KR101766657B1

KR101766657B1 - 단일 뉴클레오티드 검출방법

Info

Publication number: KR101766657B1
Application number: KR1020157032059A
Authority: KR
Inventors: 카메론 알렉산더 프레일링; 버나비 밤포스; 브루노 플라비오 노게이라 디 수자 소아레스; 토마스 헨리 아이작; 보리스 브레이너; 알레산드라 나탈; 미셸 아마시오; 폴 디어
Original assignee: 베이스4 이노베이션 엘티디; 메디칼 리서취 카운실
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2017-08-23
Also published as: EP2828409A1; US20160040223A1; CN105121662B; GB201306445D0; JP2016519576A; ES2559108T3; CA2907868C; EP2828409B1; BR112015025763A2; AU2014252805A1; US10480024B2; KR20150143614A; JP6289610B2; DK2828409T3; CN105121662A; AU2014252805B2; WO2014167324A1; CA2907868A1

Abstract

단일 뉴클레오티드 검출방법을 개시한다.
본 실시예의 일 측면에 의하면, 폴리뉴클레오티드 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 방법에 있어서, (1) 상기 분석물질로부터 단일 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하는 과정; (2) 상기 단일 뉴클레오티드 염기 각각과 캡쳐 시스템을 반응시킴으로써 포획 분자(captured molecule)들을 생성하는 과정; (3) 상기 포획 분자의 적어도 일부분을 증폭하여 상기 단일 뉴클레오티드 염기의 특징인 복수의 앰플리콘(amplicon)을 생성하는 과정; (4) 상기 복수의 앰플리콘을 특유의 검출가능 성분을 가지며 상기 복수의 앰플리콘에 상응하는 프로브(probe)로 표식하는 과정; (5) 상기 특유의 검출 가능 성분의 특성을 검출하는 과정을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

단일 뉴클레오티드 검출방법{SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHOD}

본 실시예는 점진적인 분해(degradation)에 의하여 생성된 단일 뉴클레오티드의 염기서열을 검출함으로써 RNA 또는 DNA를 특성화(characterising)하는 방법에 관한 것이다.

이 부분에 기술된 내용은 단순히 본 실시예에 대한 배경 정보를 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것은 아니다.

염기서열 분석장치의 속도가 점점 빨라지고 이러한 장치가 시장에서 저렴한 단가로 공급되면서, 유전물질의 염기서열을 분석하는 차세대 염기서열분석 방법은 이미 일반적인 생명과학 분야 및 의료 분야에서 상당한 영향을 끼치고 있다.

즉, 이러한 염기서열 분석장치에서는 우선 이중가닥 DNA 분석물질이 복수의 더 작은 폴리뉴클레오티드 단편으로 쪼개진다. 각각의 폴리뉴클레오티드 단편은 우선 하나의 사슬의 양 말단 상에서 아데닐화되고, 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않은 아데닌(adenine)으로의 혼성화(hybridisation)에 의해 보체(compliment)의 양 말단에 결합될 수 있다. 이와 같이 처리된 단편은 크기가 선택되고 결합된 단일가닥 제2 올리고뉴클레오티드들로 코팅된 표면상에서 포획된다. 결합된 단일가닥 제2 올리고뉴클레오티드들은 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적인 염기서열을 가지며 사실상 표면에 결합된 이중가닥 단편의 라이브러리는 추가적인 혼성화에 의해 생성될 수 있다. 라이브러리 구성요소들은 이후 클러스터링(clustering) 단계에서, 사용되지 않은 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하기 위해 신장(extension) 및 등온 가교반응(isothermal bridging reaction)을 이용하여 표면상에서 수백만 번 클론으로(clonally) 증폭된다. 사실상 이것은 사슬 중 하나를 통해 표면에 결합된 폴리뉴클레오티드 단편의 농도를 조밀하게 한다. 이후, 각 단편의 결합되지 않은 상보적 사슬(complimentary strand)이 제거되어 결합된 단일가닥 단편이 배열(sequencing)을 위한 준비상태가 되도록 한다. 염기서열 결정단계에서는, 단일가닥 단편들 각각이 준비되고 상보적 사슬이 재생성된다. 여기서 상보적 사슬은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 및 디데옥시 뉴클레오티드 삼인산(Dideoxynucleotide Triphosphate: ddNTP) 형태의 DNA의 4가지 특성 뉴클레오티드 염기 혼합물을 이용한 신장에 의하여 재생성된다. 각 유형의 ddNTP는 서로 다른 파장에서 형광을 발하는 상이한 형광단으로 표지(labelled)된 일부분으로 말단 블록(end-blocked)된다. 신장 반응(extension reaction)은 다음 3단계의 순환 형식을 취한다. 첫째로, 관련 ddNTP는 신장하는 사슬에 결합된다. 둘째로, 관련 ddNTP에 포함된 뉴클레오티드 염기는 시료에 조사하여 형광의 파장을 감지함으로써 식별된다. 마지막으로, 말단블록 및 이와 관련된 형광단(fluorophore)이 제거되어 다음 신장 반응이 발생한다. 이러한 과정에 의해 상보적 사슬의 배열이 염기 별로 결정된다. 이 방법은 고도로 자동화될 수 있으며 높은 정밀도를 가진 서열 리드(sequence read)를 생성할 수 있다. 반면, 오퍼레이션 속도는 신장 사이클 속도에 의해 제한된다. 따라서, 실제로 이 기술은 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드 단편 및 이 기술에 의해 얻어진 다양한 리드(read)의 전체 서열 어셈블리의 병렬 처리 과정을 포함하여 사용되는 경향이 있다. 이것 자체로 연산이 복잡해지고 잠재적인 오류가 도입될 수 있다.

더욱 최근에는 직접적인 서열결정방법을 개발하기 위한 노력이 이루어지고 있다. 예를 들어, 국제공개특허공보 제2009/030953호는 신규한 고속의 염기서열 분석장치에 관한 것으로, 염기서열 분석장치에서 특히 단일가닥 또는 이중가닥 폴리뉴클레오티드 시료(예컨대, 자연 발생적인 RNA 또는 DNA)의 뉴클레오티드 염기 또는 염기 쌍의 뉴클레오티드 서열은 나노포어(nanopore)의 출구 내에 또는 근처에 병렬로 배치된 플라스몬 나노구조(plasmonic nanostructure)로 제공되는 나노 크기의 구멍이 뚫린 기판으로 시료를 통과시킴으로써 판독된다. 이 장치에서, 플라스몬 나노구조는 검출 윈도우(본질적으로 전자기장)를 정의하고 이러한 검출 윈도우 내부에서 각각의 뉴클레오티드 염기(선택적으로 표식된(labelled))는 차례로 입사광과 상호작용하여 특징적인 방식으로 형광 또는 라만 산란 광자(raman scatter photon)로 유도된다. 이처럼 생성된 광자는 이후 간접적으로 검출되고, 데이터 스트림(Stream)으로 다중변환되며, 이러한 데이터 스트림의 정보는 폴리뉴클레오티드와 연관된 뉴클레오티드 염기서열의 특징이 된다. 이 후, 이러한 서열은 부착된 보조 컴퓨터 장치 또는 마이크로프로세서 일체로 프로그램된 상응하는 소프트웨어로 구현된 연산 알고리즘을 사용하여 데이터 스트림으로부터 구현될 수 있다. 플라스몬 나노구조 및 이와 관련된 공진 특성을 이용하는 추가적인 배경은 Adv. Mat. 2004, 16(19) pp. 1685-1706의 예에서 찾을 수 있다.

또 다른 고속의 폴리뉴클레오티드 염기서열 분석장치는 예를 들어, 미국특허 제6627067호, 제6267872호, 및 제6746594호에서 설명된다. 가장 단순한 형태의 염기서열 분석장치는 나노포어의 출구 내 또는 주변, 또는 기판 맞은편에 위치하는 검출 윈도우를 정의하기 위하여 플라스몬 나노구조 대신에 전극을 사용한다. 이후, 전위차가 전극에 인가되고, 폴리뉴클레오티드 및 나노포어에 의한 관련된 전해질의 전기적 이동 결과로서, 전극 사이에 흐르는 이온성 매질의 전기적 특성의 변화가 시간 함수로 측정된다. 이러한 장치에서, 각각의 다양한 뉴클레오티드 염기는 전류 또는 저항에서 특징적인 변동을 야기하는 '현상'을 유발하면서 검출 윈도우를 연속적으로 블록(block)하거나 언블록(unblock)한다. 이후, 이러한 변동은 전술된 것처럼 분석을 위하여 적절한 데이터 스트림을 생성하기 위하여 사용된다.

안정적인 드롭릿 스트림(droplet stream), 특히 마이크로 드롭릿 스트림(microdroplet stream)을 생성하는 것은 분자 생물학 분야에서 이미 적용되어 개발 중인 또 다른 기술분야이다. 예를 들어, 미국특허 제7708949호는 기름에서 안정적인 수성의 드롭릿을 생성하는 신규한 미소유체 방법을 소개한다. 반면에, 다른 예로서 미국공개특허공보 제2011/0250597호는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의해 주형(template)을 증폭할 수 있는 핵산 주형(일반적으로 폴리뉴클레오티드 DNA 또는 RNA 단편) 및 복수 개의 프라이머 쌍을 포함하는 마이크로 드롭릿을 생성하는 기술의 활용에 대해 기재하고 있다. 본 발명의 기술분야와 관련된 다른 특허출원들로는 일본공개특허공보 제2004/290977호, 제2004/351417호, 미국공개특허공보 제2012/0122714호, 제2011/0000560호, 제2010/01376163호, 제2010/0022414호, 및 제2008/0003142호가 있다.

국제공개특허공보 제2004/002627호는 업스트림과 다운스트림 미소유체 영역 사이의 불연속 섹션 생성을 포함하는 다양한 장치를 이용한 액체-액체 및 기체-액체 분산을 생성하는 방법을 개시하고 있다. 하지만 단일 뉴클레오티드 DNA 염기서열 결정에 적용하는 경우에 대해서는 교시하고 있지 않다.

국제공개특허공보 제2010/077859호는 전극, 반응경로와 뉴클레오티드 염기, 세척용 완충액, 시료 및 효소 레저버(enzyme reservoir)로 제공되는 기판을 포함한 드롭릿 액추에이터(droplet actuator)에 대하여 교시하고 있다. 이 액추에이터는 일반적으로 증폭 및 핵산의 배열결정에 유용하다고 알려졌지만, 이하 설명할 분석물질 분해방법에 대한 교시는 없다. 오히려 파이로 서열분석(pyrosequencing)을 이용한 분석물질의 상보적 사슬의 합성을 관측하는 식으로 완전히 다른 방식과 관련되어 있다. 미국공개특허공보 제2009/0280475호는 유사한 주제에 관한 것이다.

국제공개특허공보 제94/18218호는 단일 뉴클레오티드 스트림 순서는 분석물질로부터 분리되고 이후 형광 강화 고체 매트릭스(fluorescent-enhancing solid Matrix)에 포함되는 게놈 시퀀서(genome sequencer)를 개시한다. 이 때 각 뉴클레오티드는 레이저를 이용하여 여기되고 분광방출(spectroscopic emission) 특성이 감지된다. 이러한 서열분석기에 의해 이용되는 단일 뉴클레오티드 전사(transfer) 방법은 일련의 드롭릿이 아닌 흐르는 비혼화성 액체의 단일 이중-시스(single dual-sheath)를 생성하는 과정을 포함한다. 더욱이, 전술한 서열분석기는 이하 설명할 캡쳐 시스템 및 형광단 방출 방식을 이용하기 보다는 직접적으로 단일 뉴클레오티드를 검출하고자 한다. 이것은 분광방출이 감지될 때 신호 대 잡음비 문제가 발생할 수 있는 단점이 있다. 또한, 전체적인 감도는 물론 서열분석기 자체의 실용성을 떨어트릴 것이다.

Stephan et al Journal of Biotechnology 86 (2001) pp. 255-267 는 형광단으로 표지된 고정화 DNA 시료의 엑소뉴클레오리틱(Exonucleolytic) 분해에 의해 생성된 단일 뉴클레오티드를 카운팅하는 일반적인 방법에 대해 교시하고 있다. 하지만 생성된 다른 종류의 단일 뉴클레오티드를 분별하는 것에 대한 내용은 개시하지 않는다.

삼인산데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide triphosphate) 형태의 단일 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하기 위한 폴리뉴클레오티드의 점진적인 피로인산분해의 이용에 대해 http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/happy/HappyGroup/seq.html에 개략적으로 개시되어 있다. 그러나 실제 사용되는 방법론에 대한 정보는 거의 개시되어 있지 않다.

더욱이, 국제공개특허공보 제03/080861호는 DNA 분석물질이 정렬된 단일 뉴클레오티드 스트림으로 순차적으로 분해되는 방법에 대해 설명한다. 여기서 DNA 분석물질은 지능형 염료로 표지된 피로인산 음이온의 존재하에 수행되는 피로인산분해에 의해 분해된다. 일 실시예에서 피로인산 음이온은 부착된 특정 뉴클레오티드 종류에 따라 다른 형광 수명을 갖는 JF-4로 표지된다. 이후, 표지된 단일 뉴클레오티드 스트림은 레이저에 의하여 여기되고 성질 및 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 분광적으로 분석된다. 역시 이 경우에도 이하 설명할 캡쳐 시스템 및 형광단 방출 방법을 사용하기보다는 직접적으로 단일 뉴클레오티드를 검출한다. 따라서 이 방법 역시 신호 대 잡음비 및 감도 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 발명자들은 일 실시예로서 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하는 신규한 서열결정 방법을 개발하였으며, 뉴클레오티드 염기 스트림의 순서는 분석물질의 점진적인 분해에 의한 분석물질 내 서열의 특징이다. 그리고 감지 가능한 방식으로 각각의 뉴클레오티드 염기가 이어서 포획된다.

본 발명의 실시예에 의하면, 폴리뉴클레오티드 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 방법에 있어서, (1) 폴리뉴클레오티드 분석물질로부터 단일 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하는 과정, (2) 상기 단일 뉴클레오티드 염기 각각과 캡쳐 시스템을 반응시킴으로써 포획 분자를 생성하는 과정, (3) 상기 포획 분자의 적어도 일부분을 증폭하여 상기 단일 뉴클레오티드 염기의 특징인 복수의 앰플리콘(Amplicon)을 생성하는 과정, (4) 상기 복수의 앰플리콘을 특유의 검출가능 성분을 가지며 상기 복수의 앰플리콘에 상응하는 프로브(Probe)로 표식하는 과정, 및 (5) 상기 검출가능 성분의 특성을 검출하는 과정을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에 의하면, 전술한 폴리뉴클레오티드 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열 결정 방법을 이용하는 데 적합한 폴리뉴클레오티드 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 장치를 제공한다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 실시예들에 의하면, 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하는 서열결정 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 단일 뉴클레오티드 염기를 포함하는 마이크로 드롭릿 각각이 캡쳐 시스템과 반응하도록 만들어진 미소유체 서열분석장치를 나타낸다.

본 발명의 실시예에 의하면, (1) 폴리뉴클레오티드 분석물질로부터 단일 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하는 과정, (2) 상기 단일 뉴클레오티드 염기 각각과 캡쳐 시스템을 반응시킴으로써 포획 분자를 생성하는 과정, (3) 상기 포획 분자의 적어도 일부분을 증폭하여 상기 단일 뉴클레오티드 염기의 특징인 복수의 앰플리콘(Amplicon)을 생성하는 과정, (4) 상기 복수의 앰플리콘을 특유의 검출가능 성분을 가지며 상기 복수의 앰플리콘에 상응하는 프로브(Probe)로 표식하는 과정, 및 (5) 상기 검출가능 성분의 특성을 검출하는 과정을 포함하는 방법을 제공하는데 주된 목적이 있다.

본 발명의 방법에서 과정 (1)은 폴리뉴클레오티드 분석물질로부터 단일 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하는 과정을 포함한다. 이 과정에서 사용되는 분석물질로는 많은 뉴클레오티드 염기를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오티드가 적절하다. 원칙적으로, 폴리뉴클레오티드 길이는 제한이 없으며 인간 게놈 단편에서 발견된 뉴클레오티드 염기 수백만 개까지 포함할 수 있다. 본 방법은 보통 자연에서 발생하지 않는 뉴클레오티드 염기(즉, 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실이 아닌 뉴클레오티드 염기)로 전부 또는 일부가 구성되어 합성된 RNA, DNA, 또는 핵산 분석물질의 서열을 결정하는 데 이용될 수도 있지만 분석물질 그 자체는 자연적으로 발생하는 RNA 또는 DNA가 적절하다. 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오티드의 예로는 4-아세틸시티딘(4-acetylcytidine), 5-카복시하이드록실메틸(5- carboxyhydroxylmethyl), 우리딘(uridine), 2-O- 메틸시티딘(2-O-methylcytidine), 5-카복시메틸아미노메딜-2-티오우리딘(5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine), 5-카복시메틸아미노-메틸우리딘(5-carboxymethylamino-methyluridine), 디하이드로우리딘(dihydrouridine), 2-O-메틸수도우리딘(2-O-methylpseudouridine), 2-O-메틸구아노신(2-O-methylguanosine), 이노신(inosine), N6-이소펜틸아데노신(N6-isopentyladenosine), 1-메틸아데노신(1-methyladenosine), 1-메틸수도우리딘(1-methylpseudouridine), 1-메틸구아노신(1-methylguanosine), 1-메틸이노신(1-methylinosine), 2,2-디메틸구아노신(2,2-dimethylguanosine), 2-메틸아데노신(2-methyladenosine), 2-메틸구아노신(2-methylguanosine), 3-메틸시티딘(3-methylcytidine), 5-메틸시티딘(5-methylcytidine), N6-메틸아데노신(N6-methyladenosine), 7-메틸구아노신(7-methylguanosine), 5-메틸아미노메틸우리딘(5-methylaminomethyluridine), 5-메틸옥시아미노메틸-2-티오우리딘(5-methoxyaminomethyl-2-thiouridine), 5-메톡시우리딘(5-methoxyuridine), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘(5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine), 5-메톡시카보닐메틸우리딘(5-methoxycarbonylmethyluridine), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신(2-methylthio-N6-isopentenyladenosine), 우리딘-5-옥시아세트산-메틸에스테르(uridine-5-oxyacetic acid-methylester), 우리딘-5-옥시아세트산(uridine-5-oxyacetic acid), 와이부톡소신(wybutoxosine), 와이부토신(wybutosine), 수도우리딘(pseudouridine), 쿠에오신(queuosine), 2-티오시티딘(2-thiocytidine), 5-메틸-2-티오우리딘(5-methyl-2-thiouridine), 2-티오우리딘(2-thiouridine), 4-티오우리딘(4-thiouridine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 2-O-메틸-5-메틸우리딘(2-O-methyl-5-methyluridine), 및 2-O-메틸우리딘(2-O-methyluridine)이 있다.

과정 (1)은 적절하게는 기판에 폴리뉴클레오티드 분석물질을 부착하는 첫 번째 하위 과정을 더 포함한다. 전형적으로, 기판은 미소유체(microfluidic) 표면, 마이크로 비드(micro-bead), 또는 유리나 비분해성 중합체로 만들어진 투과성 막을 포함한다. 바람직하게, 기판은 분석물질을 수용하도록 구성된 표면을 더 포함한다. 원칙적으로, 사용될 수 있는 전술한 표면 전부에 분석물질이 부착될 수 있게 하는 많은 방법이 존재한다. 예를 들어, 에폭시실란(epoxysilane), 아미노하이드로카빌실란(aminohydrocarbylsilane), 또는 메르캅토실란(mercaptosilane)과 같은 관능 실란(functionalised silane)으로 유리 표면을 프라이밍(priming)하는 방법이 있다. 이와 같이 생성된 반응 부위는 터미널 아민(terminal amine), 숙시닐(succinyl), 또는 티올(thiol) 기를 갖는 분석물질의 유도체로 처리될 수 있다.

과정 (1)의 일 실시예에서 분석물질은 원래 배열에 상응하는 단일 뉴클레오티드 염기 스트림을 생성하도록 처리된다. 이 과정은 바람직하게는 효소를 포함한 반응 매질(reaction medium)의 존재 하에 20 ℃ 내지 90 ℃ 범위의 온도에서 수행된다. 바람직하게는, 이러한 처리과정은 비평형 유동 조건하에서 수행되며 단일 뉴클레오티드 염기는 연속적으로 반응 영역으로부터 제거된다. 더욱 바람직하게, 이 반응은 효소를 포함하는 수성 완충 매질(aqueous buffered medium)이 분석물질이 부착된 표면을 연속적으로 흐르게 함으로써 수행된다.

본 실시예의 바람직한 형태는, 과정 (1)에서 사용되는 효소가 적절한 속도로 분석물질의 점진적인 3'-5' 피로인산분해가 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide triphosphate)를 생성할 수 있도록 하는 것이다. 바람직한 분해 속도는 가능한 한 빠른 속도이며 일 실시예로 초당 1 내지 50 뉴클레오티드 염기의 속도일 수 있다. 바람직한 분해 속도는 초당 1내지 20 뉴클레오티드 염기이다. 폴리뉴클레오티드에 적용되는 피로인산분해 반응에 대한 추가적인 정보는 예를 들어 J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028에서 찾을 수 있다. 피로인산분해 반응에 사용되는 효소는 반응 조건 내에서 본질적으로 엑소뉴클라아제(exonuclease) 및 엔도뉴클라아제(endonuclease) 활성을 나타내지 않는 중합효소들로 구성된 군에서 적절하게 선택된다. 적절하게 사용될 수 있는 중합효소의 예로는 대장균(예를 들어, 클레나우(Klenow) 단편 중합효소), 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, 예를 들어, 타크 ( Taq ) 중합효소), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 칼도벨록스 (Bacillus caldovelox), 및 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)와 같은 박테리아로부터 획득된 원핵 중합효소 1 또는 효소 유도체가 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 적절하게는, 피로인산분해는 밀리몰라(milimolar) 농도의 피로인산 음이온 및 마그네슘 양이온을 더 포함하는 매질의 존재 하에서 이루어진다. 본 발명의 다른 실시예로, 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드는 분석물질을 엑소뉴클라아제 및 키나아제(kinase)로 처리함으로써 2 단계에 걸쳐 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 과정 (2)에서는, 과정 (1)에서 생성된 단일 뉴클레오티드 염기 각각이 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 염기의 올리고머(oligomer)를 포함하는 캡쳐 시스템 그 자체에 의해 포획된다. 적절하게는, 과정 (2)가 수행되기 전에 단일 뉴클레오티드 염기를 포함하는 수성 매질이 피로인산 가수분해효소(pyrophosphatase)로 처리되어 잔여 피로인산을 인산 음이온으로 가수분해한다.

본 발명의 제1 실시예에서, 캡쳐 시스템은 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드 쌍의 클래스 중 하나를 포함한다. 적절하게는, 이러한 한 쌍 중 제1 올리고뉴클레오티드는 n개(여기서 n은 1보다 크며 바람직하게는 5보다 크다)의 뉴클레오티드 염기를 포함하는 (a) 제1 이중가닥 부분 및 (b) 제2 단일가닥 부분을 포함한다. 하나의 하위 클래스에서 제1 올리고뉴클레오티드는 이중가닥 부분이 'J형'이라 불릴 수 있는 구조를 생성하도록 전구체의 3' 말단을 부분적으로 되접음(folding back)으로써 생성되는 가상 또는 실제 단일가닥 올리고뉴클레오티드 전구체(precursor)로부터 유도된 분자 구조를 가지는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 하위 클래스에서는, 더 긴 제4 단일가닥 올리고뉴클레오티드 상에 더 짧은 제3 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 혼성화한 후, 예컨대 두 가닥의 말단 뉴클레오티드를 가교시키는 등 보호기(protecting group)에 의한 이중가닥 '블런트(blunt)' 인 결과 분자의 말단을 렌더링함으로써 제1 올리고뉴클레오티드가 생성된다. 전형적으로, 제1 올리고뉴클레오티드의 전체 길이는 최대 150개 뉴클레오티드 염기까지의 길이이고, 바람직하게는 20개 내지 100개 뉴클레오티드 염기 길이이다. 동시에 정수 n은 5내지 40 사이, 바람직하게는 10 내지 30 사이의 값이 적절하다.

전술한 쌍에서의 제2 올리고뉴클레오티드에 관해 설명하면, 제2 올리고뉴클레오티드는 단일가닥이며 적절하게는 이중가닥 부분의 말단을 넘어 제1 올리고뉴클레오티드의 단일가닥 뉴클레오티드 염기에 대하여 전부 또는 일부가 상보적인 뉴클레오티드 염기서열을 갖는다. 제2 올리고뉴클레오티드의 길이는 중요한 요소는 아니며 바람직하게는, n-1개 뉴클레오티드 염기 길이가 아님에도 불구하고 단일가닥 부분에 결합 가능하도록 단일가닥 부분보다 길거나 짧을 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제2 올리고뉴클레오티드의 길이는 포획 분자 내에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 염기(예를 들어, 2 내지 10 뉴클레오티드 염기)의 짧은 오버행(overhang)이 염기의 두 가닥 중 하나의 가닥 또는 다른 가닥 상에 잔존하도록 선택된다. 이 클래스의 캡쳐 시스템은 단일 뉴클레오티드 염기를 제1 올리고뉴클레오티드의 이중가닥 말단에 부착시키고 혼성화하며 제2 올리고뉴클레오티드를 잔여 단일가닥 부분상에 결착(ligating)시킴으로써 오버행으로부터 떨어진 이중가닥의 포획 분자를 형성한다.

본 발명의 제2 실시예에서, 캡쳐 시스템은 각각의 말단이 두 개의 상이한 이중가닥 부분에 부착된 단일가닥 뉴클레오티드 부분으로 구성된 단일 올리고뉴클레오티드 클래스를 포함한다. 본 클래스의 캡쳐 시스템에서 단일가닥 뉴클레오티드 부분은 타켓(즉, 스트림 내 상보적인 단일 뉴클레오티드 염기)을 검출하는 데 있어서 매우 선택적인 프로브(probe)를 만드는 단 하나의 뉴클레오티드 염기로 구성된다.

이중가닥 올리고뉴클레오티드 부분(들)에 대해 설명하면, 이들은 바람직하게는 각각 폐쇄된 루프(closed loop) 구조를 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드 전구체들로부터 유래되거나 유래될 수 있다. 또는 단일가닥 뉴클레오티드 부분을 구성하는 중간 갭(gap)을 가진 두 개의 폐쇄된 루프 구조의 올리고뉴클레오티드 부분을 생성하기 위해 두 개의 말단을 되접음으로써 일반적인 단일가닥 올리고뉴클레오티드 전구체들로부터 유래되거나 유래될 수 있다. 전술한 모든 경우에서의 효과는 동일하다. 즉, 타겟의 상응하는 5' 및 3' 말단이 부착될 수 있는 올리고뉴클레오티드 부분의 다른 가닥 상의 3' 및 5' 자유 말단(free end)은 단일가닥 뉴클레오티드 부분의 말단에 인접할 것이다. 따라서, 캡쳐 시스템을 이용하는 것은 전체 길이만큼 이중가닥인 포획 분자를 생성하기 위하여 캡쳐 시스템의 사용 가능한 3' 및 5' 말단에 연결함으로써 타겟의 단일 뉴클레오티드 염기에 단일가닥 뉴클레오티드 부분을 부착하는 과정을 포함한다.

적절하게는, 이중가닥 올리고뉴클레오티드 부분(들)은 최대 50개의 뉴클레오티드 염기 쌍 길이이고, 바람직하게는 최대 45개의 뉴클레오티드 염기 쌍 길이이다. 더욱 바람직하게는 5개 내지 40개의 뉴클레오티드 염기 쌍 길이이고 가장 바람직한 길이는 10개 내지 30개의 뉴클레오티드 염기 쌍 길이이다. 더 긴 부분이 사용될 수 있으나, 타겟에 의한 단일가닥 뉴클레오티드 부분으로의 접근이 뒤엉킴(entanglement)으로 인해 제한될 수 있다는 잠재적인 위험성이 있다. 이러한 점에서 본 실시예는 덜 효과적이다.

전술한 두 개의 클래스에 있어서, 과정 (2)에서는 동시에 적어도 두 개의 상이한 포획 분자 세트의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 여기서 두 개의 상이한 포획 분자 세트 각각은 서로 상이한 상보적 뉴클레오티드 염기에 대해 선택적이고, 혼성화에 의해 상이한 특징적인 프로브가 결합되는 특징적인 뉴클레오티드 부분을 갖는다. 적어도 이러한 특징적인 뉴클레오티드 부분은 과정 (3)에서 증폭되어 과정 (4)에서 프로브가 부착될 수 있는 다수의 앰플리콘(amplicon)을 생성한다. 분석물질이 DNA 또는 RNA인 경우, 서로 상이한 뉴클레오티드 염기 및 상이한 프로브에 선택적인 것과 동시에 4개의 상이한 캡쳐 시스템을 이용하는 것이 가장 바람직하다.

과정 (2)는 적절하게는 스트림 내 단일 뉴클레오티드 염기 각각을 캡쳐 시스템에 접촉시킴으로써 수행된다. 가장 적절하게는 단일 뉴클레오티드 염기가 포획되어 전체적으로 이중가닥이거나 전술한 사슬의 오버행 정도를 제외하고 이중가닥인 포획 분자를 생성한다는 조건하에, 전술한 4개의 캡쳐 시스템에 접촉시킴으로써 수행된다. 이와 같은 포획은 제2 중합효소 및 리가아제를 포함하는 2가지 효소 시스템의 존재 하에 30 ℃ 내지 80 ℃ 범위의 온도에서 단일 뉴클레오티드 와 캡쳐 시스템을 함께 접촉시킴으로써 수행된다. 바람직한 실시예로서, 제2 중합효소는 과정 (1)에서 사용되는 것과 동일하여 그 밖의 또 다른 효소를 첨가할 필요가 없다.

본 발명에 따른 방법의 과정 (3)에서는, 과정 (2)에서 생성된 혼합물과 호환할 수 있는 본 발명의 기술 분야에서 이용 가능한 방법 중 하나를 사용하여 포획 분자를 증폭한다. 이 방법은 중합효소 연쇄 반응, 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification), 및 회전환 증폭법(Rolling Circle Amplification)과 같은 열 순환 및 등온 방식의 방법을 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 회전환 증폭법은 전술한 포획 분자의 제2 클래스로부터 유래된 포획 분자에 있어서 유용하다. 이러한 방법 중 어느 하나에 의해 포획 분자의 일부 및 상보적 서열을 갖는 보체(Sequence Compliment)의 수많은 복제물이 급속도로 생성될 수 있다. 증폭 방법 중 하나를 수행하기 위한 정확한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 문헌에서 쉽게 찾을 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄반응의 경우, 일반적으로 (a) 고온에서 포획 분자를 변성시켜 상응하는 단일가닥 상태로 사실상 풀리는(unzipped) 과정, (b) 짧은 단일가닥 프라이머(primer) 올리고뉴클레오티드를 3' 말단 또는 그 근접부분에서 풀린(unzipped) 포획 분자로 어닐링(annealing)하는 과정, (c) 풀린(unzipped) 포획 분자의 상보적 사슬이 생성될 때까지 5'-3' 방향으로 프라이머를 연장하는 과정, (d) 과정 (c)의 생성물을 변성시켜 풀린(unzipped) 포획 분자 및 단일가닥 형태의 상보적 사슬을 모두 재생성하는 과정, (e) 기하급수적으로 복수의 앰플리콘 복제물을 만들도록 과정 (b) 내지 과정 (d)를 수차례 반복하는 과정을 포함한다. 즉, 실제 과정 (3)은 과정 (2)에서의 생성물을 적어도 하나의 프라이머, 중합효소, 및 DNA의 경우 예컨대 4개의 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드 특성의 혼합물로 처리하는 과정을 포함한다. 과정 (3)은 4개의 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드를 전부 도입하므로, 추가된 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드의 캡쳐 시스템에 의한 포획이 생성된 다른 뉴클레오티드 염기의 추가적인 포획 분자 특성을 피하도록 방지하는 것이 중요하다. 이것은 예를 들어, 과정 (2)에서 사용되는 리가아제를 비활성화시킴(예컨대, 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드의 첨가 전에 열처리)으로써 이루어질 수 있다. 이와 달리, 과정 (3)의 중합효소 연쇄반응에 이용되는 반응 조건 및 시약은 본 발명의 기술분야에 알려진 적절한 것들이 이용될 수 있다. 전술한 4가지 성분 시스템에서 과정 (3)은 4 개의 상이한 프라이머 쌍을 첨가하는 과정을 포함할 수 있다. 여기서 각각의 프라이머 쌍은 캡쳐 시스템에서 4개의 제2 올리고뉴클레오티드 중 하나 또는 그 이상에 대하여 선택적이다. 바람직한 실시예로서, 하나의 프라이머 쌍은 캡쳐 시스템에서 4개의 제2 올리고뉴클레오티드 전부에 대하여 선택적이다.

본 발명에 따른 방법의 과정 (4)에서는, 앰플리콘이 특유의 검출가능 성분(characteristic detectable element)을 갖는 프로브로 표식된다. 이 과정은 과정 (3)에서의 증폭이 마직막 순환이 완료될 때, 더욱 바람직하게는 과정 (3)이 진행됨과 동시에 이루어질 수 있다. 적절하게는 프로브가 앰플리콘에 결합될 때까지는 검출가능 성분은 검출되지 않고, 검출가능 성분에 의해 나타나는 적절한 검출 특성은 형광이다. 바람직하게 프로브는 혼성화에 의해 해당 앰플리콘의 특이염기서열(Unique Sequence)에 결합될 수 있다. 일 실시예에서, 사용되는 프로브는 본 발명의 기술분야에서 분자 비콘(Molecular Beacon)으로 알려진 예이다. 일반적으로 분자 비콘은 사실상 스스로 되접혀(folded back) 잔존하는 단일가닥 루프를 생성하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드와, 인접한 두 개의 뉴클레오티드 염기 말단이 상보적인 뉴클레오티드 염기 쌍에 의해 서로 결합하여 이중가닥 부분을 형성하는 숏 스템(short stem)을 포함한다. 단일가닥 루프가 개념적인 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 동일한 말단의 상보적인 사슬에 부착되는 헤어핀(hairpin)에 비유될 수 있는 이러한 배열은 크게 변형된다. 형광단(fluorophore) 및 소광물질(quencher)은 각각 올리고뉴클레오티드의 자유(free) 3' 및 5' 말단에(서로 간에는 가까우며, 스템의 멀리 떨어진 말단 위치에) 부착된다. 이후, 서로 간의 기하학적 근접은 어떤 유의적인 형광이 발생하지 않도록 강화된다.본 명세서에서 사용된 바와 같이, 분자 비콘은 그것의 루프가 앰플리콘의 특이염기서열로 선택적으로 혼성화될 수 있도록 선택된다. 이로써 추가적인 변형이 유발되어 비이콘의 스템을 풀고(unzip), 형광단 및 소광물질을 이격시키며 비이콘이 형광을 발하도록 한다. 다시 말해, 전술한 4가지 성분 시스템이 사용될 때, 임의의 앰플리콘에 대하여 각각 선택적인 4개의 분자 비콘 혼합물이 사용된다. 사용가능한 대체 프로브는 예를들어, 타크만 프로브(Taqman Probe), 스콜피온 프로브(Scorpion Probe), 유사한 방식으로 동작할 수 있는 분자들을 포함한다.

마지막으로 과정 (5)에서는, 앰플리콘에 결합됨으로써 활성화되는 검출가능 성분이 검출된다. 여기서 검출가능 성분은 특정 단일 뉴클레오티드 염기를 식별하고, 분석물질 내의 뉴클레오티드 염기 서열을 검출과 관련된 데이터 스트림으로부터 복원할 수 있도록 한다. 이러한 방법은 본 발명의 기술분야에 알려진 방법이다. 예를 들어, 활성화된 분자 비콘의 형광물질은 형광단의 특징적인 형광 파장 또는 파장 엔벨로프(envelope)에 반응하는 광검출기 또는 이와 동등한 장치에 의하여 검출될 수 있다. 이는 순차적으로 광검출기가 컴퓨터와 같은 장치에 의해 처리되고 추후 분석될 수 있는 특정 뉴클레오티드 염기 종류의 전기적 신호 특성을 생성하도록 한다.

특히 바람직한 실시예로서, 본 발명에 따른 방법은 마이크로 드롭릿 내에서 전부 또는 일부가 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 탄화수소 또는 실리콘 유(silicone oil)와 같이 배열이 보존되도록 하는 비혼화성 운반 용매(immiscible carrier solvent) 내에서 과정 (1)에서 생성된 단일 뉴클레오티드 염기를 상응하는 수성의 마이크로 드롭릿 스트림으로 하나씩 삽입함으로써 개시된다. 유리하게, 이 방법은 피로인산분해반응 영역의 마이크로 드롭릿 다운스트림을 직접 생성함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 반응 매질(reaction medium)이 적절한 차원의 마이크로 드롭릿의 헤드(head)로부터 발생하여 용매의 유동 스트림이 되도록 함으로써 이루어진다. 전술한 방법 대신, 반응 매질의 작은 앨리쿼트(aliquot)는 용매에 현탁된(suspended) 기존의 수성 마이크로 드롭릿(microdroplet)의 스트림으로 순차적으로 주입될 수 있다. 후자의 방법을 이용하면 각각의 마이크로 드롭릿은 캡쳐 시스템 및 다양한 효소의 구성성분과 과정 (2)를 유발하는데 필요한 그 밖의 시약(예를 들어, 완충액)을 함유한다. 마지막으로, 전자의 방법으로 생성된 마이크로 드롭릿은 이후 기존의 마이크로 드롭릿 스트림과 합쳐져 유사한 결과를 달성할 수 있도록 한다. 본 실시예에서 바람직하게는, 이후 과정 (5)에서 앰플리콘에 의해 활성화되는 검출가능 성분 및 그것이 포함하는 뉴클레오티드 염기의 성질을 확인하기 위해 각각의 드롭릿을 분석하는 과정을 포함한다.

제공되는 마이크로 드롭릿이 하나보다 많은 단일 뉴클레오티드를 함유하는 것을 방지하기 위하여, 과정 (1)에서 각각의 채워진(filled) 마이크로 드롭릿이 1개 내지 20개, 바람직하게는 2개 내지 10개의 비어있는 상태의(empty) 마이크로 드롭릿으로 나눠지는 속도로 단일 뉴클레오티드 염기를 방출하는 것이 바람직하다. 이후, 용매의 채워진 마이크로 드롭릿 및 비어있는 상태의 마이크로 드롭릿 스트림은 유로(flow path), 적절하게는 마이크로 드롭릿이 분리된 상태에서 유지되고 서로 응집할 수 있는 기회를 갖지 않도록 하는 속도 및 방식으로 미소유체 유로를 따라 흐르게 된다. 적절하게는, 사용되는 마이크로 드롭릿은 100미크론(micron) 미만, 바람직하게는 50 미크론 미만, 더욱 바람직하게는 20 미크론 미만, 그리고 더더욱 바람직하게는 15 미크론 미만의 지름을 갖는다. 이러한 지름 중 가장 바람직한 지름 범위는 2 내지 20 미크론이다. 일 실시예에서 전체 시스템을 통한 마이크로 드롭릿의 유량(flow rate)은 초당 50개 내지 3000개의 드롭릿, 바람직하게는 초당 100개 내지 2000개의 드롭릿 범위이다.

이하 실시예들을 참조하여 본 발명에 대하여 설명한다.

캡쳐 시스템의 준비 및 사용

이하 실험은 캡쳐 시스템을 이용한 단일 뉴클레오티드 염기의 포획 및 형광단의 방출을 설명하기 위한 것이다. 여기서 캡쳐 시스템의 제1 올리고 뉴클리오티드는 J형상이고 제2 올리고뉴클레오티드는 단일가닥이다.

전술한 J형 올리고뉴클레오티드 샘플은 75 뉴클레오티드 염기를 접음(folding)으로써 제조된다. 단일가닥 올리고뉴클레오티드의 서열은 아래와 같다:

gtaggtcctggcacagagaaaaggagGcagtgatgttccatgactgatttttttttcagtcatggaacatcact*g

여기서, g, t, c 및 a는 DNA의 뉴클레오티드 염기에 대한 기존 표기를 나타내고, *은 포스포로티오에이트 연결(phosphorothioate linkage)의 존재를 나타낸다. 폴딩(folding)은 올리고뉴클레오티드 수용액을 95 ℃까지 가열한 뒤, 1 ℃ 당 10분의 속도로 다시 실온으로 천천히 냉각시킴으로써 이루어진다. 이렇게 얻어진 J형 분자는 포획 부위(상기 염기서열에서 대문자로 표시된 부분)인 단일 뉴클레오티드 염기에 부착된 잔여 단일가닥 올리고뉴클레오티드 부분(gtaggtcctggcacagaaaaaaggag)을 포함한다.

대응하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드 또한 제조되며, 아래와 같은 서열을 갖는다.

^ctccTTXTTtctgtgccaga

여기서 ^는 5' 인산기, 대문자 T는 아지드 링커(azide linker)를 통해 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염료로 표식된 티민 염기, X는 BHQ-1 소광물질로 표식된 티민 염기를 나타낸다.

다음으로 개별 포획 및 뉴클레오티드 염기 혼합물이 제조된다. 포획 혼합물은 다음 배합으로부터 도출된 것에 상응하는 혼합물을 갖는다.

2.5ul 10x BufferII

5ul 10x Taq Ligase buffer (NEB)

2.5ul 100nM of the j-shaped molecules mentioned above

5ul 100nM of the single-stranded oligonucleotide mentioned above

2ul Thermostable Inorganic Pyrophosphatase (NEB)

5ul Taq Ligase (NEB)

1ul 25mM MnSO4

water to 25ul

재료를 모방하도록 설계된 뉴클레오티드 염기 혼합물이 피로인산분해 단계로부터 유도되는 한편, 아래 배합으로부터 유도된 혼합물에 상응한다.

2.5ul 10 BufferII (supplied with Amplitaq; magnesium-free)

1.5ul MgCl2 25mM

2.5ul 10nM of deoxycytidine triphosphate (dCTP)

2ul Amplitaq (5U/ul)

2.5ul 10mM sodium pyrophosphate

water to 25ul

이후, dCTP의 포획은 전술한 동일한 양의 두 혼합물을 혼합하여 50 ℃에서 얻어진 생성물을 배양함으로써 이루어진다. 이 과정은 일반적으로 30분 후에 완료된다.

캡쳐 시스템을 이용한 드롭릿 미소유체 방법

도 1은 단일 뉴클레오티드 염기를 포함하는 마이크로 드롭릿 각각이 전술한 것과 같은 유형의 캡쳐 시스템과 반응하도록 만들어진 미소유체 서열분석장치를 나타낸다.

단일 뉴클레오티드 스트림을 포함하는 수성 매질 (1)은 PDMS 중합체로부터 제조된 10 미크론 직경의 미소유체 튜브를 통해 흐르게 된다. 여기서 단일 뉴클레오티드 스트림은 인간 DNA에서 유래된 100개 뉴클레오티드 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 분석물질의 점진적인 피로인산분해에 의해 획득된다. 피로인산분해 반응 자체는 숙시닐 브릿지(succinyl bridge)에 의해 분석물질이 기 부착되어 있는 유리 마이크로 비드(glass micro bead) 상에서 72 ℃로 수성의 완충(pH8) 반응매질 스트림을 통과함으로써 이루어진다. 여기서 수성의 완충반응매질은 타크 중합효소( Taq Pol), 리터당 2 밀리몰(millimoles)의 피로인산 나트륨, 및 리터당 2 밀리몰의 염화 마그네슘을 포함한다. 도 1을 참조하면, 1번에서 단일 뉴클레오티드 염기 순서는 마이크로 비드(micro bead)의 다운스트림이고 분석물질의 염기서열에 대응된다. 1번은 드롭릿 헤드(2)로부터 하나 이상의 비혼합성 경량 실리콘 유(light silicone oil) 스트림(4)과 접촉되는 제1챔버(3)로 출몰한다. 이러한 스트림의 속도는 격렬한 혼합을 피하고 실리콘 유 내에 부유된 수성인 구형의 드롭릿(5)을 생성하도록 선택된다. 여기서 실리콘 유는 대략 8 미크론의 지름을 갖는다. 일반적으로, 속도는 인접하는 채워진 드롭릿(filled droplet) 사이에 10개의 비어있는 드롭릿(empty droplet)이 존재하도록 조정된다. 이후, 드롭릿(5)의 스트림은 초당 드롭릿 1000개의 속도로 동일한 지름을 갖는 제2 미소유체 튜브를 따라 제2 챔버(6) 를 향하여 이동한다. 5 미크론의 수성 인 구형의 드롭릿(7)의 제2 스트림은 제2 드롭릿 헤드(8)를 이용하여 제2 챔버(6)로 주입된다. 드롭릿(5, 7)은 대략 9 미크론의 지름을 갖고 크기가 더 큰 수성의 드롭릿(9)을 형성하기 위하여 순차적인 방식으로 응집된다. 드롭릿(7) 각각은 드롭릿(5) 내에 존재하는 잔여 피로인산 음이온을 파괴하기 위하여 피로인산 가수분해효소를 함유한다.

크기가 더 큰 수성의 드롭릿(9)의 스트림은 제3 챔버(10) 내로 미소유체 튜브를 경유하여 동일한 속도로 이동한다. 제3 챔버(10)에서는, 크기가 더 큰 수성의 드롭릿이 대응되는 드롭릿 헤드(12)에 의해 주입되는 5 미크론의 수성인 구형의 드롭릿(11)의 제3 스트림과 접촉한다. 드롭릿(9) 각각이 챔버들(6, 10) 사이를 이동하는 데 소요되는 시간은 예컨대, 2분이다.

크기가 더 큰 수성의 드롭릿(9) 및 수성인 구형의 드롭릿(11)은 드롭릿(13)(대략, 10 미크론의 지름)을 생산하기 위하여 제3 챔버(10)에서 응집된다. 수성인 구형의 드롭릿(11) 각각은 중온성 리가아제(mesophilic ligase) 및 캡쳐 시스템을 포함한다. 여기서 캡쳐 시스템은 4개의 J형 제1 올리고뉴클레오티드 및 4개의 상응하는 제2 단일가닥 뉴클레오티드 쌍을 포함한다. J형 제1 올리고뉴클레오티드 각각은 60개의 뉴클레오티드 염기 길이이며 60개의 뉴클레오티드 염기를 갖는 단일가닥 올리고뉴클레오티드 전구체를 5' 말단의 45번째 뉴클레오티드 염기에 폴딩(folding)함으로써 제조된다. 이러한 폴딩으로 3개의 뉴클레오티드를 갖는 단일가닥 루프, 12개의 뉴클레오티드 염기쌍을 갖는 이중가닥 부분, 및 33개 뉴클레오티드 염기를 갖는 단일가닥 부분을 생성한다. 단일가닥 부분은 4개의 제1 올리고뉴클레오티드 각각과는 상이하다. 이러한 4개의 제1 올리고뉴클레오티드 각각은 또한 DNA의 4가지 특징적인 뉴클레오티드 염기 유형(즉, A, T, G 및 C)의 특성을 갖는 상이한 33번째 염기(단일가닥 말단으로부터 측정되는)를 갖는다. 4개의 상이한 제2 올리고뉴클레오티드는 각각 28개의 뉴클레오티드 염기의 길이를 갖고, 제1 올리고뉴클레오티드 쌍의 4번째 및 32번째 뉴클레오티드 염기에 의해 정의되는 단일가닥 부분의 일부와 상보적인 상이한 염기서열을 갖는다.

드롭릿(13) 스트림은 드롭릿 헤드(16)를 통해 주입되는 5 미크론의 수성인 구형의 드롭릿(15)의 제4 스트림과 응집이 이루어지는 제3 챔버(14)로 들어가기 전에 동일한 속도로 미소유체 튜브를 경유하여 이동한다. 미소유체 튜브에서, 드롭릿(13) 스트림은 30분 후에 핫 스폿(Hot Spot)을 지나며 리가아제는 비활성화된다(10분 내지 20분). 드롭릿(15) 각각은 제2 올리고뉴클레오티드, 타크 중합효소(Taq Pol enzyme), DNA의 특징적인 4가지 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드, 및 4개의 상이한 분자 비콘 각각에 대해 선택적인 4개의 상이한 프라이머 쌍을 포함한다. 여기서 분자 비콘은 드롭릿(13)에서 생성될 수 있는 4개의 상이한 포획 분자로부터 생성 가능한 4가지 유형의 앰플리콘 각각에 대하여 선택적이다. 드롭릿(15)은 또한 중합효소 연쇄반응 시 일반적으로 사용되는 그 밖의 첨가물들도 함유할 수 있다. 전술한 것과 같이 응집된 마이크로 드롭릿(microdroplet, 17)의 스트림은 풀린 포획 분자(unzipped capture molecule)의 중합효소 연쇄반응에 의한 증폭이 발생하는 동안 60 ℃와 95 ℃ 사이에서 20 내지 30 열사이클(thermal cycle)로 실시된다(예컨대, 분당 1사이클). 이러한 실험의 결과로서, 마이크로 드롭릿(17)은 검출 시스템에 전달된다.

검출 시스템(미도시)은 일반적으로 각각의 드롭릿을 레이저의 입사광으로 분석하는 검출 윈도우(detection window)를 포함한다. 이후 입사광은 각각의 드롭릿 내의 활성화된 분자 비콘이 본래 포획 분자와 혼합되는 단일 뉴클레오티드 염기 특유의 방식으로 형광을 발하도록 작용한다(반면, 드롭릿이 원래 비어있던 경우 형광은 실질적으로 거의 발하지 않음). 이러한 형광의 존재 또는 부재는 전술한 4개의 분자 비콘의 4가지 특징적인 파장에서 검출된다. 따라서, 드롭릿이 순차적으로 분석될 때, 본래의 폴리뉴클레오티드 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열이 실질적으로 판독될 수 있다. 일반적으로 형광의 발광은 매우 빠르게 나타나지만, 드롭릿 각각은 10분이 경과한 후에 분석되므로 비어있는 드롭릿이 쉽게 식별될 수 있는지 확인해야 한다.

1: 수성 매질 2, 8, 12, 16: 드롭릿 헤드
3: 제1 챔버 4: 경량 실리콘유
5, 7, 9, 11, 13, 15: 드롭릿 6: 제2 챔버
10: 제3 챔버 14: 제4 챔버
17: 마이크로 드롭릿

SEQUENCE LISTING <110> Base4 Innovation Limited Medical Research Council <120> Single nucleotide detection method <130> P57530WO <150> GB 1306445.6 <151> 2013-04-09 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> j-shaped oligonucleotide precursor <220> <221> misc_feature <222> (74)..(75) <223> Phosphorothioate linkage <400> 1 gtaggtcctg gcacagaaaa aaggaggcag tgatgttcca tgactgattt ttttttcagt 60 catggaacat cactg 75 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Residual single-stranded oligonucleotide region of j-shaped oligonucleotide <400> 2 gtaggtcctg gcacagaaaa aaggag 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single-stranded oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Thymine bases labelled with Alexa Fluor 488 via azide linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Thymine base labelled with BHQ-1 quencher <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Thymine bases labelled with Alexa Fluor 488 via azide linker <400> 3 ctcctttttt ctgtgccaga 20

Claims

폴리뉴클레오티드 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 방법에 있어서,
(1) 피로인산 분해효소의 존재 하에 점진적인 피로인산 분해에 의해 상기 분석물질로부터 단일 뉴클레오티드 염기 삼인산 스트림을 생성하는 과정;
(2) 중합효소 및 리가아제의 존재 하에 상기 단일 뉴클레오티드 염기 삼인산 각각과 캡쳐 시스템을 반응시킴으로써 포획 분자(captured molecule)들을 생성하는 과정으로서, 상기 캡쳐 시스템은 (i) (a) 이중가닥 부분 및 단일가닥 부분을 포함하는 제 1 올리고뉴클레오티드 및 (b) 뉴클레오티드 염기 서열이 상기 제 1 올리고뉴클레오티드의 단일가닥 부분의 그것에 적어도 부분적으로 상보적인 제 2 단일가닥 올리고뉴클레오티드; 또는 (ii) 두 상이한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 부분에 그 말단들이 결합된, 단일가닥 뉴클레오티드 부분을 포함하는 단일 뉴클레오티드를 포함하고;
(3) 상기 포획 분자의 적어도 일부분을 증폭하여 상기 단일 뉴클레오티드 염기 삼인산의 특징인 복수의 앰플리콘(amplicon)을 생성하는 과정;
(4) 상기 복수의 앰플리콘을 특유의 검출가능 성분을 가지며 상기 복수의 앰플리콘에 상응하는 프로브(probe)로 표식하는 과정;
(5) 상기 특유의 검출 가능 성분의 특성을 검출하는 과정
을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 스트림의 뉴클레오티드 염기의 순서는 상기 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열에 상응하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 캡쳐 시스템 (i)은, 상기 뉴클레오티드 염기 삼인산의 종류별로 두 가지 성분을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 캡쳐 시스템 (ii)는, 뉴클레오티드 염기 삼인산의 종류별로 단일 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드 분석물질은 표면에 결합되는 방법.
제1항에 있어서,
상기 과정 (1)의 반응 조건 하에서 피로인산 분해효소는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제로 동작하지 않는 방법.
제1항에 있어서,
상기 과정 (1)은 상기 피로인산 분해효소, 피로인산 음이온, 및 마그네슘 양이온을 포함하는 흐르는 수성매질(aqueous medium)의 존재 하에 비평형 조건에서 수행되고,
상기 단일 뉴클레오티드 염기는,
상기 단일 뉴클레오티드 염기가 생성된 반응 영역으로부터 연속적으로 제거되는 방법.
제1항에 있어서,
잔여 피로인산 음이온은 상기 과정 (1) 및 상기 과정 (2) 사이에서 피로인산 가수분해효소에 의해 파괴되는 방법.
제3항에 있어서,
캡쳐 시스템 (i)에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 J 형상인 방법.
제3항에 있어서,
캡쳐 시스템 (i)에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 전체 길이는 20 개 내지 100개 뉴클레오티드 염기의 길이인 방법.
제3항에 있어서,
상기 캡쳐 시스템 (i)은,
상이한 4가지 종류의 제2 올리고뉴클레오티드 를 포함하고,
각 종류의 제2 올리고뉴클레오티드는,
4개의 상이한 제1 올리고뉴클레오티드의 4개의 상이한 단일가닥 부분 중 어느 하나의 일부분과 상보적인 서열을 갖는 방법.
제4항에 있어서,
캡쳐 시스템 (ii)에서 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 부분은,
10개 내지 30개의 뉴클레오티드 쌍을 포함하는 방법.
제4항에 있어서,
캡쳐 시스템 (ii)에서 두 개의 별개의 이중가닥 올리고뉴클레오티드 부분이 사용되며, 상기 두 개의 별개의 이중가닥 올리고뉴클레오티드 부분 각각은 폐쇄된 루프 형태인 상기 단일가닥 뉴클레오티드 부분에서 멀리 떨어진 말단 부분을 포함하는 방법.
제4항에 있어서,
캡쳐 시스템 (ii)에서 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 부분은 상기 단일가닥 뉴클레오티드 부분을 포함하는 갭(Gap)을 남기기 위하여 말단끼리 되접음으로써 단일가닥 올리고뉴클레오티드 전구체로부터 유도될 수 있는 방법.
제1항에 있어서,
상기 캡쳐 시스템은,
적어도 두 개의 다른 형태의 캡쳐 시스템을 포함하고, 각각의 형태는 다른 뉴클레오티드 염기에 대하여 선택적인 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 과정 (3) 및 상기 과정 (4)는 동시에 수행되는 방법.
제1항에 있어서,
상기 과정 (3)의 증폭은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification), 및 회전환 증폭법(Rolling Circle Amplification) 중 어느 하나를 이용하여 수행되는 방법.
제1항에 있어서,
상기 과정 (2)는,
상기 과정 (4)가 이루어지기 전에 비활성화되는 리가아제를 사용하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 과정 (4)에서 이용되는 프로브는,
분자 비콘(Molecular Beacon), 타크만 프로브(Taqman Probe), 및 스콜피온 프로브(Scorpion Probe) 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,
상기 과정 (5)는 활성화된 프로브 상의 형광단에 의해 방출되는 형광 측정 과정을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 과정 (1) 내지 상기 과정 (5) 중 적어도 하나의 과정은 마이크로 드롭릿(Microdroplet) 안에서 수행되는 방법.
제1항 내지 제4항, 제7항 내지 제17항 및 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법을 이용하기 위하여 적용되며,
단일 뉴클레오티드 염기 삼인산 스트림의 유입구, 및 검출 시스템과 연결된 유출구를 가지는 미소유체 튜브를 포함하고,
상기 미소유체 튜브는 상기 단일 뉴클레오티드 염기 삼인산이 과정 (2)의 캡쳐 시스템과 반응하는 드롭릿을 함유하는 것인 폴리뉴클레오티드 분석물질의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 장치.