KR101771218B1

KR101771218B1 - 과립구 대식세포-콜로니 자극인자를 함유하는 구강청정제 조성물

Info

Publication number: KR101771218B1
Application number: KR1020100072013A
Authority: KR
Inventors: 박윤제; 한규범; 천용강; 신윤철; 윤창구; 김종기; 이성진
Original assignee: 주식회사 차메디텍
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2010-07-26
Publication date: 2017-08-25
Also published as: KR20120010460A

Abstract

본 발명은 구강청정제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 과립구 대식세포-콜로니 자극인자(GM-CSF)와 살균제를 유효성분으로 함유하고 면역활성 증강 효과를 갖는 구강청정제 조성물에 대한 것이다.

Description

과립구 대식세포-콜로니 자극인자를 함유하는 구강청정제 조성물{ORAL CLEANSING COMPOSITION CONTAINING GRANULOCYTE MACROPHAGE-COLONY STIMULATING FACTOR}

구강청정제는 구강의 청결을 위해 사용하는 의약부외품으로서, 주로 식사 후에 양치 대용으로 사용되고 있는데, 환부에서 나오는 삼출물, 점액, 이탈한 세포 또는 음식물 찌꺼기 등의 세척, 배출, 소독 등을 통해 구강 내 환경을 청결하게 만들고, 음식물로 인한 구취를 막을 수 있으며, 구강 내 상처에 의한 2차 감염을 막는 데 효과적인 것으로 알려져 있다.

구강청정제는 구강악취 제거 외에도 구강 내 살균 소독을 돕고 인후염, 후두염, 호흡기 내 세균 예방에 효과적이어서, 구취를 예방하고 입속 유해균을 억제하는 등 광범위한 구강질환 치료제 역할까지 겸하는 생활용품으로서, 구강청정제에 포함된 자극성이 약한 생리식염수를 비롯한 알콜과 소독효과가 있는 항생물질 등의 주성분이 입안에 남아 구강 내 조직들이 병적으로 변화하는 것을 방지하고 상처치유를 돕는 것으로 알려져 있다.

그러나 대부분의 구강청정제에는 구취의 원인 물질인 황화물 메틸머캡탄을 제거하고 불수용성인 활성성분을 녹이기 위해 알콜이 함유되어있는데, 이는 구강 건조증을 유발하는 원인이 되고 있다.

또한, 구강청정제를 과도하게 사용하면 이로운 균들을 죽여 구강 내 면역력을 떨어뜨리고 치주염과 충치를 유발할 수 있다고 보고되고 있으며, 이 외 항균제인 클로로헥시딘 성분이 일정량 이상 들어간 구강청정제액을 장기간 사용하면 치아와 잇몸이 변색되고 미각이 마비되는 경우도 있다.

시판되고 있는 대부분의 구강청정제는 알콜 성분이 6.0% 내지 35.0% 함유되어 있고, 치과에서 처방하는 구강청정제 중에는 진한 농도의 구강청정제액이 있어 그대로 사용하면 입속 점막을 자극하고 염증을 일으킬 수 있으므로 반드시 물과 희석해 사용해야 한다. 실제로 염화세틸피리디늄(CPC)이 들어있는 구강청정제의 경우에는 항균작용을 하는 성분이 매우 취약해 구취 해결도 어려울 뿐 아니라, 자주 사용하는 경우에는 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다.

종래의 구강청정제는 보통 알콜이 주성분이고, 살균소독제로서 염화벤제토늄(benzethonium chloride, 약전)이나 염화세틸피리디늄(cetylpyridinium chloride)이 포함되어 있는데, 특히 염화벤제토늄은 맛의 거부감이나 구강 조직의 변색이 없고 살균효과가 뛰어나 치주질환, 충치 등의 원인이 되는 세균들의 성장을 효과적으로 억제시킨다.

그러나, 상기 살균소독제가 입 안에 존재하는 여러 세균을 박멸하고 유해요소들을 소독하는 것으로 알려져 있지만, 최근 이들에 대한 여러 가지 부작용과 위험성들이 보고되고 있다. 호주 멜버른 대학의 마이클 맥컬로프 교수는 구강청정제의 높은 알콜 지수가 구강암을 더 쉽게 유발할 위험이 있으며, 구강청정제에 함유된 알콜 성분은 암 유발 물질이 입 안의 세포로 더 쉽게 침투하도록 도와 준다고 보고하였다(Australian Dental Journal, 2009). 또한, 2009년 브라질에서 진행된 연구 역시 일부 구강청정제를 사용하면 음주, 흡연 여부와 상관없이 구강암이 증가했다는 연구결과를 발표하였다. 2008년 Journal of Occupational Medicine and Toxicology에 발표된 논문에서는 구강청정제에 포함된 성분의 안전성에 대한 의혹을 제기한 바 있다.

실제로 알콜성 구강청정제는 입안에 오래 머물기 때문에, 더욱 해로울 수 있으며 구강에 오래 머무는 알콜 성분은 유해한 화학물질인 아세트알데히드로 산화되어 발암 요인이 된다. 최근 경희대학교 구강내과의 한 연구는 구강청정제에 의해 구강의 면역체계가 무너질 수 있다고 보고하였다.

결과적으로, 구강청정제를 장기간 남용하면 구강 내 정상적인 세균 세포가 변화하거나 특정세균이 억제되어 곰팡이가 과다 성장하게 되고, 입안에서 강력한 면역작용을 하는 침에 의한 방어벽이 알콜에 의하여 무너져 구강 칸디다 증 등 예기치 못한 질환이 발생할 수 있다.

특히, 구내염은 암환자의 방사선 치료 및 항암제 치료 후 나타나는 가장 흔한 부작용으로서, 암 자체나 치료에 따르는 다양한 스트레스의 생리적인 효과로 인하여 구강점막에 염증성 궤양반응이 나타난다.

암 진단을 받은 환자의 40%에서 질병이나 치료로 인한 구강합병증이 발생한다. 구내염이 발생하면 입안 또는 목안의 점막이 빨갛게 부어오르며 침을 삼키기 힘들 수도 있고, 염증이 생기거나 헐어서 통증을 유발할 수 있다. 구강통증의 결과로 인하여 환자는 음식을 섭취하고 삼키거나 구두장애로 인하여 구두 의사소통에 있어서 상당한 어려움을 겪게 된다. 또한, 구강 통증에 따른 식욕부진과 체중감소를 동반해 암 환자들의 생존율을 저하시킨다.

상처(창상) 치유 과정에는 일련의 생화학적, 물리학적 작용은 물론 다양한 종류의 세포들이 관여하게 된다. 상처 유발 후 혈관이 확장되고 모세혈관 삼투압이 증가함에 따라 백혈구들이 상처부위로 이동하는데, 주로 호중구와 대식세포가 감염된 조직이나 세포성 물질들을 제거하고 상처 가장자리부터 표피화가 시작된다.

상처 치유 과정은 응고, 염증 혹은 손상 조직과 같은 일련의 과정을 거친 후에 세포증식, 이동, 혈관생성, 세포외기질 합성 및 축적의 순으로 재표피화(reepithelialization)되고 재구성됨으로써 종결된다. 이러한 과정은 세포간 상호작용이 필수적이며, 이러한 상호작용은 사이토카인(cytokine)이나 성장인자가 세포 표면의 수용체들과 결합함으로써 시작된다(Brem et al., 2008).

GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor)는 골수 내 전구 세포(progenitor cell)들을 자극하여 과립구 및 대식세포로 발달하도록 하며, 127개의 아미노산들로 구성되어 있는, 분자량 23kDa 정도의 당단백질 성장인자이다(Kaplan et al., 1992; Bussolino et al., 1994; Hill et al., 1995).

GM-CSF의 구조는 2개의 분자간 이황화 결합이 있으며, 4개의 α-헬릭스와 2개의 가닥(strand)이 역평행(antiparallel)한 β-쉬트로 구성되어 있고, O-당화 부위와 N-당화 부위가 2개 존재하며, 대식세포, T 림프구, B림프구, 섬유모세포, 각질형성세포, 골모세포, 비만세포 등에서 만들어지고, GM-CSF에 의한 신호전달 경로(signaling pathway)는 JAK-STAT 경로와 MAP 키나아제 경로가 알려져 있으며, 이를 통해 세포의 생존과 분화 그리고 기능발현을 유도한다. 즉, GM-CSF는 골수 내 전구들을 자극하여 과립구 및 대식세포로 발달하도록 하며, 세포자멸(apoptosis)을 저해하여 조혈 집락형성 세포의 생존과 증식, 분화를 조절하고, 호중구, 호산구와 단핵구-대식세포(monocyte-macrophages)의 기능 활성을 촉진한다.

또한, GM-CSF는 호중구의 강력한 유인인자로서 대식세포와 호중구의 미생물사멸작용, 산화적 대사, 대식 작용을 증가시키고, 각질세포(keratinocyte)를 증식시켜 표피를 재생시키고, 표피의 랑게르한스 세포와 골수의 수지상세포를 성숙시키기도 한다. GM-CSF는 피부 손상 직후 각질세포(keratinocyte)에서 분비되어 자가분비(autocrine) 방식으로 표피세포의 증식을 촉진함으로써 상처회복을 도와주는 다기능(pleitropic) 사이토카인이다(Braunstein et al., 1994; Malik et al., 1998).

원래 GM-CSF는 주로 수술 후 면역항진제로 사용되어 왔으나, 다른 여러 기능이 발견되면서 나병 환자나 화상환자의 표피재생을 위해 사용되기도 하며, 특히GM-CSF의 국소 적용은 만성적 피부궤양과 같이 치유가 어려운 환자들의 상처회복에 도움을 주는 것으로 보고되었다.(Fararh et al, 2005).

한편 재조합 GM-CSF는 림프구, 효모, 단핵구, 섬유모세포, 식물세포, 동물세포 등 여러 가지 세포를 숙주로 이용하여 생산되어 왔으나, GM-CSF처럼 당을 포함한 당단백질의 경우 당화(glycosylation)의 정도는 물질의 안정성과 효과의 지속성에 관련되어 있는 것으로 알려져 있고, hGM-CSF에서는 특히 N-당화가 중요한 역할을 하고 있다(Kim et al., 2008). 단백질에 N-당화가 많이 되어 있으면 hGM-CSF의 반감기를 연장시키는 역할을 하는데, 식물이나 효모에서 재조합 되어 생산된 GM-CSF는 대장균 유래 GM-CSF에 비해 당사슬이 매우 풍부한 것으로 분석되어 생체 내에서 안정성과 지속성이 높게 나타나고 있다.

본 발명자들은 이러한 GM-CSF의 특징을 이용하여 전술한 종래의 구강청정제의 단점을 극복하기 위한 구강청정체를 개발하고자 연구한 결과, 이러한 GM-CSF의 면역활성을 증가시키는 기능을 활용함으로써, 면역활성이 증강된 GM-CSF를 함유하는 구강청정제 조성물을 개발하였다. 본 발명의 구강청정제 조성물은 의약부외품인 구강청정제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 구강청정제 조성물은, 다양한 면역활성 증강효과를 가진 GM-CSF를 구강청정제에 첨가함으로써 종래의 구강청정제의 면역활성 감소 효과를 상쇄하는 고기능 면역활성 증강 효과를 갖는다.

본 발명의 구강청정제에 포함되는 GM-CSF는 종래의 구강청정제 성분, 특히 살균제와 혼합되어 있는 상태에서도 GM-CSF의 역가가 유지되는 특성이 있다.

본 발명의 기본적인 목적은 과립구 대식세포-콜로니 자극인자(GM-CSF)와 살균제를 유효성분으로 함유하고 면역활성 증강 효과를 갖는 구강청정제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 기본적인 목적은 과립구 대식세포-콜로니 자극인자(GM-CSF)와 살균제를 유효성분으로 함유하고 면역활성 증강 효과를 갖는 구강청정제 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

전술한 바와 같이, 종래의 구강청정제에 함유된 알콜, 항생물질 등은 구강건조증, 치주염, 충치, 치아와 잇몸의 변색은 물론 암을 유발할 수도 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서, 본 발명의 구강청정제 조성물은 구강 내의 표피세포증식 효과가 있고 면역 활성을 증가시키는 GM-CSF를 사용한다.

그런데 GM-CSF는 단백질이기 때문에 구강청정제와 혼합되었을 때, GM-CSF의 역가가 유지되어야 하며, GM-CSF 외의 구강청정제 성분의 항균 효과도 유지되어야 한다.

본 발명자들은 GM-CSF와, 구강청정제에 사용될 수 있는 항균제를 유효성분으로 하는 신규한 구강청정제 조성물을 개발함으로써, GM-SCF의 면역 활성 증진 효과와 항균제의 항균 효과가 유지되어, 면역 활성을 증진시키는 구강청정제 조성물을 완성하였다.

본 발명의 구강청정제 조성물에 사용되는 상기 GM-CSF는 천연 GM-CSF 또는 재조합 GM-CSF일 수 있다. 또한 상기 재조합 GM-CSF는 벼와 같은 식물, 인간과 같은 동물, 대장균과 같은 세균, 또는 효모와 같은 균류로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 구강청정제 조성물에 사용되는 상기 살균제는 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄 또는 온크로민 옥사이드 M인 것이 바람직하다. 이러한 살균제들은 GM-CSF의 면역세포성장 효과를 저해하지 아니한다.

본 발명의 구강청정제 조성물은 가글액과 같이 구강 세척제, 구강 분무제 또는 치약과 같은 페이스트의 형태인 것이 바람직하다. 이는 이러한 형태가 사용이 편리하기 때문이다.

본 발명의 구강청정제 조성물에 있어서, 상기 GM-CSF의 함량이 5 pg/ml 내지 1 mg/ml인 것이 바람직하다.

본 발명의 구강청정제 조성물은 면역활성 증강 효과를 보다 더 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 구내염의 치료 효과까지 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 2의 GM-CSF가 포함된 구강청정제의 구내염 개선효과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 실시예 3의, TF-1에 대한 몇 가지 시판 중인 구강청정제의 면역 세포독성 실험 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 실시예 5의, 구강청정제의 최적 GM-CSF 농도 결정 실험에 대한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 6의, GM-CSF가 포함된 구강청정제의 면역활성 안정성 실험 결과이다(GM-CSF 농도 100 ng/ml).
도 5는 본 발명의 실시예 6의, GM-CSF가 포함된 구강청정제의 면역활성 안정성 실험 결과이다(GM-CSF 농도 200 ng/ml).
도 6은 본 발명의 실시예 7의, 구강청정제에 사용되는 항균제 성분액에 첨가된 GM-CSF의 안정성 시험 결과이다(GM-CSF 1000 ng/ml 농도).
도 7은 본 발명의 실시예 7의, 구강청정제에 사용되는 항균제 성분액에 첨가된 GM-CSF의 안정성 시험 결과이다(GM-CSF 200 ng/ml 내지 400 ng/ml 농도).

이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

GM - CSF 준비

GM-CSF로서 재조합 인간 GM-CSF를 사용하였다. 효모 유래 재조합 인간 GM-CSF와 대장균 유래 재조합 인간 GM-CSF는 시중에서 구입하여 사용하였고, 식물 유래 재조합 인간 GM-CSF는 직접 제조하여 사용하였다.

GM - CSF 의 활성 측정 방법

GM-CSF의 생체내의 주된 역할은 면역세포를 모으고 증식시키는 역할이고, 실제 in vitro 효과는 세포 기반의 측정법(cell-based assay)를 사용한다. 본 발명에서도 구강청정제의 면역증강 효과를 측정하기 위하여 GM-CSF의 활성 측정 방법과 같은 방법인 면역계 림프세포인 TF-1 세포를 활용하여 면역활성을 측정하였다.

미국세포주은행(ATCC)에서 인간 TF-1 세포주(CRL-2003)를 분양받아 즉시 10% (v/v) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, US origin)이 포함된 RPMI-1640 배지에 현탁하여 1,140 rpm에 6분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고 남은 침전물(pellet)을 동일 배지로 재현탁하여 단일 세포로 부유시킨 후, 배지와 함께 배양 용기에 접종하였다. 배양 용기는 공기 95%, 이산화탄소 5%, 37℃ 온도 조건하에서 10일간 배양하였으며, 3일마다 동일 배지로 교환하였다. TF-1의 세포 성장률 확인을 위해 Trypan blue solution(0.4%)으로 염색하고 hemocytometer를 이용하여 3일마다 세포수를 측정하였다. 활성 측정 시험에 앞서 배양 중인 TF-1 세포 중 일부를 1,140 rpm에 6분간 원심 분리하고, 5%(v/v) 소태아혈청이 포함된 RPMI-1640 배지로 재현탁하여 5x10⁴개/ml 농도로 준비하였다.

생물학적 활성 측정을 위해 국제 표준(International Standard) 재조합 GM-CSF(88/646, 10,000 IU//ml)를 영국 국립생물의약품표준화연구소에서 분양받아 분석 샘플 용액과 평행 분석법을 이용하여 GM-CSF의 활성을 측정하였다. 실험 전, 5%(v/v) 소태아혈청이 포함된 RPMI-1640 배지로 분석가능한 농도로 희석하여 사용하였다.

생물학적 활성 분석을 위한 96웰 플레이트를 준비하여 실험 웰에 5%(v/v) 소태아혈청이 포함된 RPMI-1640 배지를 100 ㎕ 첨가하고, 2번 열에는 동일 배지를 추가로 100 ㎕ 첨가하여 총 200 ㎕ 부피로 맞추었다. 표준품 분석 실험 행의 2번 웰에는 사전에 희석하여 준비된 국제 표준 재조합 GM-CSF를 15 ㎕ 첨가하여 최종 농도가 2.5 ng/㎖ 되게 하고, 분석 샘플 용액 실험 행의 2번 웰에는 분석 샘플 용액을 15 ㎕를 첨가한 다음 모든 분석 실험 행 2번 웰을 시작으로 11번 웰까지 multi-pipette을 이용하여 2배씩 희석(2 fold dilution method)을 하였고, 마지막 웰에서 회수한 100 ㎕의 용액은 버렸다. 모든 분석 실험 행의 2~11번 웰과 대조군 실험 행의 2~4번 웰에 각각 준비된 TF-1 세포주(5x10⁴개/ml) 100 ㎕를 multi-pipette을 이용하여 첨가하였고. 대조군 실험 행의 2~4번 웰에 5%(v/v) 소태아혈청이 포함된 RPMI-1640 배지 200 ㎕를 첨가하였다. 해당 96웰 플레이트를 공기 95%, 이산화탄소 5%, 37℃ 온도 조건하에서 3일간 배양하였으며, 3일 배양 후 배양액이 들어 있는 웰 당 배지 볼륨 20%의 MTS 시약(Promega사)을 넣고 벽면에 배지와 세포가 묻지 않도록 플레이트를 약하게 쳐주면서 섞었다. 추가로 공기 95%, 이산화탄소 5%, 37℃ 온도 조건하에서 4시간 동안 배양하여 Microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 Stegmann Systems사의 Parallel-Line Assay 2.0 program을 이용하여 2D 그래프로 도식화한 후 평행선 분석법을 이용하여 계산된 표준액과 분석 샘플 용액의 비역가(Relative Potency, RP) 값을 이용하여 분석 샘플 용액의 GM-CSF의 국제 표준 생물학적 활성(International Unit)을 측정하여, RP값이 1.0일 경우 표준액과 비교하여 생물학적 활성이 같다고 판정하였으며 0.5일 경우 표준액과 비교하여 생물학적 활성이 1/2이라고 판정하였다.

실시예 1. 식물 유래 GM - CSF 제조

식물 유래 GM-CSF를 제조하기 위한 식물세포주 배양에는, 비타민이 포함된 CHU N6를 기본배지로 하여 탄소원으로서 자당 3%, 2.4-D 2 ppm, 키네틴(Kinetin) 0.2 ppm 및 하이그로마이신(hygromycin) 50 ppm을 포함하고 pH 5.8인 액체 배지를 사용하였다.

1차 배양은 삼각플라스크에서 사용하였으며, 배양 부피는 삼각플라스크 전체 부피의 20%를 최종 배양 부피로 하였다. 배지의 최종 부피의 3±0.5 %(w/v) 비율로 세포를 접종한 후, 배양 온도 28℃, 교반 속도 120 rpm 및 암(暗) 조건으로 유지하며 7 일간 배양하였다.

2차 배양에는 20 l의 공기부양식 생물반응기(air lift bioreactor)를 사용하였으며, 배양 조건은 온도 28℃, 공기 유량 0.1 vvm 내지 0.2 vvm 및 암 조건으로 하였다. 최종 배양액 부피 5 l 내지 10 l로 하여 삼각 플라스크에서 배양된 세포를 3±0.5 %(w/v) 비율로 접종하여 7일간 배양하였다.

7일간 배양한 후 배양된 세포 배양액을 제거하였고, 자당을 제거한 새롭게 조성된 배양액을 첨가하여 11일간 유도(induction)한 후 수집(harvest)하였다. 필터를 사용하여 수집된 세포 배양액으로부터 세포를 제거하였고, 세포 배양액을 0.45 μm 필터로 불순물을 제거하였으며, 5 K 막(membrane)을 사용하여 농축하였다. 그 후, 염을 제거하고, 평형 완충용액(sodiume Phosphate, pH 7.4)을 사용하고 염화나트륨에 대하여 상향 농도구배를 갖는 DEAE 이온교환수지를 사용하여 용출시켰으며, 용출액을 5 K 막을 사용하여 농축하였고, pH를 5.0으로 조정하여 불순물을 제거하였다.

HiScreen Phenyl FF 소수성 수지를 사용하여 암모늄 설페이트 평형 완충용액을 pH 7.2 조건으로 암모늄 설페이트가 하향 농도 구배를 갖도록 하여 용출시켰으며, 용출액을 5 K 막을 사용하여 농축하였고, Sephacryl S-200 수지를 이용하여 PBS 완충용액 상태에서 겔 여과(gel filtration)하여 순도를 높였다.

용출된 GM-CSF를 5 K 막을 사용하여 최종 농축하였고, 0.22 μm 필터를 사용하여 제균하였으며, PBS 완충용액으로 GM-CSF의 농도가 1 mg/ml가 되도록 제조하여, 바이알(vial)에 충진하여 동결건조하였다.

실시예 2. GM - CSF 를 포함하는 구강청정제의 구내염 치료 효능 - 동물 시험

GM-CSF가 포함된 구강청정제의 구내염 치료 효능을 알아보기 위하여 시중에 판매되고 있는 한미약품의 케어가글 구강청정제(주성분: 벤제토늄염화물)에 식물유래 GM-CSF와 효모 유래 GM-CSF를 각각 5 μg/ml 농도로 첨가하여 GM-CSF가 포함된 구강청정제를 제조하였다. 실험동물은 일정한 조건에서 사육된 6주령의 평균체중 100g 내외의 햄스터(Syrian hamster)를 7일간 순화 후 사용하였다. 햄스터 구내염을 유발시키기 위하여 실험 시작시와 2일에 60 mg/kg의 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 중외제약)을 복강 주사하였다. 실험 시작시와 1일에 햄스터를 마취하고 거즈의 면적을 동일하게 표시한 후, 상기 거즈를 햄스터 구강에 부착하고 지름 1.5cm의 원모양을 표시하여 해당하는 면적부분을 23번 및 26번 게이지 니들로 상처를 발생시키고 구강에서 거즈를 제거하였다. 구내염 발생 면적은 1cm²이었으며, 구내염 발생 후 3일 내지 14일 동안 햄스터를 매일 마취하고 구강에 거즈의 면적을 동일하게 잘라서 삽입한 후, GM-CSF가 5 μg/ml 농도로 첨가된 구강청정제 0.2 ml를 거즈에 적셔 주었다. 이때 실험군은 식물 유래 GM-CSF 구강청정제와 효모 유래 GM-CSF 구강청정제를 각각 0.2 ml 씩 처리하였고 대조군은 아무것도 첨가하지 않은 구강청정제를 적셔주었다. 마취가 풀리는 3시간 후에 햄스터 구강에서 거즈를 제거하였다.

햄스터 구내염 치료 효능을 확인하는 방법으로는, 햄스터를 마취하고 구강을 벌려 동일 거리에서 사진을 찍은 후 구강 내 염증 부위의 면적을 측정하였다

실험 결과 5일째 측정한 실험동물의 구내염 면적은 식물유래 GM-CSF가 첨가된 구강청정제를 처리한 경우 GM-CSF가 첨가되지 않은 구강청정제만 처리한 대조군에 비교하여 약 1/2배로 작았으며, 효모유래 GM-CSF가 첨가된 구강청정제를 처리한 경우에도 구내염의 면적이 식물 유래 GM-CSF를 처리한 경우보다 크기는 하였으나 대조군의 1/2 정도되는 유사한 결과를 나타내었다. 또한, 8일째 구내염의 면적을 측정한 결과 그 면적은 5일째에 비해 급격히 감소하여 상처가 많이 치유되었음을 알 수 있었고, 이 때에도 역시 GM-CSF가 첨가된 구강청정제를 처리한 실험동물의 구내염 면적이 대조군에 비해 훨씬 줄어든 것을 확인하였다. 이러한 결과는 GM-CSF가 첨가된 구강청정제의 경우 용액에 포함된 GM-CSF에 의해 면역활성이 증가되어 구내염의 치료효과가 나타나는 것으로 볼 수 있으며, 이로 통해 볼 때 GM-CSF가 살균제가 포함된 구강청정제에서도 면역활성을 여전히 나타낸다는 것을 알 수 있다. 또한, 식물 유래의 GM-CSF나 효모 유래의 GM-CSF에 관계 없이 GM-CSF가 첨가된 구강청정제에서는 모두 대조군보다 빠른 구내염 치료효과를 보임으로써 GM-CSF의 종류에 관계없이 살균제가 포함된 구강청정제에서 GM-CSF의 활성이 나타난다는 것을 알 수 있다(도 1 참조).

실시예 3. GM - CSF 가 첨가되지 아니한 구강청정제의 면역 세포독성 측정

시중에 판매되는 구강청정제(가그린, 동아제약, 대한민국; 덴탈쿨링시시템, LG생활건강, 대한민국; 케어가글, 한미약품, 대한민국; 센스타임, 일동제약, 대한민국)의 면역 세포독성을 측정하기 위하여 구강청정제가 첨가된 배양액에 인간 면역 관련 세포주인 TF-1을 배양하였다. 케어가글(주성분: 벤제토늄염화물)의 경우 배지 볼륨 대비 1.3% 이상 첨가한 경우 대조군에 대비하여 TF-1 세포증식이 억제되었고, 덴탈 쿨링 시스템(주성분: 잔트)의 경우 0.6%만 첨가한 경우에도 대조군에 대비하여 TF-1의 세포 증식이 매우 많이 억제됨을 확인하였다. 이는 현재 시판되고 있는 구강청정제가 면역세포에 대한 세포독성을 가지고 있음을 나타낸다(도 2 참조).

실시예 4. GM - CSF 가 첨가된 구강청정제의 in vitro 면역 활성 측정

GM-CSF가 첨가된 구강청정제의 면역활성을 측정하기 위하여 시중에서 구입한 구강청정제에 식물 유래 GM-CSF를 1 mg/l 농도로 첨가한 후 상기 "GM-CSF의 활성 측정 방법"을 이용하여 구강청정제에 미치는 GM-CSF의 영향을 확인하였다. 식물 유래 GM-CSF는 비활성도(specific activity)가 4,670,000 IU/mg인 것을 사용하였다. GM-CSF를 각각의 구강청정제에 첨가 후 면역활성을 측정해 본 결과 GM-CSF가 첨가된 한미약품 케어가글(주성분: 벤제토늄염화물)은 4,040 IU/ml(n=2)의 활성이 측정되었으며, GM-CSF가 첨가된 LG생활건강 덴탈쿨링 구강청정제(주성분: 잔트)는 1,290 IU/ml(n=2)의 활성이 측정된 반면, 대조군인 아무 것도 첨가되지 않은 구강청정제에서는 아무런 활성이 나타나지 않았다. 이것은 구강청정제에 첨가된 식물 유래 GM-CSF로 인해 면역 세포의 세포 성장률이 증가되었음을 나타내며, GM-CSF가 첨가된 구강청정제가 면역활성을 나타낸다는 것을 의미한다.

GM-CSF가 첨가된 다양한 구강청정제의 면역 활성

구강청정제	케어가글	덴탈쿨링시스템	대조군
면역활성	4,040±808 IU/ml	1,290±258 IU/ml	0 IU/ml

또한, GM-CSF의 종류별로 면역활성이 유지됨을 확인하기 위해 시중에서 구입한 구강청정제인 케어가글에 식물 유래 GM-CSF, 효모 유래 GM-CSF 및 대장균 유래 GM-CSF를 각각 1 mg/l, 100 μg/l, 100 μg/l씩 첨가하여 면역활성이 나타나는지 확인하였다. 그 결과 각각의 다른 GM-CSF가 첨가된 구강청정제에서 정도의 차이는 있지만, 모두 면역활성을 나타냄을 확인하였다. 또한, 첨가된 GM-CSF의 농도가 증가함에 따라 면역활성이 증가됨을 확인하기 위해 효 모유래와 대장균 유래 GM-CSF를 각각 100 μg/l와 200 μg/l 농도로 첨가한 구강청정제의 면역활성을 측정하였다. 그 결과 효모 유래 GM-CSF가 첨가된 구강청정제의 경우 100 μg/l가 첨가된 경우엔 436IU/ml, 200 μg/l 가 첨가된 경우엔 10,14IU/ml를 나타내어 약 2배 정도 증가하는 것을 보여주었고, 대장균 유래 GM-CSF가 첨가된 구강청정제의 경우에도 100 μg/l가 첨가된 경우엔 294IU/ml, 200 μg/l 가 첨가된 경우엔 632IU/ml를 나타내어 역시 약 2배 정도 증가하는 것을 보여주었다. 이는 구강청정제에 GM-CSF가 첨가될 경우 그 농도에 의존하여 면역활성이 나타남을 의미한다.

GM-CSF의 종류에 따른 GM-CSF가 첨가된 구강청정제의 면역 활성

GM-CSF의 종류 및 농도	면역활성
벼 유래(1 mg/l)	4,040±808 IU/ml
효모 유래(100 μg/l)	436±139 IU/ml
효모 유래(200 μg/l)	1,014±324 IU/ml
대장균 유래(100 μg/l)	294±105 IU/ml
대장균 유래(200 μg/l)	632±221 IU/ml

실시예 5. 구강청정제에 첨가되는 GM - CSF 의 농도 결정

구강청정제에 첨가되는 GM-CSF의 최소 농도를 결정하기 위하여 시중에서 구입한 케어가글(한미약품)에 식물 유래 GM-CSF를 첨가하여 면역활성이 나타나는 최소농도를 측정하였다. 첨가된 식물 유래 GM-CSF가 면역증강 효과를 나타내는 GM-CSF 농도를 결정하기 위해 면역 관련 세포주 TF-1에 2.5 ng/ml부터 2배씩 희석하여 구강청정제에 첨가한 다음 농도별로 처리 한 결과, 최대 2.5 ng/ml 농도부터 최소 5 pg/ml 농도까지 면역세포의 증식이 일어남을 확인하였다. 생물학적 활성 실험에서 구강청정제 용액은 배지에 20배 희석됨을 감안하여 후에 측정 가능한 완제품의 GM-CSF농도는 최소 50 ng/ml 이상으로 제조되어야하며, 실제로 세포에 활성을 줄 수 있는 GM-CSF 농도는 최소 5 pg/ml인 것으로 확인되었다. 따라서 구강청정제에 첨가되어 면역활성을 나타내는 GM-CSF의 농도는 5 pg/ml 내지 1 mg/ml으로 결정하였다(도 3 참조).

실시예 6. GM - CSF 가 포함된 구강청정제의 면역활성 안정성 실험

구강청정제에 첨가된 GM-CSF의 안정성에 따라 구강청정제의 면역증강효과가 달라지므로 첨가된 GM-CSF가 얼마나 오랫동안 유지되는지 확인하였다.

시중에 판매되고 있는 한미약품의 케어가글 구강청정제에 숙주별로(식물(벼), 효모, 대장균) 생산된 GM-CSF를 100 ng/ml과 200 ng/ml 농도로 각각 첨가하고 상온(25℃)에서 12주간의 생물학적 활성의 변화를 확인하였다. 각 실험 샘플의 초기 활성을 100%로 잡고 기간에 따른 활성의 변화를 측정해본 결과 생산된 숙주에 따라 경향이 약간씩 다르게 나타났다. 식물 유래 GM-CSF가 포함된 구강청정제의 경우 초기엔 급격한 활성 감소하였으나 시간이 지남에 따라 유지되었고, 대장균과 효모 유래 GM-CSF가 포함된 구강청정제의 경우에는 시간에 따라 천천히 활성이 감소하였다. 시간이 지남에 따라 각 숙주별로 생산된 GM-CSF의 면역활성은 점차 감소하였지만, 일정한 수준의 면역활성은 계속 보유하고 있었으며, 12주차에 측정된 최종 생물학적 활성은 50~350 IU/ml로 TF-1에 대한 세포 증식 활성은 충분히 남아 있었다. 즉, 첨가되는 GM-CSF의 농도에 따라 생물학적 활성은 다르지만 안정성 시험에서 12주차에 초기 활성의 30% 내지 50%의 활성을 나타냄을 공통적으로 확인하였고, 이것으로 보아 구강청정제 용액에 일정량 이상의 GM-CSF를 첨가하면 일정시간 이후에도 GM-CSF가 포함된 구강청정제가 면역활성을 계속 보유한다는 사실을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). 특히, 대부분의 GM-CSF는 특별한 제형으로 만들어 저온 보관하여야 하나, 이 경우 가혹한 조건인 상온에서도 활성이 유지됨을 확인함으로써, 구강청정제에 첨가하여 면역 활성이 증진된 구강청정제를 만들고 이를 상온 보관하면서 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 7. GM - CSF 와 살균제의 혼합액의 면역활성 안정성 실험

구강청정제에서 살균제로서 가장 많이 사용되는 염화벤제토늄을 주요성분으로 하여, GM-CSF가 첨가될 경우의 면역활성을 측정하였다.

동결건조된 1 mg/vial의 식물 유래 GM-CSF 파우더에 염화벤제토늄(농도 100 mg/l)을 첨가하여, GM-CSF의 농도가 1 mg/l인 시액을 제조하였다. 30℃ 항온조에서 각각 0주, 1주, 2주, 4주, 8주 및 12주 동안 유지하면서 샘플링하였다. 생물학적 활성 확인 방법은 TF-1 Cell line(ATTC # CRL-2003)을 사용하였으며, 측정은 마이크로리더(Model 680. Bio-Rad)를 사용하여 490nm에서 측정하였다(도 6).

도 6을 보면, 2주 동안은 0시간과 유사한 활성을 나타내었으며, 8주 및 12주 후에는 0시간에서의 활성에 비하여 약 36%의 활성을 가지는 우수한 안정성을 보였다.

한편, 저농도의 GM-CSF가 첨가된 구강청정제에서의 안정성을 확인하기 위하여 100 mg/l의 염화벤제토늄을 포함하는 구강청정제액에 같은 방법으로 효모 유래 GM-CSF를 200 ng/ml의 농도로, 식물 유래 GM-CSF를 400 ng/ml의 농도로 첨가한 후 6주간 상온(25℃)에서 방치한 후 면역 활성이 얼마나 유지되는지 확인하였다. 6주간의 안정성 시험 결과 최종 활성은 식물 유래 GM-CSF가 포함된 경우 시작 대비 50%, 효모 유래 GM-CSF가 포함된 경우에는 68%로 확인되었으며, 최종 측정된 생물학적 활성은 700~1,500 IU/ml로 측정되어 6주간의 상온 방치에도 면역 증진 효과를 충분히 가질 수 있음을 확인되었다(도 7 참조).

또한, 이 결과를 토대로 볼때 염화벤제토늄 100 μg/ml 농도에서 GM-CSF를 100 ng/ml 이상의 농도로 첨가 시, 세포 독성이 관찰되지 않았고 면역활성도 나타내었기 때문에, 구강청정액의 살균제 성분액에 GM-CSF를 첨가하여 면역활성이 증가된 구강청정제를 제조할 수 있음을 확인하였다.

Claims

과립구 대식세포-콜로니 자극인자(GM-CSF)와 염화벤제토늄을 유효성분으로 함유하고 면역활성 증강 효과를 갖는 구강청정제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 GM-CSF는 천연 GM-CSF 또는 재조합 GM-CSF인 것임을 특징으로 하는 구강청정제 조성물.
제2항에 있어서, 상기 재조합 GM-CSF는 식물, 동물, 세균 및 균류로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래되는 것임을 특징으로 하는 구강청정제 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 구강청정제 조성물이 구강 세척액, 구강 분무제 및 페이스트로 이루어진 군에서 선택되는 형태인 것임을 특징으로 하는 구강청정제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 GM-CSF의 함량이 5 pg/ml 내지 1 mg/ml인 것임을 특징으로 하는 구강청정제 조성물.