KR101733973B1 - 방사성 요오드 표지 아자이드 추적체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단용 조성물 - Google Patents

방사성 요오드 표지 아자이드 추적체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사성 요오드 표지 아자이드 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물은 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)이 포함된 생체분자 또는 나노입자를 copper-free 클릭반응을 통하여 빠른 반응 속도와 높은 방사화학 수율로 방사성 요오드를 표지시킬 수 있고, 생체 내에서 안정하며, 간 및 신장에 빠른 속도로 흡수되어 집적되고, 빠른 체외 배출 속도를 나타내므로, 생체분자 또는 나노입자의 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

방사성 요오드 표지 아자이드 추적체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단용 조성물{Iodine radioisotope-labeled azide tracers, preparation method thereof and compositions containing the same as an active ingredient for use Iodine radioisotope-labeling or medical diagnosis}
본 발명은 방사성 요오드 표지 아자이드 추적체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단용 조성물에 관한 것이다.
지난 수십년 동안 방사성 요오드(Iodine)는 진단 및 치료를 목적으로 한 생체분자의 방사성 표지에 사용되어왔다. 구체적으로, 124I는 양전자 방출 단층촬영(PET, positron emission tomography)에, 123I 및 125I는 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT, single photon emission computed tomography)에 주로 사용되는 방사성 요오드이며, 131I는 갑상선 암과 같은 질병의 치료에 사용되고 있다.
상술한 바와 같이 방사성 요오드가 의학적으로 광범위하게 사용됨에 따라 생체분자 및 작은 단위의 분자에 방사성 요오드를 표지하기 위한 다양한 표지 방법들이 개발되어 왔다. 그 중, 친전자성 방향족 치환 반응은 직접적으로 방사성 동위원소를 표지할 수 있는 방법으로 높은 효율성을 보인다. 그러나, 상기 표지 방법을 통하여 합성한 표지화합물은 대부분 동물 체내에서 불안정해져 원하는 영상 결과를 얻지 못하는 경우가 많고, 표지를 위해 사용되는 강한 산화제는 생체 물질의 생리 활성을 감소시키는 결과를 나타내었다. 상기와 같은 문제를 해결할 수 있는 방사성 요오드를 간접적으로 표지합성 하는 방법이 연구되어 몇몇 보결분자단(prosthetic group)이 개발되었다. 그러나, 현재까지 개발된 방사성 요오드를 간접적으로 표지합성하는 방법은 활성기에 대한 화학 선택성이 없어 무작위적인 표지화합물이 생성되는 경우가 많으며, 반응속도가 느려 높은 수율을 위해 과량의 기질이 요구되는 문제점이 있다.
따라서, 살아있는 세포 및 동물 내에서 안정하고, 강한 산화제로부터의 부작용이 적은 영상화 진단용 및 치료용 물질로서 응용할 수 있는 새로운 방사성 요오드 표지 방법의 개발이 필요하다.
최근 카퍼-프리 클릭(copper-free click)반응을 통하여 사이클로옥타인(cyclooctyne) 화합물을 사용한 표지 방법은 뛰어난 특이성과 빠른 반응 속도로 인해 핵의학 영상을 위한 방사성 동위원소 표지 방법으로 주목받고 있다. copper-free 클릭 반응을 사용하여 방사성 동위원소 18F 또는 64Cu가 표지된 소분자 및 펩타이드를 효율적으로 합성하는 방법이 개발되었다.
이에, 본 발명자들은 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물이 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)이 포함된 생체분자 또는 나노입자를 copper-free 클릭반응을 통하여 빠른 반응 속도와 높은 방사화학 수율로 방사성 요오드를 표지시킬 수 있고, 생체 내에서 안정하며, 간 및 신장에 빠른 속도로 흡수되어 집적되고, 빠른 체외 배출 속도를 나타내므로, 이를 사용하여 생체분자 또는 나노입자의 방사성 요오드 표지 및 의료 진단에 유용하게 활용할 수 있다는 것을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
Adam, M. J. et al. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 153. Van Nostrand, D. Tyroid 2009, 19, 1381. Koo, H. et al. Angew. Chem., Int. Ed. 2012, 51, 11836. Yan, R. et al. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 703.
본 발명의 목적은 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물를 사용한 생체분자 또는 나노입자 화합물의 방사성 요오드 표지방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물을 사용하여 방사성 요오드가 표지된 생체분자 또는 나노입자 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방사성 요오드가 표지된 생체분자 또는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 의료 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015088266112-pat00001
상기 화학식 1에서,
n은 2-10의 정수이고; 및
X는 방사성 요오드이다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 3으로 표시되는 화합물과 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 5로 표시되는 화합물을 얻는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 6으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 7로 표시되는 화합물을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 얻은 화학식 7로 표시되는 화합물과 방사성 요오드화 금속염을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 3);를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
Figure 112015088266112-pat00002
상기 반응식 1에서,
A는 할로겐이고;
R1은 직쇄 또는 측쇄의 C1- 6알킬 또는 C6- 8아릴이고;
n은 2-10의 정수이고; 및
X는 방사성 요오드이다.
나아가, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,
상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물과 화학식 9로 표시되는 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)을 포함하는 생체분자 또는 나노입자 화합물을 카퍼-프리 클릭(Copper-free click) 반응시켜 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 펩타이드 또는 나노입자 화합물의 방사성 요오드 표지방법을 제공한다:
[반응식 2]
Figure 112015088266112-pat00003
상기 반응식 2에서,
Z는 생체분자 또는 나노입자이고;
n은 2-10의 정수이고; 및
X는 방사성 요오드이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112015088266112-pat00004
상기 화학식 2에서,
Z는 생체분자 또는 나노입자이고;
n은 2-10의 정수이고; 및
X는 방사성 요오드이다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 의료 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 방사성 요오드가 표지된 아자이드 화합물은 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)이 포함된 생체분자 또는 나노입자를 copper-free 클릭반응을 통하여 빠른 반응 속도와 높은 방사화학 수율로 방사성 요오드를 표지시킬 수 있고, 생체 내에서 안정하며, 간 및 신장에 빠른 속도로 흡수되어 집적되고, 빠른 체외 배출 속도를 나타내므로, 생체분자 또는 나노입자의 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 4의 단계 2의 반응에서 시간에 따라 방사선-TLC를 사용하여 생성물을 분리한 데이터를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1의 마우스 혈청내에서의 시간에 따른 방사능을 측정한 그래프이다.
도 3은 실시예 4의 마우스 혈청내에서의 시간에 따른 방사능을 측정한 그래프이다.
도 4는 실시예 1의 ICR 마우스에 정맥투여하여 시간에 따른 장기 및 혈액 내의 생체내 분포(biodistribution)를 측정하여 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015088266112-pat00005
상기 화학식 1에서,
n은 2-10의 정수이고; 및
X는 방사성 요오드이다.
이하, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 있어서, 상기 n은 2-10의 정수이고, 바람직하게는 상기 n은 3-5의 정수이며, 보다 바람직하게는 n은 3이다.
또한, 상기 X는 방사성 요오드이고, 바람직하게는 상기 X는 122I, 123I, 124I, 125I, 127I, 131I 및 132I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방사성 요오드이며, 보다 바람직하게는 X 는 125I이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 화학구조적 특징은 방사성 요오드가 치환된 페닐아마이드기 및 폴리에톡시를 링커로 하여 아자이드(azide)기를 포함하는 화합물이다.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 아자이드기를 통하여, 디벤조사이클로옥타인(dibenzocyclooctyne)기를 가지는 화합물과 빠른 시간 내에 높은 수율로 copper-free 클릭 반응을 진행할 수 있으므로, 디벤조사이클로옥타인 기를 가지는 화합물이라면 방사성 요오드 표지를 용이하게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 3으로 표시되는 화합물과 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 5로 표시되는 화합물을 얻는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 6으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 7로 표시되는 화합물을 얻는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 얻은 화학식 7로 표시되는 화합물과 방사성 요오드화 금속염을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 3);를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112015088266112-pat00006
상기 반응식 1에서,
A는 할로겐이고;
R1은 직쇄 또는 측쇄의 C1- 6알킬 또는 C6- 8아릴이고;
n은 2-10의 정수이고; 및
X는 방사성 요오드이다.
이하, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 화학식 3으로 표시되는 아자이드 화합물과 화학식 4로 표시되는 벤조익 애시드 화합물을 HBTU(N,N,N′,N′-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트) 및 염기 존재 하에 펩타이드 커플링 시켜 화학식 5로 표시되는 아마이드 화합물을 얻는 단계이다.
이때, 상기 염기로는 피리딘, 트리에틸아민, N,N-다이이소프로필에틸아민(DIPEA), 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]-7-운테센(DBU) 등의 유기염기 또는 소듐하이드록사이드, 소듐카보네이트, 포타슘카보네이트, 세슘카보네이트, 소듐하이드라이드 등의 무기염기를 당량 또는 과량으로 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, DIPEA를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 단계 1에서 얻은 화학식 5로 표시되는 화합물의 할로겐기와 화학식 6으로 표시되는 틴 화합물을 팔라듐 촉매하에 반응시켜 화학식 7로 표시되는 화합물의 페닐에 틴 화합물이 치환된 화합물을 얻는 단계이다.
이때, 상기 팔라듐 촉매로는 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(Pd(Ph3P)4), 팔라듐 차콜(Pd-C), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐 다이클로라이드 (PdCl2(PPh3)2), 트리스(다이벤질리덴아세톤)팔라듐(Pd2(dba)3), [1,1-비스(다이페닐포스피노)페로센]다이클로로팔라듐(PdCl2(dppf)), 알릴팔라듐 클로라이드 다이머([PdCl(allyl)]2), 팔라듐 아세테이트(Pd(OAc)2), 팔라듐 클로라이드(PdCl2) 등을 사용할 수 있으며, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(Pd(Ph3P)4)을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 단계 2에서 얻은 화학식 7로 표시되는 화합물의 틴 치환기와 방사성 요오드화 금속염을 클로라민 T(Chloramine T)를 산화제로 사용하여 반응시켜 상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻는 단계이다.
여기서, 상기 방사성 요오드화 금속염은 방사성 요오드화 알칼리금속염이며, 상기 알칼리금속염은 리튬(Li), 소듐(Na), 칼륨(K), 루비듐(Rb) 및 세슘(Cs)염이 있으며, 바람직하게는 방사성 요오드화 소듐염이다.
나아가, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,
상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물과 화학식 9로 표시되는 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)을 포함하는 생체분자 또는 나노입자 화합물을 카퍼-프리 클릭(Copper-free click) 반응시켜 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 펩타이드 또는 나노입자 화합물의 방사성 요오드 표지방법을 제공한다.
[반응식 2]
Figure 112015088266112-pat00007
상기 반응식 2에서,
Z는 생체분자 또는 나노입자이고;
n은 2-10의 정수이고; 및
X는 방사성 요오드이다.
이하, 본 발명에 따른 상기 반응식 2로 표시되는 방사성 요오드 표지방법을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 상기 반응식 2로 표시되는 방사성 요오드 표지방법에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물의 아자이드와 화학식 9로 표시되는 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)을 포함하는 생체분자 또는 나노입자 화합물의 알카인이 Copper-free 클릭 반응을 통하여 트리아졸을 형성하여 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 표지방법을 통하여 상기 펩타이드 또는 나노입자 화합물에 방사성 요오드를 표지할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 반응식 2로 표시되는 방사성 요오드 표지방법에 있어서, 상기 생체분자는 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)을 포함하는 생체분자라면 특히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 펩타이드, 어피바디(affibody), 항체, 올리고뉴클레오티드이다.
이때, 상기 펩타이드로는 암 표적 펩타이드(tumor targeting peptide)로서, RGD 펩타이드, CGNSNPKSC 펩타이드, VHSPNKK 펩타이드, CTTHWGFTLC 펩타이드, SGKGPRQITAL 펩타이드, SGRSA 펩타이드, FSRYLWS 펩타이드 등이 있으며, 바람직하게는, RGD 펩타이드이다.
또한, 상기 어피바디는 한정되는 것은 아니나, Aβ 펩타이드(peptides), 아폴리포(Apolipo) 프로테인 A1, CD25, CD28, c-Jun, EGFR, Factor VIII, 피브리노겐(Fibrinogen), Gp120, HER2, IgA, IgE, IgM, IL-8, 인슐린(Insulin), RSV G 프로테인, Taq 폴리머라제(polymerase), TNF-α, 트랜스페린(Transferrin), 트랜스타이레틴(Transthyretin) 등의 단백질에 결합될 수 있는 7 KDa내의 소분자이다.
나아가, 상기 항체는 한정되는 것은 아니나, Anti-VEGFR, Anti-ERBB2, Anti-CD20, Anti-CD19, Anti-CD22, Anti-CD33, Anti-CD25, Anti-HLA-DR 10β, Anti-tenascin, Anti-CEA, Anti-MUC1, Anti-TAG 72 등이 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 한정되는 것은 아니나, DNA, RNA, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 있다.
본 발명에 따른 상기 반응식 2로 표시되는 방사성 요오드 표지방법에 있어서, 상기 나노입자는 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)을 포함하는 나노입자라면 특히 한정되는 것이나, 금속 나노입자, 합성 고분자 나노입자, 생체 고분자 나노입자 등일 수 있다.
이때, 상기 금속 나노입자는 한정되는 것은 아니나, 금(Au), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 은(Ag), 구리(Cu)등의 금속; 또는 코발트(Co), 망간(Mn), 철(Fe), 니켈(Ni), 가돌리늄(Gd), 몰리브데넘(Mo), 아연(Zn), 크롬(Cr)등의 금속의 금속 산화물;등이며, 바람직하게는 금 나노입자이다.
또한, 상기 합성 고분자 나노입자는 한정되는 것은 아니나, 폴리에틸렌글라이콜(poly(ethylene glycol)), 폴리비닐알코올(poly(vinyl alcohol)), 폴리아크릴릭산(poly(acrylic acid)), 폴리하이드록시에스터(poly(hydroxyester)), 폴리카프로락톤(poly(ε-caprolactone)), 폴리오르토에스터(poly(orthoester)), 고분자무수화물(polanhydride), 폴리포스파겐(polyphosphagene), 폴리프로필렌 퓨마레이트(poly(propylenefumarate)), 폴리글라이콜산(poly(glycolic acid)), 폴리락트산(poly(lactic acid)), 폴리(락트산-클라이콜산)공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리하이드록시뷰틸레이트(poly(hydroxybutyate)), 폴리(하이드록시뷰틸레이트-발레르산)공중합체(poly(hydroxybutyrate-co-valerate)), 폴리우레탄(poly(urethane)), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate))등이 있다.
나아가, 상기 생체 고분자 나노입자는 한정되는 것은 아니나, 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 폴리라이신, 히알유론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginic acid), 덱스트란(dextran), 셀룰로오스(cellulose)등이 있다.
또한, 상기 나노입자는 1 nm - 1000 nm의 크기이며, 바람직하게는 10m - 500nm 의 크기의 나노입자이고, 보다 바람직하게는 50 nm - 200 nm 의 크기의 나노입자이다. 상기 나노입자의 크기가 1 nm 미만인 경우에는 본 발명에 따른 방사성 요오드가 표지된 나노입자를 제조하기 어려운 문제가 있고, 1000nm 초과인 경우에는 나노입자 고유 특성을 잃을 수 있는 문제가 있다.
본 발명에 따른 상기 반응식 2로 표시되는 표지방법은 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용함으로써, 생체분자 또는 나노입자를 방사성 요오드 표지시킬 수 있으며, 60 분 이내의 빠른 속도로 반응이 진행됨과 동시에 80 %이상의 높은 방사화학 수율 값을 나타내고, 생체와 유사한 환경에서도 80 % 이상의 높은 방사화학 수율 값을 나타내므로 방사성 요오드 표지방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물을 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물을 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 방사성 요오드는 122I, 123I, 124I, 125I, 127I, 131I 및 132I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방사성 요오드이며, 바람직하게는 125I이다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용하여 반응 조건에 따른 방사화학 수율을 측정한 결과, 60분 내의 짧은 시간에 80% 내지 99%의 높은 방사화학 수율로 방사성 요오드 표지가 가능하고, 생체와 유사한 환경에서도 높은 방사화학 수율로 방사성 요오드 표지가 가능하므로, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 방사능 요오드 표지용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다(실험예 1 및 표 1 참조).
또한, 본 발명에 따른 화합물의 생체 내에서의 안정도를 평가한 결과, 본 발명에 따른 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물은 마우스 혈청에서 24시간 이상 경과하여도 90 % 이상의 높은 방사화학적 순도를 나타내므로, 본 발명에 따른 화합물은 생체 내에서 안정함을 확인 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물은 생체 내 물질의 방사성 요오드 표지용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다(실험예 2 및 도 2 및 3 참조).
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물을 유효성분으로 포함하는 의료 진단용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 방사성 요오드는 122I, 123I, 124I, 125I, 127I, 131I 및 132I로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방사성 요오드이며, 바람직하게는 125I이다.
또한, 상기 진단은 한정되는 것은 아니나, 단일광자방출단층촬영술(SPECT), 양전자방출단층촬영술(PET), 마이크로-PET, 컴퓨터 단층 활영(CT), 자기공명영상(MRI), 방사선 진단기기 등의 표적영상에 의한 진단이다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용하여 생체와 유사한 환경의 반응 조건에서 DBCO를 표지시켜본 결과, 생체와 유사한 환경에서도 높은 방사화학 수율로 반응이 진행됨을 확인함에 따라, 의료 진단용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다(실험예 1 및 표 1 참조).
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 생체 내 분포를 측정한 결과, 15분 내의 빠른 속도로 간 및 신장에 흡수되어 높은 농도로 집적되며, 2시간 내 90 % 이상이 체외로 배출된 것을 알 수 있으므로, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 의료 진단시에 진단을 빠르게 할 수 있으며, 진단 후, 체외로 배출되므로 방사성 물질이 체내에 잔류하는 것을 방지할 수 있어, 의료 진단용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다(실험예 3 및 도 4 참조).
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예에 대해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 125 I가 표지된 N-(2-(2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 ) 에톡시 )에틸)-4-아이오도벤즈아마이드의 제조
Figure 112015088266112-pat00008
단계 1: N-(2-(2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 ) 에톡시 )에틸)-4- 아이오도벤즈아마이드의 제조
2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에탄-1-아민(1091 mg, 5 mmol)의 건조 DMF(다이메틸포름아마이드)(15 mL)에 4-아이도벤조익 애시드(1240 mg, 5 mmol), HBTU(N,N,N′,N′-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트)(2000 mg, 5.26 mmol) 및 DIPEA(다이아이소프로필에틸아민)(1.74 mL)을 상온에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 3시간 교반시켰다. 반응 종류 후, 0.2M 염산 수용액(50 mL)를 반응액에 첨가하였다. 미정제 생성물(crude)를 에틸아세테이트로 세번 추출하고, 유기층을 합치고 MgSO4(황산마그네슘)으로 건조하여 감압농축하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸아세테이트 = 1:3)로 정제하여 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-아이오도벤즈아마이드(2017 mg, 90 % 수율)를 무색오일로 얻었다.
1H NMR (CDCl3): 7.77 (d, 2H, J = 8.4), 7.52 (d, 2H, J = 8.4), 6.81 (br s, 1H), 3.60-3.66 (m, 14H), 3.35 (t, 2H, J = 5.4).
13C NMR (CDCl3): 166.94, 137.71, 133.96, 128.85, 98.47, 70.67, 70.65, 70.56, 70.26, 70.08, 69.69, 50.67, 39.94.
HRMS ([M+H]+) Calcd for C15H22IN4O4 + : 449.0680; Found 449.0685.
단계 2: N-(2-(2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 ) 에톡시 )에틸)-4-( 트리부틸스태닐 )벤즈아마이드의 제조
상기 단계 1에서 얻은 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-아이오도벤즈아마이드 (224 mg, 0.5 mmol)의 건조 1,4-다이옥산(10 mL)에 Sn2Bu6(580 mg, 1 mmol) 및 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(Pd(Ph3P)4)(58mg, 0.05 mmol)을 상온에서 첨가하였다. 상기 반응액을 5시간 환류시키고, 상온에서 냉각하였다. 미정제 생성물를 에틸아세테이트로 세번 추출하고, 유기층을 합치고 MgSO4으로 건조하여 회전농축기(rotary evaporator)를 사용하여 농축하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸아세테이트 = 1:1)로 정제하여 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-(트리부틸스태닐)벤즈아마이드(198 mg, 65 % 수율)를 무색오일로 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6) 8.42 (t, 1H), 7.72 (d, 2H, J = 8.4), 7.48 (d, 2H, J = 8.4), 3.48-3.54 (m, 12H), 3.32-3.39 (m, 4H), 1.43-1.50 (m, 6H), 1.21-1.29 (m, 6H), 1.02 (t, 6H, J = 8.0), 0.81 (t, 9H, J = 7.3).
13C NMR (DMSO-d6): 167.02, 146.23, 136.54, 134.64, 126.90, 70.33, 70.30, 70.21, 70.15, 69.76, 69.42, 50.49, 29.11, 27.20, 14.07, 9.71.
HRMS ([M+H]+) Calcd for C27H49N4O4Sn+: 613.2770; Found 613.2781.
단계 3: 125 I이 표지된 N-(2-(2-(2-(2- 아지도에톡시 ) 에톡시 ) 에톡시 )에틸)-4-아이오도벤즈아마이드의 제조
상기 단계 2에서 얻은 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-(트리부틸스태닐)벤즈아마이드(1 mg)의 에탄올(200 μL), 클로라민 T(Chloramine T) 용액(2 mg의 40 μL)를 1 X PBS에 첨가하였다. [125I]NaI(133 MBq(megabecquerel))의 0.1 M NaOH (100 μL)을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응을 상온에서 15분간 교반하고, 소듐 메타바이설파이트 수용액으로 퀀칭하였다. 미정제 생성물를 prep HPLC(용리액 변화: 20% 솔벤트 B 0-2 분; 20-80% 솔벤트 B 2-22 분; 80-100% 솔벤트 B 22-23분; 100% 솔벤트 B 23-28, 보존시간(retention time): 18.3분)으로 정제하여 125I(113 MBq)가 표지된 목적화합물(85 % 방사화학 수율)을 얻었다.
방사화학 순도: 99 %(analytical HPLC), 비방사능(specific radioactivity); 40.7 GBq/μmol.
< 실시예 2> copper-free 클릭 반응을 통한 125 I 표지된 DBCO ( 다이벤조사이클로옥타인 )-아민의 제조
Figure 112015088266112-pat00009
DBCO-아민(2 μL), 상기 실시예 1에서 얻은 125I이 표지된 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-아이오도벤즈아마이드([125I]1, 0.16 MBq, 18 μL)를 DMSO(다이메틸설폭사이드) 또는 DMSO/마우스 혈장(plasma)(1/1)에 용해시켜 반응을 수행하였다. 반응 혼합물의 전체 부피는 20 μL로 고정하고, DBCO-아민의 최종 농축은 1 mM, 100 μM 및 10 μM로 변화시켜 반응을 수행하였다. 반응 온도는 상온 또는 37 ℃로 변화시키고, 반응 시간은 15분 또는 30분으로 변화시켜 수행하였다.
실시예 2-A
DBCO-아민 사용량은 20 mmol로 하여 반응 용매는 DMSO, 반응 온도는 상온, 반응 시간은 15분으로 한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 제조방법을 수행하여 목적화합물을 얻었다.
실시예 2-B
DBCO-아민 사용량은 20 mmol로 하여 반응 용매는 DMSO, 반응 온도는 상온, 반응 시간은 30분으로 한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 제조방법을 수행하여 목적화합물을 얻었다.
실시예 2-C
DBCO-아민 사용량은 20 mmol로 하여 반응 용매는 DMSO/마우스혈청(1/1), 반응 온도는 37 ℃, 반응 시간은 30분으로 한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 제조방법을 수행하여 목적화합물을 얻었다.
실시예 2-D
DBCO-아민 사용량은 2 mmol로 하여 반응 용매는 DMSO/마우스혈청(1/1), 반응 온도는 37 ℃, 반응 시간은 30분으로 한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 제조방법을 수행하여 목적화합물을 얻었다.
실시예 2-E
DBCO-아민 사용량은 0.2 mmol로 하여 반응 용매는 DMSO/마우스혈청(1/1), 반응 온도는 37 ℃, 반응 시간은 30분으로 한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 제조방법을 수행하여 목적화합물을 얻었다.
< 실시예 3> 125 I가 표지된 DBCO 컨주게이션 (conjugation) cRGD (cyclic peptide of arginine - glycine - aspartic ) 펩타이드의 제조
Figure 112015088266112-pat00010
단계 1: DBCO가 컨주게이션된 cRGD 펩타이드의 제조
cRGD 펩타이드(RGDyK, 15 mg, 0.0177 mmol)를 DMSO(150 μL)에 용해시킨 후, DBCO-NHS 에스터(9 mg, 0.018 mmol)의 DMSO(150 μL) 및 DIPEA (16 μL, 0.09 mmol)를 상기 펩타이드 용액에 첨가하였다. 상기 반응액을 상온에서 2 시간 교반시켰다. 미정제 생성물를 prep HPLC(용리액 변화: 20% 솔벤트 B 0-2 분; 20-80% 솔벤트 B 2-22 분; 80-100% 솔벤트 B 22-23분; 100% 솔벤트 B 23-28분, 보존시간: 10.1 분)로 정제하여 (11 mg, 61 % 수율)을 얻었다.
MALDI-Tof [M+H]+ Calcd for C49H60N11O11: 978.4468; Found 978.4368.
단계 2: 125 I가 표지된 DBCO 컨주게이션 cRGD 펩타이드의 제조
상기 단계 1에서 얻은 화합물(1 mM, 2 μL)에 상기 실시예 1에서 얻은 125I이 표지된 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-아이오도벤즈아마이드([125I]1, 1.85 MBq)의 DMSO(18 μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물의 전체 부피는 20 μL이고, 125I이 표지된 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-아이오도벤즈아마이드의 최종 농축은 100 μM이다. 상기 콘쥬게이션 반응은 37 ℃에서 30분간 수행되었다. analytical HPLC(용리액 변화: 40% 솔벤트 B 0-2 분; 40-100% 솔벤트 B 2-22 분, 보존시간: 3.96 분)로 측정된 방사화학 수율은 67 %이다.
< 실시예 4> 125 I가 표지된 DBCO -PEG- SH 컨주게이션(conjugation)된 금 나노입자(gold nanoparticle )의 제조
Figure 112015088266112-pat00011
단계 1: DBCO -PEG- SH와 컨주게이션된 금 나노입자의 제조
Tween 20 수용액(1 mM, 1.5 mL)에 시트르산으로 안정화된 13 nm 금 나노입자(10 nM, 15 mL)를 첨가하였다. 20분간 교반시켜준 후, DBCO-PEG-SH(100 μM, 1.5 mL)를 첨가하고, 상기 금 나노입자 용액을 상온에서 2시간 교반시키고, DBCO기가 도입된 금 나노입자는 연속 원심분리(15,000 rpm, 20분X3)로 정제하였다.
단계 2: 125 I가 표지된 DBCO -PEG- SH 컨주게이션 금 나노입자의 제조
상기 단계 1에서 얻은 금 나노입자 용액(2 μM, 50 μL)에 상기 실시예 1에서 얻은 125I이 표지된 N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-4-아이오도벤즈아마이드(3.7 MBq)의 DMSO(5 μL)를 첨가하였다. 컨주게이션 반응은 37 ℃에서 60분간 수행하였다. 반응 종료 후, 미정제 생성물을 원심분리(15,000 rpm, 20 분)로 정제하였다. 30분 반응 후, 60분 반응 후 및 정제 후 각각 방사선-TLC(용리액: 에틸 아세이트)로 생성물을 분리하여 반응 정도를 확인해 수율을 계산하였으며 그 결과는 도 1에 나타내었다. 방사선-TLC를 통하여 측정한 최종 방사화학 수율은 95 %이다.
< 실험예 1> 반응조건에 따른 방사화학 수율(radiochemical yield) 변화 평가
DBCO-아민의 사용량, 반응 용매의 종류, 반응 온도 및 반응 시간을 변화시켜 이에 따른 방사화학 수율을 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 실시예 2-A 내지 2-E의 방사화학 수율을 analytical HPLC(용리액 변화: 40% 솔벤트 B 0-2 분; 40-100% 솔벤트 B 2-22 분, 보존시간: 5.38 분)로 측정하였다. 실시예 2-A 내지 2-E의 구체적인 반응 조건 및 이에 따른 방사화학 수율은 하기 표 1에 나타내었다.
하기 표 1은 실시예 2에서 수행한 DBCO-아민의 사용량, 반응 용매의 종류, 반응 온도 및 반응 시간을 변화시켜 이에 따른 방사화학 수율을 나타낸 것이다.
DBCO-아민
사용량(nmol)		 반응 용매(사용량) 온도 시간
(분)		 방사화학 수율
실시예 2-A 20 DMSO (20 μL) 상온 15 62
실시예 2-B 20 DMSO (20 μL) 상온 30 84
실시예 2-C 20 DMSO/마우스 혈장(1/1) (20 μL) 37 ℃ 30 >99
실시예 2-D 2 DMSO/마우스 혈장(1/1) (20 μL) 37 ℃ 30 87
실시예 2-E 0.2 DMSO/마우스 혈장(1/1) (20 μL) 37 ℃ 30 14
상기 표 1에 나타난 바와 같이,
본 발명에 따른 125I이 표지된 실시예 1을 사용하여 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)와 copper-free 클릭 반응을 통해 DBCO에 125I를 표지시키는데 있어서, 30분 내의 매우 짧은 반응 시간내에 반응이 종결되며, DMSO만을 사용하였을 경우 84 % 마우스 혈장 혼합용액을 사용하였을 경우 99%의 매우 높은 방사화학 수율을 나타냄을 확인하였다. 또한, DBCO의 사용량은 20 nmol로 사용하였을 때 84 % 또는 99 % 이상의 높은 방사화학 수율을 나타냄을 확인함에 따라 적정량이 20nmol임을 알 수 있었으며, DMSO/마우스 혈장 혼합 반응용매를 사용하고 반응 온도를 37 ℃로 반응 조건을 설정하여 생체 내와 유사한 환경에서 실험을 수행하였을 때 또한, 30분 내의 짧은 반응 속도에서 높은 방사화학 수율로 125I가 표지된 DBCO를 얻을 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 125I 표지된 실시예 1은 30분 내의 짧은 반응 시간 내에 DBCO가 포함된 화합물을 84 내지 99 %의 매우 높은 방사화학 수율로 방사성 요오드 표지가 가능하고, 생체와 유사한 환경에서도 높은 방사화학 수율로 반응이 진행되므로, 추후 본 발명에 따른 실시예 1을 사용하여 생체 내에서 효율적으로 125I를 표지를 할 수 있으므로, 방사능 요오드 표지에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 의료 진단에도 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 2> 본 발명에 따른 실시예의 마우스 혈청에서의 안정성 평가
본 발명에 따른 실시예의 마우스 혈청에서의 안정성을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실시예 1의 부분 표본(20 μL, 0.37 MBq)를 정상 마우스 혈청(serum)(200 μL)에 37 ℃에서 24시간 유지하였다. 안정성은 방사선-TLC로 측정하였으며, 0, 1, 5 및 24 시간마다 측정하여 그 결과를 도 2에 그래프로 나타내었다.
실시예 4의 부분 표본(20 μL, 0.37 MBq)를 정상 마우스 혈청(serum)(200 μL)에 37 ℃에서 24시간 유지하였다. 안정성은 방사선-TLC로 측정하였으며, 0, 1, 2, 4, 18 및 30 시간마다 측정하여 그 결과를 도 3에 그래프로 나타내었다.
도 2는 실시예 1의 마우스 혈청내에서의 시간에 따른 방사능을 측정한 그래프이다.
도 3은 실시예 4의 마우스 혈청내에서의 시간에 따른 방사능을 측정한 그래프이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1은 마우스 혈청에서 5시간 경과 후에도 방사화학적 순도가 거의 감소하지 않고 95 %이상을 나타냈으며 24시간 경과 후에도 90 %이상의 높은 방사화학적 순도를 나타내므로, 생체 내에서 안정함을 확인 할 수 있었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 4는 마우스 혈청에서 1시간 경과후 거의 감소하지 않고, 23시간 후까지 95 %이상의 방사화학적 순도를 유지하였으며, 30시간 경과 후에도 90 %이상의 높은 방사화학적 순도를 나타내므로, 생체 내에서 안정함을 확인 할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 실시예 화합물은 생체 내에서 안정하며 이에 따라, 생체 내에서 시간이 경과하여도 높은 방사화학적 순도를 나타내므로, 방사능 요오드 표지에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 의료 진단에도 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 3> 생체내 분포( Biodistribution ) 평가
본 발명에 따른 실시예 1의 생체내 분포를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실시예 1(마우스 당, 1 μCi/100 μL)을 ICR( 수컷 마우스 20마리에 정맥주사 투여하였다. 0.25, 1, 2 및 4시간마다 5마리의 마우스를 마취 후 희생하여 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 위, 갑상선 및 장과 혈액을 적출하였다. 상기 적출한 장기 및 혈액의 무게 및 방사능을 측정하여 분석하였다. 방사능은 γ-카운터로 측정하였다. 분포 데이터는 %ID/g 조직(percentage injected dose per gram tissue) 값으로 나타내어 그 결과를 도 4에 그래프로 나타내었다.
도 4는 실시예 1의 ICR 마우스에 정맥투여하여 시간에 따른 장기 및 혈액 내의 생체 내 분포(biodistribution)를 측정하여 나타낸 것이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1은 15분 내의 빠른 속도로 간 및 신장에 흡수되어 높은 농도로 집적되며, 1시간 내에 20 %이하의 농도로 떨어지고 2시간 내에 10% 이하의 농도를 보임에 따라, 2시간 내에 90% 이상이 체외로 배출된 것을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 실시예 1은 집적속도가 빠르고, 배출되기까지의 시간도 빠르므로, 의료 진단시에 진단을 빠르게 할 수 있으며, 진단 후, 체외로 배출되므로 방사성 물질이 체내에 잔류하는 것을 방지할 수 있어, 의료 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 아자이드 화합물은 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)이 포함된 생체분자 또는 나노입자를 copper-free 클릭반응을 통하여 빠른 반응 속도와 높은 방사화학 수율로 방사성 요오드를 표지시킬 수 있고, 생체 내에서 안정하며, 간 및 신장에 빠른 속도로 흡수되어 집적되고, 빠른 체외 배출 속도를 나타내므로, 생체분자 또는 나노입자의 방사성 요오드 표지 또는 의료 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

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  5. 삭제
  6. 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,
    화학식 1로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물과 화학식 9로 표시되는 DBCO(다이벤조사이클로옥타인)을 포함하는 생체분자 또는 나노입자 화합물을 카퍼-프리 클릭(Copper-free click) 반응시켜 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 생체분자 또는 나노입자 화합물의 방사성 요오드 표지방법:
    [반응식 2]
    Figure 112016124192910-pat00014

    (상기 반응식 2에서,
    Z는 생체분자 또는 나노입자이고;
    n은 2-10의 정수이고; 및
    X는 방사성 요오드이다).
  7. 제6항에 있어서,
    상기 생체분자는 펩타이드, 어피바디(affibody), 항체 및 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방사성 요오드 표지방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 나노입자는 금속 나노입자, 합성 고분자 나노입자 및 생체 고분자 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방사성 요오드 표지방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 금속 나노입자는 금(Au), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 은(Ag) 및 구리(Cu)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 금속; 또는 코발트(Co), 망간(Mn), 철(Fe), 니켈(Ni), 가돌리늄(Gd), 몰리브데넘(Mo), 아연(Zn) 및 크롬(Cr)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 금속 산화물;인 것을 특징으로 하는 방사성 요오드 표지방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 나노입자는 5 nm - 200 nm의 크기의 나노입자인 것을 특징으로 하는 방사성 요오드 표지방법.
  11. 하기 화학식 2로 표시되는 방사성 요오드가 표지된 화합물:
    [화학식 2]
    Figure 112015088266112-pat00015

    (상기 화학식 2에서,
    Z는 생체분자 또는 나노입자이고;
    n은 2-10의 정수이고; 및
    X는 방사성 요오드이다).
  12. 삭제
  13. 제11항의 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 방사성 요오드 표지용 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
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