JP6289610B2 - 単一ヌクレオチド検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＲＮＡまたはＤＮＡを、漸進的分解によりそれらから生成される単一ヌクレオチド塩基の順序づけられた配列を検出することにより、特徴分析する方法に関する。

遺伝物質の次世代配列決定は、ますます高速化する配列決定装置の販売に伴い配列決定の単価が下落しているように、すでに一般に生物科学、とくに医学に顕著な影響を与えている。このように、１つのこうした装置では、二本鎖ＤＮＡ分析物はまず複数のより小さなポリヌクレオチド断片に分解され、そのそれぞれは一本鎖の両端で一本鎖第１オリゴヌクレオチドを不対アデニン塩基へのハイブリダイゼーションによりその補体の両端に結合することができるようにまずアデニル化される。こうして得られる処理断片は次にサイズ選択され、それ自体が第１の配列補体である結合一本鎖第２オリゴヌクレオチドで覆われた表面上で捕捉され、実際にはさらなるハイブリダイゼーションにより表面結合二本鎖断片のライブラリを形成することができる。その後のクラスタリングステップでは、これらのライブラリ構成要素は次に、未使用の第２オリゴヌクレオチドを用いる伸長および等温架橋反応を用いて表面上で何百万回もクローン的に増幅される。これは、実際には、その鎖の１つによって表面に結合したポリヌクレオチド断片の密集体をもたらす。各断片の非結合相補鎖は次に配列決定用の結合一本鎖断片を残して除去される。配列決定段階では、これらの一本鎖断片のそれぞれはプライムされ、ポリメラーゼ連鎖反応およびジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）形態のＤＮＡの４つの特徴的なヌクレオチド塩基の混合物を用いる伸長によりその相補鎖が再形成される。各ｄｄＮＴＰタイプは異なる波長で蛍光する異なるフルオロフォアで標識される部分で末端ブロックされる。伸長反応はここで３ステップのサイクルの形態をとる；第１に、適切なｄｄＮＴＰが伸長鎖に結合され；第２に、これが含有するヌクレオチド塩基が試料を照射し、蛍光の波長を検出することにより識別され；最後に、末端ブロックおよびその関連フルオロフォアが除去され、次の伸長事象の発生を可能にする。この手段により、相補鎖の配列を塩基ごとに形成することができる。この方法は高度に自動化することができ、高精度の配列リードを生成することができるが、その処理速度は伸長サイクルの速度により制限されることが理解されるだろう。このように、実際には、この技術の使用は比較的短いポリヌクレオチド断片の並列処理およびそれから得られるさまざまなリードからの全配列のアセンブリを含む傾向がある。これは本質的にコンピュータ処理の複雑さおよび潜在的なエラーの発生につながり得る。

より最近では、直接配列決定方法の開発の努力がなされている。例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０３０９５３号は、とくに一本または二本鎖ポリヌクレオチド試料（例えば自然発生ＲＮＡまたはＤＮＡ）中のヌクレオチド塩基または塩基対の配列がこれをナノポアの開口部内にまたはこれに隣接して並置されたプラズモンナノ構造を備えるナノ多孔質基板を通して転位させることにより読まれる、新規高速配列決定装置について開示する。この装置では、プラズモンナノ構造は、その中で（任意で標識された）各ヌクレオチド塩基が順に光子を入射光との相互作用により特徴的に蛍光またはラマン散乱させるように誘導される、検出窓（本質的には電磁場）を画定する。こうして生成された光子はその後遠隔検出され、多重化され、その情報内容がポリヌクレオチドに関連するヌクレオチド塩基配列に特徴的であるデータストリームに変換される。この配列はその後、それと一体化したマイクロプロセッサまたはそれに付属した補助計算装置中にプログラムされた対応するソフトウェアにおいて具現化された計算アルゴリズムを用い、データストリームから回収することができる。プラズモンナノ構造およびそれらの関連共鳴特性の使用についてのさらなる背景は、例えばＡｄｖ．Ｍａｔ．２００４，１６（１９）ｐｐ．１６８５−１７０６を参照することができる。

ポリヌクレオチドの高速配列決定の別の装置は、例えば、米国特許第ＵＳ６６２７０６７号、第ＵＳ６２６７８７２号および第ＵＳ６７４６５９４号に記載される。そのもっとも単純な形態では、この装置はプラズモンナノ構造の代わりに電極を用い、基板上またはナノポアの開口部中もしくは周辺の検出窓を画定する。次に電極に異なる電位が印加され、その間を流動するイオン性媒体の電気特性の変化が、ナノポアを通るポリヌクレオチドおよび関連電解質の電気泳動的転位の結果として、時間の関数で測定される。この装置では、さまざまな個別のヌクレオチド塩基が検出窓を通過する際、それらはこれを連続的に閉塞および開放する「事象」を引き起こし、電流または抵抗の特徴的な変動をもたらす。これらの変動はその後上述したような分析に適したデータストリームを生成するのに用いられる。

安定な液滴ストリーム、とくに微小液滴ストリームの生成は、分子生物学においてすでに用途を有するもう１つの技術開発分野である。例えば、米国特許第ＵＳ７７０８９４９号は安定な油中水滴を生成する新規マイクロ流体方法を開示し、例えば米国特許第ＵＳ２０１１／０２５０５９７号は１つの核酸テンプレート（一般的にはポリヌクレオチドＤＮＡまたはＲＮＡ断片）およびポリメラーゼ連鎖反応を用いてテンプレートを増幅させることができる複数のプライマー対を含有する微小液滴を生成するためのこの技術の利用について記載する。当技術分野に関する他の特許出願としては一般的には日本国特許第ＪＰ２００４／２９０９７７号、第ＪＰ２００４／３５１４１７号、米国特許第ＵＳ２０１２／０１２２７１４号、第ＵＳ２０１１／００００５６０号、第ＵＳ２０１０／０１３７６１６３号、第ＵＳ２０１０／００２２４１４号および第ＵＳ２００８／０００３１４２号が挙げられる。

国際公開第ＷＯ２００４／００２６２７号は、アップストリームおよびダウンストリームマイクロ流体領域間に不連続部分を形成するステップを含む各種装置を用いる液体−液体および気体−液体分散物の形成方法について開示する。しなしながら、単一ヌクレオチドＤＮＡ配列決定に対するその用途は教示されていない。

国際公開第ＷＯ２０１０／０７７８５９号は、電極を備える基板、反応器経路、ならびにヌクレオチド塩基、洗浄バッファー、試料および酵素リザーバを備える液滴アクチュエータについて教示する。アクチュエータは一般的には核酸の増幅および配列決定に有用であると言及されるが、我々が後述する分析物分解方法の教示はない。むしろ、これは完全に異なる方法に関し；パイロシーケンシングを用いる分析物の相補鎖の合成を観察するものである。米国特許第ＵＳ２００９／０２８０４７５号は同様の対象に関する。

我々はここで、１つの実施形態では分析物の漸進的分解によりその順序が分析物中の配列に特徴的なヌクレオチド塩基のストリームを生成するステップ；およびその後各ヌクレオチド塩基を検出を可能にするように捕捉するステップを含む新規配列決定方法を開発した。

国際公開第ＷＯ９４／１８２１８号は、単一ヌクレオチドの順序づけられたストリームが分析物から分離され、その後各ヌクレオチドがレーザーを用いて励起され、その特徴的なスペクトル発光が検出される蛍光増強固体マトリックス中に含有されるゲノム配列決定装置について開示する。この配列決定装置により用いられる単一ヌクレオチド転位方法は、一連の液滴ではなく流動非混和性液体の単一の二重シースを形成するステップを含む。さらに、記載される配列決定装置は我々が記載するタイプの捕捉システムおよびフルオロフォア解放方法を用いるよりむしろ直接単一ヌクレオチドを検出することを求める。発光を検出する際に信号対雑音比の問題を引き起こすため、これは欠点であると我々は考える。これは配列決定装置自体の全体的な感度およびしたがって実用可能性を妥協するだろう。

Stephan et al Journal of Biotechnology 86(2001)pp.255-267は、フルオロフォアで標識された固定化ＤＮＡ試料のエキソヌクレアーゼ分解により生成される単一ヌクレオチドを計数する一般的な方法について教示する。しかしながら生成される異なる単一ヌクレオチドタイプ間の識別についての情報は提供されていない。

デオキシリボヌクレオチド三リン酸の形態の単一ヌクレオチド塩基のストリームを生成するためのポリヌクレオチドの漸進的加ピロリン酸分解の使用は、http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/happy/HappyGroup/seq.htmlで概略的な形態で開示されたが、用いられる実際の方法についての情報はほとんど提供されていない。さらに、国際公開第ＷＯ０３／０８０８６１号は、インテリジェントな染料で標識されたピロリン酸アニオンの存在下で行われる加ピロリン酸分解によりＤＮＡ分析物が単一ヌクレオチドの順序づけられたストリームに順次分解される配列決定方法について記載する。１つの例ではピロリン酸アニオンはこれが結合した特定のヌクレオチドタイプに応じて異なる蛍光寿命を有する染料ＪＦ−４で標識される。標識単一ヌクレオチドのストリームは次にレーザーにより励起され、分光分析され、ヌクレオチドの性質およびしたがってその順序が決定される。ここでも同様に、以下に我々が記載する捕捉システムおよびフルオロフォア解放方法を用いるよりむしろ直接単一ヌクレオチドが検出される。したがってこの方法も信号対雑音比およびしたがって感度の問題を引き起こすだろうと考えられる。

本発明によると、（１）分析物から単一ヌクレオチド塩基のストリームを生成するステップ；（２）各単一ヌクレオチド塩基を捕捉システムと反応させることにより捕捉分子を生成するステップ；（３）捕捉分子の少なくとも一部を増幅させ、単一ヌクレオチド塩基に特徴的な複数のアンプリコンを生成するステップ；（４）アンプリコンを、特徴的な検出可能要素を有する対応プローブで標識するステップ；および（５）検出可能要素に特徴的な特性を検出するステップ、により特徴づけられる、ポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法が提供される。

本発明の方法のステップ（１）は、ポリヌクレオチド分析物から単一ヌクレオチド塩基のストリームを生成すること含む。このステップで用いられる分析物は、適切には、多数のヌクレオチド塩基からなる二本鎖ポリヌクレオチドである。原則的に、ポリヌクレオチドの長さは、無制限とすることができ、ヒトゲノム断片中に見られる最大数百万のヌクレオチド塩基を含む。分析物自体は、適切には、自然発生のＲＮＡまたはＤＮＡであるが、本方法は、合成生成のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは自然の中で一般的には見られないヌクレオチド塩基；すなわち、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基を全体的または部分的に構成する他の核酸を配列決定するのに用いることもできる。これらの例としては、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、ワイブトシン、シュードウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−エチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンおよび２−Ｏ−メチルウリジンが挙げられる。

ステップ（１）は、適切には、ポリヌクレオチド分析物を基板に結合させる第１サブステップをさらに含む。一般的に、基板は、マイクロ流体表面、マイクロビーズまたはガラスもしくは非分解性ポリマーからなる透過性膜を備える。好適には、基板は、分析物を受け入れるよう適合した表面をさらに備える。分析物をこうした表面に結合させることができる多数の方法があり、原則的にはそのすべてを用いることができる。例えば、１つの方法は、ガラス表面をエポキシシラン、アミノヒドロカルビルシランまたはメルカプトシランのような官能化シランでプライミングすることを含む。こうしてもたらされた反応性部位は、次に、末端アミン、スクシニルまたはチオール基を有する分析物の誘導体で処理することができる。

ステップ（１）の１つの実施形態において、分析物は、その順序が前者の配列に対応する単一ヌクレオチド塩基のストリームを生成するよう処理される。このステップは、好適には、酵素を含む反応媒体の存在下で２０〜９０℃の範囲内の温度で行われる。好適に、この処理は、単一ヌクレオチド塩基が反応ゾーンから連続的に除去されるように非平衡流の条件下で行われる。もっとも好適には、反応は、酵素を含有する水性緩衝媒体に分析物が結合した表面上を連続的に流動させることにより行われる。

この実施形態の好適な形態において、ステップ（１）で用いられる酵素は、適切な反応速度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸をもたらす分析物の漸進的３’−５’加ピロリン酸分解を生じさせることができるものである。好適には、この分解速度は、可能な限り速く、１つの実施形態では毎秒１〜５０、好適には１〜２０ヌクレオチド塩基の範囲内にある。ポリヌクレオチドに適用されるような加ピロリン酸分解反応についてのさらなる情報は、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４（１９６９）ｐｐ．３０１９−３０２８を参照することができる。この加ピロリン酸分解反応で用いられる酵素は、好適には、反応条件下で本質的にエキソヌクレアーゼ活性もエンドヌクレアーゼ活性も示さないポリメラーゼからなる群から選択される。有利に用いることができるポリメラーゼの例としては、これらに限定されないが、大腸菌（例えばクレノウ断片ポリメラーゼ）、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（例えばＴａｑ Ｐｏｌ）ならびにバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・カルドベロックス（Bacillus caldovelox）およびバチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）のような細菌から得られる原核生物ｐｏｌ１型酵素または酵素誘導体が挙げられる。適切には、加ピロリン酸分解は、ピロリン酸アニオンおよびマグネシウムカチオンを好適にはミリモル濃度でさらに含む媒体の存在下で行われる。本発明の別の実施形態において、デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、分析物をエキソヌクレアーゼおよびキナーゼで処理することにより、２ステップで生成することができる。

本発明の方法のステップ（２）において、ステップ（１）で生成された各単一ヌクレオチド塩基は、ヌクレオチド塩基の１つ以上のオリゴマーを含む捕捉システム自体により捕捉される。好適には、このステップが行われる前に、単一ヌクレオチド塩基を含有する水性媒体がピロホスファターゼで処理され、すべての残留ピロリン酸がリン酸アニオンに加水分解される。

第１実施形態において、捕捉システムは、あるクラスの第１および第２オリゴヌクレオチドの対の１つを備える。こうした対における第１オリゴヌクレオチドは、好適には、（ａ）第１二本鎖領域および（２）ｎを１より大きい、好適には５より大きいものとした、ｎヌクレオチド塩基からなる第２一本鎖領域を備える。１つのサブクラスにおいて、第１オリゴヌクレオチドは、前駆体の３’末端を部分的に折り畳み、「ｊ形状」と呼ぶことができる構成をもたらすことにより二本鎖領域が形成された概念的なまたは実際の一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体から誘導される分子構造を有するものとみなすことができる。別のサブクラスにおいて、第１オリゴヌクレオチドは、第３の短い一本鎖オリゴヌクレオチドを長い第４の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端上にハイブリダイズした後、二本鎖である得られる分子の末端を例えば２つの鎖の末端ヌクレオチドを架橋する保護基により「平滑」にすることにより生成される。一般的に、第１オリゴヌクレオチドの全長は、最大１５０ヌクレオチド塩基、好適には２０〜１００ヌクレオチド塩基である。これと同時に、整数ｎは、５〜４０、好適には１０〜３０であることが好ましい。

対における第２オリゴヌクレオチドに関して、これは一本鎖であり、適切には、全体的または部分的に、二本鎖領域の末端の１ヌクレオチド塩基向こうの第１オリゴヌクレオチドの一本鎖領域のそれの補体であるヌクレオチド塩基配列を有する。第２オリゴヌクレオチドの長さは重要ではなく、これが結合することができる一本鎖領域より長くも短くもすることができるが、好適には、ｎ−１ヌクレオチド塩基長ではない。より好適には、第２オリゴヌクレオチドの長さは、捕捉分子中その２つの鎖の一方または他方に不対ヌクレオチド塩基（例えば２〜１０ヌクレオチド塩基）の短いオーバーハングが残るように選択される。このクラスの捕捉システムは、単一ヌクレオチド塩基を第１オリゴヌクレオチドの二本鎖末端に結合させ、第２オリゴヌクレオチドを残った一本鎖領域上にハイブリダイズおよびライゲートし、そのオーバーハング以外は二本鎖である捕捉分子を生成することにより機能する。

第２実施形態において、捕捉システムは、それぞれその末端が２つの異なる二本鎖領域に結合した一本鎖ヌクレオチド領域からなるあるクラスの単一オリゴヌクレオチドを備える。このクラスの捕捉システムでは、一本鎖ヌクレオチド領域は標的の検出に極めて選択的なプローブを形成するのみの１つのヌクレオチド塩基、すなわちストリーム中の相補的単一ヌクレオチド塩基を備える。

二本鎖オリゴヌクレオチド領域について、それらは、それぞれ好適にはクローズドループである２つのオリゴヌクレオチド前駆体から、または後者の末端を折り畳むことにより２つのクローズドループオリゴヌクレオチド領域および一本鎖ヌクレオチド領域を構成する中間ギャップをもたらす一般的な一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体から誘導される、または誘導可能であることが好ましい。すべての場合において、効果は同じであり；一本鎖ヌクレオチド領域の末端には標的の対応する５’および３’末端を結合させることができるオリゴヌクレオチド領域の他の鎖上の３’および５’自由末端が隣接するだろう。このように、捕捉システムの使用は、捕捉システムの利用可能な３’および５’末端を結合することにより一本鎖ヌクレオチド領域を標的単一ヌクレオチド塩基に結合させ、その全長に沿って二本鎖である捕捉分子をもたらすプロセスを含む。

適切には、二本鎖オリゴヌクレオチド領域の長さは、最大５０ヌクレオチド塩基対、好適には最大４５ヌクレオチド塩基対、より好適には５〜４０ヌクレオチド塩基対の範囲内、もっとも好適には１０〜３０の範囲内である。より長い領域を用いてもよいが、標的による一本鎖ヌクレオチド領域へのアクセスが絡み合いによって制限され得るという潜在的なリスクがある。このことは、本実施形態を、潜在的にあまり魅力的ではないものにしてしまう。

上記クラスの両方について、ステップ（２）において、異なる相補的ヌクレオチド塩基にそれぞれ選択的であり、ハイブリダイゼーションにより異なる特徴的なプローブを結合することができる特徴的なヌクレオチド領域をそれぞれ有する捕捉分子の少なくとも２つの異なるセットの混合物を同時に用いることが好ましい。少なくともこの特徴的なヌクレオチド領域は、次にステップ（３）で増幅され、ステップ（４）でプローブを結合させることができる複数のアンプリコンが生成される。分析物がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、それぞれ異なるヌクレオチド塩基および異なるプローブについて選択的である４つの異なる捕捉システムを同時に用いることがもっとも好ましい。

ステップ（２）は、適切には、単一ヌクレオチド塩基が捕捉され、全体的に二本鎖であるかまたはある程度の上記鎖オーバーハングを除いて二本鎖である捕捉分子を生成する条件下、ストリーム中の各単一ヌクレオチド塩基を捕捉システム、もっとも好適には上述した４成分捕捉システムと接触させることにより行われる。この捕捉は、適切には、単一ヌクレオチドおよび捕捉システムを第２ポリメラーゼおよびリガーゼを含む２成分酵素システムの存在下で３０〜８０℃の範囲内の温度で接触させることにより行われる。好適な実施形態において、第２ポリメラーゼは、ステップ（１）で用いられるものと同じであり、これによりこれを追加成分の形態で添加する必要を回避する。

本発明の方法のステップ（３）では、捕捉分子が、ステップ（２）で生成された生成物混合物と適合性のある当技術分野で利用可能な方法のいずれかを用いて増幅される。これらの方法は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅およびローリングサークル増幅のような熱サイクルおよび等温方法が挙げられ；これらのうちローリングサークル増幅は、上述した捕捉分子の第２クラスから誘導される捕捉分子にとくに有用である。これらの手段のいずれかにより、捕捉分子およびその配列補体の一部の多数のコピー（一般的には当技術分野においてアンプリコンと称される）を急速に形成することができる。これらの増幅方法のいずれかを行う正確な方法は当業者には周知であり、文献において容易に入手可能である。例えばポリメラーゼ連鎖反応の場合、その方法は、一般的には（ａ）捕捉分子を実際に対応する一本鎖状態に展開するように高温で変性させるステップ、（ｂ）短い一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを展開捕捉分子上にその３’末端またはその近傍でアニールするステップ、（ｃ）プライマーを５’−３’方向に展開捕捉分子の相補鎖が形成されるまで伸長するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の生成物を変性させ、展開捕捉分子および相補鎖をともに一本鎖形態で再生するステップならびに（ｅ）ステップ（ｂ）〜（ｄ）を複数回繰り返し、アンプリコンの複数コピーを急激に形成するすステップを含む。よって、実際には、ステップ（３）は、ステップ（２）の生成物を、少なくとも１つのプライマー、ポリメラーゼ、およびＤＮＡの場合には例えばその特徴的な４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の混合物で処理することを含む。ステップ（３）は、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のすべての導入を含むため、捕捉システムによるこれらの添加されたデオキシリボヌクレオチド三リン酸の捕捉が防止され、生成される他のヌクレオチド塩基に特徴的なさらなる捕捉分子を回避することが重要である。これは、例えば、ステップ（２）で用いられたリガーゼを、例えば熱処理により、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の添加前に不活性化することにより達成してもよい。その他の点では、ステップ（３）のポリメラーゼ連鎖反応を行うのに用いられる反応条件および試薬は、適切には当技術分野において記載されるものである。上述した４成分システムの場合、ステップ（３）は、各対が捕捉システム中の４つの第２オリゴヌクレオチドの１つ以上について選択的な、最大４つの異なるプライマー対の添加を含むだろう。好適な実施形態では、捕捉システム中の４つの第２オリゴヌクレオチドのすべてに選択的である単一プライマー対が用いられる。

本発明の方法のステップ（４）において、アンプリコンは、特徴的な検出可能要素を有するプローブで標識される。このステップは、ステップ（３）における増幅の最終サイクルが完了した後またはより好適にはステップ（３）が行われるのと同時に行うことができる。適切には、プローブは、プローブがアンプリコンに結合するまでは検出可能要素が検出可能でないものであり、また、適切には、検出可能要素により示される検出可能特性は、蛍光である。好適には、プローブは、ハイブリダイゼーションによりその対応するアンプリコン上の特有の配列に結合することができるオリゴヌクレオチドである。１つの実施形態において、使用されるプローブは、当技術分野において分子ビーコンとして知られるものの一例である。分子ビーコンは、一般的には、一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、これは実際には折り畳まれ、ビーコンのセンサーとして作用する残った一本鎖ループおよび２つの末端に隣接するヌクレオチド塩基が相補的なヌクレオチド塩基対合によって互いに結合し、これにより二本鎖領域となる短いステムがもたらされる。この配置は、一本鎖ループが概念的な二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ末端の相補鎖に結合したヘアピンに例えることができ、高度に歪んでいる。（ここでは互いに隣接し、ステムの遠端にある）オリゴヌクレオチドの自由３’および５’末端には、それぞれフルオロフォアおよびクエンチャが結合する。それらを互いに近接させることにより、それらの未使用状態で顕著な蛍光が発生しないようにする。本明細書において用いられる場合、分子ビーコンは、そのループがアンプリコンの特有の配列に選択的にハイブリダイズし、その際さらなる歪みをもたらし、これがビーコンのステムを展開させ、フルオロフォアおよびクエンチャを離し、ビーコンを蛍光させることができるように選択される。ここでも同様に上述の４成分システムを用いる場合には、それぞれアンプリコンの１つに選択的な４つの分子ビーコンの混合物が用いられる。用いることができる代替プローブとしては、例えば、Ｔａｑｍａｎプローブ、スコーピオンプローブおよび同様に挙動することができる分子を挙げることができる。

最後に、ステップ（５）では、アンプリコンに結合することにより活性化される検出可能要素が検出され、特定の単一ヌクレオチド塩基を識別すること、および分析物中のヌクレオチド塩基の配列を検出に関連したデータストリームから回収することを可能にする。これを行う方法は、当技術分野において周知であり；例えば、活性化分子ビーコンからの蛍光をそのフルオロフォアの特徴的な蛍光波長または波長包絡線に対して調整された光検出器または同等の装置を用いて検出してもよい。これにより、光検出器は次いで、特定のヌクレオチド塩基タイプに特徴的な、例えばコンピュータによる処理およびその後の分析が可能な電気信号を生成する。

図１は、それぞれ単一ヌクレオチド塩基を含有する微小液滴を上述したようなタイプの捕捉システムと反応させるマイクロ流体配列決定装置を概略的に例示するものである。

とくに好適な実施形態において、本発明の方法は、全体的または部分的に、微小液滴中で行われる。こうした方法は、例えば、ステップ（１）で生成された単一ヌクレオチド塩基を、順序の維持を補助する炭化水素またはシリコーン油のような非混和性担体溶媒中の対応する水性微小液滴のストリームに１つずつ挿入することにより開始してもよい。有利には、これは、例えば、反応媒体を適切な寸法の微小液滴ヘッドから溶媒の流動ストリームに入れることにより、加ピロリン酸分解反応ゾーンの微小液滴ダウンストリームを直接形成することによって行うことができる。あるいは、反応媒体の小さなアリコートを溶媒中に懸濁させた既存の水性微小液滴のストリームに、順次注入することができる。この後者の方法が用いられる場合、各微小液滴は、適切には、捕捉システムの成分ならびに各種酵素およびステップ（２）を行うのに必要なその他の試薬（例えばバッファー）を含有してもよい。最終的には、前者の実施形態において形成された微小液滴を、その後こうした既存の微小液滴のストリームと合体させ、同様の結果を達成することができる。この実施形態において、ステップ（５）は、次に、各液滴を調査し、アンプリコンにより活性化された検出可能要素およびよってそれが含有するヌクレオチド塩基の性質を識別することを、好適に含む。

所定の微小液滴が２つ以上の単一ヌクレオチド塩基を含有するというリスクを回避するため、ステップ（１）の単一ヌクレオチド塩基は、各充填微小液滴が１〜２０個、好適には２〜１０個の空の液滴で離されるような割合で放出されることが好ましい。その後、溶媒中の充填されたおよび充填されていない微小液滴のストリームを、流路、適切にはマイクロ流体流路に沿って、微小液滴が離散状態に維持され且つ互いに合体する機会を持たないような割合および方法で、流動させる。適切には、用いられる微小液滴は、１００ミクロン未満、好適には５０ミクロン未満、より好適には２０ミクロン未満、さらにより好適には１５ミクロン未満の直径を有する。すべてのそれらの直径のうち、２〜２０ミクロンの範囲内がもっとも好適である。１つの実施形態において、システム全体を通る微小液滴流量は、毎秒５０〜３０００液滴、好適には１００〜２０００液滴の範囲内である。

ここで、本発明を、下記の実施例を参照しながら例示する。

捕捉システムの調製および使用
下記の実験は、第１オリゴヌクレオチドがｊ形状であり、第２オリゴヌクレオチドが一本鎖である捕捉システムを用いる、単一ヌクレオチド塩基の捕捉およびフルオロフォアの解放について例示する。

上述したようなｊ形状オリゴヌクレオチドの試料は、次の配列：
ｇｔａｇｇｔｃｃｔｇｇｃａｃａｇａｇａａａａｇｇａｇＧｃａｇｔｇａｔｇｔｔｃｃａｔｇａｃｔｇａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｇｔｃａｔｇｇａａｃａｔｃａｃｔ^＊ｇ
を有する７５ヌクレオチド塩基、一本鎖オリゴヌクレオチドを折り畳むことにより調製され、配列中、ｇ、ｔ、ｃ、およびａは、ＤＮＡのヌクレオチド塩基の従来の概念を示し、^＊は、ホスホロチオ酸結合の存在を示す。折り畳みは、このオリゴヌクレオチドの水性溶液を９５℃まで加熱した後、１℃当たり１０分の速度でゆっくり室温まで冷却することにより行われる。こうして得られたｊ形状分子は、捕捉部位（上記配列中の大文字）である単一ヌクレオチド塩基に結合した残った一本鎖オリゴヌクレオチド領域（ｇｔａｇｇｔｃｃｔｇｇｃａｃａｇａａａａａａｇｇａｇ）を備える。

次の配列：
＾ｃｔｃｃＴＴＸＴＴｔｃｔｇｔｇｃｃａｇａ
を有する対応する一本鎖オリゴヌクレオチドも調製され、配列中、＾は、５’リン酸基を表し、大文字のＴは、アジド結合剤によってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８染料で標識されたチミン塩基を表し、Ｘは、ＢＨＱ−１クエンチャで標識されたチミン塩基を表す。

次いで、別々の捕捉およびヌクレオチド塩基混合物が調製される。捕捉混合物は、次の配合組成：
２．５μｌの１０×バッファーＩＩ
５μｌの１０×Ｔａｑリガーゼバッファー（ＮＥＢ）
２．５μｌの１００ｎＭの上記ｊ形状分子
５μｌの１００ｎＭの上記一本鎖オリゴヌクレオチド
２μｌの熱安定無機ピロホスファターゼ（ＮＥＢ）
５μｌのＴａｑリガーゼ（ＮＥＢ）
１μｌの２５ｍＭのＭｎＳＯ４
２５μｌの水
から誘導されるものに対応する組成を有し、ヌクレオチド塩基混合物の組成は、加ピロリン酸分解ステップから得られた材料を模倣するよう設計され、配合組成：
２．５μｌの１０バッファーＩＩ（Ａｍｐｌｉｔａｑを含み、マグネシウムを含まない）
１．５μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２
２．５μｌの１０ｎＭのデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）
２μｌのＡｍｐｌｉｔａｑ（５Ｕ／μｌ）
２．５μｌの１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム
２５μｌの水
から誘導されるものに対応する。

次に、等しい体積のこれらの２つの混合物を混合し、得られる生成物を５０℃でインキュベートすることにより、ｄＣＴＰの捕捉が行われる。これは、一般的には、３０分で完了する。

捕捉システムを用いた液滴マイクロ流体方法
図１は、それぞれ単一ヌクレオチド塩基を含有する微小液滴を上述したようなタイプの捕捉システムと反応させるマイクロ流体配列決定装置を概略的に例示するものである。

ヒトＤＮＡに由来する１００ヌクレオチド塩基ポリヌクレオチド分析物の漸進的加ピロリン酸分解により得られる単一ヌクレオチドのストリームを含む水性媒体１を、ＰＤＭＳポリマーからなる直径１０ミクロンのマイクロ流体チューブを通って流動させる。加ピロリン酸分解反応自体は、Ｔａｑ Ｐｏｌならびにそれぞれ１リットル当たり２ミリモル濃度のピロリン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含む７２℃の水性緩衝（ｐＨ８）反応媒体のストリームを、分析物がスクシニル架橋により予め結合したガラスマイクロビーズに通すことにより行われる。マイクロビーズのダウンストリームである１中の単一ヌクレオチド塩基の順序は分析物の配列に対応する。１が液滴ヘッド２から第１チャンバー３に現れ、ここで非混和性軽質シリコーン油４の１つ以上のストリームと接触する。これらのストリームの速度は、乱流混合を回避し、それぞれ約８ミクロンの直径を有する油中に懸濁させた水性球状液滴５を形成するように選択される。一般的に、割合は、隣接する充填液滴の間に１０個の空の液滴が存在するように調節される。５のストリームは、次に、同じ直径の第２マイクロ流体チューブに沿って、毎秒１０００液滴の割合で、５ミクロンの水性球状液滴７の第２ストリームも第２液滴ヘッド８により供給される第２チャンバー６まで推進される。液滴５および７は順次合体し、直径約９ミクロンの肥大した水性液滴９が形成される。７のそれぞれは、５のそれぞれに存在する残留ピロリン酸アニオンをすべて破壊するピロホスファターゼを含有する。

次いで、９のストリームは、マイクロ流体チューブによって同じ割合で第３チャンバー１０まで推進され、そこで、これらの液滴が対応する液滴ヘッド１２を通して同様に供給される５ミクロンの水性球状液滴１１の第３ストリームと接触される。９のそれぞれがチャンバー６および１０間を移動するのにかかる時間は、約２分である。

次いで、液滴９および１１は、１０において合体し、液滴１３（直径約１０ミクロン）が生成される。１１のそれぞれは、中温性リガーゼならびにｊ形状の第１オリゴヌクレオチドおよび４つの対応する第２一本鎖オリゴヌクレオチドの４つの対を備える捕捉システムを含有する。各ｊ形状第１オリゴヌクレオチドは、６０ヌクレオチド塩基長であり、６０ヌクレオチド塩基一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体を５’末端から第４５ヌクレオチド塩基辺りで折り畳み、３ヌクレオチド一本鎖ループ、１２ヌクレオチド塩基対二本鎖領域および３３ヌクレオチド塩基一本鎖領域をもたらすことにより調製され、４つの第１オリゴヌクレオチドのそれぞれで異なる。これらの４つの第１オリゴヌクレオチドのそれぞれは、ＤＮＡの４つの特徴的なヌクレオチド塩基タイプ（すなわちＡ、Ｔ、ＧおよびＣ）に特徴的な異なる第３３塩基（一本鎖末端から測定）も有する。４つの異なる第２オリゴヌクレオチドは、それぞれ、２８ヌクレオチド塩基長であり、それらの第１オリゴヌクレオチド対の第４および第３２ヌクレオチド塩基により画定される一本鎖領域のその部分と相補的である異なる配列を有する。

次いで、１３のストリームは、マイクロ流体チューブによって同じ速度で推進され、３０分後にホットスポットを通過し、リガーゼが不活性化され（１０〜２０分）、第３チャンバー１４に入り、そこで液滴ヘッド１６を通して同様に供給される５ミクロンの水性球状液滴１５の第４ストリームと合体する。１５のそれぞれは、第２オリゴヌクレオチドのそれぞれに選択的な４つの異なるプライマー対、Ｔａｑ Ｐｏｌ酵素、ＤＮＡに特徴的な４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸および１３で生成することができる４つの異なる捕捉分子から生成することができるアンプリコンの４つのタイプのそれぞれに選択的な４つの異なる分子ビーコンを含有する。１５は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う際に一般的に用いられる他の添加剤を含有してもよい。こうして形成された合体微小液滴１７のストリームは、次に、６０〜９５℃の２０〜３０の熱サイクル（毎分約１サイクル）にさらされ、その時間に、ポリメラーゼ連鎖反応による展開捕捉分子の増幅が行われる。この時間の終わりに、１７は、検出システムに移される。

検出システム（図示せず）は、一般的には、各液滴がレーザーからの入射光で調査される検出窓を備える。この光の作用は、次に、各液滴中の活性化分子ビーコンを、もともと捕捉分子中に組み込まれていた単一ヌクレオチド塩基に特徴的な方法で蛍光させる（液滴がもともと空だった場合は、本質的に一切蛍光しない）。次いで、この蛍光の存在または非存在が、上記４つの分子ビーコンの４つの特徴的な波長で検出される。このように、液滴を順に調査することにより、元のポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列を実際に読み出すことができる。蛍光の発現は一般的には急速であるが、空の液滴を確実に識別するため、各液滴の調査は、１０分が経過して初めて行われる。

Claims (21)

1. （１）加ピロリン酸分解酵素の存在下の漸進的加ピロリン酸分解により、分析物から単一ヌクレオチド塩基三リン酸のストリームを生成するステップ；（２）各単一ヌクレオチド塩基三リン酸を、ポリメラーゼ及びリガーゼの存在下、捕捉システムと反応させることにより捕捉分子を生成するステップ、ここで、前記捕捉システムは（ｉ）（ａ）二本鎖領域および一本鎖領域を備える第１オリゴヌクレオチド、ならびに（ｂ）そのヌクレオチド塩基配列が前記第１オリゴヌクレオチドの一本鎖領域のそれに少なくとも部分的に相補的である第２一本鎖オリゴヌクレオチド；又は（ｉｉ）その末端が２つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチド領域に結合した一本鎖ヌクレオチド領域を備える単一オリゴヌクレオチド、のいずれかを含む；（３）前記捕捉分子の少なくとも一部を増幅させ、単一ヌクレオチド塩基三リン酸に特徴的な複数のアンプリコンを生成するステップ；（４）前記アンプリコンを、特徴的な検出可能要素を有する対応プローブで標識するステップ；および（５）前記検出可能要素に特徴的な特性を検出するステップ、により特徴づけられる、ポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法。
2. 前記ストリーム中のヌクレオチド塩基の順序が、分析物中のヌクレオチド塩基配列に対応することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記捕捉システム（ｉ）が、ヌクレオチド塩基三リン酸の各タイプの２つの成分を備えることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記捕捉システム（ｉｉ）が、ヌクレオチド塩基三リン酸の各タイプの単一オリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記ポリヌクレオチド分析物が、表面に結合されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ステップ（１）の反応条件下で、前記加ピロリン酸分解酵素が、エキソヌクレアーゼ挙動もエンドヌクレアーゼ挙動も示さないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. ステップ（１）が、加ピロリン酸分解酵素、ピロリン酸アニオンおよびマグネシウムカチオンを含む流動水性媒体の存在下で非平衡条件下で行われ、単一ヌクレオチド塩基が、それらが生成される反応ゾーンから連続的に除去されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. ステップ（１）および（２）の間に、残留ピロリン酸アニオンが、ピロホスファターゼによりすべて破壊されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 捕捉システム（ｉ）において、前記第１オリゴヌクレオチドがｊ形状であることを特徴とする、請求項１〜３および５〜８のいずれかに記載の方法。
10. 捕捉システム（ｉ）において、前記第１オリゴヌクレオチドの全長が、２０〜１００ヌクレオチド塩基であることを特徴とする、請求項１〜３および５〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記捕捉システム（ｉ）が、４つの異なる第１オリゴヌクレオチド中の４つの異なる一本鎖領域の１つの一部に相補的な配列をそれぞれ有する４つの異なる第２オリゴヌクレオチドタイプを備えることを特徴とする、請求項１〜３および５〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記捕捉システム（ｉｉ）において、各二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、１０〜３０ヌクレオチド対からなることを特徴とする、請求項１、２および４〜８のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記捕捉システム（ｉｉ）において、それぞれクローズドループである一本鎖ヌクレオチド領域から離れた末端を備える２つの別々の二本鎖オリゴヌクレオチド領域が用いられることを特徴とする、請求項１、２、４〜８および１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記捕捉システム（ｉｉ）において、前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体から、その末端を折り畳み、前記一本鎖ヌクレオチド領域からなるギャップをもたらすことにより誘導可能であることを特徴とする、請求項１、２、４〜８、１２および１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記捕捉システムが、各タイプが異なるヌクレオチド塩基に選択的である少なくとも２つの異なる捕捉システムタイプを備えることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. ステップ（３）および（４）が同時に行われることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. ステップ（３）の増幅がポリメラーゼ連鎖反応、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅およびローリングサークル増幅から選択される方法を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. ステップ（２）で用いられるリガーゼが、ステップ（４）を行う前に不活性化されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. ステップ（４）で用いられる前記プローブが、分子ビーコンおよびスコーピオンプローブから選択されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
20. ステップ（５）が、活性化プローブ上でフルオロフォアにより発光される蛍光を検出することを含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
21. ステップ（１）〜（５）の少なくとも１つが、微小液滴中で行われることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。

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