KR101708038B1 - 신규 ｂｏｄｉｐｙ 화합물, 그의 합성법, 및 광가교반응을 이용한 단백질 또는 세포를 표지하는 방법 - Google Patents
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Abstract
신규 화합물, 상기 화합물을 포함하는 표지자, 표지용 조성물, 상기 표지자를 사용하여 단백질 또는 세포를 표지시키는 방법, 및 상기 표지자를 사용하여 단백질 또는 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 신규 화합물, 상기 화합물을 포함하는 표지자, 표지용 조성물, 상기 표지자를 사용하여 단백질 또는 세포를 표지시키는 방법, 및 상기 표지자를 사용하여 단백질 또는 세포를 검출하는 방법에 관한 것이다.
생체 내 단백질 표지기술은 형광물질을 특정 단백질에 부착함으로써 생물체 내에 존재하는 단백질의 위치를 정확히 파악하는데 도움을 주는 기술이다. 최근에는 이를 활용하여 고분해능 현미경의 보급이 가속화되어 기존에 존재하는 광학 현미경의 분해능을 극복하고 소기관 관찰, 새로운 기전 규명에 큰 역할을 하고 있다.
현재 보편적으로 사용되고 있는 녹색형광단백질(GFP)은 단백질에 표지하기 위해 바이러스를 이용한 형질 주입 방법을 사용하고 있는데, 바이러스의 특성 상 감염체의 DNA에 무작위로 자신의 형질을 주입하기 때문에 그로 인한 유전자 변이가 염려되고 있다.
이를 극복하기 위하여 형광을 가지는 소분자체를 직접 목표한 단백질에 붙임으로써 표지하는 방법을 연구가 활발히 이루어지고 있는데, 이 또한 소분자체의 결합부위가 생체 내의 다른 작용기와 반응을 하면서 bio-orthogonality 문제가 대두 되고 있다.
벤조피논은 이러한 문제를 해결하기 위해 도입된 물질로, 케톤체가 외부의 자외선에 의해 라디칼로 변화하면서 인접한 유기물과 결합하는 성질을 가지고 있다. 이는 생체 내의 다른 작용기와 상호작용하지 않으며 원하는 물질과 결합할 수 있는 장점으로 평가되고 있다.
본 발명자들은 BODIPY의 밝고 안정성이 높으며 세포 투과성뿐만 아니라 광가교성을 갖는 새로운 화합물을 발명하였다.
일 양상은 신규 화합물을 제공한다.
일 양상은 신규 화합물을 포함하는 표지자를 제공한다.
일 양상은 상기 화합물 및 단백질을 포함하는 표지용 조성물을 제공한다.
일 양상은 상기 표지자를 사용하여 단백질 또는 세포를 표지시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 상기 표지자를 사용하여 단백질 또는 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 하기 식 1의 화합물, 그의 수화물 또는 그의 용매화물을 제공한다.
식 중,
X1 및 X2는 독립적으로 플루오로, 브로모, 클로로, 또는 요오도이고,
R2 및 R3은 독립적으로 치환 또는 비치환된 벤조일, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고,
R5 및 R7은 독립적으로 치환 또는 비치환된 -C1 -10-알킬-, -C2 -10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
R1, R4, 및 R6은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1 -10-알킬-, -C2 -10-알케닐, 또는 -C2 -10-알키닐일 수 있다.
일 구체예에서, 식 1의 화합물은 X1 및 X2는 플로오로이고, R1, R4, 및 R6은 H이고, R5 및 R7은 치환 또는 비치환된 -C1 -10-알킬-일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화합물은
일 구체예에서, 상기 화합물은 (5,5-difluoro-1-(2-methoxyphenyl)-7,9-dimethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-2-yl)(phenyl)methanone, (1-(2-ethoxyphenyl)-5,5-difluoro-7,9-dimethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-2-yl)(phenyl)methanone, (5,5-difluoro-7,9-dimethyl-1-phenyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-2-yl)(phenyl)methanone, (5,5-difluoro-2-(2-methoxyphenyl)-7,9-dimethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-1-yl)(phenyl)methanone, 또는 (2-(2-ethoxyphenyl)-5,5-difluoro-7,9-dimethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-1-yl)(phenyl)methanone, 또는 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
용어 "알킬 (alkyl)"은 직쇄상 또는 분지상의 1가 포화 지방족 탄화수소기를 의미한다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 알킬기는 일반적으로 1~10개, 1~8개, 1~6개, 1~4개 또는 1~3개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필 (예, n-프로필 및 이소프로필), 부틸 (예, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, sec-부틸), 펜틸 (예, n-펜틸, 이소펜틸, 및 네오펜틸), n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐 및 n-데실을 포함할 수 있다.
용어 "알케닐 (alkenyl)"은 직쇄상 또는 분지상의 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 1가의 불포화 탄화수소기를 의미한다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 알케닐기는 일반적으로 2~10개, 2~8개, 2~6개, 2~4개 또는 2~3개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알케닐기는 예를 들면, 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부트-2-에닐, 시클로헥세닐, 또는 n-헥스-3-에닐 등을 포함할 수 있다. 상기 알케닐은 cis 및 trans 이성질체 또는 이들 이성질체의 혼합물을 포함할 수 있다.
용어 "알키닐 (alkynyl)"은 직쇄상 또는 분지상의 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 1가의 불포화 탄화수소기를 의미한다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 알키닐기는 일반적으로 2~10개, 2~8개, 2~6개, 2~4개 또는 2~3개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알키닐기는 예를 들면, 에티닐, n-프로피닐, n-부트-2-이닐, 또는 n-헥스-3-이닐 등을 포함할 수 있다.
치환된 알킬기는 알콕시, 치환 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환 아미노, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 아미노카르보닐아미노, 아미노티오카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 아미노술포닐, 아미노술포닐옥시, 아미노술포닐아미노, 아미디노, 아릴, 치환 아릴, 아릴옥시, 치환 아릴옥시, 아릴티오, 치환 아릴티오, 카르복실, 카르복실 에스테르, (카르복실 에스테르)아미노, (카르복실 에스테르)옥시, 시아노, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 치환 시클로알킬옥시, 시클로알킬티오, 치환 시클로알킬티오, 시클로알케닐, 치환 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 치환 시클로알케닐옥시, 시클로알케닐티오, 치환 시클로알케닐티오, 구아니디노, 치환 구아니디노, 할로, 히드록시, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 치환 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 치환 헤테로아릴티오, 헤테로환, 치환 헤테로환, 헤테로시클릴옥시, 치환 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴티오, 치환 헤테로시클릴티오, 니트로, SO3H, 치환 술포닐, 치환 술포닐옥시, 티오아실, 티올, 알킬티오, 및 치환 알킬티오로 이루어진 군에서 선택되는 1~5개의 치환기를 갖는 알킬기를 의미하고, 상기 치환기는 본원에서 정의된 바와 같다.
"알콕시"는 -O-알킬기를 의미하고 여기서 알킬은 본원에 정의된 바와 같다. 알콕시는 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, sec-부톡시, 및 n-펜톡시를 포함할 수 있다.
용어 "아릴 (aryl)"은 단환 또는 다환을 갖는 방향족 탄화수소기를 의미한다. 상기 다환은 융합된 고리 (fused ring)를 갖는 것 (예, 나프탈렌) 및/또는 융합되지 않은 고리를 갖는 것 (예, 비페닐)을 포함할 수 있다. 상기 다환은 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 고리를 갖는 것일 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 아릴기는 일반적으로 5 내지 10개, 6 내지 15개, 6 내지 12개, 또는 6 내지 10개의 탄소 고리 원자를 갖는 것일 수 있다. 상기 아릴기는 예를 들면, 페닐, 나프탈레닐 (예, 나프탈렌-1-일 및 나프탈렌-2-일), 비페닐, 안트라세닐, 또는 펜안트레닐 등을 포함할 수 있다.
용어 "시클로알킬 (cycloalkyl)"은 고리화된 알킬, 알케닐 및 알키닐기를 포함하는 비방향성 탄소고리 (non-aromatice carbocycle)를 나타낸다. 상기 시클로알킬기는 단환 또는 다환을 포함할 수 있다. 상기 다환은 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 융합된 고리를 갖는 것일 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 시클로알킬기는 일반적으로 3 내지 10개, 또는 3 내지 7개의 고리 탄소 원자를 포함한다. 시클로알킬기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로헥사디에닐 (cyclohexadienyl), 시클로헵타트리에닐, 노르보르닐 (norbornyl), 노르카닐 (norcarnyl), 아다만틸 등을 포함할 수 있다.
용어 "헤테로시클로알킬 (heterocycloalkyl)"은 N, O, 또는 S로부터 선택된 하나 이상 원자로서 고리를 형성하는 헤테로원자를 포함하는 비방향족 헤테로사이클을 의미한다. 헤테로시클로알킬기는 단환 혹은 다환 구조, 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 융합된 고리를 갖는 구조를 포함할 수 있다. "헤테로시클로알킬" 기의 예는 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 피페라진일, 테트라히드로푸란일, 테트라히드로티엔일, 2,3-디히드로벤조푸릴, 1,3-벤조디옥솔, 벤조-1,4-디옥세인, 피페리디닐, 피롤리디닐, 이소옥사졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 티아졸리디닐 등을 포함할 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 헤테로시클로알킬기는 3개 내지 10개, 3개 내지 7개, 5개 내지 7개 또는 5개 내지 6개의 고리를 형성하는 원자를 포함할 수 있다.
용어 "헤테로아릴 (heteroaryl)"은 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 고리 구성원으로 갖는 1가의 방향성기를 의미한다. 헤테로아릴기는 단환 혹은 다환 구조를 포함할 수 있다. 상기 다환은 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 축합 고리를 갖는 것일 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 헤테로아릴기는 일반적으로 3 내지 10개, 3 내지 7개, 또는 3 내지 5개의 고리 원자를 포함한다. 상기 헤테로아릴기는 1개, 2개 또는 3개의 헤테로원자를 포함하는 것일 수 있다. 헤테로아릴기는 예를 들면, 피리딜, N-옥소피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 푸릴 (furyl), 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 티에닐 (thienyl), 이미다졸릴, 푸란일 (furanyl), 티아졸릴 (thiazolyl), 인돌릴, 피릴, 옥사졸릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐, 벤즈티아졸릴, 이소옥사졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인다졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 벤조티에닐, 푸리닐, 벤즈이미다졸릴, 인돌린일 등을 포함할 수 있다.
상기 치환(기)의 정의에 대하여 살펴보면 다음과 같다. 상기 알킬기, 알콕시기, 알케닐기, 알키닐기, 알킬렌옥시드기, 시클로알킬기, 아릴옥시기, 헤테로아릴기가 갖는 "치환(된)"에서의 "치환"은 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 치환된 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염, 또는 C1 -10의 알킬기, C1 -10의 알콕시기, C2 -10의 알케닐기, C2 -10의 알키닐기, C1 -10의 헤테로알킬기, C6 -10의 아릴기, C6 -10의 아릴알킬기, C6 -10의 헤테로아릴기, 또는 C6 -10의 헤테로아릴알킬기로 치환된 것을 의미한다.
상기 C1 -10의 알킬기의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, sec-부틸, ter-부틸, neo-부틸, iso-아밀, 또는 헥실 등을 들 수 있고, 상기 알킬기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C1 -10의 알콕시기의 구체적인 예로는 메톡시, 에톡시, 또는 프로폭시 등을 들 수 있고, 상기 알콕시기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C2 -10의 알케닐기의 구체적인 예로는 비닐렌 또는 알릴렌 등을 들 수 있고, 상기 알케닐기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C2 -10의 알키닐기의 구체적인 예로는 아세틸렌 등을 들 수 있고, 상기 알키닐기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C2 -10의 알킬렌 옥시드기의 구체적인 예로는 에틸렌 옥시드, 프로필렌 옥시드, 또는 부틸렌 옥시드 등을 들 수 있다.
상기 C3 -10의 시클로알킬기의 구체적인 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실 등을 들 수 있고, 상기 시클로알킬기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C6 -10의 아릴기는 단독 또는 조합하여 사용되어, 하나 이상의 고리를 포함하는 방향족 시스템인 것을 의미하며, 예를 들어 페닐, 나프틸 등을 들 수 있다. 또한 상기 아릴기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C6 -10의 아릴옥시기의 구체적인 예로는 페녹시 등을 들 수 있고, 상기 아릴옥시기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
C6 -10의 헤테로아릴기는 N, O, P 또는 S 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리원자가 탄소인 유기 화합물인 것을 의미하며, 예를 들어 피리딜 등을 들 수 있다. 또한 상기 헤테로아릴기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
일 양상은 상술한 식 1의 화합물을 포함하는 표지자(labelling agent)를 제공한다.
상기 표지자는 공유 결합에 의해 표적 물질에 결합되어 검출가능한 신호를 갖는 물질을 의미한다. 상기 표지자는 형광 색소를 방출할 수 있다. 상기 형광 색소는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의해 여기되어 빛을 방출할 수 있다. 상기 표지자는 검출가능한 표지자일 수 있다. 상기 표지자는 형광 표지자일 수 있다.
상기 화합물은 표적 물질에 직접 결합할 수 있다. 상기 표적 물질은 시료 내에 존재하는 검출하는 대상 물질로서, 표적 물질의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질일 수 있다. 상기 표적 물질은 예를 들면 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), RNA 또는 DNA일 수 있다. 상기 표적 물질은 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들면, 효소, 단백질, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있다.
상기 단백질은 항체, 항원, 효소, 또는 펩티드일 수 있다. 상기 단백질은 HAS, BSA, Peroxidase, 또는 Lysozyme을 포함한 발현, 및/또는 정제된 단백질일 수 있다. 상기 DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 RNA는 게놈 RNA, mRNA, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 세포는 박테리아, 식물, 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 동물 세포는 예를 들면, HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293) 세포, HeLa, Huh7, 또는 MDCK 세포일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화합물은 정제된 단백질 또는 살아있는 세포 속 단백질, 예를 들면 세포막을 구성하는 단백질에 결합할 수 있다. 상기 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 상기 결합은 광 조사에 의해 초래되는 라디칼 반응을 통한 단백질과의 공유 결합일 수 있다.
또한, 상기 화합물은 링커 분자에 결합할 수 있다. 상기 링커 분자는 예를 들면, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2 +, FLAG 태그, 또는 myc 태그일 수 있다.
일 양상은 상술한 식 1의 화합물과 단백질을 포함하는 표지용 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 표지용 조성물은
표지용 조성물에 있어서, 식 1 중,
X1 및 X2는 독립적으로 플루오로, 브로모, 클로로, 또는 요오도이고,
R2 및 R3은 독립적으로 치환 또는 비치환된 벤조일, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고,
R5 및 R7은 독립적으로 치환 또는 비치환된 -C1 -10-알킬-, -C2 -10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
R1, R4, 및 R6은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1 -10-알킬-, -C2 -10-알케닐, 또는 -C2 -10-알키닐일 수 있고,
상기 R2 또는 R3은 상기 벤조일인 것일 수 있다. 상기 표지용 조성물에 있어서, 상기 벤조일 중 카보닐기의 탄소가 단백질과 결한된 것일 수 있다.
상술한 식 1의 화합물에 있어서, 식 1 중,
일 구체예에서 상기 표지용 조성물은
상기 화합물은 공유결합으로 단백질에 결합된 것일 수 있다. 상기 단백질은 폴리펩티드 또는 아미노산; 또는 아미노산의 유도체 (예, 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 또는 L-디히드록시페닐알라닌 (L-DOPA) 등)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 아미노산은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산일 수 있다. 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 셀레노시스테인, 아스파라진, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파트산, 글루탐산, 오르니틴 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 세포 중 단백질일 수 있다. 상기 세포는 박테리아, 식물, 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 동물 세포는 예를 들면, HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293) 세포, HeLa, Huh7, 또는 MDCK 세포일 수 있다. 상기 화합물은 상기 단백질 중 아미노산 또는 펩티드의 아민 관능기 (amine functional group), 수산화 관능기(hyrdorxyl functional group) 또는 티올 관능기 (thiol functional group)와 결합할 수 있다. 또한, 상기 화합물은 상기 아미노산의 N-말단의 질소와 공유결합할 수 있다.
일 양상은 상술한 식 1의 화합물과 단백질을 제공하는 단계; 및 상기 화합물과 단백질의 혼합물에 광을 조사하는 단계를 포함하는 표지용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상은 상술한 식 1의 화합물과 단백질 또는 세포를 접촉시키는 단계; 및 상기 화합물에 광을 조사하는 단계를 포함하는 단백질 또는 세포를 표지시키는 방법을 제공한다.
상기 세포는 HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293) 세포일 수 있다.
상기 광을 조사하는 단계는 단백질과 화합물의 복합체, 또는 단백질과 세포의 복합체를 형성할 수 있다. 상기 광을 조사하는 단계는 화합물과 단백질 또는 세포의 접촉 후, 화합물과 단백질의 혼합물 또는 화합물과 세포의 혼합물에 광을 조사하는 것일 수 있다. 상기 광 조사에 의해 초래되는 라디칼 반응을 통한 표지자와 단백질간의 공유 결합이 형성될 수 있다.
상기 광을 조사하는 단계는 형광 여기(excitation)을 위한 것일 수 있다. 상기 광의 파장은 예를 들면 200 nm 내지 400 nm, 200 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 300 nm, 또는 200 nm 내지 250 nm일 수 있다.
상기 광은 형광 여기를 위한 광원에서 방출되는 것이면, 어떠한 것이든 이용할 수 있다. 상기 광원은 레이저 광원일 수 있다.
일 양상은 상술한 화학식 1로 표시되는 표지자와 단백질 또는 세포를 접촉시키는 단계; 및 상기 표지자에 광을 조사하여 표지자와 단백질의 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 단백질 또는 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 광 조사는 표지자와 단백질을 결합시켜 표지자와 단백질의 복합체를 형성할 수 있다. 또한 상기 광 조사는 표지자와 세포를 결합시켜 표지자와 세포의 복합체를 형성할 수 있다.
상기 검출은 광 조사 후, 표지자와 단백질 또는 세포로부터 방출되는 형광을 측정하는 것을 통해 수행될 수 있다.
일 양상에 따른 신규 화합물에 따르면 단백질 또는 세포를 표지하는 데 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 표지자에 따르면 단백질 또는 세포를 표지하는 데 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 표지용 조성물에 따르면 단백질 또는 세포를 표지하는 데 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 단백질 또는 세포를 표지시키는 방법에 따르면, 단백질 또는 세포를 효율적으로 표지할 수 있다.
일 양상에 따른 단백질 또는 세포를 검출하는 방법에 따르면, 상기 단백질 또는 세포를 효율적으로 검출할 수 있다.
도 1은 pcBD1a, pcBD1b, pcBD1c, pcBD2a, 및 pcBD2b 각각의 화합물의 염화메틸렌 용매 하에서의 형광 및 흡광을 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물 중 하나인 pcBD1a를 HSA 및 Lysozyme의 단백질에 처리한 후, 자외선 조사 시간에 따른 상기 단백질과 pcBD1a의 겔 이미지를 나타낸 그림이다.
도 3은 pcBD1a, pcBD1b, pcBD2a, 및 pcBD2b 각각을 HEK293 세포에 처리한 후, 자외선 조사 전후에 따른 겔 이미징의 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물 중 하나인 pcBD1a를 HSA 및 Lysozyme의 단백질에 처리한 후, 자외선 조사 시간에 따른 상기 단백질과 pcBD1a의 겔 이미지를 나타낸 그림이다.
도 3은 pcBD1a, pcBD1b, pcBD2a, 및 pcBD2b 각각을 HEK293 세포에 처리한 후, 자외선 조사 전후에 따른 겔 이미징의 결과를 나타낸 그림이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 화합물의 제조
실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다. FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker 사의 Avance 400을 사용하였고, LC/MS은 Thermo 사의 Dionex ultimate 3000 / Velos pro를 사용하여, ion-trap mass spectrometer(ITMS) 방식으로 측정하였다. 시약은 주로 Aldrich사의 시약을 사용하였고, 특별한 정제 없이 사용하였다. 유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 실리카겔(silica gel)로 Merck사의 kieselgel 60 (230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피 (TLC)는 실리카겔 60 GF254 (0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하여 확인하였다. 필터지로는 Whatman 사의 직경 125 mm 용지를 사용하였다.
(1) 피롤(
pyrrol
)의 합성
아세토페논(acetophenone) (1 mmol)과 벤즈알데히드 (benzaldehyde) (1 mmol)을 3 ml 에탄올에 녹여 교반시켰다. 그 후 수산화 리튬 일수화물 (lithium hydroxide monohydrate) (0.1 mmol)을 주입하고 상온에서 하루 동안 반응시켰다. 그 후, 수산화 리튬 일수화물 (1.1 mmol)과 토실메실 이소시안화물 (1.2 mmol)을 넣고 침전이 발생할 때까지 교반시켰다. 침전물을 얼음물과 에탄올 혼합액으로 세척하고 건조시켰다.
(2)
피롤의
포름화
0℃의 디메틸포름아미드 (dimethylformamide, DMF) (1.2 mmol)에 염화포스포릴 (POCl3) (1.2 mmol)을 천천히 주입하였다. 상온에서 15분간 더 반응을 하면서 0℃의 디클로에탄 (dichloroethane) 15 ml에 (1)에서 만든 피롤 (1 mmol)을 녹였다. 준비된 피롤 용액을 천천히 주입하고, 끝나면 30분간 환류(reflux)시켰다. 상온으로 떨어지면 아세트산 나트륨 (sodium acetate) (5.5 ml)을 추가로 넣고 30분간 환류시켰다. 완료된 화합물은 포화된 염화나트륨 용액 (brine)을 사용해서 화합물을 유기층으로 추출시키고 칼럼 크로마토그래피를 통해서 2 가지의 알데히드를 얻는다 (하기 반응식 1 참조).
<반응식 1>
*R8은 H, 또는 C1-2 알콕시기.
(3) BODIPY 합성
(3) BODIPY 합성
(2)에서 합성한 알데히드 (1.0 mmol)를 무수 염화메틸렌 (anhydrous methylene chloride) 4 ml에 녹이고, 영하 5℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 2,4-디메틸 피롤 (2,4-dimethyl pyrrole)을 주입하고, 염화포스포릴 (1 mmol)을 천천히 주입하였다. 주입이 끝나면 3시간 동안 동일 온도에서 반응시키고, 그 후 BF3OEt2 (3 mmol)과 디이소프로필에틸아민 (N,N-Diisopropylethylamine, DIPEA) (3 mmol)을 주입하고 3시간 동안 반응시켰다. 최종 화합물은 칼럼 크로마토그래피를 통해서 반응식 2에서 보이는 2가지의 화합물로 나뉘어진다.
<반응식 2>
(3.1) (5,5-
difluoro
-1-(2-
methoxyphenyl
)-7,9-
dimethyl
-5H-4
l4
,5
l4
-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-2-yl)(phenyl)methanone (이하 'pcBD1a'라고 지칭)의 수득
상기 pcBD1a의 1H NMR spectroscopy, 13C NMR spectroscopy, 및 ES-MS의 측정값은 다음과 같다:
1H NMR spectroscopy (CDCl3,400MHz) : 7.99(s,1H), 7.75(d,3J(H,H)=6.8Hz,2H), 7.47-7.43(m,1H), 7.35-7.27(m,4H), 7.19(s,1H), 7.05(t,3J(H,H)=7.6Hz,1H), 6.76(d,3J(H,H)=8Hz,1H) 6.28(s,1H), 3.55(s,3H), 2.67(s,3H), 2.28(s,3H).
13C NMR spectroscopy: 190.76, 165.83, 156.88, 147.25, 140.48, 138.50, 137.06, 131.87, 131.53, 131.34, 129.96, 129.11, 128.25, 127.84, 124.82, 122.60, 121.94, 120.56, 110.83, 55.01, 15.48, 11.62.
ES-MS: [M+H]+= 738.1485(cal.),738.1531(exp.).
(3.2) (1-(2-
ethoxyphenyl
)-5,5-
difluoro
-7,9-
dimethyl
-5H-4
l4
,5
l4
-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-2-yl)(phenyl)methanone (이하 'pcDB1b'라고 지칭)의 수득
상기 pcBD1b의 1H NMR spectroscopy, 13C NMR spectroscopy, 및 ES-MS의 측정값은 다음과 같다:
1H NMR spectroscopy: (CDCl3, 400 MHz): 7.98 (s, 1H), 7.75 (t, 3J(H,H) = 6.8Hz, 2H), 7.47-7.43 (m, 1H), 7.36-7.26 (m, 4H), 7.21 (s, 1H), 7.04 (t, 3J(H,H) = 7.6 Hz, 1H), 6.75 (d, 3J(H,H) = 8 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 3.83 (br, 2H) 2.67 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 1.14 (t, 3J(H,H) = 7.2Hz, 3H)
13C NMR spectroscopy: 190.68, 165.74, 156.40, 147.26, 140.73, 138.48, 137.51, 132.27, 131.89, 131.60, 131.44, 129.93, 129.19, 128.18, 127.87, 127.53, 124.98, 122.59, 121.92, 120.35, 111.47, 63.44, 15.48, 14.51, 11.62.
ES-MS: [M+H]+ = 738.1485 (cal.), 738.1531 (exp.).
(3.3) (5,5-
difluoro
-2-(2-
methoxyphenyl
)-7,9-
dimethyl
-5H-4
l4
,5
l4
-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-1-yl)(phenyl)methanone (이하 'pcBD2a'라고 지칭)의 수득
상기 pcBD2a의 1H NMR spectroscopy 및 ES-MS의 측정값은 다음과 같다:
1H NMR spectroscopy: (CDCl3, 400 MHz): 7.71-7.69 (m, 3H), 7.61 (s, 1H), 7.37-7.32 (m, 2H), 7.19 (t, 3J(H,H) = 8 Hz, 1H) 7.09 (t, 3J(H,H) = 8.4 Hz, 1H) 6.49 (d, 3J(H,H) = 8.4 Hz, 1H) 6.28 (s, 1H), 3.48 (s, 3H) 2.69 (s, 3H), 2.31(s, 3H),
ES-MS: [M+H]+ = 738.1485 (cal.), 738.1531 (exp.).
(3.4) (2-(2-
ethoxyphenyl
)-5,5-
difluoro
-7,9-
dimethyl
-5H-4
l4
,5
l4
-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-1-yl)(phenyl)methanone
(이하 'pcBD2b'라고 지칭)의 수득
상기 pcBD2b의 1H NMR spectroscopy, 13C NMR spectroscopy, 및 ES-MS의 측정값은 다음과 같다:
1H NMR spectroscopy: (CDCl3, 400 MHz): 7.68 (d, 3J(H,H) = 10 Hz, 2H), 7.66 (s, 1H), 7.33 (t, 3J(H,H) = 7.2 Hz, 2H), 7.16 (t, 3J(H,H) = 7.6 Hz, 2H), 7.05 (t, 3J(H,H) = 8.4 Hz, 1H), 6.86 (t, 3J(H,H) = 7.6 Hz, 1H), 6.44 (d, 3J(H,H) = 8 Hz, 1H), 6.27 (s, 1H), 3.65 (q, 3J(H,H) = 14 Hz 2H), 2.68 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.32 (t, 3J(H,H) = 7.2Hz, 3H)
13C NMR spectroscopy: 192.62, 166.45, 155.03, 148.24, 138.96, 137.21, 136.01, 133.23, 132.25,132.00, 129.59, 129.43, 128.78, 128.24, 127.52, 124.71, 122.76, 122.53, 120.38, 110.75, 63.11, 15.54, 14.35, 11.63.
ES-MS: [M+H]+ = 738.1485 (cal.), 738.1531 (exp.).
(3.5) (5,5-
difluoro
-7,9-
dimethyl
-1-
phenyl
-5H-4
l4
,5
l4
-
dipyrrolo
[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-2-yl)(phenyl)methanone (이하 '
pcBD2a'
라고 지칭)의 수득
상기 pcBD1c의 1H NMR spectroscopy, 13C NMR spectroscopy, 및 ES-MS의 측정값은 다음과 같다:
1H NMR spectroscopy: (CDCl3, 400 MHz): 7.97 (s, 1H), 7.81 (dd, 4J(H,H)/3J(H,H) = 1.2, 8.0 Hz, 2H), 7.53-7.51 (m, 1H), 7.51-7.38 (m, 7H), 7.22 (s, 1H), 6.31 (s, 1H), 2.68 (s, 3H), 2.30(s, 3H),
13C NMR spectroscopy: 190.45, 166.59, 147.79, 141.47, 141.23, 138.96, 138.80, 132.53, 132.13, 131.49, 130.28, 129.31, 128.33, 128.28, 128.20, 126.80, 124.73, 122.98.
ES-MS: [M+H]+ = 738.1485 (cal.), 738.1531 (exp.).
실시예
2:
실시예
1에서의 화합물을 이용한 단백질의 표지 (
labelling
)
실시예 1에서 합성한 화합물을 HSA 및 Lysozyme의 단백질에 처리하고 약 254 nm의 자외선을 조사하여, 자외선의 조사 시간에 따른 상기 화합물과 단백질의 결합 정도를 겔 전기영동 실험을 통해 확인하였다.
젤 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Biorad사의 소형 수직 젤 전기영동장치를 사용하였다. 실험을 위한 12% SDS 젤 및 러닝 완충액 (running buffer)는 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다. 12% SDS gel은 7.9 ml의 H2O, 6.5 ml의 pH8.8-50 M의 Tris-HCl buffer, 10 ml의 30% Acryl amide, 250 ㎕의 10% SDS gel, 250 ㎕의 APS, 및 10 ㎕의 TMEDE를 혼합하여 제조하였다. 1 x running buffer는 200 ml의 10 x TGS buffer 및 1800 ml의 H2O를 혼합하여 제조하였다.
단백질은 Sigma Aldrich사의 것을 사용하였다. 표지된 단백질의 형광강도는 BIO-RAD사의 ChemiDoc 장비를 사용하였고, 광원은 Blue Epi, Green Epi이었고, 필터는 530 nm emission (28 nm bandwidth), 650 nm emission (50 nm bandwidth)를 형광파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다.
pcBD1a, pcBD1b, pcBD1c, pcBD2a, 및 pcBD2b 각각의 화합물의 용매에서의 흡광도 및 형광도를 측정하였다. 표 1은 화합물의 용매에 따른 형광 파장의 변화를 나타낸 표이다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 화합물은 특정 용매 하에서 특정 흡광과 형광을 가져, 표지자로 특이성있게 사용될 수 있음을 확인하였다. 표 1은 각각의 화합물의 흡수 파장을 나타낸다.
| 흡광도 (nm) | 형광도 (nm) | |||||||
| 화합물 | 헥세인 | 염화메틸렌 | 에탄올 | 디메틸설폭사이드 | 헥세인 | 염화메틸렌 | 에탄올 | 디메틸설폭사이드 |
| pcBD1a | 507 | 503 | 499 | 499 | 523 | 525 | 507 | 507 |
| pcBD1b | 507 | 503 | 499 | 499 | 522 | 525 | 507 | 507 |
| pcBD1c | 503 | 498 | 495 | 495 | 515 | 520 | 502 | 503 |
| pcBD2a | 540 | 535 | 531 | 495 | 575 | 595 | 592 | 590 |
| pcBD2b | 540 | 535 | 531 | 531 | 573 | 600 | 595 | 595 |
도 1은 pcBD1a, pcBD1b, pcBD1c, pcBD2a, 및 pcBD2b 각각의 화합물의 염화메틸렌 용매 하에서의 형광 및 흡광을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 도 1은 상기 각각의 화합물이 특정 단백질에 표지되었다는 것을 SDS gel을 통해 확인한 그림이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, pcBD1a, pcBD1b, pcBD1c, pcBD2a, 및 pcBD2b 각각의 화합물은 특유의 형광 및 흡광을 나타내는 것을 알 수 있다. 따라서, 각각의 화합물은 형광 표지자 또는 흡광 표지자로서 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물 중 하나인 pcBD1a를 HSA 및 Lysozyme의 단백질에 처리한 후, 자외선 조사 시간에 따른 상기 단백질과 pcBD1a의 겔 이미지를 나타낸 그림이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 후 5분부터 겔 이미지가 형광 및 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 통해 유의미하게 나타났음을 알 수 있다. 이는 UV 조사만으로, 상기 pcBD1a가 HAS 또는 Lysozyme 각각에 표지되었음을 알 수 있다. 이는 상기 화합물이 광가교성을 갖는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 화합물을 표지자로 사용될 수 있으며, 또한 광가교제(photocrosslinking agent)로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예
3:
실시예
1에서의 화합물을 이용한
HEK293
세포의 표지(
labelling
)
실시예 1에서 합성한 각각의 화합물을 HEK293 세포에 처리하고 약 254 nm의 자외선을 조사하여, 자외선의 조사 전후에 따른 상기 화합물과 상기 HEK293 세포의 결합 정도를 겔 전기영동 실험을 통해 확인하였다.
젤 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 실시예 2에서와 같은 장비를 사용하였다. 실험을 위한 12% SDS 젤 및 러닝 완충액 (running buffer)는 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다. 12% SDS gel은 7.9 ml의 H2O, 6.5 ml의 pH8.8-50M Tris-HCl buffer, 10 ml의 30% Acryl amide, 250 ㎕의 10% SDS gel, 250 ㎕의 APS, 및 10 ㎕의 TMEDE를 혼합하여 제조하였다. 1 x running buffer는 200 ml의 10 x TGS buffer, 및 1800 ml의 H2O를 혼합하여 제조하였다.
표지된 단백질을 HEK293세포로부터 얻어낸 과정은 아래와 같다. 100 mm의 cell curture dish의 70~80% 정도 세포가 자랐을 때, pcBD를 한 디쉬 당 하나씩 1 μM의 농도로 넣어주었다. 그 후 세포 안으로 pcBD가 들어가도록 두 시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2 시간 동안 두었다. 인큐베이터에서 세포를 꺼낸 후 254 nm UV를 20 분 동안 조사하였다. 이 후 배지를 제거하고 EDTA-Trypsinase 1 ml를 넣어 2분간 인큐베이터에 넣어놓았다. PBS 500 ml를 추가적으로 더 넣어 세포를 떼어내고 1.5 ml 삼각뿔 모양의 튜브에 넣어 2000 rpm으로 4분 동안 원심분리를 하였다. 이 후 1 ml PBS로 세포 침전을 닦아주고 다시 같은 조건으로 원심분리를 하였다. 그 후 상층액을 제거하고 새로운 PBS 400 ㎕를 넣어준 후 초음파로 세포를 분쇄하였다. 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거한 후 상층액을 새 튜브에 옮겨 담고 5 x SDS 로딩버퍼를 100 ㎕ 넣어주었다. 95.7℃에서 샘플을 2 분간 끓이고 식으면 젤 전기영동을 실시하였다.
표지된 단백질의 형광강도는 BIO-RAD사의 ChemiDoc 장비를 사용하였고, 광원은 Blue Epi, Green Epi이었고, 필터는 530/28, 650/50를 형광파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다.
도 3은 pcBD1a, pcBD1b, pcBD2a, 및 pcBD2b각각을 HEK293 세포에 처리한 후, 자외선 조사 전후에 따른 겔 이미징의 결과를 나타낸 그림이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사가 없는 경우에는 겔 이미징이 나타나지 않는 반면, 254 nm의 자외선 조사 후 약 20분에는 pcBD1a, pcBD1b, pcBD2a, 및 pcBD2b 화합물을 처리한 모든 HEK293 세포에서 겔 이미징이 나타나는 것을 알 수 있다. 따라서, 자외선 조사에 의해, pcBD1a, pcBD1b, pcBD2a, 및 pcBD2b 화합물이 HEK293 세포에 결합하였다는 것을 알 수 있고, 즉, 상기 화합물이 HEK293 세포에 광가교되었음을 확인하였다. 따라서, pcBD1a, pcBD1b, pcBD2a, 및 pcBD2b 화합물 각각은 모두 HEK293 세포의 표지자로 사용할 수 있는 것을 확인하였다.
Claims (11)
- 하기 식 1의 화합물, 그의 수화물 또는 그의 용매화물:
(식 1)
식 중,
X1 및 X2는 플루오로이고,
R2 및 R3은 독립적으로 치환 또는 비치환된 벤조일, 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고, R2가 벤조일인 경우, R3는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이거나, 또는 R3가 벤조일인 경우, R2는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고,
R5 및 R7은 독립적으로 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
R1, R4, 및 R6은 독립적으로 H이다. - 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은
, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물, 그의 수화물, 또는 그의 용매화물.
- 하기 식 1의 화합물, 그의 수화물 또는 그의 용매화물을 포함하는 표지자:
(식 1)
식 중,
X1 및 X2는 플루오로이고,
R2 및 R3은 독립적으로 치환 또는 비치환된 벤조일, 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고, R2가 벤조일인 경우, R3는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이거나, 또는 R3가 벤조일인 경우, R2는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고,
R5 및 R7은 독립적으로 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
R1, R4, 및 R6은 독립적으로 H이다. - 하기 식 1의 화합물, 그의 수화물 또는 그의 용매화물, 및 단백질을 포함하는 표지용 조성물:
(식 1)
식 중,
X1 및 X2는 플루오로이고,
R2 및 R3은 독립적으로 치환 또는 비치환된 벤조일, 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고, R2가 벤조일인 경우, R3는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이거나, 또는 R3가 벤조일인 경우, R2는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고,
R5 및 R7은 독립적으로 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
R1, R4, 및 R6은 독립적으로 H이고,
상기 벤조일 중 카보닐기의 탄소가 단백질과 결합한 것인 표지용 조성물. - 청구항 6에 있어서, 상기 표지용 조성물은
,
,
,
,
, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 표지용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 단백질은 항체, 항원, 효소, 펩티드, 또는 아미노산을 포함하는 것인 표지용 조성물.
- 하기 식 1의 화합물과 단백질 또는 세포를 접촉시키는 단계; 및
상기 화합물에 광을 조사하는 단계를 포함하는 단백질 또는 세포를 표지시키는 방법:
(식 1)
식 중,
X1 및 X2는 플루오로이고,
R2 및 R3은 독립적으로 치환 또는 비치환된 벤조일, 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고, R2가 벤조일인 경우, R3는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이거나, 또는 R3가 벤조일인 경우, R2는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고,
R5 및 R7은 독립적으로 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
R1, R4, 및 R6은 독립적으로 H이다. - 화학식 1로 표시되는 표지자와 단백질 또는 세포를 접촉시키는 단계; 및 상기 표지자에 광을 조사하여 표지자와 단백질의 복합체 또는 표지자와 세포의 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 단백질 또는 세포를 검출하는 방법:
(식 1)
식 중,
X1 및 X2는 플루오로이고,
R2 및 R3은 독립적으로 치환 또는 비치환된 벤조일, 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고, R2가 벤조일인 경우, R3는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이거나, 또는 R3가 벤조일인 경우, R2는 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알콕시이고,
R5 및 R7은 독립적으로 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
R1, R4, 및 R6은 독립적으로 H이다. - 청구항 9 또는 10에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포인 것인 방법.
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| KR1020140150619A KR101708038B1 (ko) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | 신규 ｂｏｄｉｐｙ 화합물, 그의 합성법, 및 광가교반응을 이용한 단백질 또는 세포를 표지하는 방법 |
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| Journal of The American Chemical Society, 2009, vol. 131, pp10077-10082* |
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