KR101805761B1 - 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 점막용 스프레이 제제 - Google Patents

폴리데옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 점막용 스프레이 제제 Download PDF

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이재휘
김익수
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Abstract

본 발명은 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 점막용 스프레이 제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide), 글리세롤모노올레이트(glycerol monooleate) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 점막용 스프레이 제제에 관한 것이다.
본 발명의 점막용 스프레이 제제는 일반적인 스프레이 기구에 의해 분사가 되기에 적절한 점도를 갖고 있으며, 입자크기, 분사패턴, 분사영역 및 점막 점착성이 매우 우수하여 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 점막을 통해 흡수시키기에 적합한 물리적 특성을 나타낸다.

Description

폴리데옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 점막용 스프레이 제제{Spray formulation for mucous membrane containing polydeoxyribonucleotide}
본 발명은 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 점막용 스프레이 제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide), 글리세롤모노올레이트(glycerol monooleate) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 점막용 스프레이 제제에 관한 것이다.
구강, 인두 또는 후두의 점막에서의 염증성 질환은 자기 면역과 같은 내인성 또는 다른 부위로부터의 영향을 포함하는 내적(internal) 또는 외적(external) 자극에 반응에 의한 염증이다. 구강, 인두 및 후두는 소화관 또는 호흡기의 입구이며, 많은 자극 및 상처에 민감하고, 많은 종류의 염증을 일으킨다.
이 중에서 구내염은 일상생활에서 가장 빈번하게 발생하는 구강 점막에 생기는 염증으로서 구강염이라고도 하며 세균, 바이러스 및 진균 등의 감염에 의한 것이 많으며, 그 외에 영양불량, 호흡기질환, 위장질환, 임신 등으로 저항력이 약해졌을 때도 발생한다. 증상으로는 타액 분비의 증가, 동통, 구취 및 물집 등이 나타나며, 심한 증상으로는 구내 및 혀의 궤양 증세가 나타난다. 경미한 증상에서는 피오구타닌 용액, 머큐러크롬 혹은 붕사(硼砂)·글리세린 및 2％의 질산은수(窒酸銀水)를 치료부위에 바르는 것으로 치료한다. 그러나 심한 증상에서는 트리암시놀론 아세토니드를 적용함으로써 치료하는 것이 가장 일반적이다.
현재 구내염 치료제로서 트리암시놀론 아세토니드를 함유하는 제제로는 연고제(오라메디 연고TM, 동국약품) 및 구강 내 부착정제(아프타치 정TM, 동화약품) 등이 시판되고 있다. 트리암시놀론 아세토니드 연고제는 유효성분을 세틸알코올이나 연고기제 등으로 제형화한 제품인데 이것은 사용 시 면봉이나 가제로 연고를 치료부위에 바르는 제제로서 사용하기가 불편하고 또한 치료부위에 잘 달라붙지 않는 문제점이 있다. 또한 구강 내 부착정제는 에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 고분자로 정제화하였으며 사용 시 정제 표면을 물이나 침으로 약간 팽윤시킨 다음 투여부위에 부착시켜 약효를 발현하도록 하는 제품이다. 그러나 이 제품은 단단한 정제 형태라 구강 점막 표면의 곡면 구조에 잘 달라붙기 어렵고 부착 후에도 말을 하거나 입을 움직이면 쉽게 정제가 점막으로부터 분리되는 단점이 있고, 약효가 오래 발현하도록 하기에는 구강 내에서 이물감 및 거부감이 느껴지는 등 문제점을 가지고 있다.
따라서, 기존 연고의 불편성이나 구강 내 부착정제의 이물감 및 거부감을 해결하기 위해 새로운 구내염 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 종래 사용되고 있는 상기 트리암시놀론 아세토니드를 함유하는 연고제 또는 부착정의 문제점을 개선하며, 점막성 염증질환에 효과적인 치료효과를 나타낼 수 있는 물질 및 이를 유효성분으로 포함하는 스프레이 제제를 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 글리세롤모노올레이트 및 비이온성 계면활성제와 함께 제제화 하면 우수한 분사력을 갖고, 점착력이 우수하며, 분사 된 후 얇은 약물함유 필름을 구강 점막 표면에 형성할 수 있는 스프레이 제형을 개발할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide), 글리세롤모노올레이트(glycerol monooleate) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 점막용 스프레이 제제를 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide), 글리세롤모노올레이트(glycerol monooleate) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 점막용 스프레이 제제를 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide), 글리세롤모노올레이트(glycerol monooleate) 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 점막용 스프레이 제제를 제공한다.
폴리데옥시리보뉴클레오티드(Polydeoxyribonucleotide, PDRN®, PDRN®은 이탈리아 마스텔리사와 대한민국 파마리서치프로덕트사의 등록상표이며 이하 PDRN으로 표시함)는 50~2,200bp의 저분자 DNA 중합체로 생체 구성 성분이기 때문에 합성물질 등에서 나타나는 알러지 반응이나 체내 거부반응이 없고, 주성분이 음전하를 가지는 DNA로 이루어져 친수성의 특성을 지닌 물질로 이러한 특성들로 인해 산업적 적용이 매우 용이하다. 또한, 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 미세 혈액순환 개선 및 항염증작용의 효과가 있고, 상처에 의해 기관이나 조직에 생긴 구조적 생화학적 변화에 대응하여 세포성장 촉진효과 및 조직재생 촉진효과, 즉, 조직 구성세포 및 조직 구성물을 증가시키는 것이 알려져 있으며, 유럽에서는 의약품으로 허가되어 상처치유, 피부이식, 화상, 흉터, 관절치료 및 미용 용도로 사용되고 있다.
따라서, 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 스프레이 제제는 점막에 발생한 염증, 궤양 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 점막용 스프레이 제제는 본 발명자가 최초로 공개하는 것이다.
본 발명의 상기 글리세롤모노올레이트(glycerol monooleate, GMO)는 양쪽성 지질로써, 모노올레인, 글리세롤-1-올레이트, 글리세롤 올레이트, 1-(시스-9-옥타데세노일)-rac-글리세롤, DL-α-모노올레인, α-모노올레인 글리세롤 등으로 널리 알려져 있다. GMO는 상온에서 끈적거리거나 왁스 상 물질이며, 특유의 향을 갖는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이다:
[화학식 1]
Figure 112016073887486-pat00001
상기 화학식 1에서 볼 수 있는 바와 같이, GMO는 글리세롤 지방산 에스터로 그 구조내에 글리세롤 부분과 탄화수소 사슬을 포함하고 있다. ‘머리’로 불려지는 상기 글리세롤 부분은 두 개의 수산화 그룹을 갖고 있으며, GMO에 극성 특성을 부여하고 있다. 반면에, ‘꼬리’로 불려지는 탄소 18개의 탄화수소 사슬은 GMO에 소수성 특성을 부여하고 있다. 즉, GMO는 양쪽성 물질로서 HLB 값이 3.8인 것으로 보고되고 있다(Phys. Chem. Chem. Phys. 13:3004-3021).
GMO는 무독성이고, 생분해성이며 생체적합성이 뛰어난 물질이다. 이는 FDA에 의해 승인받은 식품 첨가제이며 식품 가공에 있어서 계면활성제 또는 친유성의 유화제로서, 화장품 가공에 있어서 보습제로서 및 의약품 제조에 있어서 부형제로서 널리 사용되고 있다(Effectiveness of glycerol monooleate as a biosealant. J. Invasive Cardiol. 20:29-34.).
본 발명자는 GMO를 점막에 분사하였을 때, 구강 점막에 점착성을 띠는 필름을 형성하여 약물을 점막 내부로 전달할 수 있는 물질이라는 것을 확인하였고, 합성고분자와 달리 섭취 되더라도 인체에 아무런 위해성이 없기 때문에 점막제제 개발에 유용하게 활용할 수 있음에 착안하여 본 발명에 활용하였다. 본 발명의 상기 GMO는 점막 내 수분과 같은 물과 접촉시 첨막부착성이 있는 gel을 형성한다. 따라서, 본 발명에서 상기 GMO는 점막에 분사하였을 때 필름을 형성할 수 있는 필름형성제로서 사용한 것이다. GMO를 이용하여 점막용 스프레이 제제를 개발하는 것은 본 발명자가 최초로 공개하는 것이다.
본 발명의 스프레이 제제는 또한 비이온성 계면활성제를 포함한다. "비이온성 계면활성제(nonionic surfactant)"는 수용액 상태에서 이온을 생성하지 않는 계면활성제로서, 다른 유형의 계면활성제와 공존할 수 있어 복잡한 혼합액에서 첨가제로 사용되고 있다. 또한, 비이온성 계면활성제는 이온성 계면활성제보다 전해질에 덜 민감하며, 높은 염도 및 경수에도 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 구강점막부착성 필름의 주된 기제는 GMO이다. GMO는 화학구조적으로는 양친성 물질이지만 물에는 녹지 않는다. 즉 GMO를 폴록사머 등의 계면활성제를 이용하여 물에 분산시킨 후 스프레이 펌프를 이용해 구강 내 국소에 분사하면 분사물 중 물과 물에 녹을 수 있는 폴록사머는 주변 조직으로 신속히 흡수되어 사라지고 그 과정에서 GMO가 구강 점막의 표면에 달라붙게 된다. 이후 GMO가 주변 조직으로부터 물을 흡수하게 되면 서서히 겔화하면서 얇은 필름을 형성하게 된다. 따라서, 스프레이 조성물 중 계면활성제인 폴록사머는 소수성인 GMO를 물에 분산시키는 역할만을 담당한다. 폴록사머는 GMO를 물에 분산시키기 위한 분산보조제로 사용되었다. 본 연구에서는 폴록사머 이외에도 GMO를 물에 우유색으로 분산시킬 수 있는 모든 계면활성제가 분산보조제로 이용될 수 있다. 물에 분산된 GMO는 육안적으로 관찰하기에 우유색을 띤다. 물에 분산된 GMO는 아주 작은 노즐을 통해서도 분사가 될 수 있고 물리적으로 존재하는 입자를 형성하지 않아 노즐의 구멍을 막지도 않는다.
본 발명에서 지질의 분산보조제로 사용된 비이온성 계면활성제의 바람직한 예시는 폴록사머 407, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 60, 폴리솔베이트 80, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르계(옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르)를 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 폴록사머 407일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 음이온성, 양이온성, 양쪽이온성 계면활성제 보다 구성 성분 간의 상호작용 빈도가 낮고 인체에 대한 자극이 적은 것으로 알려진 비이온성 계면활성제라면 그 종류가 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 일실시예에서 사용한 폴록사머 대신 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 비이온성 계면활성제는 폴록사머(폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드- 폴리에틸렌옥사이드 3중 고분자)류 중에서 에틸렌옥사이드 유닛의 수가 프로필렌옥사이드 유닛의 수보다 큰 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407 인 것이 가장 바람직하다. 그 이유는 에틸렌옥사이드의 유닛의 수가 프로필렌옥사이드의 유닛의 수보다 클 경우 보다 친수성을 띠게 되며 이로 인해 GMO를 보다 원활하게 우유상(milky phase)으로 물에 분산시킬 수 있기 때문이다. 실제로, 본 발명의 일실시예에 따르면 프로필렌옥사이드 유닛의 수가 에틸렌옥사이드의 유닛의 수 보다 큰 폴록사머 124로는 스프레이로 분사가 가능한 우유상의 분산을 얻기 어려웠다(결과 미도시).
본 발명에서 쓰이고 있는 용어 ‘점막’이란, 상피세포에 덮여진 외배엽 유래의 상피층을 말하는바, 구체적으로는 비강, 눈, 귀, 구강, 직장, 질, 성기, 요도, 항문 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 비강 또는 구강 점막일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 스프레이 제제는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 0.1 내지 2 중량%, 글리세롤모노올레이트 3 내지 13 중량%, 비이온성 계면활성제 0.2 내지 1.5 중량% 및 잔량의 유기용매로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
제제에 포함되는 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 함량은 목적하는 약리학적 효과를 달성하기 위하여 당업자에 의해 용이하게 조절될 수 있으나, 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 함량에 따라 스프레이 제제의 점성이 변화하기 때문에 스프레이 제제의 분사력, 분사패턴, 분사영역 및 점막 점착성에 영향이 있을 수 있다. 따라서, 스프레이 제제로 활용될 수 있는 바람직한 물리적 특성을 갖는 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 함량은 총 제형에 대하여 0.1 내지 2중량%일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.15 내지 1.5중량%, 가장 바람직하게는 0.25 내지 1중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
폴리데옥시리보뉴클레오티드의 함량이 2중량%을 초과하면 제제의 점성이 지나치게 증가되어 점성 조절이 어려워져 분사력에 영향을 받게 된다. 또한, 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 함량이 0.1중량% 미만이면 목적하는 분사영역에 충분한 약리학적 효과를 달성할 수 없다.
본 발명에서 상기 글리세롤모노올레이트는 총 제형에 대하여 3 내지 13 중량%, 바람직하게는 3 내지 12 중량%, 보다 바람직하게는 3.5 내지 12 중량%, 가장 바람직하게는 4.5 내지 9 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제형에 포함된 글리세롤모노올레이트의 중량이 총 제형에 대하여 13 중량 %를 초과하는 경우에는 우유상 분산액의 점성 증가로 보통의 스프레이 펌프로는 재현성 있는 분사가 어려워지며, 3 중량% 미만인 경우에는 점막에 적용하였을 때 점착성이 지나치게 약해져, 제형의 점막에서의 체류시간이 감소하는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명에서 상기 비이온성 계면활성제는 총 제형에 대하여 0.2 내지 1.5 중량%, 바람직하게는 0.3 내지 1.3 중량%, 보다 바람직하게는 0.4 내지 1.2 중량%, 가장 바람직하게는 0.5 내지 1 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스프레이 제제에서 상기 폴리데옥시리보뉴클레오티드, 글리세롤모노올레이트 및 비이온성 계면활성제 이외에 나머지는 유기용매가 포함된다. 본 발명에서 상기 유기용매는 물, 에탄올 또는 이의 혼합물 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 유기용매가 물인 경우에는 글리세린, 프로필렌글리콜을 물의 양 대비 최대 10 중량% 이내로 포함시킬 수 있다. 물에 글리세린이나 프로필렌글리콜을 가해주면 보관 중 물의 증발을 막아주어 우유상 분산을 안정화 시키는 효과가 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 폴리데옥시리보뉴클레오티드, 글리세롤모노올레이트 및 비이온성 계면활성제가 포함된 스프레이 제제는, 나노 사이즈의 큐빅 액정 입자를 포함하고 있는 글리세롤모노올레이트 수성분산매에 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 첨가하여 제제화 하였다. 글리세롤모노올레이트 수성 분산매에 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 첨가하여 제제화 한 결과, 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 입자 크기가 작아지는 것을 확인하였고 이는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 분자가 글리세롤모노올레이트 수성 분산매의 큐보좀과 상호작용하여 소수성 기질에 함입되었기 때문으로 판단되었다.
따라서, 본 발명의 상기 스프레이 제제 내에서 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 글리세롤모노올레이트 및 비이온성 계면활성제에 의해 큐보좀(cubosome)화 되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 스프레이 제제의 점성은 일반적인 스프레이 기기 및 노즐 시스템에 의해서 분사되기에 충분할 정도로 낮은 점성을 갖고 있었으며, 제제에 포함되는 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 함량이 증가할수록 제제의 점성이 조금씩 증가하는 경향이 관찰되었다. 또한, 본 발명의 스프레이 제제의 분사영역, 분사 패턴 및 제타 포텐셜 결과로 판단하여 보면, 본 발명의 제제가 상온에서 안정하고 용이하게 분사가 가능하다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 스프레이 제제를 성인의 혀 점막에 분사하였을 때, 제제에 포함된 폴리데옥시리보뉴클레오티드가 점막을 통해 흡수되기에 충분한 시간 동안 점막 점착성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 스프레이 제제의 제제화 방법은 당업자들에게 잘 알려진 방법에 의하며, 방향제 등 통상의 부형제, 희석제, 현탁화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 점막용 스프레이 제제는 일반적인 스프레이 기구에 의해 분사가 되기에 적절한 점도를 갖고 있으며, 입자크기, 분사패턴, 분사영역 및 점막 점착성이 매우 우수하여 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 점막을 통해 흡수시키기에 적합한 물리적 특성을 나타낸다.
도 1은 본 발명에서 사용한 스프레이 기구의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2는 GMO 수성 분산매 샘플 A(4.5% GMO w/w)를 육안 관찰한 사진이다.
도 3은 4.5% 또는 9% GMO 수성 분산매와 PDRN 수용액의 평균 입자 크기(직경)을 나타낸 도면이다(AD: 수성 분산매, *: p<0.01).
도 4A는 전단속도의 기능으로서 샘플의 점성을 나타낸 것으로, 25℃, 전단속도는 10~100s-1이다(샘플 A: GMO 4.5%(w/w) 수성 분산매, 샘플 A1,A2,A3: GMO 4.5%(W/W) 수성분산매에 PDRN이 각각 0.25%, 0.5% 및 1%(w/w)로 포함되어 있는 샘플).
도 4B는 전단속도의 기능으로서 샘플의 점성을 나타낸 것으로, 25℃, 전단속도는 10~100s-1이다(샘플 C: GMO 9%(w/w) 수성 분산매, 샘플 C1,C2,C3: GMO 9%(W/W) 수성분산매에 PDRN이 각각 0.25%, 0.5% 및 1%(w/w)로 포함되어 있는 샘플).
도 5A는 전단속도의 기능으로서 샘플의 전단응력을 나타낸 것으로, 25℃, 전단속도는 10~100s-1이다(샘플 A: GMO 4.5%(w/w) 수성 분산매, 샘플 A1,A2,A3: GMO 4.5%(W/W) 수성분산매에 PDRN이 각각 0.25%, 0.5% 및 1%(w/w)로 포함되어 있는 샘플).
도 5B는 전단속도의 기능으로서 샘플의 전단응력을 나타낸 것으로, 25℃, 전단속도는 10~100s-1이다(샘플 C: GMO 9%(w/w) 수성 분산매, 샘플 C1,C2,C3: GMO 9%(W/W) 수성분산매에 PDRN이 각각 0.25%, 0.5% 및 1%(w/w)로 포함되어 있는 샘플).
도 6은 GMO 수성 분산매 기반 PDRN 제제를 분사시켰을 때, 매 분사시마다 분사되는 제제의 양을 평균낸 값이다(A: 샘플 A, C: 샘플 C, Data are presented as mean±n=10).
도 7은 샘플 A와 샘플 C의 분사패턴을 확인한 결과이다(샘플 A: GMO 4.5%(w/w) 수성 분산매, 샘플 A1,A2,A3: GMO 4.5%(W/W) 수성분산매에 PDRN이 각각 0.25%, 0.5% 및 1%(w/w)로 포함되어 있는 샘플, C: GMO 9%(w/w) 수성 분산매, 샘플 C1,C2,C3: GMO 9%(W/W) 수성분산매에 PDRN이 각각 0.25%, 0.5% 및 1%(w/w)로 포함되어 있는 샘플). 각 샘플들의 가시성을 향상시키기 위하여 메틸렌 블루로 염색하였다.
도 8은 GMO 수성 분산매 기반 PDRN 제제를 분사시켰을 때, 분사되는 영역의 평균값을 나타낸 도면이다(Data are presented as mean±n=10).
도 9는 GMO 수성 분산매 샘플 A를 건강한 성인 지원자의 혀에 분사한 후 30분이 경과된 시점에서, 혀 점액을 수득하여 편광현미경으로 관찰한 사진이다. 편광 현미경은 교차 편광기를 이용하였으며, λ/4 필터로 100배 확대하여 관찰하였다. 하얀 화살표는 GMO 수성 분산매의 질감을 나타낸 것이며, 백그라운드는 타액의 질감을 의미한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. 실험물질
고순도, 약학제형 등급의 순도를 갖는 채소-유래의 GMO는 Croda Health Care(Croda Korea Chemical, 한국)에서 구입하였으며, 폴록사머 407은 BASF(Ludwigshafen, 독일)에서, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(Polydeoxyribonucleotide, PDRNⓡ)은 PharmaResearch Product Co.,Ltd.,(성남, 경기도, 한국)에서 공급받아 사용하였다.
2. GMO 수성 분산매의 제조
GMO 수성 분산매는 종래 보고된 방법(AAPS PharmSciTech 10:960966)을 변형하여, GMO-폴록사머 407-물 벌크 큐빅 겔을 파쇄하는 방법으로 제조하였다. 예비실험을 통해, 하기 표 1에 기재된 것과 같이 다양한 양의 GMO와 폴록사머 407이 포함된 GMO 수성 분산매를 제조해 보았다:
Figure 112016073887486-pat00002
GMO와 폴록사머 407을 함께 섞고 50℃의 물에서 중탕하며 녹였으며, 동일한 농도의 물도 함께 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 48시간동안 방치하여 벌크 큐빅상의 겔이 형성될 수 있도록 하였다. 이후 벌크 큐빅 겔을 5분간 초음파처리(sonication)하고 2500 rpm에서 5분간 볼텍싱 함으로써 분쇄하였다. 이후 혼합물을 50℃에서 12시간 동안 마그네틱바를 이용하여 1000 rpm으로 교반함으로써 잔여물이나 육안으로 확인이 가능한 굵은 입자들이 전혀 없는 GMO 수성 분산매를 제조하였다.
상기 표 1에 나타낸 샘플들 중에서 A 와 C 샘플이 육안으로 관찰하였을 때 적절한 물성을 나타내는 것으로 판단되어 이후의 실험에 사용하였다. 이들 중에서 C 샘플보다 A 샘플이 폴록사머 407 함량이 더 낮기 때문에 더 선호되었다.
다양한 양의 PDRN(0.25%, 0.5% 및 1% w/w 농도)을 상기 GMO 수성 분산매 A 샘플 및 C 샘플에 넣었고, 상온에서 6시간동안 교반하여 PDRN이 GMO 수성 분산매에 완전히 용해될 수 있도록 하였다.
3. GMO 기반의 PDRN 스프레이 제형의 특성 평가
3-1. 육안관찰
GMO 수성 분산매를 상온에서 일주일 동안 방치한 후 육안상 외관을 관찰하였다. 바닥에 침전물이 있는지 여부도 함께 관찰하였다.
3-2. GMO-PDRN 스프레이의 입자성(particulate property) 평가
입자 크기, 제타 포텐셜 및 다분산지수(polydispersity index)와 같은 물리화학적 특성들을 평가하였다. 입자 크기 및 다분산지수는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instrument, Worcestershire, 영국)을 이용하여 DLS(dynamic light scattering) 방법으로 평가하였다. 제타 포텐셜을 상기 동일한 장비 및 일회용 접이식 모세관 셀을 이용하여 평가하였다.
3-3. GMO-PDRN 스프레이 제형의 점성 평가
점성은 HAAKE Rheostress 1 회전식 레오미터(Haake, Karlsruhe, 독일)을 이용하여 25℃의 온도, parallel plate geometry(P35 Ti L) 및 샘플 갭 1.00 mm의 조건에서 평가하였다. CS/CR-회전 단계를 측정 요소로서 이용하였으며, 측정은 HAAKE RheoWin job manager(Ver.4.30.0016, Thermo Fisher Scientific Inc.,MA, USA)를 이용하여 10s-1 내지 100s-1의 전단속도(shear rate)에서 각 샘플당 10 단계로 평가하였다. 전단응력(τ), 점성(η) 및 압력(γ)과 같은 점성 파라미터들은 HAAKE RheoWin data manager 소프트웨어를 이용하여 평가하였다.
4. GMO-PDRN 스프레이 제형의 분사특성
4-1. 스프레이 기구
GMO-PDRN 스프레이 제형의 분사특성은 도 1에 나타낸 것과 같이 액추에이터와 노즐이 결합된 일반적인 스프레이 기구를 이용하여 평가하였다. 스프레이 기구들은 지역 매장에서 구입하였다.
4-2. 분사에 따른 용량저하(Dose decrease per shot) 평가
GMO 수성 분산매 기반의 PDRN 제형이 각 분사마다 균일하게 분사되는지 여부를 평가하고 각 분사마다 농도의 균일성을 평가하기 위하여 Dose decrease per shot 실험을 진행하였다. 각각의 분사시마다 반사되는 약물 제형의 양은, 각각의 분사 전후에 GMO 수성 분산매 기반 PDRN 제형이 포함되어 있는 스프레이 기구의 무게를 측정함으로써 평가하였다. 각각의 샘플마다 10회 평가를 실시하였고, 평균값을 계산하여 평가하였다.
4-3. 분사 패턴 및 분사 영역 평가
제형의 분사력을 평가하기 위하여 GMO 수성 분산매 기반 PDRN 제형의 분사 패턴과 분사 영역을 평가하였다. 분사 패턴과 분사 영역의 평가는 종래 보고된 방법(AAPS PharmSciTech 10:960966)을 약간 변형하여 수행하였다. 제형은 동일한 스프레이 기구를 이용하여 분사되었으며, 스프레이 기구로부터 5 cm의 거리에 수직으로 고정되어 있는 엔지니어링 그래프 종이(2mm)에 분사하여 분사 영역을 평가하였으며, 분사 패턴의 분석은 제형에 메틸렌 블루 시약을 첨가한 후 상기 방법과 동일한 방법으로 엔지니어링 그래프 종이에 분사하여 평가하였다.
5. GMO- PDRN 스프레이 제형의 점막 점착성 in vivo 평가
25살의 건강한 성인 두 명이 본 실험에 참여하였다. 실험을 시작하기 전에 참여자는 따듯한 물로 가글을 하여 구강을 청결하게 하였다. 이후 GMO 수상 분산매 샘플 A를 각 참여자의 혀에 3회 분사하였다. 각 참여자는 실험기간 중에 음식과 물의 섭취를 중지하였으며, 참여자들의 혀에 분산매가 잔존하는지 여부를 매 30분마다 관찰하였다. 혀의 점액은 깨끗한 슬라이드 글라스에 채취하여 현미경으로 관찰하였다. 참여자의 타액을 슬라이드 글라스 위에서 건조시킨 후, 편광 현미경을 이용하여 액체 결정상(liquid crystalline phase)의 존재 여부를 관찰하였다. 또한, 참여자의 주관적인 불만사항들을 모두 기록하였다.
<실험결과>
< 실시예 1>
GMO 수성 분산매의 육안관찰 특성
상기 표 1에 나타낸 GMO 수성 분산매 샘플들 중에서 A, B 및 C 샘플들은 희뿌연 외관을 나타냈고, 육안상 관찰할 수 있는 잔존 부유 입자들은 관찰되지 않았다. PDRN을 GMO 수성 분산매에 첨가하더라도, 외관상 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 상온에서 1주일간 보관하였을 때, 육안상 관찰할 수 있는 제형 변화는 나타나지 않았다. 그러나, 공기-분산매-유리가 접촉하는 부분에서 고리가 형성되는 것으로 관찰되었는데, 이는 유리용기의 높은 표면장력 영역에서 입자가 축적되었기 때문이다. GMO 수성 분산매 샘플 A가 담긴 유리용기의 사진을 도 2에 나타내었다.
제조한 샘플들 중에서 A 와 C 샘플이 육안으로 관찰하였을 때 적절한 물성을 나타내는 것으로 판단되어 이후의 실험에 사용하였다. 이들 중에서 C 샘플보다는 A 샘플이 폴록사머 407 함량이 더 낮기 때문에 더 선호되었다.
< 실시예 2>
GMO- PDRN 스프레이의 입자성( particulate property ) 평가
입자 크기, 제타 포텐셜 및 다분산지수(polydispersity index)의 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112016073887486-pat00003
상기 표 2 및 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, PDRN이 포함되어 있거나 또는 포함되어 있지 않은 GMO 수성 분산매의 입자 평균 직경은 153 내지 213 nm 범위였다.
GMO 수성 분산매의 입자 크기는 PDRN 수성 분산매의 입자 크기보다 작았다. 한편, GMO 수성 분산매의 입자 크기는 PDRN의 첨가여부 및 첨가된 PDRN의 농도에 영향을 받지 않았다.
그러나, PDRN 수성 분산매 대조군(P1 내지 P3)과 동일한 농도의 PDRN이 포함된 GMO 수성 분산매의 입자 크기를 비교하여 보면, GMO 수성 분산매의 입자 크기가 현저히 작은 것을 확인할 수 있었다. 이것은 PDRN과 큐보좀(cubosome)과의 상호작용에 의한 결과인 것으로 판단된다. PDRN 분자는 본래 수용액 내에서 긴 사슬이 직선 구조의 형태로 존재하지만, 큐보좀 내에서 PDRN은 큐보좀의 친수성 부분에 부착되어 본래의 분자 구조에 변형이 발생할 수 있다. 큐보좀은 소수성 및 친수성 약물 분자와 같이 서로 다른 성질의 약물을 함유할 수 있는 막 조성을 갖고 있다(Biol. Pharm. Bull. 30:350353.). 따라서, 상기 입자크기 분석 결과로 판단하건데 PDRN은 큐보좀의 친수성 매트릭스에 탑재가 되어, 결과적으로 동일한 농도의 PDRN 수용액과 비교해 GMO 수성 분산매에서 더 작은 입자 크기를 나타낸 것으로 판단된다.
제타 포텐셜은 GMO 수성 분산매의 안정성을 확인하기 위하여 평가하였다. 왜냐하면 제타 포텐셜은 콜로이드 시스텀의 잠재적인 안정성을 평가하는데 있어서 잘 알려진 방법이기 때문이다. 제타 포텐셜은 특정한 용액 내에서 입자의 표면 전하를 측정하는 방법으로, 서스펜션 안에서 입자간의 상호작용을 이해하고 예측하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 수성 용매 내에서 안정 또는 불안정한 콜로이드를 구분짓는 제타 포텐셜의 경계는 mV로 여겨지고 있다. PDRN 수용액이 포함된 GMO 수성 분산매의 제타 포텐셜은 모두 샘플 C를 제외하고는 모두 30 mV 이내로 확인되었다. 따라서, GMO 수성 분산매에 기반한 PDRN 제형은 모두 안정한 콜로이드인 것으로 판단되었다.
상기 표 2에 나타낸 다분산지수(polydispersity index)에서도 볼 수 있는 바와 같이, GMO 수성 분산매는 크기 분포에서 PDRN 수용액과 비교해 보다 균일한 경향성을 나타내는 것으로 확인되었다. 즉, PDRN 수용액은 GMO 수성 분산매와 비교해 더 넓은 크기 분포를 나타냈다. PDRN 수용액이 넓은 크기 분포를 나타낸 것은 사슬 길이의 다양성에서 기인한 것으로 판단되었다.
<실시예 3>
GMO-PDRN 스프레이의 유동성
점성은 입자 크기 및 분사 기하학 구조를 포함한 다양한 제형 파라미터들을 반영하는 특성이기 때문에, 스프레이 제형의 점성은 가장 중요한 특성 중의 하나이다. GMO 수성 분산매에 기반한 PDRN 제형의 유동성을 평가하기 위하여 점성을 평가하였다.
GMO 수성 분산매에 기반한 PDRN 제형의 점성 곡선을 도 4에 나타내었다. 유사하게, 샘플들의 유동 곡선은 도 5에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 샘플 내의 PDRN 농도에 따라서 GMO 수성 분산매의 점성은 변화하였다. 샘플 A 및 C 모두에서 PDRN 농도가 높을수록 점성도 높은 것으로 확인되었다. 고농도에서 PDRN의 긴 사슬이 제형의 점성에 영향을 주는 것으로 판단되었다. 따라서, 높은 농도의 PDRN은 제형의 점성에 영향을 줄 수 있고, 이는 제형의 분사력에도 영향을 줄 수 있기 때문에 높은 농도의 PDRN은 바람직하지 않은 것으로 판단했다. 본 발명에서는 최대 1.0% 농도의 PDRN을 스프레이 제제의 제조에 사용하였는데, 이보다 높은 농도의 PDRN을 사용할 경우 PDRN 자체의 중합 특성에 따라 제형에 지나치게 높은 점성이 나타나 바람직하지 않을 수 있기 때문이다.
모든 샘플들의 점성 곡선은 매우
약한 전단 유동화(shear thinning) 경향을 나타냈다. 초기에 전단속도(shear rate)가 30s-1에 도달할 때까지 점성이 감소하였고, 이후에는 전단속도가 상승함에도 불구하고 점성은 작은 변화를 나타낼 뿐 유사한 수준에서 수평을 유지하는 것으로 확인되었다.
각 샘플들의 유동성에 대해 더 알아보기 위해, 전단속도의 기능으로서 전단력을 프로팅 함으로써 유동성 곡선을 산출하였다(도 9). 각 샘플들의 유동성 곡선은 Newtonian flow phenomenon을 보이는 유체의 유동성과 유사한 경향을 나타냈다.
본 발명의 상기 점성곡선과 유동성 곡선은 모든 샘플들의 점성 정도가 일반적인 스프레이 기기의 노즐을 통해서 분사되기에 충분한 점성을 가졌음을 명확하게 나타내고 있다. 비록, 본 발명의 샘플들이 10s-1 내지 100s-1 범위의 점성을 나타내었지만, 스프레이 기기의 노즐을 통해서 분사될 때 발생하는 높은 전단속도에서도 상기한 수치와 유사한 낮은 점성을 나타낼 것으로 예상할 수 있다. 비강 스프레이 기기에 관한 종래 연구에 따르면(Drug Dev. Ind. Pharm. 34:923929.), 비강 스프레이 기기를 통해 액체를 분사할 때의 실제 전단속도는 105 내지 106s-1로 확인되었다고 한다. 따라서, 도 8 및 도 9에 나타난 패턴을 기초로 판단해 보면, 상기 문헌에서 보고하고 있는 바와 유사한 전단속도에서 GMO 수성 분산매 및 이의 제형은 일반적으로 사용되는 스프레이 기기의 노즐을 통해서 용이하게 분사될 수 있음을 예측해 볼 수 있다.
<실시예 4>
용량저하(Dose decrease per shot) 평가
실험물질로 가득 채워진 스프레이 기기의 용액 분사에 따른 용량저하는, 노즐을 통해서 분사되는 용량의 균일성 여부를 평가하기 위해서 측정하였다. A, A1, A2 및 A3 샘플에서 매 분사시에 분사되는 제형의 양은 0.04953g 이었으며, C, C1, C2 및 C3에서는 0.0487883g 이었다. 각 제형별로 매 분사시마다 스프레이 기기에서 분사되는 제형의 양의 평균값을 도 6에 나타내었다. 샘플 A와 샘플 C의 용량저하를 비교해 보면, 분사되는 양에는 유의한 차이가 없다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 모든 제형에서 PDRN의 농도가 각 분사에 따른 용량저하에 영향을 미치는지 여부는 명확하게 확인할 수 없었다. 분사되는 제형의 용량은 균일한 것으로 확인되었으며, 도 10에서 확인되는 미미한 차이들은 스프레이 분사시 가해지는 힘, 위치, 각도 등 외부 요인에 의한 것으로 판단된다. 결론적으로, 매 분사시마다 분사되는 제형의 양은 거의 일정하게 0.05g(50mg)인 것으로 판단할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 스프레이 제형은 분사 용량 및 일관성 측면에서 매우 우수한 분사력을 가지고 있다고 할 수 있다.
<실시예 5>
분사 패턴 및 분사 영역
GMO 수성 분산매에 기반한 PDRN 제형의 분사 특성을 더 확인하기 위하여, 분사 패턴과 분사 영역을 평가하였다. 메틸렌 블루로 염색된 분사 패턴의 이미지를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 모든 제형에서 중심부에는 분사가 되지 않고 동그란 형상의 링 형태의 분사패턴을 나타내었다. PDRN의 함량이 증가할수록, 링 형태의 분사영역이 안쪽으로 확장되는 경향을 나타내었다. PDRN 함량에 따라 매 분사시 분사되는 제형의 양에는 큰 변화가 없지만, 분사패턴에는 영향을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 즉, 제형 내 PDRN의 함량이 증가할수록 테스트 용지에 점착되는 제형이 보다 균일해져, 중심부의 텅 빈 공간이 감소하는 것을 알 수 있었다.
분사 패턴과 함께, 분사 영역에서도 차이가 발견되었다. 제형이 분사된 원 형태의 면적을 계산하였고 이를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 제형 내 PDRN의 함량이 증가할수록 분사영역은 감소되는 것으로 나타났다. 특히, 샘플 C 중에서 PDRN의 함량(w/w)이 1%인 C3 샘플의 경우 분사 영역이 가장 작은 것으로 나타나 이러한 경향이 가장 명확하게 확인되었다. 샘플 A의 경우에는 PDRN의 함량 변화에 따라 각 샘플의 분사 영역에 큰 차이가 나타나지 않았지만(오로지 A3만이 현저히 차이가 났음), 샘플 C의 경우에는 PDRN의 함량 변화에 따라 각 샘플의 분사 영역에 현저한 차이가 관찰되었다. 종래 보고에 따르면(Drug Dev. Ind. Pharm. 34:923929.), 분사 영역은 점도의 직접적인 표지자가 될 수 있으며, 분사영역과 점도는 서로 반비례하는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 본 발명에서 PDRN의 함량이 높은 제형일수록 분사 영역이 작게 나타난 것이며, 점도는 이와 반대의 결과가 나타난 것으로 볼 수 있다.
즉, 제형의 점도가 낮을수록 노즐을 통해 더 잘 흩뿌려져 분사영역이 고리 형태로 관찰이 되는 것이며, 반대로 제형의 점도가 높을수록 적게 흩뿌려져 분사영역의 중심부에 상대적으로 더 많은 양의 제형이 나타나는 것이다. 매 분사시마다 분사되는 제형의 양을 고려해 본다면, 각 제형들은 물리적 성질 또는 분사 기하학 측면에서 조금씩 다른 경향을 나타내지만, 일반적인 스프레이 기구 및 노즐 시스템을 통해서 분사되기에 충분한 분사력을 지니고 있다고 판단할 수 있었다.
<실시예 6>
GMO 수성 분산매의 점막 부착성
본 발명의 스프레이 제형의 점막 점착성과 맛, 향기 등을 테스트하기 위해서 건강한 성인 지원자의 구강에 스프레이 제형을 분사하는 실험을 진행하였다. 실험 참가자들은 스프레이 제제가 타액의 분비를 약간 증가시켰다고 평가했다. 이를 제외하고는 좋지 않은 맛, 말하기의 곤란함, 짜증 및 점막 병변과 같은 것들은 관찰되지 않았다. 또한, 제형의 미미한 맛이 약 60분간 지속되는 것으로 관찰되었는데 이는 스프레이 제제가 구강에 분사된 이후 60분까지 잔존하는 것으로 판단할 수 있었다. 스프레이 제제를 구강에 분사한지 30분이 경과한 시점에 참가자의 혀 표면에서 채취한 점막의 편광 현미경 사진을 도 9에 나타냈다. 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 편광 현미경 이미지는 복굴절을 나타냈고, 질감은 1954년 로제비어가 제시한 통상적인 모자이크 질감을 나타내는 것으로 확인되었다. 점액에 존재하는 복굴절로부터 확인할 수 있는 것은, GMO 수성 분산매를 혀 표면에 분사하고 30분이 경과한 시점에서 액정상이 존재했다는 것을 의미한다. 따라서, 본 제형은 혀에 액정상이 존재했기 때문에, 분사된 이후에 생리학적 표면에 부착하여 존재한다는 것을 알 수 있었다.
참가자의 혀에 분사된 제제의 양이 매우 적기 때문에 일부는 타액에 의해 씻겨 내려갔을 것이고 일부는 참가자가 섭취했을 것으로 예상되었다. 이런 이유로 인해 오직 30분간만 참가자의 혀 표면에서 액정상이 관찰되었던 것으로 판단된다. 이러한 편광 현미경 결과 이외에, 제제의 맛이 지속되었다는 것은 제제가 구강 및 혀 표면에 적어도 한 시간 동안 존재하고 있었다는 것을 나타내는 결과로 판단할 수 있었다.
<제조예 1>
스프레이 제제의 제조
성분 및 함량 (100g 중)
폴리데옥시리보뉴클레오티드: 0.5g
글리세롤모노올레이트: 4.5g
폴록사머 407: 0.5 g
정제수: 94.5g
제조방법:
섭씨 50도로 유지된 혼합기에 GMO와 폴록사머를 지시된 양만큼 가한 후 융해, 혼합한 후 온도를 실온으로 낮추어 24시간 동안 안정화 시켰다. 따로 PDRN을 물에 용해한 후 PDRN 수용액을 GMO와 폴록사머의 혼합물에 가하여 균일하게 혼합한 후 추가로 12시간 보존하면서 안정화 균질화 하였다.
본 발명의 점막용 스프레이 제제는 일반적인 스프레이 기구에 의해 분사가 되기에 적절한 점도를 갖고 있으며, 입자크기, 분사패턴, 분사영역 및 점막 점착성이 매우 우수하여 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 점막을 통해 흡수시키기에 적합한 물리적 특성을 나타내어 점막성 궤양, 염증 등의 질환 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (6)

  1. 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide) 0.1 내지 2 중량%, 글리세롤모노올레이트(glycerol monooleate) 3 내지 13 중량%, 폴록사머 407(poloxamer 407), 폴리솔베이트계 및 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르계로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비이온성 계면활성제 0.2 내지 1.5 중량% 및 잔량의 유기용매를 포함하는 점막용 스프레이 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 글리세롤모노올레이트 및 비이온성 계면활성제에 의해 큐보좀(cubosome)화 되어 있는 것을 특징으로 하는 스프레이 제제.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 점막은 구강 점막 또는 비강 점막인 것을 특징으로 하는 스프레이 제제.
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기용매는 물, 에탄올 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제제.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108478544A (zh) * 2018-05-15 2018-09-04 杭州易敏生物医药科技有限公司 一种黏膜疾病治疗系统及其应用
KR102458630B1 (ko) * 2021-10-26 2022-10-26 (주) 에이치엔에이파마켐 레티날 및 공유결합성 유기 골격체를 함유하는 큐보좀 조성물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jie Lai et al., AAPS Pharm Sci Tech, 10(3) 960-966 (2009.09.)*

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