KR101798981B1 - 췌도세포 이식용 세포이식물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 췌도세포 이식용 세포이식물 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 구형세포(Spheroid) 및 췌도세포(Islet) 클러스터(islet cluster)를 유효성분으로 포함하는 췌도세포(Islet) 이식을 위한 세포이식물, 상기 세포이식물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 상기 세포이식물의 제조방법을 제공하는 데 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 세포이식물은 췌도세포의 생물학적인 활성 및 기능의 손실이 적으며 췌도세포의 생존률을 높일 수 있어, 췌도세포의 질의 향상 또는 기능을 장기적으로 유지할 수 있을 뿐만 아니라 혈관형성능을 향상시켜 당뇨병을 치료하는 데 이용될 수 있다.

Description

췌도세포 이식용 세포이식물 및 이의 용도{Cell Implant for Islet Grafts and Uses Thereof}

본 발명은 췌도세포 이식용 세포이식물 및 이의 용도에 관한 것이다.

현재 당뇨병으로 고통받고 있는 환자는 전 세계의 4.6%이며, 지속적으로 증가하여 2025년에는 6.0%를 초과할 것으로 예상되고 있다. 최근, 췌장이식 및 췌도세포이식을 통한 당뇨병 치료가 시행되고 있다. 그러나 현재 췌도세포 이식을 위한 세포의 분리 및 배양기술은 2~4명의 공여자로부터 얻은 췌도세포로 한 명의 당뇨병환자에게 이식할 수 있는 정도이며, 이식 후 인슐린 비의존성의 유지는 10%(5년)을 넘지 못하고 있는 실정이다. 면역 억제제의 도입을 통해 이식 결과는 지속적으로 개선 되었지만 당뇨병 치료를 위한 임상 췌도 이식에 있어 획기적인 돌파구는 여전히 필요한 상태이다.

이에 따라, 췌도 분리 및 배양 조건을 최적화하고, 이식된 췌도의 손상을 최소화하여 이식 조직의 생존률을 향상시키고자 하는 연구들뿐만 아니라, 다양한 췌도세포의 증식방법, 인간 이외의 동물조직을 이용한 이종이식 등의 방법 등에 대해서도 연구가 진행되고 있다.

그 중 캐나다 에드먼톤에서 췌도 이식(islet transplantation) 프로토콜이 정립되면서, 임상적 췌도세포 이식은 제1형 당뇨병 환자를 치료하기 위한 가능한 치료방법으로 대두되고 있다. 하지만 이식된 췌도세포의 낮은 생착률은 장기간 혈당 조절 실패의 주요 요인이다. 췌도세포는 이식 후 수일 내에 새로운 혈관재생, 혈류조절 등을 통해 생착이 성공적으로 이루어져야 하지만, 이식된 체도세포는 내인성 췌도세포에 비해 혈관 밀도, 산소분압, 영양분 등이 낮은 상태에 노출되기 때문에, 많은 세포가 사멸과정을 거치는 등 정상적인 췌도세포의 생착에 어려움이 생기고 인슐린의 분비 조절에 문제가 발생한다.

또한, 췌장 췌도세포는 많은 혈관을 이루고 있기 때문에, 췌도 이식에서의 손상된 혈관형성은 초기 이식 기간에 췌도 세포 파괴에 기여하는 가장 중요한 요소 중에 하나이나, 새로운 혈관망의 완성은 이식 후 대략 10-14일이 지나서야 형성이 이루어진다.

한편, 단층 배양에 비해 구형 배양 방법(spheroid culture method)은 세포-세포 접촉 및 세포-매트릭스 접촉을 제공함으로써 줄기세포를 다량으로 증식시킬 수 있고, 다양한 혈관형성 인자(proangiogenic factors)에 의한 측분비 효과에 따라 허혈성 질환에서 신생혈관형성능을 나타낸다고 보고된 바 있다.

따라서, 최종적으로 당뇨병을 치료하기 위해서는 이식 전 췌도세포의 질의 향상 또는 장기적으로 유지할 수 있을 뿐만 아니라 높은 혈관 형성능과 측분비(paracrine) 효과를 가진 자가 치료 세포군을 증대시킬 수 있는 효율적인 전략이 필요하다.

본 발명자는 당뇨병 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 골수 유래의 혈관형성능 구형 세포(spheroid)와 췌도세포 클러스터(islet cluster)를 공동 이식하여 혈관형성 촉진 및 췌도의 생착률 증가를 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 췌도(Islet) 이식을 위한 세포이식물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 당뇨병 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 췌도 이식을 위한 세포이식물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 구형세포(Spheroid) 및 췌도세포 클러스터(islet cluster)를 유효성분으로 포함하는 췌도세포(Islet) 이식을 위한 세포이식물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구형세포는 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells)로부터 유래된 것이다.

본 발명의 췌도세포 이식을 위한 세포이식물을 제조하기 위해서는 각각 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포(Spheroid)와 췌도세포 클러스터를 분리제작한다.

상기 췌도세포의 클러스터의 제작을 위한 췌장 조직로부터의 췌장세포의 분리 및 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다.

상기 구형세포의 제작을 위한 골수 자체 및 골수로부터 유래된 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells)의 분리 및 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다.

상기 골수는 포유동물로부터 획득될 수 있다. 상기 포유동물은 인간, 소, 말, 돼지, 염소, 개, 고양이, 닭, 마우스, 랫트, 래빗 및 기니피그로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 골수 단핵세포는 중간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cells) 뿐만 아니라 림프구(lymphocytes), 단핵구(monocytes), 줄기세포 및 전구세포와 같은 조혈 세포 계통을 포함하는 이종 집단(heterogeneous population)을 의미하며, 본 발명에서는 밀도 구배 분리를 이용하여 골수로부터 분리한 골수 단핵세포를 이용하였다.

상기 줄기세포는 혈액줄기세포(Hematopoietic Stem Cells, HSCs) 및 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cells; EPCs) 등을 포함할 수 있으며, 특정 조건에 의해 특정세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포(Spheroid)", "골수 유래 구형세포(BM-spheroid)", "구형세포(spheroid)" 또는 "구형세포"는 골수 단핵세포로부터 유래되고 실질적으로 구 형상을 한 배양 실질 세포의 응집괴를 의미하고, 도 1a의 현미경 사진에서 보이는 형태 또는 그것에 근사한 형태의 것을 포함할 수 있다.

"실질적으로 구 형상"은 완전한 구 형상의 것에 한정되는 것이 아니라, 약간 편평 형상으로 된 형태도 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 구형세포는 포유동물의 대퇴부 및 경골로부터 골수를 분리한 후, 원심분리에 의해서 수득한 단핵세포를 EGM-2이 포함된 배지에서 5일 동안 ultra-low attach surface 디쉬 상에서 배양시킨 세포를 의미할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구형세포는 신장 피막 또는 간문맥을 통해 상기 췌도세포 클러스터와 함께 공동 이식된다.

본 발명의 주요한 특징 중 하나는 췌도세포 이식을 위한 세포이식물을 제조하기 위해 구형세포 및 췌도세포 클러스터를 각각 단독 분리 제작한 후, 각각 별개로 주입하여 공동 이식하거나, 또는 구형세포 및 췌도세포 클러스터를 혼합하여 공동 이식할 수 있다는 것이다.

또한, 체내로 투여된 구형세포 및 췌도 세포 클러스터가 실제로 표적 부위에 안정적으로 도달하여 목적하는 치료 효과를 나타내기 위해서는 여러 가지 요건이 만족되는 것이 바람직하다. 먼저, 간문맥 내 투여 시 적합한 크기인 경우 간문맥 내로 투여된 상기 세포들이 혈류 내 속도를 감소시키거나 혈전을 형성하지 않도록 할 수 있다.

예컨대, 상대적으로 크기가 큰 구형세포가 체내로 투여되면 혈관 내 활성에 영향을 줄 수 있다. 구체적으로, 혈류 속도를 감소시킬 수 있을 뿐 아니라, 혈액 순환을 방해하여 혈류의 중단, 혈전 형성, 혈관 폐색, 심지어 사망을 유발할 수 있고, 반대로 크기가 작은 구형세포가 투여되면 혈류로 인해 생착되지 못하는 문제점이 발생할 수 있다.

따라서, 적합한 크기의 구형세포 및 췌도세포 클러스터(islet cluster)를 간문맥에 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 혈관 내로 투여되기 전 세포의 파쇄나 응집(aggregation)이 형성되지 않고, 투여된 후에도 세포의 파괴나 응집의 형성 없이 표적 부위에 안정적으로 도달할 수 있는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라, 표적 부위에 도달한 상기 세포들이 목적하는 치료효과를 나타내도록 일정 농도 이상의 세포가 투여되는 것이 바람직하다. 상기 여러 요건 중, 본 발명의 구형세포의 크기는 췌도의 크기와 유사하여 체내 투여 및 생착에 적합한 크기를 가지므로 혈관 내로 투여된 구형세포가 혈류 내 속도를 감소시키거나 혈전을 형성함 없이 안정적으로 치료효과를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 구형 세포를 언급하면서 사용하는 단어 "적합한 크기"란 체내(예컨대, 간문맥)로 투여된 구형 세포가 혈류 내 흐름이나 순환을 방해하지 않으면서 표적 조직으로 용이하게 이동하여 표적 조직에 생착되어 머무르면서 그 활성 및 효능을 나타내는 데 유리할 수 있는 크기를 의미한다.

따라서, 본 발명의 세포이식물은 특정 경로, 예컨대, 간문맥과 같은 혈관을 통해 체내 주입해야 하므로, 본 발명의 구형 세포의 크기는 체내 투여에 적합한 크기를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 구형 세포의 크기는 이식하고자 하는 췌도세포와 동일 또는 유사한 크기로 만드는 것이 가장 바람직하다.

상기 췌도세포 클러스터(islet cluster)와 동일 또는 유사한 크기의 적합한 구형세포의 크기는 본 발명의 목적을 달성시킬 수 있는 한 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 본 발명의 구형세포의 적합한 크기는 해당 췌도세포 클러스터(islet cluster) 직경에 대한 구형세포 직경의 차이가 상기 췌도세포 클러스터(islet cluster)의 직경 크기와 대비하여 0 내지 500 ㎛ 이하로 차이나는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0~200 ㎛ 이하, 가장 바람직하게는 0~50 ㎛ 이하이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구형 세포의 적합한 크기는 해당 췌도세포 클러스터(islet cluster)와 동일 또는 유사한 크기일 수 있으며, 그 직경은 10 내지 500 ㎛ 범위이고, 보다 바람직하게는 50 내지 350 ㎛ 범위이다.

본 발명에서 상기 구형세포는 췌도세포 클러스터(islet cluster)와 유사한 크기이며, 이를 이식함으로써 보다 장기간 동안 간에서 유지되도록 머물게 해서 췌도세포 기능을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구형세포는 비-구형세포(non-spheroid)와 비교하여 CD14, CD34, CXCR4, CD14/CXCR4 또는 CD14/CD34가 과발현된다.

또한, 본 발명의 구형세포는 단핵세포 및 조혈모세포의 특성을 갖는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 구형세포는 단핵구의 마커인 CXCR4 및 CD14, 및 조혈모세포의 마커인 CD34를 과발현한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "과발현"은 당업계에서 통상적으로 이용되는 유전자발현 분석 방법, 예컨대 실시간 RT-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 웨스턴 블럿("Imaging Systems for Westerns: Chemiluminescence vs. Infrared Detection, 2009, Methods in Molecular Biology, Protein Blotting and Detection, vol. 536". Humana Press. Retrieved 2010), FACS(Flow cytometry 또는 Fluorescence-activated cell sorting, Loken MR (1990). Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting (2nd ed.). Wiley. pp. 34153) 면역화학염색법(Immunocytochemistry Methods and Protocols. Edited by Lorette C. Javois, 2nd edition, 1999. Human Press) 등의 분자생물학적 실험에 따라 유전자발현 또는 단백질 발현을 분석한 경우에, 본 발명의 구형세포를 이식하지 않은 대조군보다 유전자 발현 및/또는 단백질 발현이 높은 것으로 분석되는 경우를 의미할 수 있다.

본 발명의 구형세포는 DiI-ac-LDL(Acetylated Low Density Lipoprotein labeled with 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate) 흡수능 및 BS-1(Bandeiraea simplicifolia 유래) 렉틴(lectin) 결합능을 가질 수 있다.

상기 DiI-ac-LDL 흡수능은 구형세포를 확인할 수 있는 마커로, 세포가 DiI-ac-LDL와 접촉한 경우에, 지질단백질은 리소좀효소에 의해 분해되고 형광 염색제인 DiI가 세포 내 막에 축적되어 가시적으로 확인할 수 있다.

상기 BS-1 렉틴 결합능은 구형세포의 혈관형성 기여를 확인할 수 있는 마커로, 구형세포에 BS-1 렉틴을 반응시키는 경우에, 구형세포는 BS-1와 결합능을 나타낼 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구형세포 및 상기 췌도세포 클러스터(islet cluster)는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenegenic) 조직으로부터 유래된 세포 또는 이들 유래의 2 종류 이상의 세포들로 구성될 수 있고, 가장 바람직하게는 자가 유래이다.

본 발명의 세포이식물을 구성하고 있는 골수 유래 구형세포와 췌도세포 클러스터(islet cluster)를 공동 이식할 경우 대조군에 비하여 췌도세포의 생존률이 증가하고, 혈관형성능이 촉진될 뿐만 아니라 우수한 정상 혈당 조절능을 나타낼 수 있다.

즉, 본 발명의 세포이식물은 췌도세포 클러스터(islet cluster)와 함께 이식된 골수 유래 구형세포가 초기 췌도세포의 정착 안정화에 영향을 미쳐 췌도세포의 기능(당부하 검사 및 인슐린 분비)을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 세포이식물의 췌도세포 클러스터와 함께 이식된 골수 유래 구형세포는 베타세포의 증식을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 직접(incorporation)적으로 혈관 형성(revascularization)에 기여하여 혈관을 신생 또는 형성시킬 수 있으므로 다양한 허혈성 질환, 예컨대, 당뇨병의 예방 및 치료에 적용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "혈당 조절능"은 마우스를 기준으로 하여 세포이식물을 이식한 경우, 정상 혈당농도에 도달하도록 하는 세포이식물의 효능을 의미한다. 보다 구체적으로, 세포이식물에 대하여 정상 혈당 도달 누적 퍼센트 및 당부하검사(Intraperitoneal glucose tolerance tests, IPGTT) 후 개선된 혈당변화로 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "혈관형성능"은 세포이식물에 의한 혈관 신생 능력을 의미하며, 구체적으로 세포이식물에 의한 혈관 생성 정도를 확인하기 위해, CD31 항체(마우스를 기준으로 하여)를 이용하여 면역세포화학법을 실시하여 생성된 혈관을 개수하여 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 세포이식물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병일 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 국소 이식 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 1-10000 세포수/kg(체중)이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다

본 발명의 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물은 상기 세포이식물을 유효성분으로 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 췌도세포 이식을 위한 세포이식물의 제조방법을 제공한다:

(a) 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포(Spheroid)를 제작하는 단계;

(b) 상기 구형세포 및 췌도세포 클러스터(islet cluster)를 혼합하여 세포이식물을 제조하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 세포이식물은 구형세포 및 췌도세포 클러스터의 세포 혼합비가 1000:1 내지 10000:1의 세포수 혼합비를 가질 수 있다.

즉, 본 발명의 방법에 따르면, 표적 조직으로의 이동이 용이하며 안정성이 우수한 세포이식물을 제조할 수 있으므로 세포이식물의 투여에 의한 세포치료 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 세포이식물을 제조하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 세포이식물은 구형세포를 함께 포함함으로써 췌도세포의 생물학적인 활성 및 기능의 손실이 적으며 췌도세포의 생존률을 높일 수 있어, 췌도세포의 질의 향상 또는 기능을 장기적으로 유지할 수 있을 뿐만 아니라 혈관형성능을 향상시켜 당뇨병을 치료하는 데 이용될 수 있다.

도 1은 3 차원 배양을 이용한 마우스 골수 유래 구형세포(spheroid)에 대한 특성을 나타낸 것이다.
도 2는 마우스 골수 유래 구형세포(spheroid)를 구성하는 아세포군을 나타낸 것이다.
도 3은 골수 유래 구형세포가 인간제대정맥내피세포에 의해 형성된 관 구조에 참여(incorporation)함을 나타낸 것이다.
도 4는 골수 유래 구형세포가 생체 내 매트리젤 플러그 모델 (matrigel plug model)에서 혈관 형성능 (angiogenenic capacity)을 가지고 있음을 나타낸 것이다.
도 5는 골수 유래 구형세포와 췌도세포 클러스터(islet cluster)의 공동 이식에 의해 향상된 혈당 조절능을 나타낸 것이다.
도 6은 골수 유래 구형세포와 췌도세포 클러스터(islet cluster)의 공동 이식 후 이식된 부위에서의 향상된 혈관형성과 베타세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 7은 골수 유래 구형세포는 향상된 기능적 혈관 형성뿐만 아니라 혈관형성에 참여함을 나타낸 것이다.
도 8은 인간 췌도세포의 크기에 따른 구성을 나타낸 것이다.
도 9는 간문맥을 통한 구형세포(spheroid)와 췌도세포 클러스터(islet cluster) 공동 이식 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 BM-구형세포와 MSC(mesenchymal stem cells)-유래 구형세포의 효과를 비교한 결과이다.
도 11은 구형세포 집적 정도에 따른 비교에 대한 대략적인 도면이다.
도 12는 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 구형세포의 집적 정도에 따른 혈당 조절능 결과를 보여준다.
도 13은 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 구형세포의 집적 정도에 따른 이식된 췌도세포의 기능을 확인한 결과를 보여준다.
도 14는 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 구형세포의 집적 정도에 따른 이식된 췌도세포의 형태를 확인한 결과를 보여준다.
도 15는 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 구형세포의 집적 정도에 따른 이식된 췌도세포의 혈관형성능을 확인한 결과를 보여준다.
도 16은 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 구형세포의 집적 정도에 따른 이식된 BM-구형세포를 추적한 결과를 보여준다.
도 17은 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 이식 경로에 따른 생체외 췌도세포의 기능을 확인한 결과를 보여준다.
도 18은 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 이식 경로에 따른 췌도세포의 형태를 확인한 결과를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 재료 및 방법

마우스의 골수로부터 단핵세포 분리 및 구형세포(spheroid) 형성

다음과 같이 마우스의 골수로부터 단핵세포를 분리하여 구형세포(spheroid)를 제작하였다.

10~12주령의 수컷 C57BL/6J로부터 유래한 녹색형광 유전자 변형 마우스 (Green fluorescent protein-transgenic mice, GFP-Tg)와 정상 C57BL/6J 마우스의 대퇴부와 경골로부터 골수(bone marrow, BM)를 수집하였다. 근육과 결합조직을 뼈로부터 깨끗하게 제거한 후, 30-게이지 주사기를 사용하여 1x PBS을 주입하여 뼈 속 안에 있는 골수를 획득하였다. 상기 골수를 Histopaque-1083을 이용하여 밀도차에 의한 원심분리에 의해서 단핵세포(Mononuclear cells, MNCs)를 분리하였다. 이식된 세포를 추적하기 위해서 GFP-Tg에서 분리한 골수 세포를 사용하였다.

이러한 골수 단핵세포로부터 골수 유래 구형세포(BM-spheroid)를 만들기 위해서, 3~5 x 10⁶ 단핵세포/㎖로 EGM-2 + 5% FBS 배양액에 섞은 후, HydroCellTM ultra-low attach surface 디쉬에 접종하였다. 2 일 배양 후, 신선한 배양액을 첨가해 주고 3 일간 더 배양하였다. 형성된 구형세포는 이후 실험관(in vitro)과 생체 내(in vivo) 실험에 사용하였다.

췌도세포 클러스터(islets cluster) 분리

마우스의 췌장에 0.8 mg/kg collagenase P을 총담관으로 주입하여 췌도세포 덩어리인 클러스터(cluster)를 분리하였으며, Ficoll 밀도 차를 이용하여 정제하였다. 췌도세포는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640에서 배양하였으며, 다음날 해부현미경으로 췌도세포 클러스터만을 파이펫으로 수집하여 이식에 이용하였다.

유세포 분석

신선한 골수 단핵세포(BM-MNC), 골수 유래 구형세포(BM-spheroid), 골수 유래 비-구형세포(BM-non-spheroid)(단순 분리된 골수 단핵세포)의 세포 구성을 확인하기 위해서 다음과 같이 유세포 분석을 실시하였다.

BM-구형세포는 디스페이즈(dispase, 100 ㎍/㎖)를 처리하여 낱개 세포로 분리하였다. 각 세포 (1~2 x 10⁵)들은 100 ul에 0.5% BSA가 첨부된 버퍼에 각각의 항체들을 다양한 농도로 처리 후, 4℃에서 20 분간 두었다. 이후 1xPBS로 2 회 세척하고 유세포 분석을 실시하였다. 항체는 PE(phycoerythrin)- 또는 FITC(fluorescein isothiocyanate)-결합 항-마우스 CD31, PE-항-마우스 CD14, FITC-항-마우스 CD45, PE-항-마우스 CXCR4 또는 APC-항-마우스 CXCR4, PE-Cy5-CD3 및 FITC 또는 eFluor　660-결합 항-마우스 CD34를 사용하였다. 분석은 CellQuestPro software를 사용하였다. BM-비-구형세포와 BM-구형세포의 생존을 평가 하기 위해서, Calcein-AM과 PI(Propidium Iodide)를 사용하였다. 각 세포는 2 μM Calcein-AM 처리하고 37℃에서 25 분간 둔 후, 세척하고 2.5 μM PI 처리하여, 유세포 분석을 실시하였다.

메트리젤 위에서의 혈관형성 테스트

인간 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)에 의해 형성된 관 구조에 BM-구형세포가 참여하는지를 조사하기 위해서, 24 웰 플레이트에 250 ul 메트리젤을 도포하고 37℃에서 30 분간 두었다. HUVEC에 의해 형성된 혈관 구조에 참여한 BM-구형세포를 추적하기 위해서 GFP에서 유래된 골수를 사용하였으며, HUVEC은 신선한 골수 단핵세포, BM-구형세포(BM-spheroid), BM-비-구형세포(BM-non-spheroid), 및 낱개의 세포로 분리한 BM-분리된 구형세포(BM- dissociated spheroid)와 함께 메트리젤 위에 배양 하였다.

또한, 공동 배양에 의한 간접적인 효과를 조사하였다. 메트리젤 위에 배양하는 HUVEC과 분리하기 위해서 신선한 골수 단핵세포, BM-구형세포, BM-비-구형세포를 배양 막 인서트(culture membrane insert) 웰에 넣어주고 공동 배양하였다. 세포는 1% FBS가 첨부된 EBM-2에 배양하였다. 24 시간 후에, 각 세포와 함께 배양된 HUVEC에 의해 형성된 관 구조 정도를 비교하였으며, 관 구조의 세포들은 25 ㎍/㎖ Calcein-AM으로 표지하였으며, 형광으로 표지된 관들은 형광 현미경상에서 관찰되었다.

생체 내 매트리젤 플러그 어세이

생체 내 매트리젤 플러그는 마우스의 피부 아래에 세포와 함께 이식된 젤 플러그 내에 새롭게 형성된 혈관을 관찰하기 위해서 실행하였다. 생체 내 이식된 세포가 혈관 형성에 기여 정도를 확인 하기 위해서 1x10⁶ GFP-BM-구형세포, BM-비-구형세포(BM-non-spheroid) 또는 신선한 골수 단핵세포를 사용하였으며, 세포는 300 ul 매트리젤에 섞어서 마우스의 옆구리의 피하에 주입하였다. 14 일 후, 이식된 매트리젤 덩어리를 수집하였으며, 형광 염색을 위해서 4% PFA에 고정시켰다. 조직은 OCT compound로 냉동 보존하였다. 조직은 10 ㎛로 절단하였으며, 새롭게 형성된 혈관은 CD31 항체를 이용하여 각 세포군에 따른 형성 정도를 비교하였다.

골수 단핵 세포로부터 CD31 +, CD14 +, CD34 +의 분리

어떤 세포군이 구형세포 형성에 참여하는지를 확인하기 위해서, PE-CD31, PE-CD14, 및 APC-CD34 항체로 유세포분석을 통해 골수 단핵세포로부터 CD31, CD14, CD34 양성 세포를 분리하였다. 세포는 100 ul에 0.5% BSA가 첨부된 버퍼에 각각의 항체들을 다양한 농도로 처리 후, 4℃에서 20 분간 두었다. 이후, 1x PBS로 2 회 세척 후, FACS Aria III로 분리하였다. 분리된 각 항체의 양성세포들은 CM-DiI (1 ㎛)로 염색 후, DiI로 염색된 양성세포들은 각 대응 음성세포와 함께 구형세포 (spheroid) 배양 배지에서 5 일간 공동 배양하였다. DiI로 염색된 양성세포가 구형세포의 중심쪽에도 존재하는지 확인하기 위해서, GFP-Tg 마우스에서 얻은 GFP-단핵세포를 위에서 설명한 방법과 동일하게 GFP-CD31, CD14, CD34 양성세포를 얻고, 정상 마우스로부터 음성 세포를 얻어서 5 일간 공동배양 후, Zeiss CLSM780 confocal microscope을 이용하여 GFP-양성세포가 구형세포 중심에 분포하는지를 확인 하였다.

BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식 및 상기 이식 결과에 대한 평가

10~12 주령의 GFP-Tg와 정상 마우스는 실험 조건에 따라서 공여자와 수여자로 사용하였으며, GFP-Tg 마우스는 수여자로부터 유래한 혈관의 기여도 정도를 평가하기 위해 사용하였다. 마우스의 당뇨 모델은 180 mg/kg의 스트렙토조토신 (streptozotocin, STZ)을 복강 내 주사 하였으며, 혈당 측정은 꼬리 정맥을 통해 혈액을 채취해 glucose meter를 이용하여 수행을 하였다. 지속적인 고혈당(=20 mmol/l)을 유지하는 마우스만을 이식에 사용하였다. 췌도세포 클러스터와 BM-구형세포는 동계 수여자(syngeneic recipient)의 왼쪽 신장 피막 또는 간문맥에 이식하였다. 공동 이식 실험을 위해서, 200 개의 췌도세포 클러스터와 240 개의 BM-구형세포(한 개의 구형세포는 4.2 ± 1.3 x 10³ 개의 단핵세포로 구성하고 있으며, 전체의 세포의 수는 1 x 10⁶ 세포임), 또는 200 개의 췌도세포 클러스터와 1 x 10⁶ BM-비-구형세포가 이식에 사용되었다. 이식 후, 체중과 혈당은 1주일에 2 번씩 측정을 하였다. 이식 부위가 존재하는 신장을 14 일과 28 일째 제거하여 조직 면역 염색과 형태학적 분석을 하였다. 기능적 혈관 (functional vessel)을 평가 하기 위해서, 신장을 제거하기 전에, 200 ㎍ TRITC-BS(tetramethyl rhodamine isothiocyanate-bandeiraea simplicifolia)1-lectin을 꼬리 정맥을 통해 주입하고 1 시간 후에, 이식 부위를 획득하였다. 28 일째에 당부하검사(intraperitoneal glucose tolerance tests, IPGTT)을 실행하였다. 16 시간 동안 절식을 시킨 후, 1 g/kg로 당을 복강 내로 주입해 주고, 시간 별 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 분으로 혈당을 측정하였다. 0 분과 30 분에 안구옆을 터뜨려 모세관을 통해 혈액을 얻었으며, 분리한 혈청 인슐린은 랫트/마우스 인슐린 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 이용하여 측정하였다. 정상혈당에 도달한 마우스 퍼센트와 도달 시간을 각 군마다 계산하였으며, 수행한 혈당 검사 중 2일 연속으로 혈당량이 <11/1 mmol/l로 떨어졌을 때 효과가 있는 것으로 판단하였다.

면역염색

이식 28일째에 신장을 적출하여 4% 파라포름알데하이드에 고정을 시키고, PBS로 세척 후, 30% 수크로즈에 담가 냉동 블록을 제작하였다. 조직은 10 ㎛로 절단하여 조직염색을 실행하였다. 조직염색은 췌도세포 염색을 위해 인슐린 항체, 새로운 혈관 염색을 위해 CD31 항체, 베타세포의 증식 여부 확인을 위해 Ki67과 BrdU 항체, GFP 유래 세포를 염색을 위해 GFP 항체, 알파세포 염색을 위해 글루카곤 항체를 사용하였다. 조직은 10% normal goat ser㎛으로 blocking 후, 랫트 항-마우스 CD31, 래빗 폴리크로날 항-GFP, 래빗 항-Ki67, -BrdU, 기니피그 항-인슐린, 래빗 항-글루카곤 항체를 1차 항체로 사용하였으며, 568-결합 고트 항-래트, 488 또는 568-결합 고트 항-래빗, Cy3-결합 항-기니피그를 2차 항체로 사용하였다. 핵 염색을 위해서 DAPI를 사용하였다. 형태학적 측정과 분석은 Image-Pro Plus software version 5.1을 이용해 수행하였다.

통계분석

데이터는 평균값 ± 측정 표준 오차로 나타내었다. 각 군(group)간의 차이는 two-tailed unpaired t-test, log-rank test, 및 one-way analysis of variance (ANOVA)로 분석하였고, p-value < 0.05 일 때 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1. 3차원 배양을 이용한 마우스 골수 유래 구형세포(spheroid) 형성

본 발명자들은 3 차원 배양 방법을 이용하여 마우스 골수 단핵세포를 배양하였다.

그 결과, 골수 유래 구형세포(BM-spheroid)인 BM-구형세포는 ultra-low attach 표면 디쉬 위에서 자연적으로 형성되었으며, 구형세포(spheroid)의 모양과 크기는 이전에 보고된 결과와 유사하였다(도 1a 및 1b).

또한, 5 일째 형성된 BM-구형세포와 신선한 골수 단핵세포간의 표면 단백질 마커를 비교하기 위해서, CD14, CD34, CXCR4, CD31에 대한 유세포 분석을 실행하였다.

그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, BM-구형세포는 신선한 골수 단핵세포와 5 일째 BM-비-구형세포(BM-non-spheroid)보다 CD14, CD34, CXCR4의 발현 양상이 더 높았다. 비록 BM-구형세포는 대부분 CD14을 발현하지만, CD31 발현 양상은 신선한 단핵세포보다 낮았다. 또한, BM-구형세포는 신선한 골수 단핵세포와 BM-비-구형세포에 비해서 CD14+/CXCR4+와 CD14+/CD34+의 비율이 유의하게 더 높게 발현되었다 (표 1).

실시예 2. 마우스 골수 유래 구형세포(spheroid)를 구성하는 아세포군 확인

본 발명자들은 실시예 1에서 제조된 마우스 골수 유래 구형세포(spheroid)를 구성하는 아세포군을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 양성 군집(positive population)은 DiI로 염색하고 음성 군집(negative population)은 염색을 하지 않고 동시에 배양한 경우 DiI 염색된 세포만이 구형세포(spheroid)를 형성했다는 것을 확인하였으며(도 2a), 각 군집을 따로 배양 시, 양성 군집은 구형세포를 형성하는 반면 음성 군집은 형성하지 못했다(도 2b).

또한, GFP-Tg 마우스에서의 각 마커의 양성 군집만을 분류(sorting)한 세포와 야생형 마우스에서 각 마커의 음성 군집을 분류하여 동시에 배양한 후, 구형세포를 절단하여 공초점(confocal) 장비를 이용하여 구형세포 내부를 관찰하였다. 그 결과, 내부도 각 양성 세포로 구성되어 있음을 보여준다(도 2c).

실시예 3. 인 비트로 상에서의 BM-구형세포의 혈관 형성능 확인

본 발명자들은 구형세포 자체의 혈관 형성능을 확인하기 위해서 매트리젤 튜브 형성(tube formation) 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 구형세포로부터 관들이 뻗어 나와서 서로 연결이 되어 망상구조를 형성하였으며(도 3a), 이러한 관들은 전형적인 내피세포의 항체인 CD31 면역염색에 양성을 보였다(도 3b). 반면, BM-비-구형세포(BM-non-spheroid)와 신선한 골수 단핵 세포는 혈관 구조를 형성하지 못하였다.

또한, GFP-Tg 마우스로부터 유래한 GFP-BM-구형세포는 HUVEC에 의해 형성된 혈관 구조에 참여함을 관찰 할 수 있었으며, 신선한 단핵세포나 BM-비-구형세포보다 많은 세포들이 혈관에 참여함을 보였다(도 3c).

한편, BM-구형세포로부터 분비되는 인자들에 대한 효과를 평가하기 위해서, 매트리젤 위에 HUVEC가 분리하기 위해 배양 용기 내 상단부에 배양 막 인서트(culture membrane insert)를 놓고 안에 구형세포를 넣어주고 24 시간 두었다.

그 결과, BM-구형세포는 신선한 단핵세포나 BM-비-구형세포에 비해 많은 혈관 형성을 관찰 할 수 있었다(도 3d).

또한, BM-구형세포는 신선하게 분리한 골수 단핵세포나 BM-비-구형세포보다 혈관 증식에 관련된 인자들이 높게 발현됨을 관찰 할 수 있었으며(도 3e), 이러한 인자들이 실험관 내에서의 구형세포에서 분비하는 인자들에 의해서 내피세포의 혈관 형성(matrigel tube formation)을 향상시킬 수 있는 요인임을 보여주었다.

실시예 4. 생체 내 매트리젤 플러그에서의 BM-구형세포의 혈관 형성능 확인

본 발명자들은 생체 내에서 BM-구형세포가 혈관 형성능을 가지고 있는지 평가 하기 위해서 매트리젤 플러그 어세이(matrigel plug assay)를 실시하였고, 14일째의 매트리젤 플러그 내의 혈관 밀도를 CD31 항체로 면역형광염색하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 음성대조군(blank), 골수 단핵세포(BM-MNC), 및 BM-비-구형세포와 비교했을 때, BM-구형세포를 주입한 군에서 새로운 혈관 형성이 뚜렷하게 증가하였다(도 4a 및 4b).

또한, GFP-BM-구형세포는 CD31으로 염색된 혈관 주변에 위치하거나 직접 혈관에 참여함이 관찰되었다(도 4c).

이러한 결과들은 BM-구형세포가 생체 내에서 새로운 혈관 형성에 기여할 수 있음을 보여준다.

실시예 5. BM-구형세포 및 췌도세포 클러스터의 공동 이식에 의한 혈당 조절능 향상 확인

본 발명자들은 췌도세포 클러스터와 혈관능을 가진 BM-구형세포를 함께 동계의 마우스 당뇨 모델에 이식했을 때의 결과를 조사하였다.

먼저, 췌도 이식 전, Calcein AM과 PI을 이용하여 BM-구형세포와 BM-비-구형세포의 생존력을 평가한 결과 모두 90% 이상 생존함을 확인하였다.

그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 췌도세포 클러스터+구형세포군의 평균 혈당은 단독 췌도세포군과 췌도세포 클러스터+비-구형세포군보다 유의성 있게 낮았으며(도 5a), 시간에 따른 정상 혈당 도달 누적 퍼센트도 췌도세포 클러스터+구형세포군에서 더 높았다(도 5b).

또한, 생체 내에서 이식된 췌도세포의 기능을 조사하기 위해, 이식 후 28 일 째에 당부하검사(Intraperitoneal glucose tolerance tests, IPGTT)를 실시하였다.

그 결과, 도 5c 및 5d에 나타낸 바와 같이, 단독 췌도세포군과 췌도세포 클러스터+비-구형세포군에 비해, 췌도세포 클러스터+구형세포군이 포도당 부하 후 개선된 혈당변화를 보였으며(도 5c), 당부하검사에서의 혈당 커브의 영역값 (value of the area under the glucose curve, AUG_glu) 역시 췌도세포 클러스터+구형세포군에서 유의성있게 작았다(도 5d).

한편, 췌도세포 클러스터+구형세포군에서 나아진 혈당 조절 현상이 이식된 췌도세포로부터 인슐린 생성이 증가했기 때문인지를 확인하였으며, 췌도세포 클러스터+구형세포군에서의 혈청 속 마우스 인슐린의 농도가 단독 췌도세포군과 췌도세포 클러스터+비-구형세포군에 비해 높았다(도 5e).

실시예 6. BM-구형세포 및 췌도세포 클러스터의 공동 이식에 의한 혈관형성 및 베타세포증식 향상 확인

본 발명자들은 혈관형성 정도를 평가하기 위해, 상기 실시예 5에서 14일과 28일째에 이식된 신장을 적출하여 CD31 항체로 면역염색하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 혈관 밀도는 BM-구형세포 및 췌도세포 클러스터 공동 이식군에서 뚜렷하게 더 높았으며(도 6a), 혈관은 내분비 영역 내와 주변에서 관찰되었다(도 6b).

또한, 췌도세포 클러스터+구형세포군은 내분비 영역과 비내분비영역에 있어서 췌도세포 클러스터+비-구형세포군보다 유의성 있게 넓었으며(도 6c), BM-구형세포 및 췌도세포 클러스터 공동 이식군에서 글루카곤 양성 알파세포는 대부분 내분비 영역 주위에 분포를 하고 있는 반면, 췌도세포 클러스터+비-구형세포군에서 알파세포는 불규칙하게 분포함을 보였다.

또한, 두 군 간의 알파세포의 갯수도 유의성있게 차이를 보였으며(도 6d), 클러스터 공동 이식군은 향상된 베타세포의 증식을 나타냈다(도 6e 및 6f).

이러한 결과들은 BM-구형세포 및 췌도세포 클러스터의 공동 이식이 베타세포의 증식을 향상시킨다는 것을 제시한다.

실시예 7. BM-구형세포의 혈관 형성 참여

본 발명자들은 이식된 조직에서의 기능적 혈관의 정도와 수여자로부터 유래한 기능적 혈관의 기여 정도를 평가 하기 위해서, GFP-Tg 수여자 마우스에 TRITC-결합(conjugated) BS1-렉틴을 주입하여 형성된 혈관에 염색 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 주입된 렉틴에 염색된 양성 혈관은 BM-비-구형세포군보다 BM-구형세포에서 유의성 있게 더 많이 관찰되었다(도 7a 및 7b). 또한, 수여자 유래 기능적인 혈관 밀도는 췌도세포 클러스터+BM-구형세포군이 췌도세포 클러스터+비-구형세포군에 비해서 뚜렷하게 더 높았으며, 이식된 GFP-구형세포는 내분비 영역 내 또는 주변에 분포함을 볼 수 있었으며, 구형세포 공동 이식군에서 혈관에 끼어 있는 세포가 더 많이 관찰되었다(도 7c 및 7d).

실시예 8. 간문맥을 통한 구형세포와 췌도 공동 이식

본 발명자들은 간문맥을 통한 구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 효과를 확인하기 위해, 간문맥(Portal vein)을 통해 이식하였다.

도 8은 인간 췌도세포의 크기에 따른 구성을 보여준다. 인간 췌도세포의 전체적인 크기는 50~350 ㎛로 구성되어있고, 대부분을 구성하고 있는 췌도 크기는 100~200 ㎛이다. 간문맥을 통해 이식하므로, 너무 크게 만들면 혈관을 막아 버리기 때문에 색전증을 유발한다. 따라서, 골수 유래 구형세포를 이식하고자 하는 인간 췌도세포와 유사한 크기로 만드는 것이 중요하다.

좌측 그래프는 분리한 췌도 세포의 크기에 따른 실제 췌도의 숫자(islet number) 분포를 설명한다. 그러나, 크기가 작은 췌도의 경우 숫자가 많다고 하더라도 실제로 차지하는 부피는(인슐린을 분비하는 능력과 비례) 상대적으로 작다. 즉, 췌도세포 수로 적용하면 크기가 작고 큰 세포의 구분이 없이 반영하기 때문에 같은 수를 이식하였더라도 서로의 기능이나 결과가 다를 수 밖에 없다. 따라서, 췌도 직경이 150 ㎛인 경우를 기준으로 삼아서 각 크기의 췌도세포를 환산하여 새롭게 개수한 것이 islet equivalent, 즉, IEq(우측 그래프)이다. 따라서, 분리한 췌도의 크기에 상관없이 150 ㎛ 췌도 크기 기준으로 환산한 숫자로 정의할 수 있다. 좌측 및 우측 그래프에서 50-99 ㎛ 크기의 췌도는 숫자는 많은 편이나, 150 ㎛ 기준으로는 미미한 숫자임을 나타낸다.

즉, 100-350 ㎛ 크기 췌도가 중요함을 알 수 있다.

또한, 췌도세포 이식 부위는 간이라는 특이한 이식 부위 때문에 다른 세포와의 이식에 어려움이 있다. 단세포로 이식을 하게 되면 체순환을 하기 때문에 간이라는 특정부위에 머물기가 어렵기 때문이다.

따라서, 본 발명자들은 구형세포의 크기를 췌도세포 클러스터와 유사한 크기로 제작하고 이를 이식함으로써 보다 오래 간에서 유지되도록 머물게 해서 구형세포의 효과로 인해 췌도세포 기능을 향상시키고자 하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 췌도세포 단독군보다 췌도세포 클러스터와 유사한 크기의 골수유래 구형세포 및 췌도세포 클러스터를 동시에 이식한 군에서 뚜렷하게 향상된 혈당 조절능을 나타내었다.

실시예 9. MSC -구형세포와의 비교

본 발명자들은 간문맥을 통한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 탁월한 췌도세포 생착율 및 생존율 증진 효과를 확인하기 위해, 행잉-드롭(hanging-drop) 방법으로 MSC(mesenchymal stem cells)-유래 구형세포를 제작하여 비교하였다.

간략하게, MSC-유래 구형세포를 만들기 위해서, 20 ul당 간엽줄기세포의 수 (1, 2.5, 5, 10 x 10⁴)에 따라서 디쉬(dish) 뚜껑 안쪽에 한 방울씩 배열하여 놓은 다음 뒤집어서 뚜껑을 덮고 3 일간 배양을 한 후, 형성된 구형세포(spheroid)를 획득하였다.

상기 제작된 MSC-유래 구형세포를 간문맥으로 이식한 경우, 병리적 현상을 일으키는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 BM-구형세포를 주입한 경우에는 병리적 현상(thrombosis 또는 embolism)이 관찰되지 않은 반면, MSC-유래 구형세포의 경우 간 표면에 괴사와 같은 병리적 현상이 뚜렷하게 나타남을 관찰할 수 있었다.

실시예 10. 구형세포 집적 정도에 따른 비교

본 발명자들은 간문맥을 통한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터 공동 이식시 구형세포의 집적 정도에 따른 췌도세포 생착율 및 생존율 증진 효과를 확인하기 위해, 클러스터 상태인 본 발명의 BM-구형세포를 분리시킨 BM-구형세포-분리(dissociated cells)를 제작하여 비교하였다(도 11 참조).

10-1. 혈당 수준 비교

혈당 조절능을 조사하기 위하여, 당뇨병 유발(streptozotocin-induced diabetic mice) 마우스의 간문맥을 통해 각각 췌도세포 클러스터 단독 이식, 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식, BM-구형세포-분리와 췌도세포 클러스터의 공동이식시킨 후, 혈중 글루코스의 농도를 확인하였다.

그 결과, 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 다른 대조군에 비해, 28 일간 혈당 변화에서 간문맥으로 이식한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식은 향상된 혈당 조절능을 나타냈을 뿐만 아니라(도 12a), 개선된 당뇨 치료율을 나타냈다.

10-2. 이식된 췌도세포의 기능 확인

28일째 이식된 췌도세포의 기능을 조사하기 위하여, 당뇨병 유발(streptozotocin-induced diabetic mice) 마우스의 간문맥을 통해 각각 췌도세포 클러스터 단독 이식, 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식, BM-구형세포-분리와 췌도세포 클러스터의 공동이식시킨 후, 당부하 및 공복시 혈중 글루코스의 농도를 확인하였다.

그 결과, 도 13a 내지 도 13c에 나타낸 바와 같이, 복강에 글루코스(1g/kg) 주입 후, 시간에 따른 혈당 변화를 확인한 경우, 다른 대조군에 비해, 간문맥으로 이식한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군은 신속하게 혈당이 조절됨을 확인 할 수 있었으며(도 13a 및 도 13b), 또한, 0 및 30 분에 혈액 내의 인슐린 농도 조사한 경우, 다른 대조군에 비해, 간문맥으로 이식한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군이 가장 높게 인슐린을 분비하고 있음을 알 수 있다(도 13c).

10-3. 이식된 췌도세포의 형태학적 확인

간문맥을 통해 이식된 췌도세포의 형태를 조사하기 위하여, 당뇨병 유발(streptozotocin-induced diabetic mice) 마우스의 간문맥을 통해 각각 췌도세포 클러스터 단독 이식, 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식, BM-구형세포-분리와 췌도세포 클러스터의 공동이식 후, 간에 이식된 췌도세포의 형태, β-세포의 비율, 췌도세포의 크기 및 췌도세포 수를 확인하였다.

그 결과, 도 14a 내지 도 14d에 나타낸 바와 같이, 다른 대조군에 비해, 간문맥으로 이식한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군에서의 간에 이식된 췌도세포의 형태는 온전한(intact) 모양을 하고 있으며(도 14a), β-세포의 비율(도 14b), 췌도세포의 크기(도 14c) 및 췌도세포 수(도 14d)가 유의하게 높았다.

10-4. 이식된 췌도세포의 혈관형성능 확인

간문맥을 통해 이식된 췌도세포의 혈관형성능을 평가하기 위하여, 당뇨병 유발(streptozotocin-induced diabetic mice) 마우스의 간문맥을 통해 각각 췌도세포 클러스터 단독 이식, 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식, BM-구형세포-분리와 췌도세포 클러스터의 공동이식 후, 혈관 형성 정도를 형광 이미지로 확인하였다.

그 결과, 도 15a 및 도 15b에 나타낸 바와 같이, 다른 대조군에 비해, 간문맥으로 이식한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군에서 향상된 혈관 형성이 관찰되었다. 도 15b에 이러한 결과를 그래프로 나타내었다.

10-5. 이식된 BM-구형세포의 추적

간문맥을 통해 이식된 BM-구형세포를 추적하기 위하여, 당뇨병 유발(streptozotocin-induced diabetic mice) 마우스의 간문맥을 통해 각각 췌도세포 클러스터 단독 이식, 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식, BM-구형세포-분리와 췌도세포 클러스터의 공동이식 후, Resovist로 표지한 BM-구형세포를 MRI로 확인하였다.

그 결과, 도 16a에 나타낸 바와 같이, 인 비트로 MRI 이미지 상에서 BM-구형세포가 관찰되는 것을 확인하였다.

또한, 도 16b에 나타낸 바와 같이, 간문맥으로 이식한 Resovist로 표지한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군은 MRI 이미지에서 단일 세포인 BM-비-구형세포(대조군)보다 유의하게 많은 저강도 스팟(hypointense spot)이 관찰되었다.

또한, 도 16c에 나타낸 바와 같이, 이식된 간을 적출하여 ex-vivo로 MRI 찰영한 결과, 간문맥으로 이식한 Resovist로 표지한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군은, 생체외 간(Liver ex-vivo) MRI 상에서 단일 세포인 BM-비-구형세포(대조군)보다 유의하게 많은 저강도 스팟(hypointense spot)이 관찰되었다.

또한, 도 16d에 나타낸 바와 같이, GFP-mouse로 부터 만든 GFP-BM-spheroid를 이식 후, 8일째 광학 이미지(optical imaging) 장비로 GFP 발현 정도를 확인한 결과, 간문맥으로 이식한 Resovist로 표지한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군은, 간에 많이 존재하는 반면 단일 세포인 BM-비-구형세포(대조군)는 간에는 거의 존재하지 않으며, 폐에 존재하고 있음을 확인하였다.

10-6. 이식 경로에 따른 생체외 췌도세포의 기능 확인

본 발명자들은 간문맥(intraportal) 또는 정맥(tail vein)을 통한 공동 이식에 대한 췌도세포 기능을 평가하였다. 도 17a에 개략적으로 나타내었다.

그 결과, 도 17e에 나타낸 바와 같이, 췌도 단독군(도 17b); 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터를 간문맥으로 공동 이식군(도 17c); 췌도는 간문맥으로 이식 후, 분리된 구형세포는 꼬리 정맥으로 이식한 군(도 17d)의 혈당 그래프에서, 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터를 간문맥으로 공동 이식군이 꼬리정맥 이식군보다 향상된 당뇨 회복율을 나타냈다.

10-7. 이식 경로에 따른 췌도세포의 형태학적 확인

본 발명자들은 간문맥(intraportal) 또는 정맥(tail vein)을 통해 이식된 췌도세포의 이식된 췌도세포의 형태, β-세포의 비율, 췌도세포의 크기 및 췌도세포 수를 확인하였다.

그 결과, 도 18a 및 도 18b에 나타낸 바와 같이, 다른 대조군에 비해, 간문맥으로 이식한 본 발명의 BM-구형세포와 췌도세포 클러스터의 공동 이식군에서의 이식된 췌도세포의 형태는 온전한(intact) 모양을 하고 있으며(도 18a), β-세포의 비율(도 18b 상단 패널), 췌도세포의 크기(도 18b 하단 왼편 패널) 및 췌도세포 수(도 18b 하단 오른편 패널)가 유의하게 높았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포(Spheroid) 및 췌도세포 클러스터(islet cluster)를 유효성분으로 포함하는 췌도세포(Islet) 이식을 위한 세포이식물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포의 직경 크기는 10 내지 500 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 세포이식물.
4. 제1항에 있어서, 상기 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포는 비-구형세포(non-spheroid)와 비교하여 CD14, CD34, CXCR4, CD14/CXCR4 또는 CD14/CD34를 과발현하는 것을 특징으로 하는 세포이식물.
5. 제1항에 있어서, 상기 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포 및 상기 췌도세포 클러스터(islet cluster)는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenegenic) 유래인 것을 특징으로 하는 세포이식물.
6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포이식물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 다음 단계를 포함하는 췌도세포 이식을 위한 세포이식물의 제조방법:
   (a) 골수 단핵세포(Bone Marrow Mononuclear Cells) 유래 구형세포(Spheroid)를 제작하는 단계;
   (b) 상기 구형세포 및 췌도세포 클러스터(islet cluster)를 혼합하여 세포이식물을 제조하는 단계.
9. 제8항에 있어서, 상기 단계 (b)의 세포이식물은 구형세포 및 췌도세포 클러스터(islet cluster)의 세포 혼합비가 1000:1 내지 10000:1의 세포수로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.

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