KR101933554B1 - Ｈｂｔ　유도체의 광가교반응을 이용한 단백질 표지 및 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

하기 식 1의 화합물을 포함하는 표지자, 표지용 조성물, 상기 표지자를 사용하여 단백질을 표지시키는 방법, 및 상기 표지자를 사용하여 단백질을 검출하는 방법을 제공한다:
Figure 112016070989183-pat00019
(식 1)
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6, 및 R8은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고, R7은 H 또는 -NR9R10이고, 상기 R9 및 R10은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고, X는 -NR11, -O, 또는 S이고, 상기 R11은 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고, Y는 -OR12 또는 -NR13R14이고, 상기 R12는 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고, 상기 R13 및 R14는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이다.

Description

ＨＢＴ　유도체의 광가교반응을 이용한 단백질 표지 및 검출 방법{Method for labelling a protein, and method for detecting a protein by photocrosslinking　of　HBT derivatives}
본 발명은 표지자 및 단백질을 표지하기 위한 조성물, 및 상기 표지자를 이용하여 단백질을 표지시키는 방법 및 상기 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
생체 내 단백질 표지기술은 녹색형광단백질 (GFP)이 개발된 이후로 분자생물학에서 중요하게 다루어지고 있는 연구분야 중에 하나이다. 단순히 생물체 내에 존재하는 단백질의 위치를 파악하는 것뿐만 아니라, 세포의 분화 및 신호전달 체계에 따른 단백질의 이동을 모니터링함으로써, 기존에 존재하는 현미경의 분해능을 극복하고 새로운 기전을 밝히는데 큰 역할을 하고 있다.
GFP를 단백질에 표지하는 방법으로는 바이러스를 이용한 형질 주입 방법을 널리 사용하고 있는데, 바이러스의 특성상 감염체의 DNA에 무작위로 자신의 형질을 주입하기 때문에 그로 인한 유전자 변이가 염려되고 있다.
이를 극복하기 위하여 형광을 가지는 소분자체를 직접 목표한 단백질에 붙임으로써 표지하는 방법을 연구하고 있는데, 이 또한 소분자체의 결합부위가 생체 내의 다른 작용기와 반응을 하면서 바이오-직교성(bio-orthogonality) 문제가 대두되고 있다. 현재는 클릭 화학(click chemistry)과 같이 생체 내에 작용기와 반응을 하지 않으면서 단백질에 표지할 수 있는 방법 또는 광가교(photocrosslinking)를 사용한 부착법이 연구되고 있다.
일 양상은 표지자를 제공한다.
일 양상은 표지용 조성물을 제공한다.
일 양상은 단백질을 표지시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 표지자(Labelling agent)를 제공한다.
Figure 112016070989183-pat00001
(식 1)
식 중
R1, R2, R3, R4, R5, R6, 및 R8은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
R7은 H 또는 -NR9R10이고, 상기 R9 및 R10은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
X는 -NR11, -O, 또는 S이고, 상기 R11은 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
Y는 -OR12 또는 -NR13R14이고, 상기 R12는 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고, 상기 R13 및 R14는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐일 수 있다.
일 구체예에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, 및 R8은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
R7은 H 또는 -NR9R10이고, 상기 R9 및 R10은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
상기 R11은 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고,
상기 R12는 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-이고, 상기 R13 및 R14는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화합물은
Figure 112016070989183-pat00002
, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서 상기 식 1로 표시되는 화합물은 2-(2-hydroxyphenyl)benzothiazole (HBT), 2-(2-hydroxyphenyl)benzimidazole (HBI), 2-(2-hydroxyphenyl)-5-(diethylamino)benzimidazole (HDBI), 2-(2-hydroxyphenyl)benzoxazole (HBO), 2-(2-Aminophenyl)-1H-benzimidazole, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
용어 "알킬 (alkyl)"은 직쇄상 또는 분지상의 1가 포화 지방족 탄화수소기를 의미한다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 알킬기는 일반적으로 1~10개, 1~8개, 1~6개, 1~4개 또는 1~3개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필 (예, n-프로필 및 이소프로필), 부틸 (예, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, sec-부틸), 펜틸 (예, n-펜틸, 이소펜틸, 및 네오펜틸), n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐 및 n-데실을 포함할 수 있다.
용어 "알케닐 (alkenyl)"은 직쇄상 또는 분지상의 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 1가의 불포화 탄화수소기를 의미한다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 알케닐기는 일반적으로 2~10개, 2~8개, 2~6개, 2~4개 또는 2~3개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알케닐기는 예를 들면, 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부트-2-에닐, 시클로헥세닐, 또는 n-헥스-3-에닐 등을 포함할 수 있다. 상기 알케닐은 cis 및 trans 이성질체 또는 이들 이성질체의 혼합물을 포함할 수 있다.
용어 "알키닐 (alkynyl)"은 직쇄상 또는 분지상의 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 1가의 불포화 탄화수소기를 의미한다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 알키닐기는 일반적으로 2~10개, 2~8개, 2~6개, 2~4개 또는 2~3개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 알키닐기는 예를 들면, 에티닐, n-프로피닐, n-부트-2-이닐, 또는 n-헥스-3-이닐 등을 포함할 수 있다.
치환된 알킬기는 알콕시, 치환 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환 아미노, 아미노카르보닐, 아미노티오카르보닐, 아미노카르보닐아미노, 아미노티오카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 아미노술포닐, 아미노술포닐옥시, 아미노술포닐아미노, 아미디노, 아릴, 치환 아릴, 아릴옥시, 치환 아릴옥시, 아릴티오, 치환 아릴티오, 카르복실, 카르복실 에스테르, (카르복실 에스테르)아미노, (카르복실 에스테르)옥시, 시아노, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 시클로알킬옥시, 치환 시클로알킬옥시, 시클로알킬티오, 치환 시클로알킬티오, 시클로알케닐, 치환 시클로알케닐, 시클로알케닐옥시, 치환 시클로알케닐옥시, 시클로알케닐티오, 치환 시클로알케닐티오, 구아니디노, 치환 구아니디노, 할로, 히드록시, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 치환 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴티오, 치환 헤테로아릴티오, 헤테로환, 치환 헤테로환, 헤테로시클릴옥시, 치환 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴티오, 치환 헤테로시클릴티오, 니트로, SO3H, 치환 술포닐, 치환 술포닐옥시, 티오아실, 티올, 알킬티오, 및 치환 알킬티오로 이루어진 군에서 선택되는 1~5개의 치환기를 갖는 알킬기를 의미하고, 상기 치환기는 본원에서 정의된 바와 같다.
"알콕시"는 -O-알킬기를 의미하고 여기서 알킬은 본원에 정의된 바와 같다. 알콕시는 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, sec-부톡시, 및 n-펜톡시를 포함할 수 있다.
용어 "아릴 (aryl)"은 단환 또는 다환을 갖는 방향족 탄화수소기를 의미한다. 상기 다환은 융합된 고리 (fused ring)를 갖는 것 (예, 나프탈렌) 및/또는 융합되지 않은 고리를 갖는 것 (예, 비페닐)을 포함할 수 있다. 상기 다환은 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 고리를 갖는 것일 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 아릴기는 일반적으로 5 내지 10개, 6 내지 15개, 6 내지 12개, 또는 6 내지 10개의 탄소 고리 원자를 갖는 것일 수 있다. 상기 아릴기는 예를 들면, 페닐, 나프탈레닐 (예, 나프탈렌-1-일 및 나프탈렌-2-일), 비페닐, 안트라세닐, 또는 펜안트레닐 등을 포함할 수 있다.
용어 "시클로알킬 (cycloalkyl)"은 고리화된 알킬, 알케닐 및 알키닐기를 포함하는 비방향성 탄소고리 (non-aromatice carbocycle)를 나타낸다. 상기 시클로알킬기는 단환 또는 다환을 포함할 수 있다. 상기 다환은 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 융합된 고리를 갖는 것일 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 시클로알킬기는 일반적으로 3 내지 10개, 또는 3 내지 7개의 고리 탄소 원자를 포함한다. 시클로알킬기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로헥사디에닐 (cyclohexadienyl), 시클로헵타트리에닐, 노르보르닐 (norbornyl), 노르카닐 (norcarnyl), 아다만틸 등을 포함할 수 있다.
용어 "헤테로시클로알킬 (heterocycloalkyl)"은 N, O, 또는 S로부터 선택된 하나 이상 원자로서 고리를 형성하는 헤테로원자를 포함하는 비방향족 헤테로사이클을 의미한다. 헤테로시클로알킬기는 단환 혹은 다환 구조, 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 융합된 고리를 갖는 구조를 포함할 수 있다. "헤테로시클로알킬" 기의 예는 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 피페라진일, 테트라히드로푸란일, 테트라히드로티엔일, 2,3-디히드로벤조푸릴, 1,3-벤조디옥솔, 벤조-1,4-디옥세인, 피페리디닐, 피롤리디닐, 이소옥사졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 티아졸리디닐 등을 포함할 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 헤테로시클로알킬기는 3개 내지 10개, 3개 내지 7개, 5개 내지 7개 또는 5개 내지 6개의 고리를 형성하는 원자를 포함할 수 있다.
용어 "헤테로아릴 (heteroaryl)"은 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 고리 구성원으로 갖는 1가의 방향성기를 의미한다. 헤테로아릴기는 단환 혹은 다환 구조를 포함할 수 있다. 상기 다환은 예를 들면, 2개, 3개 또는 4개의 축합 고리를 갖는 것일 수 있다. 달리 정의되지 않는다면, 상기 헤테로아릴기는 일반적으로 3 내지 10개, 3 내지 7개, 또는 3 내지 5개의 고리 원자를 포함한다. 상기 헤테로아릴기는 1개, 2개 또는 3개의 헤테로원자를 포함하는 것일 수 있다. 헤테로아릴기는 예를 들면, 피리딜, N-옥소피리딜, 피리미디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 푸릴 (furyl), 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 티에닐 (thienyl), 이미다졸릴, 푸란일 (furanyl), 티아졸릴 (thiazolyl), 인돌릴, 피릴, 옥사졸릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐, 벤즈티아졸릴, 이소옥사졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 인다졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 벤조티에닐, 푸리닐, 벤즈이미다졸릴, 인돌린일 등을 포함할 수 있다.
상기 치환(기)의 정의에 대하여 살펴보면 다음과 같다. 상기 알킬기, 알콕시기, 알케닐기, 알키닐기, 알킬렌옥시드기, 시클로알킬기, 아릴옥시기, 헤테로아릴기가 갖는 "치환(된)"에서의 "치환"은 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 치환된 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염, 또는 C1-10의 알킬기, C1-10의 알콕시기, C2-10의 알케닐기, C2-10의 알키닐기, C1-10의 헤테로알킬기, C6-10의 아릴기, C6-10의 아릴알킬기, C6-10의 헤테로아릴기, 또는 C6-10의 헤테로아릴알킬기로 치환된 것을 의미한다.
상기 C1-10의 알킬기의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, sec-부틸, ter-부틸, neo-부틸, iso-아밀, 또는 헥실 등을 들 수 있고, 상기 알킬기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C1-10의 알콕시기의 구체적인 예로는 메톡시, 에톡시, 또는 프로폭시 등을 들 수 있고, 상기 알콕시기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C2-10의 알케닐기의 구체적인 예로는 비닐렌 또는 알릴렌 등을 들 수 있고, 상기 알케닐기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C2-10의 알키닐기의 구체적인 예로는 아세틸렌 등을 들 수 있고, 상기 알키닐기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C2-10의 알킬렌 옥시드기의 구체적인 예로는 에틸렌 옥시드, 프로필렌 옥시드, 또는 부틸렌 옥시드 등을 들 수 있다.
상기 C3-10의 시클로알킬기의 구체적인 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실 등을 들 수 있고, 상기 시클로알킬기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C6-10의 아릴기는 단독 또는 조합하여 사용되어, 하나 이상의 고리를 포함하는 방향족 시스템인 것을 의미하며, 예를 들어 페닐, 나프틸 등을 들 수 있다. 또한 상기 아릴기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 C6-10의 아릴옥시기의 구체적인 예로는 페녹시 등을 들 수 있고, 상기 아릴옥시기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
C6-10의 헤테로아릴기는 N, O, P 또는 S 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리원자가 탄소인 유기 화합물인 것을 의미하며, 예를 들어 피리딜 등을 들 수 있다. 또한 상기 헤테로아릴기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 "치환"에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.
상기 표지자는 단백질을 표지하는 것일 수 있다. 상기 표지자는 단백질 표지자일 수 있다.
상기 표지자는 형광 또는 흡광 표지자일 수 있다. 상기 표지자는 형광 또는 흡광을 발생시키는 것일 수 있다. 상기 형광은 청색 또는 녹색 영역의 형광일 수 있다. 상기 표지자는 광을 조사받는 경우, 표지자 중 수소 원자가 인접한 산소 또는 질소 원자로 이동하여 Stokes shift가 큰 형광을 나타내는 것일 수 있다.
다른 양상은 하기 식 2 또는 식 3의 화합물 및 단백질을 포함하는 표지용 조성물을 제공한다.
하기 식 2의 화합물 및 단백질은 다음과 같다:
Figure 112016070989183-pat00003
(식 2)
식 2 중,
R15, R16, R17, R18, R19, R20, 및 R21은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
X는 -NR22H, -O, 또는 S이고, 상기 R22는 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
Y는 -OR23 또는 -NR24R25이고, 상기 R23은 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고, 상기 R24 및 R25는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐일 수 있다.
하기 식 3의 화합물 및 단백질은 다음과 같다:
Figure 112016070989183-pat00004
(식 3)
식 3 중,
R26, R27, R28, R29, R30, 및 R32는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
R31은 -NR32R33이고, 상기 R32 및 R33은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
X는 -NR34H, -O, 또는 S이고, 상기 R34는 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
Y는 -CR35 또는 -NR36R37이고, 상기 R35는 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고, 상기 R36 및 R37은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이다.
상기 표지용 조성물은
Figure 112016070989183-pat00005
,
Figure 112016070989183-pat00006
,
Figure 112016070989183-pat00007
,
Figure 112016070989183-pat00008
,
Figure 112016070989183-pat00009
, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 화합물은 공유결합으로 단백질에 결합된 것일 수 있다. 상기 단백질은 폴리펩티드 또는 아미노산; 또는 아미노산의 유도체 (예, 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 또는 L-디히드록시페닐알라닌 (L-DOPA) 등)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 아미노산은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산일 수 있다. 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 셀레노시스테인, 아스파라진, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파트산, 글루탐산, 오르니틴 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 세포 중 단백질일 수 있다. 상기 세포는 박테리아, 식물, 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 동물 세포는 예를 들면, HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293) 세포, HeLa, Huh7, 또는 MDCK 세포일 수 있다.
또한, 상기 표지자는 링커 분자에 결합할 수 있다. 상기 링커 분자는 예를 들면, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2+, FLAG 태그, 또는 myc 태그일 수 있다.
다른 양상은 상술한 화학식 1로 표시되는 표지자와 단백질을 접촉시키는 단계; 및 상기 표지자에 광을 조사하는 단계를 포함하는 단백질을 표지시키는 방법을 제공한다. 상기 단백질에 관해서 상술한 바와 같다.
상기 표지자에 광을 조사하는 단계는 상기 표지자와 단백질이 결합하여 표지자와 단백질의 복합체를 형성할 수 있다. 상기 표지자와 단백질의 복합체는 공유 결합을 통해 상기 표지자와 상기 단백질이 결합되는 것일 수 있어, 상기 복합체는 접합체(conjugate)일 수 있다. 상기 광을 조사하는 단계는 상기 표지자의 라디칼 반응을 초래하여 상기 표지자와 단백질의 복합체를 형성할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표지자는 Y가 -OH 또는 -NR13R14이고, 상기 R13 및/또는 R14가 -H인 경우, 상기 표지자는 토토머(tautomer) 형태로 변화하여, 즉, 수소결합을 통해서 표지자가 케톤의 형태로 변화하여 단백질과 결합할 수 있다. 상기 표지자는 상기 단백질 중 아미노산 또는 펩티드의 아민 관능기 (amine functional group), 수산화 관능기(hyrdorxyl functional group) 또는 티올 관능기 (thiol functional group)와 결합할 수 있다. 상기 결합은 공유결합일 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, 상기 표지자가 Y가 -OH인 경우, 아래 반응식 1과 같은 토토머 형태를 가질 수 있다. 상기 표지자는 토토머 평형을 이용하여 단백질과의 화학결합유도 특성을 갖는 것일 수 있다:
<반응식 1>
Figure 112016070989183-pat00010
상기 화합물은 공유결합으로 단백질에 결합된 것일 수 있다. 상기 단백질은 폴리펩티드 또는 아미노산; 또는 아미노산의 유도체 (예, 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 또는 L-디히드록시페닐알라닌 (L-DOPA) 등)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 아미노산은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산일 수 있다. 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 셀레노시스테인, 아스파라진, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파트산, 글루탐산, 오르니틴 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 세포 중 단백질일 수 있다. 상기 세포는 박테리아, 식물, 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 동물 세포는 예를 들면, HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293) 세포, HeLa, Huh7, 또는 MDCK 세포일 수 있다.
다른 양상은 상술한 화학식 1로 표시되는 표지자와 단백질을 접촉시키는 단계; 및 상기 표지자에 광을 조사하는 단계를 포함하는 단백질을 표지시키는 방법을 제공한다. 상기 단백질에 관해서 상술한 바와 같다.
상기 표지자에 광을 조사하는 단계는 상기 표지자와 단백질이 결합하여 표지자와 단백질의 복합체를 형성할 수 있다. 상기 표지자와 단백질의 복합체는 공유 결합을 통해 상기 표지자와 상기 단백질이 결합되는 것일 수 있어, 상기 복합체는 접합체(conjugate)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표지자는 Y가 -OH 또는 -NR13R14이고, 상기 R13 및/또는 R14가 -H인 경우, 상기 표지자는 토토머(tautomer) 형태로 변화하여, 즉, 수소결합을 통해서 표지자가 케톤의 형태로 변화하여 단백질과 결합할 수 있다. 상기 표지자는 상기 단백질 중 아미노산 또는 펩티드의 아민 관능기 (amine functional group), 수산화 관능기(hyrdorxyl functional group) 또는 티올 관능기 (thiol functional group)와 결합할 수 있다. 또한, 상기 화합물은 상기 아미노산의 N-말단의 질소와 공유결합할 수 있다. 상기 결합은 공유결합일 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, 상기 표지자가 Y가 -OH인 경우, 아래 반응식 1과 같은 토토머 형태를 가질 수 있다. 상기 표지자는 토토머 평형을 이용하여 단백질과의 화학결합유도 특성을 갖는 것일 수 있다:
<반응식 A>
Figure 112016070989183-pat00011
상기 광을 조사하는 단계는 단백질과 화합물의 복합체를 형성할 수 있다. 상기 광을 조사하는 단계는 화합물과 단백질의 접촉 후, 화합물과 단백질의 혼합물에 광을 조사하는 것일 수 있다.
상기 광을 조사하는 단계는 형광 여기(excitation)을 위한 것일 수 있다. 상기 광의 파장은 예를 들면 200 nm 내지 400 nm, 200 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 300 nm, 또는 200 nm 내지 250 nm일 수 있다. 상기 광은 형광 여기를 위한 광원에서 방출되는 것이면, 어떠한 것이든 이용할 수 있다. 상기 광원은 레이저 광원일 수 있다. 상기 광은 자외선일 수 있다.
다른 양상은 상술한 화학식 1로 표시되는 표지자와 단백질을 접촉시키는 단계; 및 상기 표지자에 광을 조사하는 단계를 포함하는 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 광 조사는 표지자와 단백질을 결합시켜 표지자와 단백질의 복합체를 형성할 수 있다. 상기 검출은 광 조사 후, 표지자와 단백질의 복합체로부터 방출되는 형광 또는 흡광을 측정하는 것을 통해 수행될 수 있다.
일 양상에 따른 표지자에 따르면 단백질을 효율적으로 표지하는 데 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 표지용 조성물에 따르면 단백질을 효율적으로 표지하는 데 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 단백질을 표지시키는 방법에 따르면, 단백질을 효율적으로 표지할 수 있다.
일 양상에 따른 단백질을 검출하는 방법에 따르면, 상기 단백질을 효율적으로 검출할 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 화합물 중 HBI, HDBI, 및 HBO의 BSA, HSA, peroxidase, 및 Lysozyme의 단백질의 표지 및 자외선(UV) 조사시간에 따른 단백질의 표지 효율을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 화합물의 제조
실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약은 다음과 같다. FT-NMR 분광 분석을 위한 기기는 Bruker 사의 Avance 400을 사용하였고, LC/MS는 Thermo 사의 Dionex ultimate 3000 / Velos pro를 사용하여, ion-trap mass spectrometer(ITMS) 방식으로 측정하였다. 시약은 Aldrich사의 시약을 특별한 추가 정제 없이 사용하였다. 필터지는 Whatman 사의 직경 125 mm 용지를 사용하였다. 실험에 사용된 유도체 중 2-(2-Aminophenyl)-1H-benzimidazole) (ABI)는 Aldrich 사에서 판매하는 시약을 구매하여 사용하였고, NMR 분석과 형광/흡광 값은 해당 기술분야에서 알려진 방법에 의하여 기재하였다.
(1) 2-(2-hydroxyphenyl)benzothiazole (HBT)의 합성
살리실알데히드 (salicylaldehyde) (122 mg, 1 mmol, Aldrich)와 2-아미노티오페놀 (2-aminothiophenol) (135 ul, 1 mmol, Aldrich)을 2 ml의 DMF에 녹였다. 상온에서 교반시키면서, 메타이아황산나트륨(Sodium metabisulfite) 1 mmol을 500 ul의 물에 녹여서 주입시키고, 90℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합액은 얼음물에 넣어 침전시키고 필터로 거른 후 상온에서 건조시켰다. 건조가 끝난 화합물을 다시 에탄올에 녹여서 재결정 과정을 수행하였다 (Lingyu Zeng, Shiyu Chen, Tian Xia, Cheng Zhong and Zhihong Liu. Chem. Commun., 2014, 50, 11139-11142 참조). 상술한 바와 같이, 하기 반응식 1에 의해 HBT를 합성하였다.
<반응식 1>
Figure 112016070989183-pat00012
(2) 2-(2-hydroxyphenyl)benzimidazole (HBI)의 합성
살리실알데히드 (salicylaldehyde) (122 mg, 1 mmol, Aldrich)와 o-페닐렌디아민 (o-phenylenediamine) (108 mg, 1 mmol, Aldrich)을 2 ml의 DMF에 녹였다. 상온에서 교반시키면서, 메타이아황산나트륨(Sodium metabisulfite) 1 mmol을 500 ul의 물에 녹여서 주입시키고, 90℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합액은 얼음물에 넣어 침전시키고 필터로 거른 후 상온에서 건조시켰다. 건조가 끝난 화합물을 다시 에탄올에 녹여서 재결정 과정을 수행하였다 (Lingyu Zeng, Shiyu Chen, Tian Xia, Cheng Zhong and Zhihong Liu. Chem. Commun., 2014, 50, 11139-11142 참조). 상술한 바와 같이, 하기 반응식 2에 의해 HBI를 합성하였다.
<반응식 2>
Figure 112016070989183-pat00013
(3) 2-(2-hydroxyphenyl)-5-(diethylamino)benzimidazole (HDBI)의 합성
4-디에틸아미노 살리실알데히드 (4-(diethylamino)salicylaldehyde) (193 mg, 1mmol, Aldrich)와 o-페닐렌디아민 (o-phenylenediamine) (108 mg, 1 mmol, Aldrich)을 2 ml의 DMF에 녹였다. 상온에서 교반시키면서, 메타이아황산나트륨(Sodium metabisulfite) 1 mmol을 500 ul의 물에 녹여서 주입시키고, 90℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합액은 얼음물에 넣어 침전시키고 필터로 거른 후 상온에서 건조시켰다. 건조가 끝난 화합물을 다시 에탄올에 녹여서 재결정 과정을 수행하였다 (Lingyu Zeng, Shiyu Chen, Tian Xia, Cheng Zhong and Zhihong Liu. Chem. Commun., 2014, 50, 11139-11142 참조). 상술한 바와 같이, 하기 반응식 3에 의해 HDBI를 합성하였다.
<반응식 3>
Figure 112016070989183-pat00014
(4) 2-(2-hydroxyphenyl)benzoxazole (HBO)의 합성
살리실알데히드 (salicylaldehyde) (122 mg, 1 mmol, Aldrich)와 2-아미노페놀 (2-aminophenol) (109 mg, 1 mmol, Aldrich)을 2 ml의 DMF에 녹였다. 상온에서 교반시키면서, 메타이아황산나트륨(Sodium metabisulfite) 1 mmol을 500 ul의 물에 녹여서 주입시키고, 90℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합액은 얼음물에 넣어 침전시키고 필터로 거른 후 상온에서 건조시켰다. 건조가 끝난 화합물을 다시 에탄올에 녹여서 재결정 과정을 수행하였다 (Lingyu Zeng, Shiyu Chen, Tian Xia, Cheng Zhong and Zhihong Liu. Chem. Commun., 2014, 50, 11139-11142 참조). 상술한 바와 같이, 하기 반응식 4에 의해 HBO를 합성하였다.
<반응식 4>
Figure 112016070989183-pat00015
(5) 2-(2-Aminophenyl)-1H-benzimidazole (ABI)의 준비
2-(2-아미노페닐)-1H-벤지미다졸(ABI)은 Aldrich에서 상업적으로 입수하였고, 이의 카탈로그 번호는 642681이다. ABI의 화학식은 다음과 같다:
Figure 112016070989183-pat00016
(식 4).
실시예 2: 실시예 1에서의 화합물을 이용한 단백질의 표지(labelling)
실시예 1에서 합성하거나 수득한 화합물을 빛이 차단된 상태에서 BSA, HSA, Peroxidase, 및 Lysozyme의 단백질에 처리하고 30분간 잘 섞어준 후 약 254 nm의 자외선을 조사하여, 자외선의 조사 시간에 따른 상기 화합물과 단백질의 결합 정도를 겔 전기영동 실험을 통해 확인하였다. 젤 전기영동 실험을 위해 전기영동장치(Bio-Rad사), 소형 수직 젤 전기영동장치를 연결하여 사용하였다. 실험을 위한 12% SDS 젤 및 러닝 완충액 (running buffer)는 다음과 같이 직접 제조하여 사용하였다. 12% SDS gel는 7.9ml의 H2O, 6.5ml의 pH8.8-50M Tris-HCl buffer, 10 ml의 30% Acryl amide, 250 μl의 10% SDS gel, 250 μl의 APS, 및 10 μl의 TMEDE를 혼합하여 제조하였다. 1 x running buffer는 200 ml의 10 x TGS buffer, 및 1800 ml의 H2O를 혼합하여 제조하였다.
BSA, HSA, peroxidase, 및 Lysozyme의 단백질은 Sigma Aldrich사의 것을 사용하였다. 표지된 단백질의 형광강도를 BIO-RAD사의 ChemiDoc 장비를 사용하였고, 광원은 Blue Epi, Green Epi를 사용하였고, 필터는 530 nm emission(28nm bandwidth), 650 nm emission (50nm bandwidth)를 형광 파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다.
표 1은 DMSO 중에서의 화합물의 흡광도 및 형광도의 최대값을 나타낸 표이다 (Lingyu Zeng, Shiyu Chen, Tian Xia, Cheng Zhong and Zhihong Liu. Chem. Commun., 2014, 50, 11139-11142; Cristina Rodrı´guez-Rodrı´guez 외 저술. J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131, 1436-1451 참조). 254 nm에서의 자외선 조사한 경우, 형광도 및 흡광도의 변화가 없이 안정된 것을 확인하였다. 따라서, 상기 화합물은 단백질과 같은 표지 대상이 없는 경우에도 형광의 변화가 없이 안정된다는 것을 확인하였다.
화합물 흡광도 (nm) 형광도 (nm)
HBT 350 515
HBI 320 463
HDBI 360 448
HBO 380 480
ABI 360 415
도 1a 내지 도 1d는 화합물 중 HBI, HDBI, 및 HBO의 BSA, HSA, peroxidase, 및 Lysozyme의 단백질의 표지 및 자외선(UV) 조사시간에 따른 단백질의 표지 효율을 나타낸 도면이다. 도 1a 내지 도 1d의 Y축은 겔의 형광 세기로, 화합물과 단백질의 광가교결합 정도를 나타낸다.
도 1a는 HBI, HDBI, 및 ABI 순서로 나타낸 값이다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 후 5분부터 표지가 유의미하게 나타남을 알 수 있다. 이는 UV 조사만으로, 상기 화합물들이 BSA에 표지되었음을 알 수 있다. 이는 상기 화합물이 광가교성을 갖는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 화합물을 표지자로 사용될 수 있으며, 또한 광가교제(photocrosslinking agent)로 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1b는 HBI, HDBI, 및 ABI 순서로 나타낸 값이다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 후 5분부터 표지가 유의미하게 나타남을 알 수 있다. 이는 UV 조사만으로, 상기 화합물들이 HSA에 표지되었음을 알 수 있다. 이는 상기 화합물이 광가교성을 갖는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 화합물을 표지자로 사용될 수 있으며, 또한 광가교제(photocrosslinking agent)로 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1c는 HBI, HDBI, 및 ABI 순서로 나타낸 값이다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 후 5분부터 표지가 유의미하게 나타남을 알 수 있다. 이는 UV 조사만으로, 상기 화합물들이 peroxidase에 표지되었음을 알 수 있다. 이는 상기 화합물이 광가교성을 갖는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 화합물을 표지자로 사용될 수 있으며, 또한 광가교제(photocrosslinking agent)로 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1d는 HBI 및 HDBI 순서로 나타낸 값이다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 후 5분부터 표지가 유의미하게 나타남을 알 수 있다. 이는 UV 조사만으로, 상기 화합물들이 Lysozyme에 표지되었음을 알 수 있다. 이는 상기 화합물이 광가교성을 갖는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 화합물을 표지자로 사용될 수 있으며, 또한 광가교제(photocrosslinking agent)로 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1a 내지 1d의 결과를 종합하면, HBI, HDBI, 및 ABI가 각각 단백질의 표지자로서 사용될 수 있고, 이로부터 상기 화합물은 광 조사만으로 단백질에 표지되었다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 화합물은 광가교제로 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, HBI의 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물 중 가장 높은 광가교적 특성을 나타낸다는 것을 보여준다.

Claims (3)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 표지자와 단백질을 접촉하는 단계; 및
    상기 표지자에 5분 이상 254 nm 파장의 자외선을 포함하는 광을 조사하여 표지자의 토토머화를 유도하는 단계를 포함하는 단백질을 표지시키는 방법:
    Figure 112017043023295-pat00017
    (화학식 1)
    식 중
    R1, R2, R3, R4, R5, R6, 및 R8은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
    R7은 H 또는 -NR9R10이고, 상기 R9 및 R10은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
    X는 -NR11, -O, 또는 S이고, 상기 R11은 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
    Y는 -OH이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 광을 조사하는 단계는 상기 표지자의 라디칼 반응을 초래하여 상기 표지자와 단백질의 복합체를 형성하는 것인 방법.
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 표지자와 단백질을 접촉시키는 단계; 및
    상기 표지자에 5분 이상 254 nm 파장의 자외선을 포함하는 광을 조사하여 표지자의 토토머화를 유도하는 단계를 포함하는 단백질을 검출하는 방법:
    Figure 112017043023295-pat00018
    (화학식 1)
    식 중
    R1, R2, R3, R4, R5, R6, 및 R8은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
    R7은 H 또는 -NR9R10이고, 상기 R9 및 R10은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
    X는 -NR11, -O, 또는 S이고, 상기 R11은 H, 치환 또는 비치환된 -C1-10-알킬-, -C2-10-알케닐, 또는 -C2-10-알키닐이고,
    Y는 -OH이다.
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