H2O和3％TIPS组成的侧链脱保护溶液(150μL/孔)在室温(rt)下处理1.5小时。然后，去除脱保护溶液，使用含有88.5％TFA、4％三氟甲磺酸(TFMSA)、5％H2O和2.5％TIPS的溶剂化混合物(250μL/孔)在rt下将盘溶解过夜。用冰冷的乙醚(700μL/孔)对所得到的肽-纤维素缀合物进行沉淀，并且以1000rpm向下旋转90分钟，随后用冰冷的乙醚额外洗涤所形成的沉淀物。将所得到的沉淀物重溶解于DMSO(250μL/孔)中，以得到最终储备液，将其转移到384孔板中，并且使用SlideSpotter机器人(Intavis AG)打印(一式两份)到白色包被的CelluSpots空白载玻片(76×26mm，Intavis AG)上。
μSPOT测定的可视化和分析
在用100mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)冲洗肽阵列载玻片后，用3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在rt下封闭阵列>2小时。随后，在rt下，将阵列与His-标签化整联蛋白受体(2.5nM)一起在封闭中孵育1小时。在用封闭缓冲液洗涤5×1分钟后，用HRP-缀合的6×-His标签抗体(1:10000，ab184607，abcam)在rt下探测载玻片0.5小时。最后，在rt下用PBS洗涤载玻片3×1分钟，用PBST洗涤2×1分钟，用PBS洗涤2×1分钟。使用SuperSignalWest Femto最高灵敏度底物(Thermo Scientific)与Fusion FX SPectra多模态成像平台(Vilber)，来可视化洗涤后的阵列。使用阵列分析软件(Active Motif)分析所得到的印迹，其中该软件通过比较分析阵列上的每个肽重复的强度来定义每个数据集的误差范围。
结果
我们首先生成了15-mer肽的文库，其涵盖了两种蛋白质全序列，以系统地绘制它们与整联蛋白αV/β5受体的相互作用。这分别产生关于RUCILP1(SEQ ID NO:22-95)和RUCILP2(SEQ ID NO:96-168)的74和73种肽，其是在酸不稳定的、氨基官能化的纤维素膜盘上化学合成的。
在初步筛选之前，我们确认了二抗并不与包被的显微镜载玻片产生非特异性结合(‘背景结合’)(图41A)。然后，通过用重组表达的His-标签整联蛋白αV/β5(2.5nM)筛选μSPOT肽阵列，随后与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的6×-His抗体一起孵育，以半定量方式评估所得到肽的相对结合亲和力(图41B)。
在肽阵列可视化后，我们鉴定了分别含有残基12ETSAKVSWKNAADGKEAAG30(SEQ IDNO:169；RUCILP1)和12ETSAKASWKNAADGKEAAG30(SEQ ID NO:183；RUCILP2)的两个结合表位(图42A和图42B)。另外，两种蛋白质74ESAKSEKVEFTTVKK88(SEQ ID NO:95；RUCILP1)和73NESVKSEKVTFKTLK87(SEQ ID NO:168；RUCILP2)的最C末端序列对整联蛋白受体均显示了相对高的亲和力(图42A和图42B)。
两种蛋白质在N末端处鉴定的结合区域与我们的AlphaFold建模一致，其中我们预测环(loop)位于相同区域处(图43A和图43B)。
柔性环是将二级结构元件聚集在一起的蛋白质区段，并且通常在蛋白质的表面上发现。它们在很大程度上负责与其它蛋白质(例如假定的受体)的相互作用。
事实上，两种蛋白质中鉴定的结合区域对应于鸢尾素中可能与相同的整联蛋白受体相互作用的环26(图43C)。我们的AlphaFold模型还将两种蛋白质的C尾部预测为位于蛋白质表面上的柔性元件(图43D)。因此，在两种蛋白质的C末端处发现针对受体的额外结合命中是合理的。
结论
SPOT肽微阵列测定使得能够在实验上验证在计算机芯片上预测的蛋白质与其受体的结合。在我们的初步在计算机芯片上的预测中，发现了位于两种蛋白质的残基69DAA71处的另一潜在的环。然而，本实验的结果并不支持RUCILP1中的预测结合，而在RUCILP2中，我们发现了包括预测环的两个丙氨酸残基的15-mer肽70AAGNESVKSEKVTFK84(SEQ ID NO:165)，其显示出与αV/β5整联蛋白受体的显著结合。
实施例8-RUCILP1和RUCILP2在体外和体内的头对头生物活性比较
在细胞和啮齿类动物研究中表明，RUCILP2对代谢具有多重有利作用。在此处，我们对RUCILP1和RUCILP2在体外和体内的作用进行头对头比较。
材料与方法
细胞培养实验
将3T3-L1细胞(小鼠成纤维细胞系)分配到12孔板上并生长至汇合，然后用86nM胰岛素、0.1μM地塞米松和250μM甲基异丁基黄嘌呤处理来诱导分化。诱导两天后，在重组RUCILP或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)的存在下，将细胞转入至诱导培养基两天。随后，在指示浓度的重组RUCILP、21-AABP1、商业重组鸢尾素或PBS的存在下，将细胞在86nM胰岛素中维持四天，每隔一天更换培养基，持续6天。然后收获细胞用于q-PCR分析，如关于基因表达分析的标准方案中所进行的描述。
将MLO-Y4细胞(小鼠骨细胞样细胞系)接种到I型胶原包被的6孔板上的补充有2.5％胎牛血清(来自Fisher Scientific的FBS，#11550356)、2.5％小牛血清(Hyclone，SH30072.03)和1％青霉素-链霉素(Fisher Scientific，#11548876)的最低基本培养基(来自Fisher Scientific的α-MEM，#15430584)中。将细胞培养物奥驰在37℃、5％CO2的湿化室中，每2-3天更换培养基。在60％汇合时，用温PBS洗涤后，将培养基转入至FreeStyle293表达培养基。孵育4小时后，用重组RUCILP或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)或PBS处理细胞24小时。处理后，收获MLO-Y4细胞，用于硬化蛋白的mRNA水平的qRT-PCR分析，如关于标准基因表达分析的方案中所进行的描述。
将C2C12细胞(小鼠成肌细胞细胞系)接种到12孔板上的补充有10％FBS(胎牛血清，Fisher Scientific，#11550356)和1％青霉素-链霉素(Fisher Scientific，#11548876)的DMEM/F-12培养基(杜氏改良Eagle培养基/营养素混合物F-12，FisherScientific，#11524436)中。将细胞培养物保持在37℃、5％CO2的湿化室中，每2-3天更换培养基。在大约80％汇合时，用2％马血清替换10％胎牛血清，以诱导C2C12成肌细胞分化成肌管。二十四小时后(分化的第1天)，用重组RUCILP或商业重组鸢尾素(Sigma，#SRP8039-10UG和Phoenix pharmaceuticals，#067-29A)或PBS处理细胞。在第三天，用与第一天相同的培养基恢复细胞。在第3天时处理6小时后，收获细胞用于所指示基因的mRNA水平的qRT-PCR分析。
小鼠实验
所有小鼠都购自Janvier Labs(Le Genest-Saint-Isle，法国)，具有C57BL/6N背景品系(无特定病原体级)。根据丹麦动物实验监察局(许可证号：2018-15-0201-01491)和哥本哈斯大学(项目号：P20-392)批准的协议进行动物实验。在下述条件下饲养小鼠：除非另有说明，否则所有小鼠都饲养在23±1℃的富集环境下，12小时光照/12小时黑暗循环，随意获取食物和自来水。使用雄性小鼠进行所有这些体内研究。在进行任何实验之前，使小鼠在标准饲料下适应上述环境1周。在恒定气候室(Memmert，HPP750)的开放笼中进行该适应。除非有关表型分型策略(间接量热法)要求单独饲养，否则将小鼠分组饲养。
对于RUCILP干预研究，用标准饲料饲喂的雄性小鼠(n＝6只/组，8周龄)每天分别腹膜内注射1mg/kg重组RUCILP1、RUCILP2或盐水处理，持续一周。然后处死所有动物，收集皮下脂肪垫和肝脏。如关于基因表达分析的标准方案中所述的，通过qRT-PCR分析皮下脂肪和肝脏中所指示基因的mRNA水平。
细胞和小鼠组织中的基因表达分析
根据通过RNeasy微型试剂盒(Qiagen)的制造商提供的说明，使用QIAzol裂解试剂(Qiagen)从细胞或组织中提取总RNA，随后用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific)测定RNA纯度和浓度。使用iScriptTMSelect cDNA合成试剂盒(Bio-RadLaboratories)，将总共1μg RNA用于逆转录为cDNA。在与PLUS Master Mix(Primer Design)预混合后，使用LC480系统(Roche Diagnostics)对样品进行实时PCR。对于每种指示的基因，样品在384孔板中一式两份运行，并且在针对看家Rpl36或GAPDH基因标准化后，使用ΔΔCt方法用于定量表达。
结果
体外测量时，RUCILP1和RUCILP2的生物活性的头对头比较
首先，我们测试了RUCILP对小鼠成纤维细胞(3T3-L1)、小鼠成骨细胞(MLO-Y4)和小鼠成肌细胞(C2C12)中的基因表达的剂量反应效应。
为了评估对脂肪细胞褐变的作用，我们测量了Ucp1、Prdm16、Pgc1a、Dio2和Cox2的表达，并且测量了AdipoQ的表达作为白色脂肪细胞的标记物。作为骨形成的标记物，我们测量了硬化蛋白的表达；并且肌管形成的标记物(包括Heyl、Sox3和Stat3的表达)。
如图44所示，在小鼠成纤维细胞中，我们观察到两种RUCILP以剂量依赖性方式上调脂肪细胞褐变的标记物，同时下调脂联素表达。在骨细胞中，RUCILP1和RUCILP2在150nM的剂量下增加硬化蛋白表达水平。在成肌细胞中，Heyl的表达在RUCILP2刺激后显示了比RUCILP1暴露后更明显的剂量依赖性反应，而其它两种肌管形成标记物(Sox8和Stat3)以较少的剂量依赖性方式反应。
除RUCILP1和RUCILP2之外，我们还在3T3-L1成纤维细胞上测试了21-AABP1(即衍生自RUCILP1的21个氨基酸片段)(图45)，然而，尽管由Ucp1、Prdm16和Dio2组成的褐变标记物有明显的上调趋势，但其效应被视为是不显著的。
当在C57/b6小鼠体内测量时，RUCILP1和RUCILP2的比较研究
将RUCILP1或RUCILP2以1mg/kg体重的剂量注射到C57/b6小鼠的腹膜内7天，并以与对照相同的方式给予等渗盐水。在解剖皮下白色脂肪组织(SWAT)后，对产热和白色脂肪细胞的标记物进行基于定量PCR的测量，我们发现两种RUCILP对产热标记物(包括Ucp1、Prdm16和Dio2)显示出相当的作用(图46)。然而，我们并未发现在RUCILP1暴露后，白色脂肪细胞的基因标记物(即AdipoQ和Ppara)的表达的显著降低，而RUCILP2暴露缩减了白色脂肪细胞中这两种基因的表达。在小鼠肝细胞中，RUCILP2暴露降低参与糖异生的基因(即G6pase和Pepck1)的表达，而RUCILP1暴露没有影响。
结论
在体外实验中，我们发现小鼠成纤维细胞(3T3-L1)、小鼠成骨细胞(MLO-Y4)和小鼠成肌细胞(C2C12)暴露于等价浓度的重组RUCILP1或RUCILP2，对所选基因的表达诱导总体相似的作用。
21-AABP1对褐变基因的表达没有显著的体外作用。
在关于RUCILP1和RUCILP2作用的小鼠体内研究中，两种肽对皮下白色脂肪组织(SWAT)中的产热具有相当的刺激作用。然而，虽然RUCILP2降低了SWAT中的白色基因和肝脏中的糖异生基因标记物的表达，但RUCILP1没有此类作用。
实施例9-丙氨酸扫描以鉴定负责与整联蛋白受体结合的特定残基，以及截短扫描以确定关于RUCILP1和RUCILP2衍生片段的结合活性所需的最小肽长度
在发现RUCILP1和RUCILP2可能经由19-mer结合表位与整联蛋白αV/β5受体结合之后，进行以下：1)丙氨酸扫描肽文库，以鉴定负责结合的特定氨基酸残基；以及2)截短扫描肽文库，以估计保持结合活性的最短肽，随后进行SPOT肽微阵列(μSPOT)测定，以可视化且定量结合亲和力。
材料与方法
用于μSPOT测定的两个19-mer表位的丙氨酸扫描文库和截短扫描文库的合成
在含有9-芴甲氧羰基-β-丙氨酸(Fmoc-β-Ala)接头的酸不稳定的、氨基官能化的纤维素膜盘(Intavis AG)(最小负载1.0μmol/cm)上，使用RePepSL合成仪(Intavis AG)来合成μSPOT肽阵列22(CelluSpots，Intavis AG，Cologne，德国)。通过使用20％哌啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液(分别为1×2和1×4μL，3和5分钟)进行Fmoc脱保护来启动合成，随后用二甲基甲酰胺(DMF，7×100μL/盘)和乙醇(EtOH，3×300μL/盘)洗涤。通过使用Fmoc-Gly-OH和Boc-Gly-OH的混合物(0.25M：0.25M的NMP溶液)，将盘的负载降低到50％。所有偶联都使用1.2μL偶联溶液来实现，所述偶联溶液由预活化的氨基酸(AA，0.5M)与2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯oxyma(1.5M)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC，1.1M)的NMP溶液(2:1:1，AA:oxyma:DIC)组成。进行6次偶联(分别为5、10、20、30、30和30分钟)，随后用封端混合物(5％酸酐的NMP溶液)将膜封端两次，用DMF(7×100μL/盘)洗涤。链延长后，用20％哌啶的NMP溶液(3×4μL，每次5分钟)进行最终的Fmoc脱保护，随后用DMF的6×洗涤，用封端混合物(3×4μL，每次5分钟)进行后续N末端乙酰化，以及用DMF(7×100μL/盘)和EtOH(7×200μL/盘)进行最终洗涤。将经干燥的纤维素膜盘转移到96个深孔板中，并且用由80％TFA、12％DCM、5％H2O和3％TIPS组成的侧链脱保护溶液(150μL/孔)在室温(rt)下处理1.5小时。然后，去除脱保护溶液，使用含有88.5％TFA、4％三氟甲磺酸(TFMSA)、5％H2O和2.5％TIPS的溶剂化混合物(250μL/孔)在rt下将盘溶解过夜。用冰冷的乙醚(700μL/孔)对所得到的肽-纤维素缀合物进行沉淀，并且以1000rpm向下旋转90分钟，随后用冰冷的乙醚额外洗涤所形成的沉淀物。将所得到的沉淀物重溶解于DMSO(250μL/孔)中，以得到最终储备液，将其转移到384孔板中，并且使用SlideSpotter机器人(Intavis AG)打印(一式两份)到白色包被的CelluSpots空白载玻片(76×26mm，Intavis AG)上。
μSPOT测定的可视化和分析
在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)冲洗肽阵列载玻片后，用3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液在rt下封闭阵列>2小时。随后，在rt下，将阵列与His-标签化整联蛋白受体(2.5nM)一起在封闭中孵育1小时。在用封闭缓冲液洗涤5×1分钟后，用HRP缀合的6×-His标签抗体(1:10000，ab184607，abcam)在rt下探测载玻片0.5小时。最后，在rt下用PBS洗涤载玻片3×1分钟，用PBST洗涤2×1分钟，用PBS洗涤2×1分钟。使用SuperSignal WestFemto最高灵敏度底物(Thermo Scientific)与Fusion FX SPectra多模态成像平台(Vilber)，来可视化洗涤后的阵列。使用阵列分析软件(Active Motif)分析所得到的印迹，其中该软件通过比较分析阵列上的每个肽重复的强度来定义每个数据集的误差范围。
结果
为了鉴定对于两种RUCILP和整联蛋白受体之间的结合至关重要的氨基酸残基，我们生成了两种RUCILP中鉴定的结合表位的丙氨酸扫描文库，其中我们用丙氨酸替换19-mer表位的每个氨基酸残基，并且将肽与整联蛋白受体的结合亲和力与野生型的结合亲和力进行比较。
如图47中所示的，在系统筛选突变肽后，我们发现RUCILP1和RUCILP2中的赖氨酸取代引起受体亲和力的严重丧失，表明两种RUCILP的结合表位中碱性残基的重要性。
另外，我们发现了用丙氨酸取代酸性残基(谷氨酸和天冬氨酸)或色氨酸引起结合亲和力增加。
结果解释如下：
(1)19-mer表位中对于维持结合亲和力可能重要的氨基酸残基：
RUCILP1:12ETSAKVSWKNAADGKEAAG30(SEQ ID NO:169)
RUCILP2:12ETSAKASWKNAADGKEAAG30(SEQ ID NO:183)
(2)19-mer表位中取代为丙氨酸后可能潜在地增强结合亲和力的氨基酸残基：
RUCILP1:12ETSAKVSWKNAADGKEAAG30(SEQ ID NO:169)
RUCILP2:12ETSAKASWKNAADGKEAAG30(SEQ ID NO:183)
接下来，我们对所鉴定的结合表位进行截短扫描，以确定维持核心结合活性所需的最小长度。文库通过从每个末端系统地截短肽的序列而生成。如图48中所示，对于两个结合表位，我们发现了N末端氨基酸残基对于维持与整联蛋白受体的核心结合活性比C末端残基更重要。
与19-mer肽相比时，15-mer肽显示了更高的结合亲和力，表明截短的肽可能与整联蛋白受体结合更紧密。通过采用截短扫描，我们证实了展示高结合亲和力的最短肽是：
RUCILP1:12ETSAKVSWK20(SEQ ID NO:235)
RUCILP2:12ETSAKASWK20(SEQ ID NO:268)
讨论
我们据此报告，RUCILP1和RUCILP2中鉴定的两个19-mer结合表位的3个赖氨酸(K16、K20和K26)残基对于维持结合活性是重要的。在这三个赖氨酸残基中，两个19-mer表位的C末端赖氨酸残基(K26)先前预测为与负责结合整联蛋白受体的柔性环(17ADGK20)有关。
我们的丙氨酸扫描结果不仅支持了AlphaFold预测的结果，而且还突出显示了碱性氨基酸残基特别是赖氨酸对于维持与整联蛋白受体的结合亲和力的重要性。
相当重要的是，我们发现了四个酸性残基的取代引起结合亲和力的显著增加，为肽修饰提供了候选位点以进一步改善亲和力。
在截短扫描中，我们将19-mer表位截短为含有9个氨基酸残基的肽，具有相当有利的结合性质。9-mer肽可能潜在地充当两种RUCILP的潜在药物先导类似物，同时保留RUCILP1和RUCILP2的许多关键特征。
序列概述
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序列表
<110> 哥本哈根大学
<120> 衍生自扭链瘤胃球菌的肽
<130> P5952PC00
<160> 274
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met His Pro Gly Ser Pro Ser Ala Trp Pro Pro Arg Ala Arg Ala Ala
1 5 10 15
Leu Arg Leu Trp Leu Gly Cys Val Cys Phe Ala Leu Val Gln Ala Asp
20 25 30
Ser Pro Ser Ala Pro Val Asn Val Thr Val Arg His Leu Lys Ala Asn
35 40 45
Ser Ala Val Val Ser Trp Asp Val Leu Glu Asp Glu Val Val Ile Gly
50 55 60
Phe Ala Ile Ser Gln Gln Lys Lys Asp Val Arg Met Leu Arg Phe Ile
65 70 75 80
Gln Glu Val Asn Thr Thr Thr Arg Ser Cys Ala Leu Trp Asp Leu Glu
85 90 95
Glu Asp Thr Glu Tyr Ile Val His Val Gln Ala Ile Ser Ile Gln Gly
100 105 110
Gln Ser Pro Ala Ser Glu Pro Val Leu Phe Lys Thr Pro Arg Glu Ala
115 120 125
Glu Lys Met Ala Ser Lys Asn Lys Asp Glu Val Thr Met Lys Glu Met
130 135 140
Gly Arg Asn Gln Gln Leu Arg Thr Gly Glu Val Leu Ile Ile Val Val
145 150 155 160
Val Leu Phe Met Trp Ala Gly Val Ile Ala Leu Phe Cys Arg Gln Tyr
165 170 175
Asp Ile Ile Lys Asp Asn Glu Pro Asn Asn Asn Lys Glu Lys Thr Lys
180 185 190
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Thr Pro Glu His Gln Gly Gly Gly Leu Leu
195 200 205
Arg Ser Lys Ile
210
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Ser Pro Ser Ala Pro Val Asn Val Thr Val Arg His Leu Lys Ala
1 5 10 15
Asn Ser Ala Val Val Ser Trp Asp Val Leu Glu Asp Glu Val Val Ile
20 25 30
Gly Phe Ala Ile Ser Gln Gln Lys Lys Asp Val Arg Met Leu Arg Phe
35 40 45
Ile Gln Glu Val Asn Thr Thr Thr Arg Ser Cys Ala Leu Trp Asp Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Gln Ser Pro Ala Ser Glu Pro Val Leu Phe Lys Thr Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Glu Lys Met Ala Ser Lys Asn Lys Asp Glu Val Thr Met Lys Glu
100 105 110
<210> 3
<211> 141
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques）
<400> 3
Ala Pro Val Asp Val Lys Val Ser Glu Ile Thr Glu Thr Ser Ala Lys
1 5 10 15
Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn
20 25 30
Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala
35 40 45
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50 55 60
Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys
65 70 75 80
Val Thr Phe Lys Thr Leu Lys Ala Glu Glu Gln Lys Glu Asp Ser Thr
85 90 95
Leu Glu Asn Asn Glu Lys Pro Gly Ala Val Gln Thr Gly Asp His Val
100 105 110
Asn Val Phe Val Trp Met Ile Gly Leu Leu Ile Ser Ala Ser Ala Ala
115 120 125
Val Ala Val Met Phe Lys Arg Asn Lys Asn Arg Lys Asp
130 135 140
<210> 4
<211> 87
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 4
Ala Pro Val Asp Val Lys Val Ser Glu Ile Thr Glu Thr Ser Ala Lys
1 5 10 15
Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn
20 25 30
Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala
35 40 45
Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu
50 55 60
Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys
65 70 75 80
Val Thr Phe Lys Thr Leu Lys
85
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 5
Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly
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20
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 6
Val Ser Glu Ile Thr Glu Thr Ser Ala Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 7
Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 8
Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 261
<212> DNA
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 9
gctccggtcg acgtaaaagt ttcggaaatt accgagacaa gcgcaaaagc atcatggaag 60
aacgcggcgg acggaaaaga agcggcagga tacaacgtat atgttgacgg tgtaaaattg 120
aacaaagaac ttcttacaga agcatcttgc ggattgacaa atctgaaagc agagactaca 180
tattttgtag aagtgacggc ggtagacgca gccggaaatg aatctgttaa atcagaaaaa 240
gtgacgttta agacattgaa a 261
<210> 10
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 针对大肠杆菌进行密码子优化的扭链瘤胃球菌RUCILP2肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(261)
<223> 密码子优化的RUCILP2
<400> 10
gctcccgtag atgttaaagt atcagaaatt accgagacca gcgcgaaagc gagctggaaa 60
aatgcggcgg acggtaaaga ggcggcgggc tacaacgtgt atgttgatgg tgtgaagctg 120
aacaaagagc tgctgaccga agcgagctgc ggcctgacca acctgaaagc ggaaaccacc 180
tacttcgtgg aagttaccgc ggtggatgcg gcgggcaatg agagcgttaa gagcgagaaa 240
gtgaccttca agaccctgaa a 261
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 11
gcagagacta catattttgt agaagtgacg gcggtagacg cagccggaaa tgaatctgtt 60
aaa 63
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 针对大肠杆菌进行密码子优化的，衍生自来自扭链瘤胃球菌的RUCILP2的多肽21-AABP
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(63)
<223> 衍生自RUCILP2的密码子优化的21-AABP
<400> 12
gctgagacaa cgtattttgt tgaagtaact gctgtggacg cggcaggtaa cgagagcgtt 60
aag 63
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 13
gtttcggaaa ttaccgagac aagcgcaaaa 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 针对大肠杆菌进行密码子优化的，经胰蛋白酶消化的衍生自来自扭链瘤胃球菌的RUCILP2的氨基酸7-16的多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 衍生自RUCILP2的氨基酸7-16
<400> 14
gtttctgaga tcaccgagac gagcgcaaaa 30
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 15
gaagcggcag gatacaacgt atatgttgac ggtgtaaaa 39
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 针对大肠杆菌进行密码子优化的，经胰蛋白酶消化的衍生自来自扭链瘤胃球菌的RUCILP2的氨基酸27-39的多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(39)
<223> 衍生自RUCILP2的氨基酸27-39
<400> 16
gaagctgccg ggtacaacgt ctatgtagat ggtgtcaaa 39
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 17
gaacttctta cagaagcatc ttgcggattg acaaatctga aa 42
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 对于大肠杆菌进行密码子优化的，经胰蛋白酶消化的衍生自来自扭链瘤胃球菌的RUCILP2的氨基酸43-56的多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(42)
<223> 衍生自RUCILP2的氨基酸43-56
<400> 18
gaactgctga cagaagcaag ttgcggactt actaacctta aa 42
<210> 19
<211> 88
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 19
Ala Pro Val Asp Val Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys
1 5 10 15
Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn
20 25 30
Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr
35 40 45
Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu
50 55 60
Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Glu Glu Ser Ala Lys Ser Glu Lys
65 70 75 80
Val Glu Phe Thr Thr Val Lys Lys
85
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 20
Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ser Ala Lys
20
<210> 21
<211> 1271
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 21
Met Lys Lys Lys Trp Val Ser Gly Met Leu Ala Leu Leu Leu Val Gly
1 5 10 15
Thr Thr Val Gly Ser Met Met Pro Thr Glu Ala Val Gln Ala Glu Glu
20 25 30
Asn Ser Gln Gly Lys Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Glu Asn Gly Lys Asp
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Leu Ser Glu Gly Lys Ala Phe Gln Thr Leu Asn Lys
50 55 60
Val Asn Asp Leu Thr Leu Gly Ala Gly Asp Arg Val Leu Leu Lys Asn
65 70 75 80
Gly Ser Val Phe Glu Asp Gln Ala Leu His Ile Lys Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Glu Asn Ala Pro Ile Lys Ile Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Gly
100 105 110
Arg Pro Gln Ile Asn Thr Asn Gly His Gly Gln Trp Glu Leu Asn Tyr
115 120 125
Gly His Lys Leu Asp Asn Gln Asn His Lys Trp His Gly Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ser Ile Leu Leu Lys Asp Val Glu Tyr Ile Glu Ile Glu Gly Leu
145 150 155 160
Glu Ile Thr Asn Asp Arg Asp Ser Ala Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys
165 170 175
Asn Tyr Lys Tyr Asn Asp Ala Glu Cys Met Asp Arg Thr Gly Val Ala
180 185 190
Gly Val Ala Lys Asn Lys Gly Thr Val Asp His Ile Val Leu Asn Asp
195 200 205
Leu Tyr Ile His Asp Val Thr Gly Asn Val Tyr Asn Lys His Met Thr
210 215 220
Asn Gly Gly Ile Tyr Phe Ile Val Glu Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ala
225 230 235 240
Thr Gly Ile Ala Arg Tyr Asn Asp Val Thr Ile Gln Asn Cys Tyr Leu
245 250 255
Asp Thr Val Asn Arg Trp Gly Ile Ala Val Gly Tyr Thr Tyr Glu Trp
260 265 270
Ala Lys Phe Asn Gly Gly Ala Leu Ser Asp Glu Thr Met Lys Thr Tyr
275 280 285
Ala Ser Ser Asp Val Val Ile Gln Asn Asn Tyr Leu Asn Asn Val Gly
290 295 300
Gly Asp Ala Ile Thr Thr Met Tyr Ile Asp Arg Pro Val Ile Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Val Ser Glu Asn Ala Ala Ala Gln Ile Asn Thr Thr Asp Tyr Thr
325 330 335
Asp Pro Gln Pro Gln Leu Asp Ala Asn Gly Asn Pro Asn Gly Lys Thr
340 345 350
His Thr Gly Gly Arg Val Ala Ala Gly Ile Trp Pro Trp Lys Cys Lys
355 360 365
Asn Ala Val Phe Gln Tyr Asn Glu Cys Phe Lys Thr Leu Asn Ala Ser
370 375 380
Lys Gly Asn Gly Asp Gly Gln Pro Trp Asp Ala Asp Tyr Gly Asp Gly
385 390 395 400
Thr Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Ser His Gly Asn Thr Ala Ser Thr Ile
405 410 415
Met Phe Cys Gly Gly Glu Ser Ile Asn Asn Thr Phe Arg Tyr Asn Ile
420 425 430
Ser Val His Glu Asp Met Gly Pro Leu Asp Pro Ala Gly Asn Ala Gly
435 440 445
Asn Thr Gln Val Tyr Asn Asn Thr Phe Val Ile Lys Glu Gly Ile Arg
450 455 460
Ser Ile Trp Tyr Arg Asp Ser Gly Pro Val Thr Met Glu Asn Asn Ile
465 470 475 480
Phe Tyr Phe Asp Gly Glu Gln Pro Ala Gln Ile Thr Asn Trp Asn Pro
485 490 495
Arg Asn Asn Lys Val Tyr Ser Asn Asn Leu Phe Tyr Asn Val Ser Ser
500 505 510
Tyr Pro Asp Asp Lys Ala Ala Val Lys Val Glu Lys Gly Thr Pro Val
515 520 525
Leu Ala Asp Ala Ala Ser Gly Pro Val Lys Ala Ala Glu Asn Lys Gln
530 535 540
Ala Arg Arg His Glu Asp Pro Thr Glu Ile Thr Val Phe Asp Gly Phe
545 550 555 560
Lys Leu Ala Glu Asn Ser Pro Ala Ile Asn Lys Gly Lys Val Val Ile
565 570 575
Asp Arg Asn Gly Tyr Ser Ile Asp His Asp Phe Phe Gly His Ala Val
580 585 590
Thr Ala Thr Pro Glu Ile Gly Ala Ala Glu Ser Asp Val Ile Gly Asp
595 600 605
Leu Val Leu Arg Ser Val Val Tyr Gln Ile Asp Gln Glu Ser Lys Thr
610 615 620
Ile Ser Asp Ile Pro Lys Asn Thr Thr Val Glu Gln Phe Cys Lys Asp
625 630 635 640
Ser Ile Val Asp Thr Gly Val Thr Ile Thr Val Lys Ser Lys Asp Gly
645 650 655
Lys Pro Leu Glu Asn Ala Asp Ile Ile Lys Gly Gly Met Thr Val Thr
660 665 670
Val Ser Cys Glu Gly Lys Glu Ala Val Val Tyr Thr Val Val Ala Ser
675 680 685
Ser Asp Asn Lys Leu Lys Ser Ala Tyr Tyr Glu Val Lys Asp Lys Thr
690 695 700
Ile Tyr Val Pro Phe Thr Glu Lys Asn Pro Thr Thr Ala Gly Glu Leu
705 710 715 720
Lys Gly Asn Val Gln Ala Ala Glu Thr Ala Glu Val Ser Val Val Ser
725 730 735
Gly Glu Lys Thr Leu Lys Asp Gln Glu Asn Ile Ala Asp Ala Met Thr
740 745 750
Met Arg Ile Thr Ala Glu Asp Gly Lys Thr Asn Asp Tyr Thr Ile Lys
755 760 765
Gln Lys Asn Thr Tyr Asn Trp Ala Leu Asp Tyr Ala Gly Pro Gln Gln
770 775 780
Gly Asn Val Trp Phe Gly Gln Lys Lys Ala Ala Ser Gly Glu Trp Thr
785 790 795 800
Glu Ile Lys Glu Tyr Asp Ser Gln Tyr Pro Asn Trp Met Val Asn Thr
805 810 815
Tyr Tyr Gly Pro Gly Ile Asp Glu Gln Ser His Ser Ala Lys Pro Thr
820 825 830
Glu Ala Thr His Gly Leu Leu Ser Ala Pro Pro Ser Thr Gly Ile Ser
835 840 845
Thr Ala Met Ala Tyr Arg Val Pro Lys Asp Gly Met Val Ser Phe His
850 855 860
Val Lys Asp Asp Glu Pro Tyr Leu Arg Gln Asn Gly Asn Ser Gly Gly
865 870 875 880
Thr Val Thr Leu Lys Leu Leu Val Asn Asp Glu Glu Lys Gln Ser Val
885 890 895
Ile Leu Glu Gln Ser Lys Val Gln Ala Lys Asp Trp Lys Ala Phe Asp
900 905 910
Lys Ile Glu Val Lys Arg Gly Asp Tyr Ile Arg Val Ala Ala Ile Ser
915 920 925
Asn Gly Asn Pro Thr Lys Pro Ser Val His Val Thr Pro Ile Ile Thr
930 935 940
Tyr Leu Asn Glu Gly Gly Thr Pro Ala Pro Glu Pro Thr Pro Glu Leu
945 950 955 960
Lys Ala Pro Val Asp Val Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala
965 970 975
Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr
980 985 990
Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu
995 1000 1005
Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser
1010 1015 1020
Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Glu Glu Ser Ala Lys
1025 1030 1035
Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Thr Val Lys Lys Val Val Val Asp
1040 1045 1050
Lys Glu Ala Leu Lys Ala Asn Ile Glu Arg Ala Ser Ala Leu Leu
1055 1060 1065
Asn Glu Thr Asp Lys Tyr Thr Glu Glu Ser Leu Lys Ala Leu Glu
1070 1075 1080
Glu Ala Leu Ala Ala Ala Gln Lys Val Asn Ser Asp Pro Lys Ala
1085 1090 1095
Asp Gln Thr Lys Val Asn Asp Ala Asn Thr Ala Leu Glu Lys Ala
1100 1105 1110
Ile Lys Asp Leu Lys Glu Gln Glu Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr
1115 1120 1125
Pro Glu Leu Lys Ala Pro Val Asp Val Lys Val Ser Glu Ile Thr
1130 1135 1140
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys
1145 1150 1155
Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn
1160 1165 1170
Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys
1175 1180 1185
Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala
1190 1195 1200
Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val Thr Phe Lys Thr Leu
1205 1210 1215
Lys Ala Glu Glu Gln Lys Glu Asp Ser Thr Leu Glu Asn Asn Glu
1220 1225 1230
Lys Pro Gly Ala Val Gln Thr Gly Asp His Val Asn Val Phe Val
1235 1240 1245
Trp Met Ile Gly Leu Leu Ile Ser Ala Ser Ala Ala Val Ala Val
1250 1255 1260
Met Phe Lys Arg Asn Lys Asn Arg
1265 1270
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 22
Ala Pro Val Asp Val Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 23
Pro Val Asp Val Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 24
Val Asp Val Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 25
Asp Val Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 26
Val Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 27
Lys Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 28
Val Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 29
Ser Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 30
Glu Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 31
Val Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 32
Thr Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 33
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 34
Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 35
Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 36
Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 37
Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 38
Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 39
Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 40
Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 41
Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 42
Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 43
Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 44
Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 45
Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 46
Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 47
Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 48
Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 49
Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 50
Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 51
Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 52
Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 53
Asn Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 54
Val Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 55
Tyr Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr
1 5 10 15
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 56
Val Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr
1 5 10 15
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 57
Asp Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr
1 5 10 15
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 58
Gly Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 59
Thr Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 60
Lys Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 61
Val Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 62
Asn Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 63
Glu Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 64
Glu Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 65
Leu Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 66
Ile Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr
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<210> 67
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 67
Ala Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr
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<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 68
Glu Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 69
Thr Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 70
Thr Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 71
Tyr Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 72
Asn Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 73
Val Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 74
Ser Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 75
Ser Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val
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<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 76
Leu Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp
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<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 77
Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala
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<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 78
Asp Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 79
Gly Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 80
Thr Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Glu
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 81
Thr Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Glu Glu
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 82
Tyr Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Glu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 83
Ser Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Glu Glu Ser Ala
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 84
Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Glu Glu Ser Ala Lys
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 85
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 86
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 87
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<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 88
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 89
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<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 90
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<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 91
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 94
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<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 95
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<213> 扭链瘤胃球菌
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 102
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 103
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 104
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 105
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 106
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 107
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 108
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 109
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 110
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 111
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 112
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1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 113
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1 5 10 15
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 114
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1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 115
Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 116
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<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 117
Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 118
Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 119
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<210> 120
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 120
Gly Lys Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys
1 5 10 15
<210> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 121
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1 5 10 15
<210> 122
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 122
Glu Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn
1 5 10 15
<210> 123
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 123
Ala Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys
1 5 10 15
<210> 124
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 124
Ala Gly Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu
1 5 10 15
<210> 125
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 125
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1 5 10 15
<210> 126
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 126
Tyr Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu
1 5 10 15
<210> 127
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 127
Asn Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr
1 5 10 15
<210> 128
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 128
Val Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu
1 5 10 15
<210> 129
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 129
Tyr Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala
1 5 10 15
<210> 130
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 130
Val Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser
1 5 10 15
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 131
Asp Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys
1 5 10 15
<210> 132
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 132
Gly Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly
1 5 10 15
<210> 133
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 133
Val Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu
1 5 10 15
<210> 134
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 134
Lys Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr
1 5 10 15
<210> 135
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 135
Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn
1 5 10 15
<210> 136
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 136
Asn Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu
1 5 10 15
<210> 137
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 137
Lys Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys
1 5 10 15
<210> 138
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 138
Glu Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala
1 5 10 15
<210> 139
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 139
Leu Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu
1 5 10 15
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 140
Leu Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr
1 5 10 15
<210> 141
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 141
Thr Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr
1 5 10 15
<210> 142
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 142
Glu Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr
1 5 10 15
<210> 143
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 143
Ala Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 144
Ser Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val
1 5 10 15
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 145
Cys Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu
1 5 10 15
<210> 146
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 146
Gly Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val
1 5 10 15
<210> 147
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 147
Leu Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr
1 5 10 15
<210> 148
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 148
Thr Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala
1 5 10 15
<210> 149
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 149
Asn Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val
1 5 10 15
<210> 150
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 150
Leu Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp
1 5 10 15
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 151
Lys Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala
1 5 10 15
<210> 152
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 152
Ala Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala
1 5 10 15
<210> 153
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 153
Glu Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 154
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 154
Thr Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn
1 5 10 15
<210> 155
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 155
Thr Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu
1 5 10 15
<210> 156
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 156
Tyr Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser
1 5 10 15
<210> 157
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 157
Phe Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val
1 5 10 15
<210> 158
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 158
Val Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys
1 5 10 15
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 159
Glu Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser
1 5 10 15
<210> 160
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 160
Val Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu
1 5 10 15
<210> 161
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 161
Thr Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys
1 5 10 15
<210> 162
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 162
Ala Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val
1 5 10 15
<210> 163
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 163
Val Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val Thr
1 5 10 15
<210> 164
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 164
Asp Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val Thr Phe
1 5 10 15
<210> 165
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 165
Ala Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val Thr Phe Lys
1 5 10 15
<210> 166
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 166
Ala Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val Thr Phe Lys Thr
1 5 10 15
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 167
Gly Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val Thr Phe Lys Thr Leu
1 5 10 15
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 168
Asn Glu Ser Val Lys Ser Glu Lys Val Thr Phe Lys Thr Leu Lys
1 5 10 15
<210> 169
<211> 19
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 169
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 170
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 170
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala
<210> 171
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 171
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Gly Gly
<210> 172
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 172
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Gly Ala Gly
<210> 173
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 173
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 174
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 174
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Ala Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 175
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 175
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 176
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 176
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Ala Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 177
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 177
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Gly Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 178
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 178
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Gly Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 179
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 179
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Ala Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 180
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 180
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Ala Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 181
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 181
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Ala Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 182
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ala Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 183
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1 5 10 15
Ala Ala Gly
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 184
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1 5 10 15
Ala Ala Gly
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<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 185
Glu Thr Ser Gly Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 186
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 186
Glu Thr Ala Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 187
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 187
Glu Ala Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 188
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP1的丙氨酸扫描序列
<400> 188
Ala Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 189
<211> 19
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 189
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 190
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 190
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 191
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Gly Gly
<210> 192
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 192
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Gly Ala Gly
<210> 193
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 193
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 194
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 194
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Ala Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 195
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 195
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 196
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 196
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Ala Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 197
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 197
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Gly Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 198
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 198
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Gly Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 199
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 199
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Ala Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 200
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 200
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Ala Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 201
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 201
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Ala Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 202
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 202
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ala Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 203
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 203
Glu Thr Ser Ala Lys Gly Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 204
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 204
Glu Thr Ser Ala Ala Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 205
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 205
Glu Thr Ser Gly Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 206
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 206
Glu Thr Ala Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 207
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 207
Glu Ala Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 208
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 丙氨酸扫描序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RUCILP2的丙氨酸扫描序列
<400> 208
Ala Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 209
<211> 19
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 209
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 210
<211> 18
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 210
Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 211
<211> 17
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 211
Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 212
<211> 16
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 212
Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 213
Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 214
<211> 14
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 214
Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 215
<211> 13
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 215
Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 216
Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 217
<211> 11
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 217
Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 218
<211> 10
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 218
Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 219
Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 220
<211> 8
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 220
Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 221
<211> 7
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 221
Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 222
<211> 6
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 222
Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 223
<211> 5
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 223
Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 224
<211> 4
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 224
Glu Ala Ala Gly
1
<210> 225
<211> 3
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 225
Ala Ala Gly
1
<210> 226
<211> 18
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 226
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 227
<211> 17
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 227
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 228
<211> 16
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 228
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
<210> 229
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 229
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys
1 5 10 15
<210> 230
<211> 14
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 230
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly
1 5 10
<210> 231
<211> 13
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 231
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp
1 5 10
<210> 232
<211> 12
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 232
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala Ala
1 5 10
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 233
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 234
<211> 10
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 234
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys Asn
1 5 10
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 235
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp Lys
1 5
<210> 236
<211> 8
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 236
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser Trp
1 5
<210> 237
<211> 7
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 237
Glu Thr Ser Ala Lys Val Ser
1 5
<210> 238
<211> 6
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 238
Glu Thr Ser Ala Lys Val
1 5
<210> 239
<211> 5
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 239
Glu Thr Ser Ala Lys
1 5
<210> 240
<211> 4
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 240
Glu Thr Ser Ala
1
<210> 241
<211> 3
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 241
Glu Thr Ser
1
<210> 242
<211> 19
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 242
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 243
<211> 18
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 243
Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 244
<211> 17
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 244
Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 245
<211> 16
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 245
Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 246
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 246
Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 247
<211> 14
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 247
Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 248
<211> 13
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 248
Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 249
<211> 12
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 249
Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 250
<211> 11
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 250
Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 251
<211> 10
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 251
Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5 10
<210> 252
<211> 9
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 252
Ala Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 253
<211> 8
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 253
Ala Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 254
<211> 7
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 254
Asp Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 255
<211> 6
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 255
Gly Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 256
<211> 5
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 256
Lys Glu Ala Ala Gly
1 5
<210> 257
<211> 4
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 257
Glu Ala Ala Gly
1
<210> 258
<211> 3
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 258
Ala Ala Gly
1
<210> 259
<211> 18
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 259
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 260
<211> 17
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 260
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 261
<211> 16
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 261
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys Glu
1 5 10 15
<210> 262
<211> 15
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 262
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly Lys
1 5 10 15
<210> 263
<211> 14
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 263
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp Gly
1 5 10
<210> 264
<211> 13
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 264
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala Asp
1 5 10
<210> 265
<211> 12
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 265
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala Ala
1 5 10
<210> 266
<211> 11
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 266
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 267
<211> 10
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 267
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys Asn
1 5 10
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 268
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp Lys
1 5
<210> 269
<211> 8
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 269
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser Trp
1 5
<210> 270
<211> 7
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 270
Glu Thr Ser Ala Lys Ala Ser
1 5
<210> 271
<211> 6
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 271
Glu Thr Ser Ala Lys Ala
1 5
<210> 272
<211> 5
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 272
Glu Thr Ser Ala Lys
1 5
<210> 273
<211> 4
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 273
Glu Thr Ser Ala
1
<210> 274
<211> 3
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌
<400> 274
Glu Thr Ser
1

Claims (36)

1.一种长度小于200个氨基酸的分离的多肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：
a.根据SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
b.SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:4和/或SEQ IDNO:19具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性，但与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有小于99％的序列同一性；
c.SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的变体，其中所述变体相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至40个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有5、10、15、20、25、30或35个氨基酸取代；
d.长度为至少10个氨基酸的SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的片段，或者分别相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的所述片段的变体，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
e.通过在N末端处截短至少一个氨基酸，例如1至67个氨基酸，例如1至60个氨基酸，例如1至50个氨基酸，例如1至40个氨基酸，例如1至30个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至10个氨基酸取代，例如相对于SEQID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代的变体；
f.通过在C末端处截短至少一个氨基酸，例如1至21个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至15个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQID NO:19的氨基酸序列，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至30个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、5、10、15、20或25个氨基酸取代的变体；
g.通过在N末端处截短至少一个氨基酸，1至67个氨基酸，例如1至60个氨基酸，例如1至50个氨基酸，例如1至40个氨基酸，例如1至30个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸，以及在C末端处截短至少一个氨基酸，例如1至21个氨基酸，例如1至20个氨基酸，例如1至15个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如1至5个氨基酸而不同于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，其中所述多肽具有至少10个氨基酸的长度，或者其相对于SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的变体；
h.根据SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
i.SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:5和/或SEQ IDNO:20具有至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性，但与SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有小于99％的序列同一性；
j.SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的变体，其中所述变体相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1至10个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
k.包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的至少10个连续氨基酸的SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20的片段，或者其相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1至5个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
1.SEQ ID NO:19的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:27、33、34、35、36、37和95，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
m.SEQ ID NO:4的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:107、108、109、110、111、165和168，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
n.SEQ ID NO:19的变体的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:173、176、181和188，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
o.SEQ ID NO:4的变体的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:193、196、201和208，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；
p.SEQ ID NO:19的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:210、211、212、213、229、232、233、234和235，以及其相对于SEQ ID NO:19具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ IDNO:19具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度；和
q.SEQ ID NO:4的片段，其中所述片段选自由SEQ ID NO:243、244、245、246、262、265、266、267和268，以及其相对于SEQ ID NO:4具有1至3个氨基酸取代，例如相对于SEQ ID NO:4具有1、2或3个氨基酸取代的各自的变体组成的组，其中所述多肽具有小于50个氨基酸的长度。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有至少10个氨基酸，例如至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的长度。
3.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有小于100个氨基酸，例如小于95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25个氨基酸的长度。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有10-200个氨基酸，例如10-100个，例如10-50个，例如15-30个，例如15-25个，例如50-150个，例如50-100个，例如70-100个，例如80-90个氨基酸的长度。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:4和/或SEQ IDNO:19具有至少90％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有至少95％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:19具有至少97％的序列同一性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:4和/或SEQ IDNO:19相比具有1至25个氨基酸取代。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:4和/或SEQ IDNO:19相比具有1至10个氨基酸取代。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:5和/或SEQ IDNO:20具有至少90％的序列同一性，例如与SEQ IDNO:5和/或SEQ ID NO:20具有至少95％的序列同一性，例如与SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:20具有至少97％的序列同一性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:5和/或SEQ IDNO:20相比具有1至5个氨基酸取代。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO:5和/或SEQID NO:20相比具有1至3个氨基酸取代。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸取代是保守取代。
12.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述片段包含以下或由以下组成：对应于SEQ ID NO:6、根据SEQ ID NO:4的位置7至16的氨基酸序列，或者其与SEQ ID NO:4相比具有1至5个氨基酸取代的变体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述片段包含以下或由以下组成：对应于SEQ ID NO:7、根据SEQ ID NO:4的位置27至39的氨基酸序列，或者其与SEQ ID NO:4相比具有1至6个氨基酸取代的变体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述片段包含以下或由以下组成：对应于SEQ ID NO:8、根据SEQ ID NO:4的位置43至56的氨基酸序列，或者其与SEQ ID NO:4相比具有1至6个氨基酸取代的变体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含：
a)在SEQ ID NO:4的氨基酸位置7的V，或者其保守取代例如T、A、M、F、L或I；和/或在SEQID NO:4的氨基酸位置9的E，或者其保守取代例如P、D、S、R、K、Q、H或N；和/或在SEQ ID NO:4的氨基酸位置58的E，或者其保守取代例如P、D、S、R、K、Q、H或N；或者
b)在SEQ ID NO:5的氨基酸位置5的Y，或者其保守取代例如H、M、I、L、F或W；和/或在SEQID NO:5的氨基酸位置6的F，或者其保守取代例如M、V、I、L、W或Y；和/或在SEQ ID NO:5的氨基酸位置8的E，或者其保守取代例如P、D、S、R、K、Q、H或N；和/或在氨基酸位置17的N，或者其保守取代例如G、D、E、T、S、R、K、Q或H。
16.一种缀合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与所述多肽缀合的一个或多个部分，任选地其中所述多肽和所述一个或多个部分通过接头彼此缀合。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其中所述一个或多个部分选自由烷基、芳基、杂芳基、烯烃、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)、糖类和多糖组成的组。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽或缀合物，其中所述多肽是二聚体或多聚体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的多肽或缀合物，其中所述多肽能够：
a)与αV/β5整联蛋白受体结合；
b)例如通过诱导参与产热的基因的表达，诱导白色脂肪细胞中的产热；
c)例如通过降低参与脂肪生成的基因的表达，降低脂肪细胞的脂质含量；
d)例如通过刺激骨细胞中的硬化蛋白表达，刺激骨形成；
e)诱导心肌生成；
f)诱导成肌细胞中的肌管形成和肌生成；
g)增强肠屏障连接；
h)刺激胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的分泌；
i)刺激胰岛素的分泌；
j)刺激肽-YY(PYY)的分泌；
k)刺激生长抑素的分泌；
l)例如通过降低受试者的脂肪量且增加瘦体量，诱导重量减轻；
m)改善葡萄糖耐量；和/或
n)增加胫骨的皮质厚度。
20.一种分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的多肽或缀合物。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自由SEQ ID NO:9至18组成的组。
22.一种载体，其包含根据权利要求20至21中任一项所述的多核苷酸。
23.根据权利要求22所述的载体，其中所述载体是表达载体，例如选自由例如大肠杆菌表达载体和pGEX-4T-1的细菌表达载体以及SF9-昆虫表达载体组成的组中的表达载体。
24.一种宿主细胞，其包含根据权利要求20所述的多核苷酸和/或根据权利要求22或23所述的载体，例如其中所述多核苷酸和/或载体对于所述宿主细胞是异源的。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由大肠杆菌和扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)组成的宿主细胞的组。
26.根据权利要求24至25中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由以下组成的组：扭链瘤胃球菌ATCC 27756、扭链瘤胃球菌AM22-16、扭链瘤胃球菌aa_0143和扭链瘤胃球菌2789STDY5834841。
27.一种药物组合物，其包含：
a)根据权利要求1至19中任一项的多肽或缀合物；
b)包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽：
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
c)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸；
d)编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
e)根据权利要求22至23中任一项的载体，
f)包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；和/或
g)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞；和/或
h)包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；和/或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体。
28.一种膳食组合物，其包含
a)根据权利要求1至19中任一项的多肽或缀合物；
b)包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽：
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
c)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸；
d)编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
e)根据权利要求22至23中任一项的载体，
f)包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；和/或
g)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞；和/或
h)包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；和/或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
其中所述膳食组合物包含益生元、益生菌、活体生物药(LBP)、合生元、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、纤维和/或营养素，例如膳食矿物质中的一种或多种。
29.权利要求1至19中任一项所述的多肽或缀合物，或RUMTOR_00181多肽，其包含以下或由以下组成：
a)根据SEQ ID NO:21的多肽，或与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
d)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞，或包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
和/或
e)根据权利要求27的药物组合物，
其用作药物。
30.一种包含以下的宿主细胞，其用作益生菌或活体生物药(LBP)：
a)根据权利要求1至19中任一项的多肽或缀合物，和/或包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽：
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，和/或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；和/或
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，和/或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体。
31.根据权利要求1至19中任一项所述的多肽或缀合物，或RUMTOR_00181多肽，其包含以下或由以下组成：
a)根据SEQ ID NO:21的多肽，或与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
d)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞，或包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；和/或
e)根据权利要求27的药物组合物，
其用于治疗和/或预防代谢病症、肌肉病症和损伤、和/或骨病症。
32.根据权利要求1至19中任一项所述的多肽或缀合物，或RUMTOR_00181多肽，其包含以下或由以下组成：
a)根据SEQ ID NO:21的多肽，或与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
d)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞，或包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；和/或
e)根据权利要求27的药物组合物；
其用于治疗和/或预防选自由以下组成的组中的疾病、病症和/或状况：代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、2型糖尿病(T2D)、脂肪肝病(FLD)、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、肌萎缩侧索硬化(ALS)、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和骨硬化症。
33.包含以下的宿主细胞作为益生菌或活体生物药(LBP)的用途：
a)根据权利要求1至19中任一项的多肽或缀合物，和/或包含以下或由以下组成的RUMTOR_00181多肽：
i.根据SEQ ID NO:21的多肽；或
ii.与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，和/或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；和/或
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，和/或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体。
34.包含以下或由以下组成的权利要求1至19中任一项所述的多肽或缀合物或RUMTOR_00181多肽作为食品成分或者作为食品或饮品添加剂的用途：
a)根据SEQ ID NO:21的多肽，或与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
d)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞，或包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
和/或
e)根据权利要求28的饮食组合物。
35.包含以下或由以下组成的权利要求1至19中任一项所述的多肽或缀合物或RUMTOR_00181多肽在制备药物中的用途：
a)根据SEQ ID NO:21的多肽，或与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
d)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞，或包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；和/或
e)根据权利要求27的药物组合物；
所述药物用于治疗代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和/或骨硬化症。
36.一种用于治疗以下的方法：代谢病症、肌肉病症和损伤和/或骨病症，例如代谢综合征、肥胖、前驱糖尿病、T2D、FLD、心血管疾病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、ALS、兰伯特-伊顿综合征、重症肌无力、多发性肌炎、周围神经病变、骨质疏松症、成骨不全和/或骨硬化症，其中所述方法包括向有此需要的个体施用包含以下或由以下组成的根据权利要求1至19中任一项所述的多肽或缀合物或RUMTOR_00181多肽：
a)根据SEQ ID NO:21的多肽，或与其具有至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少98％的序列同一性的SEQ ID NO:21的变体；
b)根据权利要求20至21中任一项的多核苷酸，或编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；
c)根据权利要求22至23中任一项的载体，或包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；
d)根据权利要求24至26中任一项的宿主细胞，或包含以下的宿主细胞：
i.编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸；或
ii.包含编码所述RUMTOR_00181多肽的多核苷酸的载体；和/或e)根据权利要求27的药物组合物。
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