KR101727708B1 - 뇌암 치료용 조성물 및 영릉향 추출물의 제조방법 - Google Patents

뇌암 치료용 조성물 및 영릉향 추출물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 건조된 영릉향(零陵香, Lysimachia foenum-graecum Hance) 분쇄물로부터 지방족 극성 용매를 이용하여 추출되고 유효성분인 영릉향 추출물 및 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함하는 뇌암 치료용 조성물을 제공한다. 상기 영릉향 추출물은 미량만으로도 뇌암 관련 세포의 사멸 및 증식 억제를 유도할 수 있어 다양한 약학적 제형에 폭 넓게 적용될 수 있다.

Description

뇌암 치료용 조성물 및 영릉향 추출물의 제조방법{COMPOSITION FOR TREATMENT OF BRAIN CANCER AND METHOD OF MANUFACTURING EXTRACT FROM LYSIMACHIA FOENUM-GRAECUM HANCE}
본 기술은 뇌암 치료제에 관한 기술로서, 미량의 천연 추출물로서 우수한 암세포 사멸 효과를 발휘하는 약리 조성물에 관한 기술이다. 보다 상세하게는, 신경교종 세포에 대한 성장 억제제 또는 아폽토시스(apoptosis) 유도제로서 사용하기 위한 조성물에 관한 기술이다.
아울러 본 기술은 뇌암 인자에 대한 현저한 사멸 효과를 발휘할 수 있는 천연 추출물의 제조방법에 관한 기술이다.
영릉향(零陵香, Lysimachia foenum-graecum Hance)은 앵초과(Primulaceae)의 두해살이풀이다. 다른 이름으로는 훈초, 혜초라고도 하며 봄맞이꽃과 식물인 영릉향의 전초를 말린 것이다. 줄기는 높이가 70cm 정도이며 잎은 어긋나고 겹잎으로서, 여름에 잎겨드랑이에서 꽃줄기가 나와서 작은 나비 모양의 꽃이 피는 식물이다. 그 꽃이 풍한사로 인한 감기로 두통이 있을 때 쓰이며, 향기로 흉복부의 팽만 증상을 치료하며, 코막힘이나 치통에도 진통작용을 나타낸다. 유럽이 원산지로 우리나라에도 분포하며 한방에서는 진통작용, 항염증작용 및 미백효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 영릉향의 성분 동정 연구에 의하면 eugenol, methylchavicol 등의 화합물이 보고되어 있다.
뇌암을 포함한 뇌종양의 발병원인은 명확하게 밝혀져 있지 않으며 유전적 소인으로 추정하고 있으나 특정 가계(家系)에 빈발하는 것만은 아니다. 뇌암은 특정 화학물질이나 방사선이 뇌종양 발병률을 높인다는 보고가 있으며, 태아의 신경계통이 형성되는 과정에서의 문제 때문에 발생한다는 주장도 있다. 발병원인은 스트레스 및 전자파등과 관련이 있다는 보고가 있기도 하나 발병원인에 대한 정확한 근거자료는 없는 실정이다. 그러므로 현재까지 예방법 또한 없는 실정이며, 뇌종양은 종양이 생긴 위치에 따라 증상이 상이하게 다른 특징이 있다.
최근에는 종양 혈관형성 억제제 아바스틴(Avastin, bevacizumab)이 치명적이고 완치가 불가능한 악성 뇌종양 치료제로 연구되고 있다. 그러나 아직까지 뇌암 관련 치료제는 없는 것으로 인식되고 있으며, 부작용이 없는 천연약재의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 영릉향과 관련하여, 영릉향 or 零陵香 or "Lysimachiae Foenumgraeci Herba" or "Lysimachia foenum-graecum" or "Lysimachia foenumgraecum") and (뇌 or 뇌암 or cerebral* or brain* or encephal* or 뇌종양)과 같은 논문 검색에서도 본 출원일 이전 자료들이 검색되지 않았다.
다만, 일반적인 항암기작과 관련하여, Protein Kinase C Receptor Binding Assay for the Detection of Chemopreventive Agents from Natural Products An Geon-Ho ; Suh Young-Bae ; Son Kun-Ho ; | Natural product sciences v.3 no.1 , pp.29 - 37 , 1997 의 문헌이 있다. PKC는 신호전달, 세포성장 조절, 유전자 발현 등에 중추적 역할을 하며, 이의 억제제는 암의 예방이나 치료에 역할을 할 수 있고, 영릉향의 메탄올 추출물은 PKC 결합의 억제제 활성을 나타낸다는 정도의 내용만이 개시되어 있다.
본 발명은 천연 추출물에 의한 뇌암 관련 세포의 효과적인 사멸을 유도할 수 있고 상기 뇌암 세포의 성장을 현저하게 억제할 수 있는 신규의 치료제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 천연 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물은 건조된 영릉향(零陵香, Lysimachia foenum-graecum Hance) 분쇄물을 지방족 극성 용매에 침잠시켜 추출된 영릉향 추출물을 유효성분으로 포함한다. 상기 추출물은 60 미만의 온도 하에서 추출될 수 있다.
상기 영릉향 추출물은 50g/ml의 농도에서 8.03개의 U-87 MG 세포주에 48시간 처리될 경우, 알라머 블루(Alamar Blue) 분석법에 의한 U-87 MG 세포주의 생존률이 5% 이하로서 매우 우수한 사멸 효과를 갖는다. 또한 상기 농도에서의 영릉향 추출물의 EC50 값은 15g/ml 내지 20g/ml이다.
한편, 상기 건조된 영릉향은 상온의 음지에서 건조될 수 있으며, 상기 지방족 극성 용매로서는 탄소수 1 내지 5인 알코올을 사용할 수 있다.
상기 뇌암은 신경교종 세포에 기인한 뇌암을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 영릉향 추출물의 제조 방법은 음지에서 1차 건조된 영릉향을 분쇄하여 영릉향 분쇄물을 준비하는 단계, 상기 영릉향 분쇄물을 탄소수 1 내지 5인 알코올 용매에 60 미만의 온도 하에서 침잠시켜 유효성분을 추출하는 단계, 상기 유효성분을 포함하는 알코올 용매를 2차 건조하여 상기 유효성분의 고형분을 수득하는 단계, 및 상기 유효성분의 고형분을 냉동 보관하는 단계를 포함한다. 상기 2차 건조는 60 미만의 감압 상태에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물은 뇌암 세포주에 대한 사멸 및 성장 억제 효과가 우수하고, 영릉향 추출물은 천연물로서 부작용이 거의 없어서 치료용 조성물 외의 식품 분야 등 다양한 이종의 분야에도 널리 활용될 수 있다. 또한, 상기 영릉향 추출물은 뇌암 세포 성장 억제제, 뇌암 분화치료제 또는 뇌암의 아폽토시스(apoptosis) 유도제로서 활용 가능할 수 있다.
나아가, 극미량으로도 뇌암 세포에 대한 사멸 효과가 우수하여 다양한 제형에도 본 발명에 따른 영릉향 추출물이 유연한 함량으로 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 실시예 2에서 수행된 실험에 대응하여, 추출물의 농도에 대한 U-87MG 세포의 생존율을 도시한 그래프이다.
도 2는 비교예 2에서 수행된 실험에 대응하여, 추출물의 농도에 대한 U-87MG 세포의 생존율을 도시한 그래프이다.
이하에서는 본 발명에 따른 뇌암 치료용 조성물에 대하여 상세하게 설명하도록 한다.
상기 뇌암 치료용 조성물은 영릉향 추출물을 유효성분으로 포함하며, 기타 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함할 수 있다. 추출물을 제조하기 위해서는 우선 영릉향을 건조하는 단계가 필요하다. 영릉향의 건조 방법은 특별히 국한되지 않으나, 상기 건조는 외부의 강한 광원에 의하여 영릉향에 함유된 고유 화합물들이 변성되지 않도록 음지에서 이루어질 수 있다. 건조된 영릉향은 추출 효율의 극대화를 위하여 적당한 형태로 분쇄되어 사용되고, 분쇄 정도 즉, 영릉향 분쇄물의 사이즈는 추출물의 화학적 성질 변화와 무관하므로, 물리적인 측면에서 결정되면 충분하다. 또한, 상기 건조는 상온에서 이루어질 수 있고, 건조 기간은 특별히 한정되지는 않으나 대략 수일(數日) 정도 이루지는 것이 바람직하다.
상기 지방족 극성용매로서는 80 미만, 나아가 60 미만의 온도 하에서도 영릉향의 추출 효율이 우수한 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 1 내지 5인 지방족 알코올을 사용한다. 추출 용매로서는 예를 들면, 에탄올을 들 수 있다. 열수추출 등의 고온 추출 방식은 영릉향 내 함유된 뇌암 사멸 인자인 화합물의 변성이나 파괴를 유발할 수 있어 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물에 포함되는 영릉향 추출물의 추출방법은 저온 추출 방식이 바람직하다.
상기 영릉향 추출물은 뇌암 세포 성장 억제제, 뇌암 분화치료제 또는 뇌암의 아폽토시스(apoptosis) 유도제의 기능을 함유하며, 특히 뇌암으로서 신경교종 세포에 기인한 뇌암을 포함한다.
상기 분쇄된 영릉향은 전술한 바와 같이 에탄올 등의 유기 용매에 추가적인 조치 없이 침잠됨으로써 추출물이 발생될 수 있다. 발생된 추출물은 60 미만의 온도 하에서 건조될 수 있으며, 건조 효율을 개선을 위하여 감압 하에서 이루어질 수 있다. 건조가 완료되면, 고형인 영릉향 추출물이 수득될 수 있다. 수득된 고형의 영릉향 추출물은 수분 등 외부 조건에 의한 유효 성분의 변성을 방지하고 추출물 내 유효 화합물의 안정성을 확보하기 위하여 극저온 상태(-15 이하)에서 보관되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물은 상기 영릉향 추출물을 단독으로 포함할 수 있으며, 기타 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함할 수 있다. 상기 약리학적으로 허용 가능한 담체의 예로서는 물, 글리세린, 유단, 전분, 식염수 등을 들 수 있다.
또한, 상기 영릉향 추출물은 뇌암 예방 및 치료용 조성물, 약제, 식품 또는 식품 첨가제로 사용할 수 있으며, 약제로 사용하는 경우 경구 또는 비경구로 사용될 수 있다. 상기 조성물의 제형은 사용방법이나 유효성을 고려하여 다양하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물의 제형으로서 경고제, 과립제, 로션제, 산제, 시럽제, 액제, 주사제, 캅셀제, 환원제 등의 예를 들 수 있다.
일반적으로 세포 실험에서 사용한 농도의 약 100배 내지 200배를 동물실험에서 사용하므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
이하에서는 구체적인 실시예들을 들어 본 발명의 일 실시예에 따른 영릉향 추출물에 대하여 설명하도록 한다. 그러나 이하의 실시예들에 의하여 본 발명의 기술사상이 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예 1]: 영릉향 추출물의 제조
입수된 영릉향을 실온에서 음지인 장소에 보관하며 5일간 건조하였다. 건조된 영릉향은 소정의 크기로 분쇄되었다. 분쇄된 영릉향은 95% 에탄올 용액에 침잠되어 50의 온도 하에서 24시간 동안 추출 과정을 거쳤다. 영릉향 추출물 및 에탄올 용액의 혼합물은 45의 온도 하에서 감압 건조되었다. 건조된 후 고형분의 영릉향 추출물이 수득되었다. 수득된 고형분의 영릉향 추출물을 -20의 저온 하에서 보관하였다.
[실시예 2]: 영릉향 추출물이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향
실시예 1에서 수득된 고형분의 영릉향 추출물이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 사람 뇌암 세포주인 U-87 MG에 대하여 알라마 블루(Alamar Blue) 분석을 시행하였다. 알라마 분석은 MTT 분석의 변형된 형태인데, 특정 효소에 의해서 분해되는 화합물을 살아있는 세포에 처리한 후 화합물이 분해되면서 나오는 생성물의 형광 세기를 측정함으로써 약물을 처리한 후 살아있는 세포의 상대적인 숫자를 알아내는 실험방법이다.
본 실시예에서 사용된 뇌암 세포주인 U-87 MG 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 실험에 이용하였고, 뇌암 세포주인 U-87 MG에 대하여 세포 성장 억제효과를 확인 하였다. U-87 MG 뇌암 세포주를 10% FBS와 25 mM HEPES를 포함하는 MEM 배지에서 배양한 후 96-웰 플레이트에 각 웰 당 8.03 개의 세포를 주입하고 DMSO에 녹인 실시예 1의 영릉향 추출물을 0 내지 100 g/ml 농도로 48 시간 동안 처리하였을 때, 세포 성장을 저해하는 정도를 확인하였다. 각 농도의 추출물을 처리한 후, 96-웰 플레이트에서 각 웰에 채워진 0.2 ml의 세포 배양액에 20 l의 알라마 블루 시약을 첨가한 후 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 544 nm의 파장에서 조사광을 조사하면서 590 nm에서 형광의 세기를 형광광도계(Fluorescence Microplate Reader; Molecular Devices Corp.)로 흡광도를 측정하였다. 도 1은 본 실시예에서 수행된 실험에 대응한 U-87 MG 세포주의 생존률을 도시한 그래프이다. 아래 표 1은 본 실시예의 실험결과를 기재한 표이다. 각각의 농도 실험은 5회 반복한 결과이고, 그 평균값의 변화를 도 1에 도시하였다.
0
g/ml		 3.125
g/ml		 6.25
g/ml		 12.5
g/ml		 25
g/ml		 50
g/ml		 100
g/ml
평균 1.000 0.790 0.697 0.716 0.550 0.003 0.001
표준편차 0.000 0.033 0.030 0.078 0.080 0.001 0.000
상기 표 1 및 도 1에서 나타난 바와 같이 영릉향 추출물의 처리 농도가 높을수록 뇌암 세포의 성장이 감소하였으며, 이로부터 영릉향 추출물이 뇌암 치료효과를 가짐을 확인할 수 있었다. 특히, 본 실험에서 영릉향 농도가 50g/ml의 농도 이상이 될 경우 현저히 급격하게 거의 모든 U-87 MG가 사멸되는 것으로 확인되었으며, 이는 영릉향 추출물의 경우 특정 농도 이상에서 임계적인 치료효과를 나타내는 것으로 판단될 수 있다.
[비교예 1]
강황은 폐암, 자궁암, 유방암 등의 다양한 종류의 암에 대하여 항암 활성을 나타내는 물질이다. 본 발명자들은 상기 강황이 뇌암 세포의 성장에 미치는 정도를 확인함으로써 본 발명의 대계근 추출물의 유효성을 확인하였다.
구체적으로, 서울 약재상에서 구입한 강황(국산) 3 을 음지 및 실온에서 5일간 건조하고 분쇄하였다. 상기 분쇄된 강황을 95% 에탄올(ethanol) 30 에 침지시키고 50에서 24시간 동안 추출하였다. 이것을 여과지를 통하여 여과한 후 45 감압 조건에서 건조 및 농축하여 총 추출물 474 g을 수득하고, -20에서 보관하였다.
상기 강황 추출물을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 U-87 MG 세포의 성장 억제 정도를 확인하고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 기재하였다.
대계근 농도 뇌암 세포 생존율
(평균)		 표준편차
0 / 1.000 0.000
3.125 / 1.020 0.076
6.25 / 1.042 0.097
12.5 / 1.060 0.092
25 / 1.021 0.081
50 / 0.987 0.090
100 / 0.913 0.029
하기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명자의 연구결과 다른 암에 대하여 치료용 효과가 높은 것으로 판단되는 강황의 경우 뇌암 관련한 치료 효과는 매우 미미한 것으로 나타났다. 이에 반하여, 전술한 바와 같이 본 발명에 따른 실시예 2의 영릉향 추출물은 매우 높은 뇌암 세포 사멸 효과를 나타낸다.
[실시예 3] EC50 값 측정
EC50라 함은 본 발명에 따른 영릉향 추출물이 나타낼 수 있는 최대 효과를 100%라 했을 때, 50%의 효과를 나타내는 농도를 의미하여, 50% 유효농도 또는 50% 효능 농도라고 한다. EC50 산출결과 17.75 g/ml의 값이 구하여 졌다.
[실시예 4] 안정성 평가
본 발명에 따른 영릉향은 한약제로 구분되어 있어 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였으나, 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다.
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 실시예 1의 관동화 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 5 g/의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독
성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 관동화 추출물은 모두 랫트에서 5 g/까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 5 g/이상인 안전한 물질로 판단되었다.

Claims (9)

  1. 건조된 영릉향(零陵香, Lysimachia foenum-graecum Hance) 분쇄물을 지방족 극성 용매에 침잠시켜 추출된 영릉향 추출물을 유효성분을 포함하는 뇌암 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 영릉향 추출물 용액 50g/ml을 8.03개의 U-87 MG 세포주에 48시간 처리한 후의, 알라머 블루(Alamar Blue) 분석법에 의한 U-87 MG 세포주의 생존률이 5% 이하인 것을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 영릉향 추출물의 EC50 값은 15g/ml 내지 20g/ml인 것을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 지방족 극성 용매는 탄소수 1 내지 5인 알코올인 것을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 뇌암은 신경교종 세포에 기인한 것임을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
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