KR101796218B1 - 개의 체장 길이 예측용 snp 마커 및 이를 이용한 예측 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 개의 체장 길이를 예측할 수 있는 SNP 마커 조성물, 상기 SNP 마커를 이용하여 개의 체장 길이를 정확, 신속하게 판단할 수 있는 키트, 마이크로어레이 및 개의 체장 길이 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커를 활용하면, 신속하고 정확하게 개의 체장 길이를 예측할 수 있다.
Description
본 발명은 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 및 이를 이용한 개의 체장 길이예측 방법에 관한 것이다.
개의 체장은 앞가슴의 흉골(앞쪽 뼈) 끝에서 좌골 끝까지의 길이를 의미하고, 체고는 어깨뼈 맨 꼭대기에서 앞발이 지면에 닿는 곳까지의 길이를 의미한다.
개에서의 체장은 체고와 함께 대표적인 경제형질 중 하나로서 애견가들 사이에서는 외형상에 대한 선호도를 달리하기에 유전자 검사를 통한 조기 예측의 필요성이 대두되고 있다.
개의 형질에 대한 유전자 마커에 관한 선행문헌으로는 "분자육종에 의한 소형 삽살개 개발에 관한 연구 최종보고서“연구기관: 경북대학교, 2004년 농림부 주관)를 들 수 있다.
개의 체장 관련 유전자 마커를 이용하면, 체장 길이에 대한 애견가들의 선호도를 충족시킬 수 있고, 체장이 길거나 짧은 개체를 생산하기 위한 무분별한 번식을 제한할 수 있음으로써 반려견의 보호·복지정책에 일조함으로써 반려견 문화정착이 가능하며, 개의 체장 길이에 대한 관련된 유전자를 발굴함으로써 동물의 성장에 대한 학술적 가치와 의학적 기초정보를 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
이와 같은 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과, 개의 체장길이에 대한 관련된 유전자를 발굴함으로써 조기 진단을 위한 유전자 마커를 개발하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 SNP 마커를 이용한 개의 체장 길이를 조기에 예측할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 본 발명은 (a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (b) 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 2의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (c) 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 3의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (d) 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 4의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (e) 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 5의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (f) 서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 6의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (g) 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 7의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (h) 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 8의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (i) 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 9의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (j) 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 10의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (k) 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 11의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (l) 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 12의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (m) 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 13의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 (n) 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C이고, 상기 서열번호 14의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개의 체장 길이 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개의 체장 길이 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 a) 개로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및 b) 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계를 포함하는 개의 체장 길이 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 개의 체장 길이를 조기에 예측할 수 있어 체장 길이에 대한 애견가들의 선호도를 충족시킬 수 있는 효과를 도모할 수 있다.
또한, 체장이 길거나 짧은 개체를 생산하기 위한 무분별한 번식을 제한할 수 있음으로써 반려견의 보호·복지정책에 일조할 수 있고 반려견 문화정착이 가능하다.
나아가, 개의 체장 길이에 대한 관련된 유전자를 발굴함으로써 동물의 성장에 대한 학술적 가치와 의학적 기초정보를 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 본 발명은 (a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (b) 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 2의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (c) 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 3의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (d) 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 4의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (e) 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 5의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (f) 서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 6의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (g) 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 7의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (h) 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 8의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (i) 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 9의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (j) 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 10의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (k) 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 11의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (l) 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 12의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (m) 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 13의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 (n) 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C이고, 상기 서열번호 14의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개의 체장 길이 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 개의 체장 길이 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 a) 개로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및 b) 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 61번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계를 포함하는 개의 체장 길이 예측 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 단계 b)에서 상기 분리된 핵산 분자를 증폭한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 증폭된 유전자 산물을 정제하여 염기서열을 분석하거나, 본 발명의 SNP 마커와 혼성화하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 핵산 분자를 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서 혼성화란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다. 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다.
혼성화 정도를 검출하기 위해, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지물질로 표지될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 P32 또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 SNP의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인한 결과 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A인 경우; 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 G인 경우; 및 서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 C인 경우;로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 해당하면 체장이 상대적으로 긴 것으로 판단하는 방법을 제공한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예
1. 개에 대한 Canine 170K SNP chip 분석
개 50두의 혈액으로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, CanineHDBeadChip(Illumina, San Diego, CA, USA)를 이용하여 SNP 유전자형 분석을 실시하였다.
<실험 1일째 Amplification>
○ 재료 및 기구
1. 시약
2. 기구
Centrifuge, Vortex, Illumina Hybridization 오븐
○ 실험방법
1. MSA3 바코드를 붙인 MIDI plate (앞으로 MSA3 plate 로 표기)에 20ul의 MA1을 분주한다.
2. 4ul의 DNA를 MSA3 plate에 넣는다.
3. Lab tracking form에 DNA ID 와 옮긴 MSA3 plate의 위치를 적어둔다.
4. 4ul의 0.1N NaOH를 MA1 과 DNA 가 들어있는 MSA3 plate 각 well에 넣는다.
5. 96well cap mat을 이용하여 MSA3 plate를 덮고, 1600rpm에서 1분 동안 vortex한다.
6. 280×g에서 1분간 원심분리 한다.
7. 실온에서 10분간 반응시킨다.
8. 34ul 의 MA2를 샘플이 들어있는 MSA3 plate 각 well에 넣는다.
9. 38ul 의 MSM를 샘플이 들어있는 MSA3 plate 각 well에 넣는다.
10. Cap mat를 덮고 280×g에서 1분간 원심분리 한다.
11. 37℃의 Illumina Hybridization 오븐에서 20-24 시간 동안 반응시킨다.
(Amplification)
<실험 2일째 - Fragment>
○ 재료 및 기구
○ 실험방법
1. 오븐에서 plate를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리한다.
2. 25ul의 FMS를 샘플이 들어있는 각 well에 넣는다.
3. cap mat으로 MSA3 plate를 덮고 1600 rpm 1분 vortex 한다.
4. plate를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리한다.
5. 37℃ heat block에서 1시간 동안 반응시킨다.
<2일째 - Precipitation>
○ 재료 및 기구
○ 실험방법
1. Cap mat을 벗기고 25ul의 PM1을 샘플이 들어있는 각 well에 넣는다.
2. Cap mat을 덮고 1600rpm에서 1분간 원심분리 한다.
3. 37℃에서 5분간 반응시킨다.
4. plate를 꺼내어 50×g에서 1분 원심 분리한다.
5. Cap mat을 벗기고 155ul의 2-propanol을 샘플이 들어있는 각 well에 넣는다.
6. 새로운 cap mat을 이용하여 plate를 덮고 10번 뒤집어서 혼합한 뒤 4℃에서 30분 동안 보관한다.
7. 4℃, 3,000rpm에서 20분 동안 원심분리 후 즉시 원심분리기에서 MSA3 plate를 꺼낸다.
8. Cap mat을 즉시 제거하고 빠르게 뒤집어 상층액을 버린다.
9. 흡수성 패드(키친타올, 킴타올 등) 에 10회 정도 가볍게 두드린다.
10. 뒤집혀진 플래이트 그대로를 튜브렉에 올려놓고 1시간 동안 자연 건조시킨다.
<2일째 -
Resuspend
>
○ 재료 및 기구
○ 실험방법
1. 23ul의 RA1을 DNA pellet이 들어있는 각 well에 넣고, 남은 RA1은 XStain HD Bead Chip 용으로 보관한다(냉동보관).
2. MSA3 plate 에 foil seal을 올리고 heat-sealer block을 5초 동안 눌러 sealing한다.
3. 48℃의 Illumina Hybridization 오븐에서 1 시간 동안 반응시킨다
4. 1800rpm에서 1분간 vortexing 한다.
5. 280×g, 1분 원심분리 한다.
<2일째 - Hybridization>
○ 재료 및 기구
○ 실험방법
1. MSA3 plate는 95℃ heat block에서 20분간 denature 시킨다.
2. 20분 후 MSA3 plate를 heat block에서 꺼낸 후 실온에 30분 동안 두고 식힌다.
3. plate를 식히는 30분이 거의 다 되어갈 무렵 HybChamber에 HybChamber Gaskets을 끼운다.
4. 400ul의 PB2를 HybChamber에 있는 8개의 humidifying buffer reservoir에 넣고 HybChamber 두껑을 닫아 실온에 둔다.
5. 실온에서 30분 동안 DNA를 식히고 나면 MSA3 plate를 280×g, 1분 원심분리한다.
6. 보관중인 Chips을 하나씩 냉장고에서 가져와 chips 보장을 뜯고 HybChamber insert의 바코드 모양과 chips의 바코드부분을 맞춰서 놓은 후 멀티채널 피펫을 이용하여 샘플당 15ul씩 따서 chips의 양쪽 부분으로 샘플을 loading 한다.
7. 각 chips의 샘플 loading이 끝나는 대로 HybChamber에 넣고 다음 chips도 같은 방법으로 반복한다.
8. Chamber가 채워지면 chamber 뚜껑을 닫고 48℃의 Illumina Hybridization 오븐에 넣고 속도 5로 세팅하여 16-24시간 동안 반응한다.
<3일째 - Washing bead chips>
○ 재료 및 기구
1. 시약
2. 기구
- Multi-sample beadChip Alignment fixture
- Te-Flow Flow-Through chambers(black frames, spacers, glass back plate and clamps)
- Wash Dish
- Wash Rack
○ 실험방법
1. Hyb chamber를 Hybridization 오븐에서 꺼낸다.
2. Hyb chamber의 잠금 장치를 열고 chamber 속의 insert 한번에 하나씩을 꺼낸다.
3. 칩에 붙어 있는 Seal을 잡아당겨 칩으로부터 제거한다.
4. Seal이 제거된 칩은 Wash Rack에 꽂아 WB1 Wash dish에 담근다.
5. 모든 칩이 WB1 에 담기게 되면 Wash Rack을 dish에서 1분 동안 뺏다 넣었다 하는 방법으로 씻어 주고 PB1이 들어 있는 또 다른 Wash Dish에 Wash Rack을 옮겨 1분 동안 이 과정을 반복해 준다.
6. 다시 PB1 wash dish에 담근 후 Wash Rack을 dish에서 1분 동안 뺏다 넣었다 하는 방법으로 씻어 주고 PB1 이 들어 있는 또 다른 Wash Dish 에 Wash Rack을 옮겨 1분 동안 이 과정을 반복해 준다.
7. Washing 이 끝나고 나면 BeadChips Alignment fixture 에 back frame을 올리고 바코드 방향에 맞추어 칩을 한 장씩 올린 후 하얀색 부분과 분리한 투명한 부분의 스페이스를 Alignment fixture의 윗부분과 아랫부분에 맞춰 끼운다.
8. 스페이스를 올린 후 칩의 위쪽 부분(바코드가 없는 부분)에 Alignmet bar를 올리고 유리판의 끝이 bar 에 대게끔 유리판을 덮은 후 클립을 끼운다.
(Flow-through chamber assembly 완성)
9. 클립을 끼우고 나면 Alignment bar를 제거하고 Flow-through chamber assembly 양끝의 스페이스 부분을 가위로 잘라준다.
<3일째 -
XStain
Beadchips
>
○ 재료 및 기구
1. 시약
2. 기구
- Water circulator
- Chamber Rack
- Wash dish 2개, staining rack, tube rack
○ 실험방법
1. 챔버렉의 온도가 44℃가 되면 Flow-through chamber assembly를 챔버렉에 끼운다.
2. 각 chips에 150ul의 RA1을 넣고 30초 동안 반응시킨다. 이 과정을 5번 더 반복한다.
3. 450ul의 XC1을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
4. 450ul의 XC2을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
5. 200ul의 TEM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
6. 450ul의 95% formamide/1mM EDTA을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후 한번 더 넣어준다.
7. 5분 동안 반응시킨다.
8. LTM tube 의 라벨에 적혀 있는 온도를 확인하고 그 온도대로 챔버렉의 온도를 바꾸어 준다.
9. 450ul의 XC3을 각 칩에 넣고 1분 동안 반응시킨 후 다시 한번 넣어준 후 8번의 온도에 도달할 때까지 기다린다.
10. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
11. 450ul 의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시킨다.
12. 250ul의 ATM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
13. 450ul 의 XC3를 넣고 1분 후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시킨다.
14. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
15. 450ul 의 XC3를 넣고 1분후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시킨다.
16. 250ul의 ATM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
17 450ul 의 XC3를 넣고 1분후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시킨다.
18. 250ul의 LTM을 각 칩에 넣고 10분 동안 반응시킨다.
19. 450ul 의 XC3를 넣고 1분후 한 번 더 넣어준 후 5분간 반응시킨다.
20. 이 과정이 끝나면 즉시 Flow-through chamber에서 chamber Rack을 분리하고 실온의 실험 테이블로 옮긴 후 평평하게 꺼내어 놓는다.
21. 310 ml 의 PB1을 세척용기에 넣고 염색용 rack을 용기 안에 담가 놓는다.
22. 기구를 이용하여 chamber rack의 클립을 벗기고 유리블록을 들어서 제거한 후에 chips의 bead 부분이 건드리지 않게 양끝에 붙어 있는 스페이스를 제거한다.
23. 칩에 붙였던 부착물을 모두 제거하고 나면 PB1에 담겨있는 스테이닝렉에 꽃아 PB1에 담가둔다. 같은 방법으로 모든 chips을 처리한다.
24. 천천히 염색용 랙을 10번 정도 위 아래로 움직여서 칩을 담금질 한 후 5분 동안 담가둔다.
25. 다른 세척용 용기에 XC4 310ml을 채운 후 24번과 같은 방법으로 10회 동안 담금질 한 후 5분 동안 담가둔다.
26. 5분 후 세척용 용기에서 염색용 랙을 꺼낸 후 튜브렉에 다음 그림과 같은 방법으로 올려놓는다.
27. 집게를 이용하여 chips을 랙에서 조심스럽게 꺼내어 튜브렉 위에 올려놓는다.
28. Chips을 올려놓은 튜브렉을 조심스럽게 진공 건조기에 넣고 508mmHG (0.68 bar)의 진공 상태로 55-55분 동안 말려준다.
29. Chips이 건조된 것이 확인되면 에탄올에 적신 킴와이프를 이용하여 chip의 가장자리 부분을 잘 닫아 준다. 이때 bead 부분은 건드리지 않게 주의한다.
30. Beadchips은 실험 완료 후 72시간 이내에 Scanner를 이용하여 이미지화를 시키도록 한다.
개 50두에 대하여 고밀도 SNP 170K chip 분석을 통해 개의 체장 길이를 예측 가능한 SNP 14개를 선발하였으며, 이들에 대한 정보는 아래 표 1에서 보는 바와 같다.
본 발명은 고밀도 SNP 170K chip 분석을 통해 개의 체장 길이와 유의적으로 연관된 SNP 14개를 선발하여 이들을 이용한 유전자형 분석으로 개의 체장 길이를 조기 예측 가능케 하는 유전자 마커로 활용 가능할 것으로 사료된다. 기대 효과로는 개의 체장 길이에 대한 애견가들의 선호도를 충족시킬 수 있으며 개의 체장 길이가 길거나 짧은 개체를 생산하기 위한 무분별한 번식을 제한함으로 반려견의 보호·복지정책에 일조하여 반려견 문화정착을 가능하게 하며 개의 체장 길이에 관련된 유전자를 발굴함으로써 동물의 성장에 대한 학술적 가치와 의학적 기초정보를 확보할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> SNP marker for prediction of dog's body length and prediction
method using the same
<130> NPF-28988
<160> 14
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> Canis lupus familiaris
<400> 1
ttctygcatc ggattgcctg agaatgtggg tctaaggggg gctccgaagg ggcccatgtc 60
aattgttgct tatgccctcg gttcatttct acacctcctg ttgccaagta ctggactgat 120
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<212> DNA
<213> Canis lupus familiaris
<400> 2
gtcaggagtc catgacatgt aattaatgcc ccttttttcc cactggactc taaggacagg 60
aaacctgaat tgcctacaac tcccctttcc caaactgctg ctgtagcaag catgatgcat 120
a 121
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<212> DNA
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ggccactacc aaatggaagg ataatgagtg aygctgtgga ttcagggccc tagccgggtc 60
atggagcaag aatgcctgtt gatgtgcaca ctcaagaaag ctgatgctag aaaggggctc 120
a 121
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<212> DNA
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tcctactaaa aatccacaat agtcttctgt tccaagatga aatttaatta tctagtcatg 60
acacccaagg ctcttcacac tgtcattgta atccaacttt tcagcctcct gtctgtttta 120
c 121
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<212> DNA
<213> Canis lupus familiaris
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aaagggggac atttttcctt ttctaacata gccaggagat aaaaaggcca gatagcatgt 120
t 121
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<212> DNA
<213> Canis lupus familiaris
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aattcaaata actgacccta tgtgggcttc tactgaacgg ggtctaagtg ccagagccaa 60
aagctatttg catgcagttt tgcttcccca gaccagagac tgaggttcag gacatctcat 120
a 121
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<213> Canis lupus familiaris
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atgttacaaa ttaggtttgc tgtcctatag gataatgaca aaccacaaag ctagaaacct 120
g 121
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aagctcctca gatatgttag ctcaagggtc cccacagtcc ccccgcgagg caggagattg 60
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cctttgtgat cttgcatttg gcaggtttta gggagcatga gctactttta agaaagtcat 60
aaacatttcc acactgaatg ttgagttgct gatttctact cactctgtct tttccycctc 120
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Claims (7)
- 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 8의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 9의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 11의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 12의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 13의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 14로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 C이고, 상기 서열번호 14의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;를 포함하는, 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 조성물. - 제1항에 있어서,
서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 2의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 3의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 4의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 5의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 6의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 7의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 61번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 10의 내부의 염기서열로써 61번째 염기를 포함하는 5 내지 121개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는, 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 개의 체장 길이 예측용 SNP 마커 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는 개의 체장 길이 예측용 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는 개의 체장 길이 예측용 마이크로어레이.
- a) 개로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및
b) 서열번호 8, 9, 11, 12, 13, 및 14의 폴리뉴클레오티드의 61번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계를 포함하는 개의 체장 길이 예측 방법. - 제6항에 있어서,
상기 단계 b)는 상기 분리된 핵산 분자를 증폭하여 확인하는 것인, 개의 체장 길이 예측 방법.
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| Genome Research, Vol. 23, pp. 1985-1995 (2013.09.11.) |
| PLOS Genetics, Vol. 7, Issue 10, pp. e1002316 (2011.10.13.) |
| 한국삽살개재단, 고전 및 분자 육종기법을 적용한 삽살개 품종 정립 및 세계적 산업화에 관한 연구 (2011.12.23.)* |
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